esquema general
DESCRIPTION
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico. SESIÓN 2 : AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina. SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
ESQUEMA GENERAL
SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico
SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de
etidio
SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina
OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A
KANAMICINA
Medio LB + KANAMICINA
Escherichia coli
Se “introducirá el vector pET-TEM
Sitio múltiple de restricción
Origen de replicación
Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina
fosfotransferasa
PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Ccc: supercoiled circular covalently closed
Oc: open circular
Plásmidos
La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite
desarrrollar estrategias de purificación
TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento
PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Ccc: supercoiled circular covalently closed
Oc: open circular
Purificación de plásmidos
1. LisisQuímica Mecánica Cambios en la Tempratura
2. Remover partículas grandes Centrifugación Filtración (uso de membranas)
3. Purificación intermedia Precipitación fraccionada Adsorción a membranas
4. Purificación alta resoluciónMétodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad
Disolver Liofilizar Formular
5. Conservar
ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE
PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA
Aislamiento de plásmidos por el método de lisis
alcalina
Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria
Solución GTE: Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9
La glucosa no tiene carga pero es un osmolito
El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la
membrana.
También el Mg2+ es cofactor de Dnasas
Componentes de la solución GTE
Tris-HCl
Glucosa
Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1%
Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas
celulares.
SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS
Solución de lisis
El NaOH desnaturaliza el
DNA plasmídico y cromosomal
Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos.
El DNA cromosomal que se renaturaliza se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos.
Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA “escapan” del precipitado y SE ENCUENTRAN EN
EL SOBRENADANTE
El isopropanol precipita los ácidos nucleícos
Incubar por 20 min a -20°C
Lavar el “botón” con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se
evapora más rápido
Purificación de plásmidos
Por ejemplo unión al pétido 16mer
NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-
Gln-COOH
¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos?
1. Absorbancia 260 nm
2. Electroforesis en geles de agarosa
Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos
DNA cromosomal
Plásmido abierto
Plásmido superenrrollado
1 Precipitación con isopropanol
2 Cromatografía intercambío aniónico
3 Filtración con membrana de nitrocelulosa
4 Lo que se retuvo en la membrana de
nitrocelulosa
Microscopia de polímero de agarosa
Uso de “colorantes”
Tinción con Syber Safe
