evaluación in vitro de las propiedades antioxidantes en
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Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
Evaluación in vitro de las propiedades
antioxidantes en leches fermentadas con jugo de
frutilla y frambuesa
MANNO, Carolina; MANRIQUE, D. Guillermo; VEGA, M. Fernanda
Agosto, 2020
Tandil
Evaluación in vitro de las propiedades antioxidantes en leches
fermentadas con jugo de frutilla y frambuesa
Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada
como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciada de la
estudiante: Manno, Carolina
Director: Dra. Vega María Fernanda
Codirector: Dr. Manrique Guillermo Daniel
Evaluador: Lic. Montero Gabriela
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos
Aires por brindarme la posibilidad de realizar mi formación universitaria y al
Departamento de Tecnología y Calidad de los Alimentos de la Facultad de
Ciencias Veterinarias, lugar donde desarrollé esta Tesis.
A mi Directora María Fernanda Vega por su apoyo, dedicación y
acompañamiento durante la realización de esta Tesis. A mi Codirector
Guillermo Manrique por la ayuda brindada y el tiempo dedicado a este
proyecto.
A Roxana Medina y al Centro de Referencia de Lactobacilos de Tucumán por
facilitarme material esencial para llevar a cabo este trabajo.
A Emilia Latorre por su buena predisposición, colaboración y participación
durante el desarrollo de la Tesis.
Al personal del Área de Calidad de Leche y Productos Lácteos.
Al Laboratorio de Toxicología y en especial a Julieta Decundo por cederme
instrumentos necesarios para este proyecto.
A todas las personas que me acompañaron y me apoyaron durante toda la
carrera.
RESUMEN
Los antioxidantes naturales son compuestos que pueden retardar o prevenir la oxidación de biomoléculas en organismos vivos. En las últimas décadas, numerosos estudios han demostrado que la acción de los antioxidantes se relaciona con una serie de efectos beneficiosos para la salud humana, los que incluyen la disminución de la incidencia de enfermedades degenerativas, cardiovasculares y de ciertos tipos de cáncer. En la dieta humana, los antioxidantes naturales provienen de vegetales y pertenecen mayoritariamente a la familia de los compuestos fenólicos. Dentro de éstos, los ácidos fenólicos representan una fracción significativa, pudiéndose encontrar en forma libre o ligados mediante enlaces éster a polisacáridos de la pared celular. Se ha demostrado que un proceso de hidrólisis, que permita la liberación de la fracción ligada de éstos ácidos fenólicos, aumenta su biodisponibilidad y metabolismo. En particular, la enzima feruloil esterasa cataliza este tipo de hidrólisis, pudiendo estar presente en ciertas cepas de lactobacilos potencialmente útiles para la elaboración de alimentos fermentados. En el presente trabajo, se evaluó la actividad antioxidante in vitro de productos elaborados a base de leche, con o sin el agregado de jugo frutilla y frambuesa, analizando el efecto de la fermentación mediante la acción de cepas de lactobacilos con y sin actividad feruloil esterasa. El porcentaje de inhibición del radical DPPH alcanzó valores de 13,9% ± 6,0 y 12,8% ± 4,9 en leches sin jugo fermentadas con L. plantarum y L. fermentum respectivamente, mientras que en la leche con jugo fermentada con los mismos microorganismos, los valores fueron 36,9% ± 7,0 y 34,4% ± 8,2, en cada caso. Para la leche con jugo sin fermentar el valor fue de 61,9% ± 8,9. Dada la mayor actividad antioxidante registrada en la leche con jugo sin fermentar, se pudo confirmar que el jugo fue el principal componente responsable de esta propiedad, mientras que la actividad feruloil esterasa provista por los microorganismos estudiados condujo a una disminución en dicha actividad, posiblemente debido al metabolismo de los compuestos fenólicos liberados por parte dichos microorganismos.
Palabras clave: Actividad antioxidante – Leches fermentadas – Actividad
feruloil esterasa – Lactobacillus spp.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
OBJETIVO .......................................................................................................... 6
Objetivo general .............................................................................................. 6
Objetivos específicos ...................................................................................... 6
ANTECEDENTES .............................................................................................. 7
MARCO LEGAL ............................................................................................... 14
Código Alimentario Argentino........................................................................ 14
Códex Alimentarius ....................................................................................... 16
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 18
O1.- Evaluar la actividad feruloil esterasa de cepas de Lactobacillus spp.
y seleccionar las cepas a utilizar ............................................................... 18
a) Cepas de lactobacilos y determinación de la actividad feruloil esterasa ... 18
O2.- Determinar la concentración de jugo de frutilla y frambuesa a
utilizar que no inhiba el desarrollo de las cepas seleccionadas ............ 18
a) Evaluación de la esterilidad del jugo ......................................................... 19
b) Preparación de la base láctea y obtención de los inóculos de los starters
seleccionados. .............................................................................................. 19
c) Determinación de la concentración de jugo mixto de frutilla y frambuesa a
adicionar ....................................................................................................... 19
O3.- Evaluar el efecto del agregado de jugo de frutilla y frambuesa y de
la fermentación con distintas cepas de Lactobacillus spp. sobre la
actividad antioxidante in vitro de leche. ................................................... 20
a) Elaboración de muestras .......................................................................... 20
b) Medición de actividad antioxidante in vitro ................................................ 21
c) Análisis estadístico .................................................................................... 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 22
O1.- Evaluar la actividad feruloil esterasa de cepas de Lactobacillus spp.
y seleccionar las cepas a utilizar ............................................................... 22
a) Cepas de lactobacilos y determinación de la actividad feruloil esterasa ... 22
O2.- Determinar la concentración del jugo de frutilla y frambuesa a
utilizar que no inhiba el desarrollo de las cepas seleccionadas ............ 23
a) Evaluación de la esterilidad del jugo ......................................................... 23
b) Preparación de la base láctea y obtención de los inóculos de los starters
seleccionados. .............................................................................................. 24
c) Determinación de la concentración de jugo mixto de frutilla y frambuesa a
adicionar ....................................................................................................... 25
O3.- Evaluar el efecto del agregado de jugo de frutilla y frambuesa y de
la fermentación con distintas cepas de Lactobacillus spp. sobre la
actividad antioxidante in vitro de leche. ................................................... 28
a) Elaboración de muestras .......................................................................... 28
b) Medición de actividad antioxidante in vitro ................................................ 31
CONCLUSIÓN ................................................................................................. 34
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 35
1
INTRODUCCIÓN
En las últimas décadas, la actitud frente a la alimentación se ha modificado, en
parte por la mayor conciencia de los consumidores sobre la influencia de la
dieta en la calidad de vida y el riesgo de desarrollo de enfermedades. Como
consecuencia, se ha observado un mayor esfuerzo de las industrias por
desarrollar alimentos funcionales, incluyendo probióticos y prebióticos, que
favorecen la buena salud y reducen el riesgo de sufrir ciertas enfermedades,
proporcionando una buena oportunidad de crecimiento para la industria
alimentaria (Mollet y Rowland, 2002). La Comisión FUFOSE (Functional Food
Science in Europe) coordinada por el ILSI (International Life Science Institute)
publicó un consenso en el cual se establece que, “un alimento puede ser
considerado como ‘funcional’ si se puede demostrar de forma satisfactoria que
poseen un efecto beneficioso sobre una o varias funciones específicas del
organismo, más allá de los efectos nutricionales habituales, siendo esto
relevante para la mejora de la salud y el bienestar y/o para la reducción del
riesgo de enfermedades”. Además indica que deben ser alimentos
convencionales consumidos como parte de una dieta normal, que contengan
componentes naturales en concentraciones modificadas o no (Diplock et al.,
1999).
Los alimentos de origen lácteo son consumidos por la mayor parte de la
población de manera diaria y aportan efectos beneficiosos para la salud,
especialmente para niños, mujeres, y personas con enfermedades que
incrementen sus requerimientos nutricionales, ya que en su composición
incluyen lactosa, que aporta energía y mejora la absorción intestinal de calcio,
magnesio y fósforo, proteínas de alto valor biológico que contribuyen al
desarrollo y mantenimiento de la masa muscular, calcio, fósforo y vitamina D,
que ayudan a prevenir la osteoporosis y desarrollar un sistema óseo fuerte,
vitaminas del grupo B que aportan energía, riboflavina y vitamina A para un
sistema inmunológico saludable (Domínguez Salas et al., 2019). Algunas
leches fermentadas y otros productos lácteos fermentados, pueden ser
considerados alimentos funcionales, ya que brindan al consumidor bacterias
lácticas beneficiosas que son capaces de multiplicarse y mantenerse en el
interior del intestino grueso, actuando como protectoras de la mucosa intestinal,
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facilitando la absorción de los nutrientes de los alimentos, estimulando el
sistema inmune, como así también ejerciendo otros efectos beneficiosos para
la salud del huésped (Stanton et al., 2005).
Las bacterias empleadas en la industria láctea pertenecen principalmente al
género Lactobacillus, las que fundamentalmente sirven de cultivos iniciadores
en diversos productos, tales como yogures, leches fermentadas, mantecas,
quesos y kéfir (Carr et al., 2002). Un cultivo iniciador puede definirse como una
preparación microbiana, con un gran número de células de al menos un
microorganismo, que se adiciona a la materia prima para iniciar una
fermentación rápida y dirigida. Estos microorganismos se caracterizan por tener
buen desarrollo en leche, elevada producción de ácido, el que contribuye a la
preservación del alimento, y producción de etanol, compuestos aromáticos,
bacteriocinas, exopolisacáridos y enzimas. Estos metabolitos resultan de gran
importancia, ya sea desde el punto de vista organoléptico, nutricional y/o
tecnológico. Además, algunos de estos microorganismos presentan
propiedades probióticas (Wouters et al., 2002, Leroy y De Vuyst, 2004).
Ciertas especies de lactobacilos poseen actividad de cinamoil esterasas,
proveniente de un grupo de enzimas que hidrolizan ésteres conjugados de
ácidos hidroxicinámicos tales como el ferúlico, cafeico y cumárico. Dentro de
este grupo de enzimas, se destacan las feruloil esterasas (FE) capaces de
liberar preferentemente ácido ferúlico, uno de los ácidos hidroxicinámicos más
abundantes en la naturaleza (Fazary y Ju, 2007, Liu et al., 2016)
Los ácidos hidroxicinámicos pertenecen a un amplio conjunto de compuestos
de origen vegetal que poseen un anillo aromático con uno o más sustituyentes
hidroxilo, denominados compuestos fenólicos. Estos constituyen un grupo
químicamente muy heterogéneo de casi 10.000 compuestos con funciones muy
diversas, tales como antioxidantes, defensa frente a patógenos, soporte
mecánico, atracción de polinizadores, compuestos de absorción de la radiación
ultravioleta perjudicial, entre otras (Dixon y Paiva, 1995). Los compuestos
fenólicos se encuentran ampliamente distribuidos, principalmente en las
paredes celulares de las plantas, por lo que están presentes en productos
alimenticios como salvados, granos enteros, frutas y verduras, y también en
bebidas como el té, café y cerveza (Fazary y Ju, 2007). En muchos casos, la
3
mayor parte de estos compuestos se encuentran conjugados a los
componentes polisacarídicos de la pared celular mediante enlaces éster
(fracción de compuestos fenólicos conocida como “ligada”), aspecto que en
principio, podría reducir su bioaccesibilidad y biodisponibilidad (Couteau et al.,
2001, Bhathena et al., 2008) en detrimento de sus potenciales efectos
beneficiosos para la salud. Las FE catalizan la hidrólisis de estos enlaces éster
entre los ácidos fenólicos y los polisacáridos estructurales, liberando estos
ácidos para que puedan absorberse fácilmente en el tracto digestivo superior
de los humanos (Russo, 2018).
Es importante investigar los mecanismos de bioaccesibilidad y
biodisponibilidad, ya que sólo los compuestos liberados y/o absorbidos en el
intestino delgado son potencialmente activos y capaces de ejercer efectos
benéficos a la salud (Quirós Sauceda et al., 2012).
La bioaccesibilidad se define como la cantidad de un componente del alimento
que está presente en el intestino humano, como consecuencia de su liberación
de la matriz del alimento, y que puede ser capaz de atravesar la barrera
intestinal (Shim et al., 2009). En cambio, la biodisponibilidad se define como la
cantidad y velocidad a la que el principio activo se absorbe y llega al lugar de
acción (Holst y Williamson, 2008). La biodisponibilidad de cada compuesto
fenólico en el tracto gastrointestinal puede depender de diversos factores como
su tamaño, grado de conjugación, la matriz alimentaria y las interacciones
químicas con otros fitoquímicos y/o biomoléculas de la pared celular.
Una de las funciones del ácido ferúlico que más interesan en el presente
trabajo, es su actividad antioxidante frente a radicales libres. Un antioxidante es
una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación (pérdida de uno o más
electrones) otras biomoléculas en organismos vivos (INTA-Chile y CORFO-
Chile, 2011), mientras que un radical libre es una molécula que en su
estructura presenta un electrón desapareado en el orbital externo,
configuración que le confiere una alta inestabilidad y por tanto, reactividad
química. Los radicales libres pueden encontrarse en todo el organismo, ya sea
en el interior o en el exterior de las células, manteniendo actividad biológica al
oxidar proteínas, enzimas, lípidos, componentes de membranas celulares,
4
fibras de colágeno, ADN, ARN, entre otras biomoléculas, dañando
principalmente el tejido conjuntivo (Camacho Cervantes, 2015).
Los radicales libres se forman como consecuencia del metabolismo normal en
los seres vivos y cuando su nivel excede el que puede ser controlado por los
sistemas antioxidantes intrínsecos del organismo, pueden causar daño
oxidativo a diferentes moléculas. Cuando el daño es intenso y sostenido en el
tiempo, y no logra ser revertido o reparado debido a un desequilibrio entre la
producción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y la capacidad de un
sistema biológico para detoxificarse eficazmente, pueden producirse patologías
asociadas al estrés oxidativo, tales como enfermedades cardiovasculares,
circulatorias, neurológicas, degenerativas y ciertos tipos de cáncer (Pisoschi y
Pop, 2015, Poprac et al., 2017).
Está bien documentado el efecto antioxidante que poseen los compuestos
fenólicos de las frutillas y frambuesas (Álvarez et al., 2010, Chen et al., 2013,
De Souza et al., 2014, Mandave et al., 2014). Estas frutas biosintetizan
compuestos fenólicos con propiedades antioxidantes capaces de captar
radicales libres, restaurando el equilibrio fisiológico, siendo así importantes
para evitar el daño oxidativo y para disminuir el riesgo de sufrir enfermedades
inducidas por estrés oxidativo (García Alonso et al., 2004). Sin embargo, como
ya se dijo anteriormente, esta propiedad depende de la estructura química de
esos compuestos, de su bioaccesibilidad en el alimento y de su
biodisponibilidad en el tracto gastrointestinal. Es en este sentido que la acción
de las enzimas cinamoil esterasas pueden tener un rol importante en la acción
antioxidante de los compuestos fenólicos que se encuentran en estas frutas.
Algunos jugos de fruta han sido utilizados como vehículos de bacterias
probióticas para ampliar la oferta de alimentos funcionales, obteniendo
resultados positivos solo para ciertas frutas y ciertos géneros bacterianos, ya
que muchas cepas pierden gradualmente su viabilidad por el bajo pH y el alto
contenido de compuestos fenólicos del medio (Yoon et al., 2004, Yoon et al.,
2005, Nualkaekul y Charalampopoulos, 2011). De esta manera, el uso de leche
como base, resulta una alternativa interesante que podría mejorar la
supervivencia de las bacterias adicionadas en relación al uso de jugos de fruta
como matriz.
5
Considerando todo lo expresado, en el presente trabajo de tesis, se planteó el
objetivo de evaluar el efecto sobre las propiedades antioxidantes de leche por
el agregado de jugo mixto de frutilla y frambuesa y por la fermentación con un
Lactobacillus spp. con actividad feruloil esterasa y con un Lactobacillus spp. sin
dicha actividad.
6
OBJETIVO
Objetivo general
Estudiar el efecto sobre la actividad antioxidante in vitro de leches, por el
agregado de jugo de frutilla y frambuesa y por el proceso de fermentación con
distintas cepas de Lactobacillus spp.
Objetivos específicos
O1.- Evaluar la actividad feruloil esterasa de cepas de Lactobacillus spp. y
seleccionar las cepas a utilizar.
O2.- Determinar la concentración de jugo de frutilla y frambuesa a utilizar que
no inhiba el desarrollo de las cepas seleccionadas.
O3.- Evaluar el efecto del agregado de jugo de frutilla y frambuesa y de la
fermentación con distintas cepas de Lactobacillus spp. sobre la actividad
antioxidante in vitro de leche.
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ANTECEDENTES
En este trabajo se evaluó el efecto de la adición de un jugo mixto de frutilla y
frambuesa y de la utilización una cepa de Lactobacillus spp. con actividad
feruloil esterasa y una cepa de Lactobacillus spp. sin dicha actividad, sobre la
actividad antioxidante in vitro de leche.
En primer lugar, se seleccionó jugo mixto de frutilla y frambuesa para ser
adicionado a la leche en la que luego se evaluará el efecto de la fermentación
con distintos microorganismos sobre la actividad antioxidante del producto.
Esta elección del jugo fue basada en información bibliográfica en la que se
demuestra la actividad antioxidante de compuestos presentes en estas frutas,
tales como el ácido ascórbico y los compuestos fenólicos del tipo antocianinas
y ácidos fenólicos.
En un estudio desarrollado en la Universidad Nacional de Tucumán por Álvarez
et al. (2010), se evaluó la actividad antioxidante de las principales variedades
de frutilla cultivadas en esa región, mediante el ensayo de captación de DPPH
(radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo), obteniendo como resultado un porcentaje
de inhibición del radical del 59,99% para las frutillas Camarosa, y del 62,15%
para las Camino Real, por lo que ambas variedades de la fruta presentaron una
elevada actividad antioxidante.
En otro trabajo, llevado a cabo por Chen et al. (2013) se evaluó el contenido
total de polifenoles, flavonoides y antocianinas y la capacidad antioxidante de
15 variedades de frambuesa comercial. Los resultados permitieron agrupar las
variedades en tres grupos: el primer grupo presentó valores de 278,66 ± 31,2
mg EAG (equivalentes ácido gálico)/100g PF (peso fresco) de polifenoles
totales, 169,33 ± 45,6 mg/100g PF de flavonoides totales, 92,51 ± 14,1 mg EA
(equivalentes de antocianas)/100g PF y 819,26 ± 11,2 mg EAA (equivalentes
de ácido ascórbico)/100g PF de actividad antioxidante, el segundo grupo
contenía 572,67 ± 63,1 mg EAG/100g PF de polifenoles totales, 487,03 ± 47,7
mg/100g PF de flavonoides totales, 357,13 ± 116,4 mg EA/100g PF de
antocianas y 984,21 ± 46,0 mg EAA/100g PF de actividad antioxidante, el
último grupo contenía 256,63 ± 42,30 mg EAG/100g PF de polifenoles totales,
8
192,84 ± 47,45 mg/100g PF de flavonoides totales, 39,14 ± 15,71 mg EA/100g
PF de antocianas y 758,47 ± 50,87 mg EAA/100g PF de actividad antioxidante.
Mandave et al. (2014) evaluaron el contenido total de fenoles y la actividad
antioxidante en dos variedades de frutilla comercial, resultando un total de
207,4 ± 0,96mg EAG/g PF en frutillas Camarosa y 99,4 ± 0,16 mg EAG/g PF en
frutillas Sweet Charlie, la actividad antioxidante resultó 39,01 ± 4,92 EC50-
mg/ml DPPH y 58,05 ± 2,48 EC50-mg/ml DPPH (concentración efectiva para
lograr un 50% de inhibición) en las frutillas Camarosa y Sweet Charlie
respectivamente.
En la investigación realizada por De Souza et al. (2014) se identificaron
compuestos bioactivos y se midió la actividad antioxidante de frutillas,
frambuesas, moras, arándanos y cerezas. El contenido de compuestos
bioactivos resultó, para las frambuesas y frutillas respectivamente, 357,83 ±
7,06 y 621,92 ± 15,51mg EAG/100g PF de fenoles totales, 9,61 ± 2,15 y 38,17
± 2,76 mg CE (equivalentes de catequina)/100g PF de flavonoides, 14,69 ±
2,03 y 16,03 ± 0,50 mg de cianidina 3-glucósido/100g PF de antocianinas y
92,17 ± 10,11 y 90,13 ± 2,24 mg/100g PF de ácido ascórbico. La actividad
antioxidante mediante el ensayo de captación de DPPH dio como resultado
4960,58 ± 157,33 y 3778,94 ± 333,88 EC50-g PF/g DPPH para las frambuesas
y frutillas respectivamente.
En todos los estudios mencionados previamente, se realizaron diferentes
determinaciones in vitro de la actividad antioxidante de los frutos, resultados
que no pueden ser extrapolados a nivel fisiológico de manera directa, ya que se
deben considerar tanto la bioaccesibilidad de los compuestos antioxidantes en
el alimento como también su biodisponibilidad en el tracto gastrointestinal
(Fernández Panchón et al., 2008). Estas características dependen de
propiedades de los compuestos antioxidantes, como su tamaño molecular,
grado de conjugación, capacidad de interacción con otros compuestos,
principalmente con fibra dietaria, carbohidratos, proteínas y lípidos, entre otras.
Los ensayos in vivo para evaluar biodisponibilidad de compuestos
antioxidantes como los compuestos fenólicos, se basan en la determinación de
dichos compuestos o sus metabolitos en plasma, suero u orina en animales de
9
laboratorio. Sin embargo, el análisis de estos compuestos en fluidos biológicos
es complejo debido a sus amplias diferencias estructurales y a la gran variedad
de metabolitos generados en los procesos digestivos. Además, se requieren
técnicas analíticas específicas como la cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas para obtener datos consistentes (Cantero Soler,
2009).
Gran parte de los compuestos fenólicos se encuentran de forma insoluble,
unidos mediante enlaces éster entre los grupos hidroxilo del anillo aromático y
los grupos carboxilo de los componentes estructurales de las paredes celulares
de las plantas, como celulosa, hemicelulosa, lignina, pectinas y proteínas
(Acosta Estrada et al., 2014). Las antocianinas, por su parte, se encuentran
mayoritariamente unidas mediante enlaces glucosídicos a los azúcares,
principalmente glucosa, rutinosa y soforosa (Maatta Riihinen et al., 2004). De
esta forma, resisten la digestión estomacal e intestinal y llegan intactos al
colon, donde actúan principalmente enzimas provenientes de la microbiota
(Acosta Estrada et al., 2014).
En cuanto al procesamiento térmico del jugo utilizado, realizado con el fin de
asegurar que solo actúen las cepas adicionadas y tener un proceso de
fermentación controlado, se han realizado diversas investigaciones que tienen
diferentes resultados en cuanto a cómo se ven afectados los compuestos
fenólicos, vitaminas, antocianinas, entre otros componentes volátiles.
En el trabajo de Sánchez Franco et al. (2015) se elaboraron diferentes jugos de
mora: control (sin tratar), pasteurizado (70°C durante 30 minutos) y
termoultrasonicado (45°C durante 25 minutos), y se evaluó en cada uno el
contenido de ácido ascórbico, fenoles totales, antocianinas y la actividad
antioxidante. Los resultados mostraron que el ácido ascórbico disminuyó un
24% en el termoultrasonido y un 9% con el pasteurizado. Por otro lado, los
compuestos fenólicos aumentaron con ambos tratamientos, un 39% con
termoultrasonido y 9% con pasteurización. El contenido de antocianinas
aumentó un 11,3% con termoultrasonido y disminuyó un 11% con el
pasteurizado. La actividad antioxidante aumentó un 15,5% en el pasteurizado y
un 132% en el termoultrasonido.
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En la investigación de Málaga Barreda et al. (2013), se estudió el efecto del
procesamiento (pulpeado, estandarizado y pasteurizado) de aguaymanto sobre
la concentración de algunos compuestos bioactivos y sobre la actividad
antioxidante. Los valores obtenidos demuestran una reducción de todos los
componentes estudiados luego del tratamiento, aunque no resulta una
destrucción significativa. El ácido ascórbico se redujo de 24,21 a 18,91mg/100g
y los compuestos fenólicos de 58,6 a 48,93mg EAG/100g. La actividad
antioxidante tuvo una retención del 92%, disminuyendo de 4,12 a 3,78 µmol TE
(equivalentes de Trolox)/g.
En otro trabajo, Arozarena et al. (2014) estudiaron el efecto de la
pasteurización sobre un jugo a base de moras, frutillas, tomate y remolacha.
Los resultados demostraron una reducción de los compuestos evaluados y una
modificación del color hacia intensidades más bajas y tonalidades menos
rojizas. La pasteurización produjo una disminución del contenido de
antocianinas del 9%, y un descenso del 15% del contenido de polifenoles
totales.
Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente con respecto a la
biodisponibilidad de los compuestos fenólicos, en el presente estudio se
consideró la posibilidad de utilizar cepas de Lactobacillus spp. con actividad
FE, como agentes fermentadores de la leche con adición de jugo mixto de
frutilla y frambuesa. Esta enzima cataliza la liberación de ácidos
hidroxicinámicos esterificados de la pared celular en vegetales, lo que podría
contribuir a modificar la capacidad antioxidante del producto.
En la investigación realizada por Liu et al. (2016), se analizaron un total de 33
cepas de Lactobacillus spp. para determinar cuáles presentaban actividad FE,
utilizando placas de agar suplementadas con etil ferulato (EtF). Doce de las
muestras estudiadas demostraron actividad FE, siendo el Lactobacillus
fermentum (NRRL B-1932) la cepa que demostró la mayor actividad.
También, en el trabajo de tesis doctoral de Russo (2018), realizada en la
Facultad de Bioquímica Química y Farmacia de la Universidad Nacional de
Tucumán, se evaluó la actividad feruloil esterasa de cepas de bacterias lácticas
de la Colección de Cultivos del Centro de Referencia para Lactobacilos
(CERELA, Tucumán). De las 40 cepas evaluadas, solo 12 mostraron actividad
11
FE: 2 L. acidophilus, 4 L. fermentum, 1 L. helveticus, 1 L. johnsonii, 1 L.
mucosae, 2 L. plantarum y 1 L. reuteri.
Además, en un trabajo llevado a cabo en la Universidad Nacional de Cuyo,
Mendoza, Bolondi y Márquez (2018) evaluaron algunas propiedades
probióticas in vitro e in vivo de 10 cepas de Lactobacillus spp. aisladas de
quesos y leches caprinas, y solo L. johnsonii CRL 1231 y L. fermentum CRL
1446.2 manifestaron actividad FE.
Por otra parte, en los últimos años se ha registrado un aumento en el número
de estudios relacionados con el posible metabolismo de compuestos fenólicos
por parte de algunas especies del género Lactobacillus. Si bien los estudios
siguen siendo escasos, se ha evidenciado que la presencia de estos
microorganismos produce algunas variaciones sobre las características
organolépticas, fundamentalmente el color y aroma, como también en otras
propiedades de los productos, los cuales dependen de la especie utilizada para
la fermentación.
Bloem et al. (2007), estudiaron el crecimiento de L. brevis, L. hilgardii, L.
plantarum, Oenococcus oeni, y Pediococcus damnosus en presencia de
diversos ácidos fenólicos y derivados: ácido ferúlico, ácido vanílico,
coniferaldehído, eugenol e isoeugenol, tanto como su capacidad para
metabolizarlos. En general, todas las cepas utilizadas redujeron la vainillina a
su correspondiente alcohol vanílico. Este resultado confirmó que el
metabolismo de algunas bacterias lácticas produce modificaciones sobre los
ácidos fenólicos, pudiendo producir cambios organolépticos al liberar,
compuestos volátiles que pueden contribuir al aroma de los productos
fermentados.
Por otro lado, Spano et al. (2005) estudiaron la modificación del metabolismo
bacteriano por variaciones abióticas en la matriz donde se desarrollan.
Evaluaron la capacidad de algunas bacterias ácido lácticas para hidrolizar
glicoconjugados (terpenos, fenoles y alcoholes) durante la fermentación,
analizando la expresión del gen de la β-glucosidasa aislado de cepas de L.
plantarum, L. paraplantarum, L. pentosus, Pediococcus damnosus y O. oeni,
bajo tensiones abióticas. Se concluyó que el gen está regulado por tensiones
12
abióticas como la temperatura, el etanol, los sulfitos y el pH, afectando el
metabolismo de estas cepas.
En cuanto a la modificación de otras propiedades, Suazo Mercado (2012)
evaluó el efecto de la fermentación sobre la concentración polifenólica,
actividad antioxidante y el color de tres muestras de semillas de cacao
Nicaragüense de una misma variedad (Trinitario), una sin fermentar y dos
fermentadas. El resultado demuestra que la fermentación afecta negativamente
a ambos parámetros, ya que el contenido de polifenoles se redujo desde 115 ±
2 mg/L, en la muestra sin fermentar, hasta 56 ± 2 mg/L y 43 ± 1 mg/L, en las
muestras fermentadas, y la actividad antioxidante disminuyó desde 709 ± 17
μmol de Trolox/L, muestra sin fermentar, hasta 154 ± 8 μmol de Trolox/L y 124
± 4 μmol de Trolox/L en las muestras fermentadas, esto se debe a que los
microorganismos hidrolizan los polifenoles del cacao, principalmente
antocianinas, para liberar ácidos volátiles que mejoran su sabor y aroma. En
cuanto al color, la muestra sin fermentar presenta una tonalidad violeta intensa,
debida a las flavonoides y antocianinas, y las semillas fermentadas son menos
rojizas y más marrones, ya que las diversas reacciones bioquímicas oxidan
estos compuestos.
Zapata Bustamante et al. (2013) estudiaron el efecto de la fermentación sobre
la concentración de fenoles totales y antocianinas y la actividad antioxidante de
5 variedades de cacao colombiano. Luego de la fermentación, en dos
variedades de cacao la concentración de fenoles y la actividad antioxidante
disminuyeron desde 37,98 ± 0,9 a 27,46 ± 3,3mg/g los fenoles y de 367,8 ± 15,
3 µmol.g-1 a 278,13 ± 5,4 µmol.g-1 la actividad antioxidante, en otras dos
aumentaron de 29,08 ± 8,9mg/g a 42,73 ± 10,6mg/g y de 362,06 ± 3,3 µmol.g-1
a 464,64 ± 22 µmol.g-1 respectivamente y en una variedad se mantuvieron
estables. El contenido de antocianinas disminuyó en todas las muestras desde
1,22 ± 0,3mg/g a 0,68 ± 0,3mg/g. Los autores concluyeron que, las pérdidas de
fenoles totales son debidas a que pueden acomplejarse con proteínas,
polisacáridos y alcaloides del cacao durante la fermentación, y el incremento se
produce por la formación de proantocianidinas poliméricas (taninos). La
reducción del contenido de antocianinas se produjo debido a que durante la
fermentación las enzimas microbianas hidrolizan el enlace glicosídico,
13
produciendo azúcar y aglicona. Finalmente, los cambios en la actividad
antioxidante están directamente relacionados con las modificaciones
mencionadas.
14
MARCO LEGAL
Código Alimentario Argentino
El Código Alimentario Argentino (CAA), Ley 18.284/69, Decreto Reglamentario
2126/71, establece en el Capítulo VIII sobre Alimentos Lácteos, actualizado el
3/2019, las siguientes especificaciones para leches fermentadas:
Art. 576 - (Resolución Conjunta SPRyRS y SAGPyA N° 33/2006 y N° 563/2006)
1) “Se entiende por Leches Fermentadas los productos, adicionados o no de
otras sustancias alimenticias, obtenidos por coagulación y disminución del pH
de la leche o leche reconstituida, adicionada o no de otros productos lácteos,
por fermentación láctica mediante la acción de cultivos de microorganismos
específicos. Estos microorganismos específicos deben ser viables, activos y
abundantes en el producto final durante su período de validez.”
1.2) “Se entiende por Leche Fermentada o Cultivada el producto incluido en la
definición 1) cuya fermentación se realiza con uno o varios de los siguientes
cultivos: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium sp.,
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus y/u otras bacterias acidolácticas
que, por su actividad, contribuyen a la determinación de las características del
producto terminado.”
2) Clasificación:
a) De acuerdo con el contenido de materia grasa, las leches fermentadas se
clasificarán en:
• Con Crema. Aquéllas cuya base láctea tenga un contenido de materia grasa
mínimo de 6,0g/100 g.
• Enteras o Integrales. Aquéllas cuya base láctea tenga un contenido de
materia grasa máximo de 5,9g/100g y mínimo de 3,0g/100 g.
• Parcialmente descremadas. Aquéllas cuya base láctea tenga un contenido de
materia grasa máximo de 2,9g/100 g y mínima de 0,6g/100g.
• Descremadas. Aquéllas cuya base láctea tenga un contenido de materia
grasa máximo de 0,5g/100 g.
b) Cuando en su elaboración se han adicionado ingredientes opcionales no
lácteos, antes, durante o después de la fermentación, hasta un máximo de 30%
m/m, se clasifican como leches fermentadas con agregados.
15
3) En la elaboración de las leches fermentadas se utilizarán:
a) Ingredientes obligatorios: Leche o leche reconstituida estandarizada en su
contenido de materia grasa. Cultivos de bacterias lácticas. Cultivos de bacterias
lácticas específicas, según corresponda a las definiciones establecidas en 1.1),
1.2), 1.2.1), 1.3), 1.4) y 1.5).
b) Ingredientes opcionales: Leche concentrada, crema, manteca, grasa anhidra
de leche o butteroil, leche en polvo, caseinatos alimenticios, proteínas lácteas,
otros sólidos de origen lácteo, sueros lácteos, concentrados de sueros lácteos.
Frutas en forma de pedazos (trozos), pulpa, jugo u otros preparados a base de
frutas. Otras sustancias alimenticias tales como miel, coco, cereales, vegetales,
frutas secas, chocolate, especias, café, otras, solas o combinadas.
Cultivos de bacterias lácticas subsidiarias.
Azúcares y/o glúcidos (excepto polisacáridos y polialcoholes). Maltodextrinas.
Almidones o almidones modificados en una proporción máxima de 1% (m/m)
del producto final. Los ingredientes opcionales no lácteos, solos o combinados
deberán estar presentes en una proporción máxima del 30% (m/m) del
producto final.
5) Las leches fermentadas deberán responder a los siguientes requisitos:
5.1) Características sensoriales:
• Aspecto: Consistencia firme, pastosa o semisólida, líquida.
• Color: Blanco o de acuerdo con la o las sustancias alimenticias y/o
colorante(s) adicionadas.
• Sabor y olor: Característico o de acuerdo con la o las sustancias alimenticias
y/o aromatizantes/saborizantes adicionadas. Método de toma de muestra: FIL
50 C: 1999.
5.2) Requisitos físico-químicos:
5.2.1) Las leches fermentadas definidas en 1) deberán cumplir los requisitos
físico-químicos consignados en la tabla:
Materia Grasa Láctea (g/100 g)
Norma FIL 116A:1987
Con Crema Mín. 6.0
Enteras o Integrales 3,0 a 5,9
Parcialmente descremadas 0,6 a 2,9
Descremadas Máx. 0,5
Acidez (g de ácido láctico/100 g) 0,6 a 2,0
16
Norma FIL 150:1991
Proteínas lácteas (g/100 g) Mín. 2,9
5.3) Las leches fermentadas deberán cumplir con el siguiente requisito durante
su período de validez:
Recuento de bacterias lácticas totales (UFC/g). Norma FIL 117A:1988: Mín. 106
5.7) Tratamiento térmico:
Las leches fermentadas no deberán ser sometidas a ningún tratamiento térmico
luego de la fermentación. Los microorganismos de los cultivos utilizados deben
ser viables y activos y estar en concentración igual o superior a la consignada
en el inciso 5.3) en el producto final y durante su período de validez.
7) Las leches fermentadas deberán conservarse y comercializarse a una
temperatura no superior a 10°C.
8) El rotulado de las Leches Fermentadas deberá efectuarse en conformidad
con las siguientes exigencias:
9.4) El producto definido en 1.2) se designará "Leche Fermentada" o "Leche
Cultivada" o bien "Leche Fermentada Natural" o "Leche Cultivada Natural"
mencionando las expresiones "con crema", "entera" o "integral", "parcialmente
descremada" o "descremada" según corresponda de acuerdo con los incisos
2.a) y 5.2) del presente artículo. Podrá ser mencionada la presencia de
bifidobacterias siempre que se cumpla con lo establecido al respecto en el
inciso 5.3) del presente artículo.
9.5) El producto definido en 1.2) que corresponda a la clasificación del inciso
2.b) se designará "Leche Fermentada con..." o "Leche Cultivada con…",
llenando el espacio en blanco con el nombre de la o las sustancias alimenticias
adicionadas que otorgan al producto sus características distintivas.
Códex Alimentarius
El Códex Alimentarius, desarrollado por la Comisión del Codex Alimentarius,
establece en la Norma para leches fermentadas (CXS 243-2003) las siguientes
especificaciones (FAO y OMS, 2010):
1. Ámbito
17
Esta norma se aplica a las leches fermentadas, es decir, la Leche Fermentada
incluyendo las Leches Fermentadas Tratadas Térmicamente, las Leches
Fermentadas Concentradas y los productos lácteos compuestos basados en
estos productos, para consumo directo o procesamiento ulterior.
2. Descripción
La leche fermentada es un producto lácteo obtenido por medio de la
fermentación de la leche, que puede haber sido elaborado a partir de productos
obtenidos de la leche con o sin modificaciones en la composición según las
limitaciones de lo dispuesto en la Sección 3, por medio de la acción de
microorganismos adecuados y teniendo como resultado la reducción del pH
con o sin coagulación (precipitación isoeléctrica).
Estos cultivos de microorganismos serán viables, activos y abundantes en el
producto hasta la fecha de duración mínima. Si el producto es tratado
térmicamente luego de la fermentación, no se aplica el requisito de
microorganismos viables.
3. Composición
Proteína láctea mín. 2,7% p/p
Grasa láctea menos del 10% p/p
Acidez valorable (% de ácido láctico) mín. 0,3% p/p
Suma de microorganismos mín. 107 UFC/g
Microorganismos etiquetados mín. 106 UFC/g
18
MATERIALES Y MÉTODOS
A continuación se describen los materiales y métodos utilizados en el desarrollo
del trabajo experimental de la tesis, distribuidos de acuerdo a los objetivos
específicos definidos previamente.
O1.- Evaluar la actividad feruloil esterasa de cepas de Lactobacillus spp. y
seleccionar las cepas a utilizar
a) Cepas de lactobacilos y determinación de la actividad feruloil esterasa
Para la selección de las cepas a utilizar en los ensayos posteriores, se evaluó
la presencia de actividad feruloil esterasa en 3 cepas bacterianas: Lactobacillus
acidophilus (provisto por Sacco, Italia), Lactobacillus fermentum CRL 973
(aislada de remolacha) y Lactobacillus plantarum (aislada de cerdos). La cepa
L. fermentum pertenece a la Colección de Cultivos del Centro de Referencia
para Lactobacilos (CERELA, Tucumán), y se utilizó como control positivo,
debido a que tiene actividad FE demostrada (Russo, 2018).
En primer lugar, se cultivó cada una de las cepas en 4ml de caldo Man Rogosa
Sharpe (MRS, Biokar Diagnostics, Francia) a 37 ± 1°C (estufa Faeta,
Argentina) durante 8 horas.
Luego, la actividad FE se determinó sembrando por estrías el cultivo de cada
cepa en placas con medio MRS agarizado, sin glucosa y suplementado con 4,5
mM de etil ferulato (EtF, Sigma Aldrich, Estados Unidos). Las placas fueron
incubadas a 37 ± 1°C en microaerofilia (candle jar system) y se las monitoreó
cada 24 horas durante 3 días. La actividad FE positiva, se evidenció por la
formación de un halo claro alrededor de la zona de crecimiento bacteriano (Liu
et al., 2016).
O2.- Determinar la concentración de jugo de frutilla y frambuesa a utilizar
que no inhiba el desarrollo de las cepas seleccionadas
En el presente trabajo se utilizó un jugo mixto de frutilla y frambuesa con pulpa,
provisto por la empresa Sendero Azul, ubicada en Coronel Suarez, Provincia
de Buenos Aires, la cual distribuye en la ciudad de Tandil sus jugos naturales,
sin conservantes ni colorantes.
19
a) Evaluación de la esterilidad del jugo
Se evaluó la esterilidad del jugo comercial, de manera de garantizar que no
aporte carga microbiana en el proceso de fermentación. Para ello, se sembró
una muestra de jugo en profundidad en medios MRS y PCA (Plate Count Agar,
Biokar Diagnostics, Francia) a 37 ± 1°C, y en medio YGC (Extracto de
levadura, Glucosa y Cloranfenicol, Biokar Diagnostics, Francia) a 30 ± 1°C,
incubando en todos los casos durante 48 horas.
b) Preparación de la base láctea y obtención de los inóculos de los starters
seleccionados.
Para los ensayos se mezcló leche parcialmente descremada (La Serenísima,
Mastellone hermanos) conteniendo 1% de materia grasa, y leche en polvo
descremada (Svelty move, Nestlé) con 0% de materia grasa, para alcanzar un
13% de sólidos totales (De la Cruz Huaman, 2011). Esta base láctea se
esterilizó durante 15 minutos a 0,5 atm (110°C). Ensayos previos permitieron
determinar el proceso de esterilización necesario para evitar el desarrollo de
otros microorganismos diferentes de las cepas starters seleccionadas durante
la fermentación, y favorecer la precipitación de una fracción de las proteínas del
suero para mejorar la consistencia del producto final.
Los inóculos de los microorganismos starters a utilizar se prepararon, en cada
caso, agregando 100 µL del correspondiente cultivo activo con 8 horas de
crecimiento con DO600 ~ 1 (Espectrofotómetro UV-Vis Pharmacia LKB biochrom
limited, Ultrospect III, Inglaterra) a 5 ml de base láctea estéril, incubando luego
a 37 ± 1°C durante 20 horas.
c) Determinación de la concentración de jugo mixto de frutilla y frambuesa a
adicionar
Para determinar la posible inhibición del jugo sobre el desarrollo de las cepas
seleccionadas, se adicionaron distintas concentraciones del jugo a muestras de
base láctea inoculadas y se evaluó la disminución del pH en cada caso durante
la fermentación, considerando el grado de acidificación alcanzado, como
criterio para establecer el nivel de inhibición de crecimiento microbiano.
Para cada cepa seleccionada se realizaron 5 ensayos partiendo de base láctea
estéril conteniendo, respectivamente, 0%, 5,6%, 11,1% 16,7% y 22,2% de jugo
20
mixto de frutilla y frambuesa estéril y un 2% del inóculo del starter
correspondiente. Las muestras se incubaron luego a 37°± 1°C durante 8 horas,
haciendo mediciones de pH inicial y cada 90 min (Checker Hi981030, Hanna,
China). El final de la incubación se determinó al llegar a pH cercano a 5,5 para
evitar la coagulación de las proteínas lácteas. Al finalizar el tiempo de
fermentación, las muestras se refrigeraron a 4 ± 1°C para detener la acción del
starter. Pasadas 24 horas se realizó una nueva medición de pH para evaluar
estabilidad del producto.
O3.- Evaluar el efecto del agregado de jugo de frutilla y frambuesa y de la
fermentación con distintas cepas de Lactobacillus spp. sobre la actividad
antioxidante in vitro de leche.
a) Elaboración de muestras
Utilizando la base láctea estéril con el % de jugo de frutilla y frambuesa
determinado como óptimo en el ensayo anterior, se preparó una muestra para
cada cepa seleccionada agregando un 2% del inóculo del starter
correspondiente. Se incubaron a 37 ± 1°C midiendo pH inicial y cada 2 horas
hasta el final de la incubación, que se determinó al llegar a pH cercano a 5,5
para evitar la coagulación de las proteínas lácteas. En cada muestra, se realizó
recuento inicial y final de microorganismos en medio MRS agarizado,
sembrando en profundidad e incubando en microaerofilia a 37 ± 1°C durante 48
horas.
Por otro lado, utilizando la misma base láctea estéril y el % de jugo de frutilla y
frambuesa seleccionado, se prepararon otras muestras según el siguiente
diseño experimental:
- Una muestra sin fermentos incubada a 37 ± 1°C
- Una muestra sin fermentos incubada a 4 ± 1°C
- Una muestra de base láctea para cada cepa seleccionada con 2% del
inóculo del starter correspondiente, sin jugo, incubadas a 37 ± 1°C
- Una muestra para cada cepa seleccionada, con agua destilada estéril y
jugo, sin base láctea, incubadas a 37 ± 1°C
- Una muestra con agua destilada estéril y jugo, sin fermentos
(reemplazados por 900 µl de base láctea estéril), incubada a 37 ± 1°C
21
- Una muestra con agua destilada estéril y jugo, sin fermentos
(reemplazados por 900 µl de base láctea estéril), incubada a 4 ± 1°C
En este caso, las muestras fueron incubadas durante 20 horas, se midió pH
inicial y final, y se realizó el recuento final de microorganismos en medio MRS
agarizado.
b) Medición de actividad antioxidante in vitro
En todas las muestras elaboradas se midió la actividad antioxidante in vitro
mediante el ensayo de captación de DPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo)
(Molyneux, 2004), el cual evalúa la capacidad que tiene un posible antioxidante
para neutralizar un radical.
El compuesto DPPH es un radical estable que presenta una intensa coloración
violeta y absorbe a 517nm. En el ensayo se determina la concentración inicial
de DPPH y la concentración resultante una vez que se ha añadido el posible
antioxidante, por lo que, una reducción del valor de absorbancia se traduce en
una disminución de la concentración del radical debido a la cesión de
electrones por parte de la especie antioxidante.
Para realizar la medición se mezclaron 20μL de cada muestra con 500μl de
metanol, se centrifugó a 8000 rpm durante 5 minutos en microcentrífuga
(D2012, DragonLab, China) y se agregaron 500μl de una solución metanólica
100 μM de DPPH (Sigma Aldrich, Estados Unidos). Se midió la absorbancia
(Abs) inicial (t0) y final (t30) a 517nm en espectrofotómetro, incubando en
oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos entre cada medición.
Finalmente, la actividad antioxidante se calculó por la disminución de la
absorbancia mediante la siguiente ecuación (Huang et al., 2005):
% Inhibición de radicales DPPH = [(Abs (t0) – Abs (t30)) / Abs (t0)] x 100
c) Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el programa InfoStat, versión 2010,
desarrollado por el grupo InfoStat FCA, de la Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina. Se utilizó para determinar diferencias significativas entre las
mediciones de actividad antioxidante in vitro, realizando un test-t de Student
para muestras pareadas (p< 0,05).
22
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El resultado obtenido demuestra que el agregado de jugo mixto de frutilla y
frambuesa aumenta la actividad antioxidante de la base láctea, mientras que el
proceso de fermentación con ambas cepas de lactobacilos,
independientemente de presentar o no actividad feruloil esterasa, la disminuye.
O1.- Evaluar la actividad feruloil esterasa de cepas de Lactobacillus spp. y
seleccionar las cepas a utilizar
a) Cepas de lactobacilos y determinación de la actividad feruloil esterasa
De las 3 cepas de lactobacilos estudiadas (una de uso comercial y dos de uso
experimental), solo mostró actividad FE la proveniente de la colección del
CERELA: L. fermentum CRL 973. Si bien fue utilizada como control positivo en
este ensayo (dado que existen trabajos previos que demuestran la presencia
de la actividad FE), es de destacar que los resultados obtenidos aquí plantean
la posibilidad de un potencial uso comercial de este microorganismo en casos
donde dicha actividad enzimática pueda aportar un beneficio adicional en
productos lácteos fermentados, situación que no sería viable para la cepa de
uso industrial testeada.
En la Figura 1 se distingue el halo de inhibición alrededor de la cepa L.
fermentum, y la ausencia de éste alrededor del crecimiento de L. plantarum,
indicativo de la incapacidad de este microorganismo para hidrolizar ésteres de
ácidos hidroxicinámicos. La cepa L. acidophilus fue descartada debido a que no
se observó crecimiento en la placa suplementada con EtF.
23
Figura 1: Halos de inhibición de las cepas L. fermentum CRL 973 [1]; L. plantarum [2] y
L. acidophilus [3].
Los resultados de esta tesis, están en concordancia con los obtenidos por Liu
et al. (2016), donde L. fermentum resultó la cepa con mayor actividad FE, y con
los de la tesis de Russo (2018), quien demostró actividad FE en 4 cepas de L.
fermentum, incluyendo la cepa CRL 973 de la Colección de Cultivos del
CERELA.
Finalmente se seleccionó la cepa L. fermentum, con actividad FE, y la cepa L.
plantarum, sin actividad.
O2.- Determinar la concentración del jugo de frutilla y frambuesa a utilizar
que no inhiba el desarrollo de las cepas seleccionadas
a) Evaluación de la esterilidad del jugo
Como se indica en materiales y métodos, se realizó la siembra del jugo en
medios MRS, YGC y PCA para evaluar su esterilidad. Solo se obtuvo
crecimiento de una unidad formadora de colonia en el medio MRS (Figura 2).
Teniendo en cuenta este resultado, se decidió esterilizar el jugo a 0,5 atm
(110°C) durante 15 minutos para asegurar que durante la fermentación del
producto solo actúen las cepas starters seleccionadas.
1
2
3
24
Figura 2: jugo sembrado en MRS (izquierda), YGC (centro) y PCA (derecha)
Considerando que se aplica un tratamiento térmico al jugo de frutilla y
frambuesa, previo a su uso en los ensayos de fermentación de la base láctea
con agregado del mismo, y que además se quiere evaluar la actividad
antioxidante de los productos, se hace necesario considerar el efecto que
podría tener la temperatura sobre los compuestos fenólicos antioxidantes que
aporta el ingrediente de origen vegetal. Existen algunas controversias en
cuanto a cómo afecta el tratamiento térmico a los compuestos fenólicos.
Sánchez Franco et al. (2015) demostraron que luego de la pasteurización de un
jugo de moras, el contenido de fenoles totales aumenta un 9% y la actividad
antioxidante un 15%, por otro lado, el contenido de ácido ascórbico disminuye
un 9%, y el de antocianinas un 11%; Málaga Barreda et al. (2013) observaron
que la producción de puré de aguaymanto disminuyó el contenido de ácido
ascórbico (21,9%), fenoles totales (16,6%) y actividad antioxidante (8%),
Arozarena et al. (2014) comprobaron que la pasteurización de un jugo de mora,
fresa, tomate y remolacha, disminuyó el contenido de antocianinas un 9% y los
fenoles totales un 15%.
En el presente trabajo, teniendo en cuenta que en todas las muestras se utilizó
un lote único de jugo de frutilla y frambuesa esterilizado bajo condiciones
relativamente moderadas, este tratamiento térmico no se consideró como un
factor que pudiera afectar en distinto grado los valores de actividad antioxidante
de los productos obtenidos.
b) Preparación de la base láctea y obtención de los inóculos de los starters
seleccionados.
En la siguiente imagen se pueden observar cada uno de los starters inoculados
en 5 ml de base láctea estéril, luego de 20 horas de incubación.
25
Figura 3: inóculo de L. fermentum a la izquierda, inóculo de L. plantarum a la derecha
c) Determinación de la concentración de jugo mixto de frutilla y frambuesa a
adicionar
En la siguiente imagen se pueden observar las muestras obtenidas al mezclar
la base láctea estéril con las diferentes concentraciones de jugo usadas,
inoculadas con la cepa L. fermentum, antes de la fermentación.
Figura N 4: base láctea con jugo de frutilla y frambuesa al 22,2% (A), 16,7% (B),
11,1% (C), 5,6% (D) y 0% (E)
A B C D E
26
Las Figuras 5 y 6, muestran la variación del pH de la base láctea con agregado
de distintas cantidades de jugo de frutilla y frambuesa, en función del tiempo
de fermentación con L. fermentum y L. plantarum, respectivamente. Puede
observarse que para ambas cepas, e independientemente del % de jugo
agregado en cada caso, se produjo la acidificación del medio, lo que revela que
el jugo no inhibió el crecimiento de los microorganismos a ninguna de las
concentraciones de jugo ensayadas. Por otro lado, para cada una de las cepas,
se evidenció la misma variación del pH entre el comienzo y el final del proceso
de fermentación, para todas las concentraciones de jugo estudiadas. En el
caso de L. fermentum dicha variación resultó de 0,2 ± 0,01, mientras que para
L. plantarum la misma fue de 0,6 ± 0,03. Este resultado demuestra que esta
última cepa presentó mayor capacidad de acidificación, y por ende de
formación de ácido láctico en el medio. Dados los menores valores de pH
alcanzados al utilizar un 22,2% de jugo durante la fermentación con ambas
cepas, se seleccionó este valor para los subsiguientes ensayos.
Figura N 5: curvas de pH en las leches fermentadas con L. fermentum
27
Figura N 6: curvas de pH en las leches fermentadas con L. plantarum
Durante la fermentación se pudo observar que la intensidad del color rosado
inicial de todas las muestras adicionadas con el jugo disminuía hasta el color
de la base láctea, igualando la muestra sin agregado de jugo. En las muestras
fermentadas con el L. plantarum, esta modificación se produjo después de
aproximadamente 3 horas, en cambio en las inoculadas con L. fermentum,
sucedió hacia el final de la fermentación (6 horas).
Esto puede deberse a la acción bacteriana, si bien el metabolismo de los
compuestos fenólicos por parte de Lactobacillus spp. aún no está
completamente estudiado, los trabajos de varios autores evidencian que
algunas especies de este género bacteriano tienen la capacidad de provocar
diferentes variaciones organolépticas en los alimentos fermentados, como la
reducción de la intensidad del color. Según estos autores, este proceso se
debe a reacciones de oxidación sobre las antocianinas y flavonoides (Bloem et
al., 2007, Suazo Mercado, 2012).
Como se muestra en la Tabla 1, en el caso de la fermentación con L.
fermentum no se produjeron diferencias significativas en el valor de pH al final
de la fermentación y a las 24 horas a 4 °C, para todas las concentraciones de
jugo utilizadas. En cambio, en la fermentación con L. plantarum, luego del
28
período de refrigeración, el pH resultó menor respecto del valor registrado al
final de la fermentación, para todas las concentraciones de jugo utilizadas,
resultado que evidencia que este microorganismo continúa su crecimiento bajo
refrigeración.
Tabla 1: pH al final de la fermentación y a las 24 horas a 4°C.
% de jugo agregado
a la base láctea
L. fermentum L. plantarum
pH final
fermentación
pH 24 h
a 4°C
pH final
fermentación
pH 24 h
a 4°C
0 6,38 ± 0,01 6,38 ± 0,02 6,00 ± 0,01 6,00 ± 0,03
5,6 6,29 ± 0,02 6,30 ± 0,01 5,88 ± 0,03 5,82 ± 0,02
11,1 6,17 ± 0,01 6,17 ± 0,02 5,75 ± 0,02 5,67 ± 0,01
16,7 6,06 ± 0,03 6,06 ± 0,02 5,62 ± 0,01 5,52 ± 0,02
22,2 5,96 ± 0,02 5,96 ± 0,01 5,51 ± 0,01 5,35 ± 0,03
O3.- Evaluar el efecto del agregado de jugo de frutilla y frambuesa y de la
fermentación con distintas cepas de Lactobacillus spp. sobre la actividad
antioxidante in vitro de leche.
a) Elaboración de muestras
En las siguientes figuras pueden observase cada uno de los tipos de muestra
preparadas para este ensayo, siguiendo el diseño experimental detallado en la
sección de Materiales y Métodos.
29
Figura 7: Base láctea con jugo y el inóculo de cada starter (a la izquierda); base láctea
sin jugo, con el inóculo de cada starter (a la derecha), antes de iniciar fermentación.
Figura 8: Agua con jugo sin inóculos (a la izquierda); base láctea con jugo sin inóculos
(a la derecha).
30
Figura 9: Agua con jugo y el inóculo de cada starter, L. fermentum a la izquierda y L.
plantarum a la derecha.
En la Tabla 2 se muestran las mediciones de pH en las muestras elaboradas
con base láctea, 22% de jugo mixto de frutilla y frambuesa y 2% de inóculo de
cada starter desde el inicio de la fermentación y cada 2 horas, durante 6 horas
en la fermentación con L. fermentum, y durante 4 horas en la fermentación con
L. plantarum. Los resultados permitieron evidenciar que ambas cepas
acidificaron a niveles que se correspondieron con los valores de pH esperados.
Tabla 2: Valores de pH durante la fermentación con ambos microorganismos.
MUESTRAS Tiempo (h)
0 2 4 6
L. fermentum 5,92 ± 0,02 5,85 ± 0,05 5,78 ± 0,03 5,73 ± 0,01
L. plantarum 5,87 ± 0,04 5,74 ± 0,03 5,4 ± 0,02 -
En el resto de las muestras utilizadas en esta tesis, las cepas también lograron
la acidificación deseada, observando que pueden resistir el pH ácido.
Tabla 3: pH inicial y final de todas las muestras preparadas.
MUESTRAS pH
INICIAL FINAL
Base láctea con jugo y L. fermentum 6 ± 0,14 5,7 ± 0,05
Base láctea con jugo y L. plantarum 5,94 ± 0,18 5,42 ± 0,08
31
Base láctea con jugo sin cepa (incubada a 37°C) 5,83 ± 0,03 6,03 ± 0,05
Base láctea con jugo sin cepa (mantenida a 4°C) 5,82 ± 0,02 6,01 ± 0,07
Base láctea sin jugo con L. fermentum 6,48 ± 0,09 6,3 ± 0,07
Base láctea sin jugo con L. plantarum 6,45 ± 0,1 6,02 ± 0,05
Agua con jugo y L. fermentum 3,7 ± 0,2 3,12 ± 0,02
Agua con jugo y L. plantarum 3,6 ± 0,43 3 ± 0,04
Agua con jugo sin cepa (incubada a 37°C) 4,11 ± 0,18 4,30 ± 0,07
Agua con jugo sin cepa (mantenida a 4°C) 4,12 ± 0,15 4,24 ± 0,02
En la Tabla 4 pueden observarse los recuentos obtenidos a partir de las
siembras de cada muestra al final de la incubación en medio MRS agarizado.
En todos los casos los resultados obtenidos se encontraron dentro de lo
establecido tanto por el C.A.A. como el Códex Alimentarius para leches
fermentadas (mínimo de 106 UFC/ml), y se lograron valores superiores. En las
muestras se sembró inicialmente un 2% de inóculo de cada starter, que
contenían 3,14 ± 1,6 .108 UFC/ml (L. fermentum), y 1,4 ± 0,3 .109 UFC/ml (L.
plantarum).
Tabla 4: recuento bacteriano
MUESTRAS UFC/ml
Base láctea con jugo y L. fermentum 3 ± 1,8 .107
Base láctea con jugo y L. plantarum 5,7 ± 0,9 .108
Base láctea sin jugo con L. fermentum 7,4 ± 1,5 .106
Base láctea sin jugo con L. plantarum 5,4 ± 2 .108
Agua con jugo y L. fermentum 1 ± 0,5 .106
Agua con jugo y L. plantarum 2,8 ± 0,9 .107
b) Medición de actividad antioxidante in vitro
La mayor actividad antioxidante in vitro se obtuvo en las muestras sin fermentar
con agregado de jugo de frutilla y frambuesa (61,9 ± 8,9%); se evidencia que
existe una diferencia estadísticamente significativa (p<0,05) con respecto a las
muestras sin agregado de jugo (10,05 ± 2,5%).
32
En la Tabla 5 pueden observarse los valores de actividad antioxidante
obtenidos en las diferentes muestras analizadas.
Tabla 5: actividad antioxidante
MUESTRAS % Inhibición de radicales
Base láctea 10,05 ± 2,5
Base láctea con jugo y L. fermentum 34,41 ± 8,2
Base láctea con jugo y L. plantarum 36,87 ± 7,0
Base láctea con jugo sin cepa (incubada a 37°C) 61,65 ± 8,7
Base láctea con jugo sin cepa (mantenida a 4°C) 62,08 ± 9,2
Base láctea sin jugo con L. fermentum 12,84 ± 4,9
Base láctea sin jugo con L. plantarum 13,91 ± 5,9
Agua con jugo y L. fermentum 53,12 ± 4,0
Agua con jugo y L. plantarum 53,54 ± 5,4
Agua con jugo sin cepa (incubada a 37°C) 46,38 ± 2,4
Agua con jugo sin cepa (mantenida a 4°C) 51,98 ± 7,0
En cuanto a las posibles variables planteadas, se demuestra que:
La temperatura de incubación no modifica la actividad antioxidante; ya
que no existe una diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) entre
las muestras sin fermentar que se mantuvieron en la heladera (62,08 ±
9,2%) y las que se sometieron a incubación (61,65 ± 8,7%), también sin
fermentar.
La fermentación de ambas cepas reduce la actividad antioxidante in
vitro, esto se demuestra con una diferencia estadísticamente significativa
(p<0,05) entre las muestras preparadas con base láctea y jugo sin
fermentar (61,65 ± 8,7%), y aquellas que tienen agregado de fermentos
(34,41 ± 8,2% y 36,87 ±7,0% para L. fermentum y L. plantarum
respectivamente).
Las diferentes cepas utilizadas, en este caso no producen diferencias
en la actividad antioxidante in vitro, ya que no se observa una diferencia
estadísticamente significativa (p>0,05) entre las muestras inoculadas
con L. fermentum (34,41 ± 8,2%) y L. plantarum (36,87 ± 7,0%), con lo
33
cual, la actividad feruloil esterasa no afecta ni beneficia la inhibición del
radical.
Si bien no se observa in vitro un aumento de la actividad antioxidante con la
acción de la enzima feruloil esterasa, debería hacerse un ensayo in vivo para
poder evaluar si se incrementan los beneficios para el consumidor al aumentar
la biodisponibilidad de los compuestos fenólicos.
El uso de base láctea o agua destilada en las muestras fermentadas,
modifica la actividad de las cepas y produce una diferencia en la
actividad antioxidante. En las muestras con agua y jugo se observa
mayor actividad (53,12 ± 4,0% para el L. fermentum y 53,54 ± 5,4% para
el L. plantarum) que en las muestras con base láctea y jugo (34,41 ±
8,2% y 36,87 ± 7,0% respectivamente), para ambas cepas la diferencia
fue estadísticamente significativa (p<0,05).
La menor actividad antioxidante en las muestras de base láctea con jugo
fermentadas puede deberse a una posible reducción del contenido de
antocianinas, compuestos fenólicos y ácido ascórbico, producida por el
metabolismo bacteriano (Suazo Mercado, 2012, Zapata Bustamante et al.,
2013). Por otra parte, la mayor actividad antioxidante en las muestras
fermentadas elaboradas a base de agua, puede deberse a que el pH de estas
muestras es más bajo que el de las muestras con base láctea, lo cual afecta el
metabolismo de estas cepas, de acuerdo con lo indicado por Spano et al.
(2005).
En las muestras sin fermentos, el uso de base láctea o agua destilada
produce diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) en la
actividad antioxidante, los valores de inhibición del radical fueron de
49,18 ± 5,6% en las muestras de agua y jugo, y de 62,98 ± 8,2% en las
de base láctea y jugo. De acuerdo con lo explicado anteriormente, la
ausencia de microorganismos no afecta a los compuestos con actividad
antioxidante, con lo cual se obtiene un valor mucho mayor en las
muestras elaboradas con base láctea.
34
CONCLUSIÓN
El agregado de jugo mixto de frutilla y frambuesa aumentó la actividad
antioxidante de la base láctea, mientras que el proceso de fermentación con
ambas cepas de lactobacilos, independientemente de presentar o no actividad
feruloil esterasa, la disminuyó. Este efecto negativo puede ser explicado por la
disminución que experimentarían los diferentes compuestos antioxidantes
aportados por el jugo (tales como ácido ascórbico, carotenoides, flavonoides,
antocianinas y ácidos fenólicos) luego de la fermentación, consecuencia del
metabolismo de tales compuestos por parte de las bacterias lácticas utilizadas.
Como trabajo a realizar, se propone la incorporación del jugo mixto de frutilla y
frambuesa luego del proceso de fermentación, de tal manera de obtener un
producto fermentado en el que los componentes antioxidantes provistos por el
jugo sean mínimamente afectados por el metabolismo de las bacterias lácticas,
al mismo tiempo que se consigue un valor de acidez acorde a lo establecido
por la legislación para leches fermentadas. Por otro lado, con el fin de
determinar el potencial efecto que ejercería en la salud humana el aumento de
la biodisponibilidad de compuestos fenólicos ligados provenientes de matrices
vegetales, se considera necesario realizar ensayos in vitro e in vivo, que
permitan analizar cómo la actividad feruloil esterasa de bacterias del tipo
Lactobacillus fermentum afecta la actividad antioxidante en este tipo de
alimentos.
35
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