BIOLOGIA MOLECOLARE E CLINICA – 6/1- PelliciLezione 1

30 domande a risposta multipla

La genomica ha cambiato in 20-30 anni il modo di fare medicina. Il sequenziamento del DNA (2003) è stato il punto di partenza, che ha rivoluzionato il modo di fare diagnosi: perchè conosciamo tutte le basi del DNA, l'unica cosa che ci è richiesta è sapere che cosa fanno quelle date sequenze. Dal sequenziamento del DNA si sono fatte moltissime scoperte che hanno permesso la nascita della medicina personalizzata.

Progetto genoma: nato negli anni 90. per la prima volta ricercatori di varie parti del mondo si sono messi a collaborare per riuscire a sequenziare il genoma umano. Principali risultati del sequenziamento del DNA:

• Non siamo gli esseri più complessi. Prima del sequenziamento si pensava che il numero di geni fosseproporzionale al grado di evoluzione. Ora si sa che le piante hanno più geni di noi, i roditori lo stessonumero di geni.

• Noi siamo identici per il 99% e l'1% di diversità fa sì che noi dobbiamo attuare terapie personalizzate anche in pazienti affetti dalla stessa patologia.

• Si è stabilita qual è la porzione codificante e non codificanti per proteine, l'esistenza di sequenze ripetitive, ecc...

Noi siamo entrati, dopo il sequenziamento del DNA, nell'era post-genomica, dove si applicano i risultati delsequenziamento del DNA attraverso l'uso di particolari tecniche.Cosa si fa nell'era post-genomica?Clonare un gene ora non è una gran cosa: ora dobbiamo occuparci di attribuire una funzione a tutti i pezzetti di dna che sono stati sequenziati: questa è la genomica funzionale. Si serve dell'ingegneria genetica, della trascrittomica (che studia i trascritti e quindi l'espressione), nextgeneration sequencing (tecniche per sequenziare il DNA), la proteomica (che studia le proteine- si usa il western blotting per studiare le proteine nella cellula, ecc...).Poi è nata un'altra branca importante, il System Biology. Nell'ambito della biologia molecolare esistono dei bioinformatici che si occupano di analizzare tutti i dati che emergono dalla genomica, dal sequenziamento, dalla trascrittomica, dalla proteomica, ecc... Prima si studiava il singolo gene la singola proteina, mentre ora si studiano tutte le proteine, tutti i geni della cellula. System biology studia gli organismi viventi come sistemi che si evolvono nel tempo, ossia nella interazione dinamica delle parti di cui sono composti. Questo si fa integrando i dati ottenuti dalla genomica e le teorie dei sistemi dinamici.Tutte queste tecniche sono usate nella farmacogenomica e nelle terapie personalizzate.

ANALISI DEL DNA

Nella cellula gli acidi nucleici sono DNA e RNA. Noi vogliamo studiare o uno o l'altro. Le tappe csono:• isolamento degli acidi nucleici. Dobbiamo scegliere se partire da un tessuto o da una cultura.

Dobbiamo anche essere in grado di isolare il DNA plasmidico (nei procarioti c'è un dna cromosomico e poi un piccolo dna a doppia catena circolare nel citoplasma, che si chiama plasmide).Se vogliamo studiare un gene dobbiamo gclonarlo in un vettore e, generalmente, i vettori utilizzati sono vettori plasmidici.

Partiamo da tessuti animali, vegetali, lieviti, sangue batteri, ecc... e da questi campioni biologici dobbiamo estrarre l'acido nucleico.Se non estraiamo il DNA con la tecnica corretta, se andiamo a fare PCR andiamo ad ampificare una molecola che non è il DNA e quindi diamo delle diagnosi (di malattia, paternità,ecc...) che non sono corrette.

Era post-genomica:- Genomica funzionale- System Biology- Farmacogenomica e terapie personalizzate

• Analizzare gli acidi nucleici.• Concentrazione degli acidi nucleici. Per farlo dobbiamo usare tecniche spettrofotometriche• vogliamo separare gli acidi nucleici tramite elettroforesi.

Per prima cosa dobbiamo fare la lisi della cellula, per arrivare a raggiungere l'acido nucleico. Esistono quindidelle tecniche di lisi cellulare.

Il DNA è una struttura stabile di facile manipolazione e può essere conservato a 4°C.RNA è una struttura molto più labile (si degrada facilmente); la nostra cute è ricca di rnasi e dnasi: per isolare rna quindi dobbiamo usare alcuni accorgimenti, come usare dei guanti, e togliere tutti questi enzimi (disinfettare il piano di lavoro, lavare bene tutto, eccc). Se invece voglio analizzare il DNA tutti questi accorgimenti non sono necessari, perchè è più resistente. Per RNA si usa una vetreria sterile. Vanno conservati a -70 °C.A seconda del punto da cui estraggo DNA (tessuto o cellule), uso tenciche diverse. Il tessuto lo devo disgregare per arrivare ai nuclei: devo eliminare il tessuto connettivo, ecc... -> più complesso. A seconda della Se parto da una cultura cellulare, devo solo lisare la membrana plasmatica.

Per analizzarlo il DNA deve essere integro, come si presenta all'interno della cellula e non degradato (frammentato in tanti piccoli pezzi); questo lo si capisce grazie a elettroforesi che ci consente di vederne la struttura.Inattivazione delle nucleasi presenti sulla pelle. https://drive.google.com/open?id=0B4qZSb7m1oknRXBvc3hHMkNzWTQDNAasi -> richiedono ioni metalici per la loro attività. Sono termolavili e facilmente inattivate da agenti chelanti e dalla sterilizzazione in autoclave (= mettere tutta la vetreria, tutto quello che uso, soluzioni, punte della pipetta, ecc a 120°C per almeno un quarto d'ora).RNAasi -> non richiedono cofattori. Possono adsorbirsi a ventro e plastica e rimanere attive.

Varie tappe:Prima tappa :lisi cellulare

Ci sono vari tipi di lisi che non devono comunque essere troppo aggressivi ◦ Distruzione meccanica -> lisi ipotonica. Con

▪ omogenizzatore (= rende miscele eterogenee, omogenee) . Per omogenizzazione si usa una soluzione isotonica (per garantire integrità fisica e metabolica degli organuli) con dentro:EDTA = agente chelante (= che va a formare complessi con atomi o ioni) che quando è nelle soluzioni di lisi serve a inibire dnasi e mantenere strutture cellulareDTT e betamercaptoetanolo = riducono i ponti disolfuro e sono usati nella preparazione di campioni. Sono agenti riducenti.Gli omogenizzatori possono essere con pestelli mossi a mano o elettricamente (dounce, Potter) e si usano per lisare tessuti e non cellule.

▪ Ultrasuoni. Lo strumento è il sonicatore. ◦ Trattamenti non meccanici. Questo tipo di lisi può essere:

▪ aggressiva -> arriva a frammentare il materiale di partenza▪ delicata -> mantiene integro il materiale di partenza formando dei pori sulla membrana.

Consistono in congelamento e scongelamento (se metto e tolgo la provetta dal ghiaccio secco tante volte, vado a rompere le cellule), shock osmotico, ecc...Per alcuni esperimenti voglio lisare e rendere accessibile il dna del nucleo, pur mantenedo l'integrità della membrana nucleare (quindi posso fare una lisi più blanda o una più spinta).

RNALabileDegradato da RNAasiConservati a -70°C

DNAPiù resistenteConservato a 4°C

Differenza tra endonucleasi ed esonucleasi: sono entrambe nucleasi, ma una taglia all'interno, l'altra all'estremità della catena di DNA.

La lisi blanda di solito si usa per i batteri, per isolarne i palsmidi. Detergenti rompono la membrana rimuovendo i lipidi e dissociando le proteine dagli acidi nucleici. I più famosi sono: nonidet p40 (detergente molto forte. Quando ne uso 1% ne distruggo molto), tween 20 e triton (lisi più blanda), SDS (distrugge tutto).

Proteasi. Possono essere inibitori oppure degli enzimi (come proteinasi K) che degradano le proteine di membrana. Degradano anche le nucleasi cellulari.

Le moderne soluzioni di lisi le usano entrambe (sia proteasi che detergenti).

L'allontanamento delle membrane una volta rottesi fa con centrifugazione. Ciò che si trova nella parte superiore è sopranatante, quello sotto (che precipita) è pellet e comprende membrane e frammenti cellulari, che si depositano a velocità diverse a seconda della diversa densità.Qual è il principio di seprazione con centrifugazione: particelle in soluzione, si stratificano con velocità diverse a causa delle diverse densità e solubilità.

Seconda tappa: DeproteinizzazioneIl pellet non contiene solo acido nucleico: devo eliminare le varie proteine e altre cose attaccate è una miscela complessa. Le devo eliminare. Come facciamo?Tramite un'estrazione fenolica (che elimina proteine, lipidi e carboidrati dagli acidi nucleici nel pellet). Il fenolo è anche abbastanza pericoloso, perciò quando viene utilizzato deve essere fatto con molta attenzione. Metto quantità di fenolo = a sopranatante e poi mescolo -> la soluzione diventa lattescente. Poi centrifugo e di nuovo avrò un pellet e qualcosa che si stratifica all'interfase e nella parte superiore.Il fenolo si deposita nel fondo ( è pesante). Le proteine si depositano nella parte intermedia. L'acido nucleico si stratifica nella parte superiore, nella soluzione acquosa (a ph maggiore uguale a 8).Con una pipetta vado a prelevare solo questa parte acquosa che ha solo DNA o RNA e la metto in una nuova pipetta. Devo stare attenta a non prendere la parte con proteine o con il fenolo, altrimenti contamino tutto. --> ho isolato il DNA o RNA da solo senza proteine -> ho fatto la deproteinizzazione.

Terza tappa: estrazione eterea. Serve a eliminare il fenolo eventualmente ancora presente. Metto uguale quantità di alcol isoamilico a quella del fenolo e cloroformio in una proporzione 49:49:1. In questa tappa gli acidi nucleici si depositano sul fondo.

Dopo la centrifugazione l'etere, localizzato nella parte superiore del tubo, è allontanato. Quello che resta è la miscela di acidi nucelici.

Quarta tappa: eliminazione di DNA/RNAPoi devo eliminare RNA con RNAasi se voglio studiare il DNA (o viceversa se voglio analizzare il DNA.

Quinta tappa: precipitazione del DNA/RNAIo ho ancora DNA o RNA (qui facciamo esempio di DNA) nella nostra provetta in acqua o nel tampone. Lo voglio risospendere nel volume che mi serve. Per esempio, se lo devo sequenziare, mi serve 1 microgrammo in 20 microlitri. Allora lo devo precipitare, lo risospendo poi nel volume che decido io. Vado ad aggiungere 2 volumi di etanolo puro e sodio acetato ( ne aggiungo in modo da arrivare alla concentrazione di 0,3 M nella soluzione finale). Poi mescolo e ottengo il mio pellet fatto di DNA.Poichè il sodio acetato potrebbe contaminare il pellet, aggiungo etanolo al 70% (prima lo avevo messo puro) = 7 parti della soluzione sono datti da etanolo, mentre il resto è acqua.

Sesta tappa: dosaggio del DNA/RNALa concentrazione del dna si stabilisce tramite uno spettrofotometro. Lo spettrofotometro analizza il DNA (oRNA) a 2 diverse lunghezze d'onda. Poi si stabilisce l'assorbanza a 260 e a 280 nm. Si fa il rapporto tra

Come faccio la deproteinizzazione? Tramite estrazione fenolica 1:1 con il sopranatante

questi due valori e se si avvicina a 1,8 (per DNA) o 2 (per RNA) vuol dire che l'acido nucleico non è contaminato nè da proteine nè da fenolo.

Lezione 2- 15/3

ELETTROFORESI DEL DNAAbbiamo estratto il DNA e abbiamo calcolato la concentrazione del DNA tramite lo spettrofotometro (vedi parte prima). Ma noi vogliamo VEDERE il DNA. Per vedere l'aspetto del DNA (per vedere se è integro, degradato o digerito) dobbiamo fare un'elettroforesi del DNA. È una delle tecniche di base che vengono utilizzate in biologia molecolare. L'elettroforesi permette di separare, identificare e purificare frammenti di DNA.Il DNA è una molecola carica negativamente a ph neutro e quindi, in un campo elettrico, migra verso il polo positivo. Deve esistere il campo magnetico e il gel di agarosio, sostanza all'interno della quale i frammenti diDNA devono migrare (deve essere quindi fatta in modo da consentire questo spostamento).

La velocità di migrazione del DNA dipende dalla sua forma (se è lineare, se esistono dei concatameri, se è digerito) e dal suo rapporto carica/massa. La maggior parte delle molecole di DNA hanno la stessa forma, con rapporti carica/massa molto simili. Quindi possiamo dire che l'elettroforesi separa il DNA sulla base delle sue dimensioni (perchè la dimensione è l'unico parametro che distingue i frammenti di DNA, che per il resto sono uguali): i frammenti più grandi sono più lenti nella migrazione, quelli più piccoli sono più veloci.

Nella camera di elettroforesi (orizzontale) abbiamo un catodo e un anodo con una soluzione tampone + una sostanza (agarosio o piliacrilamide).

Possiamo usare agarosio o poliacrilamide. Queste sostanze hanno dei pori che consentono il movimento delDNA al loro interno. La poliacrilamide ha una matrice che consente la discriminazione di frammenti molto piccoli (da 5 a 500 bp) ed è usata nei gel verticali.L'agorosio è un gel orizzontale, comunemente il più usato in laboratorio, serve a discriminare frammenti più grandi (200- 50000 bp). L'agorosio e la poliacrilamide sono come delle farine che vengono messe in una beuta, viene aggiunto della soluzione tampone e messo nel microonde, dove bolle e così va in soluzione grazie al calore (=si scioglie). Quando è sciolto è colato in una vaschetta (che contiene un pettine che andrà a formare dei pozzetti – il gel sidistribuisce attorno ai denti, si solidifica e quando tolgo il pettine restano i buchi nel gel) e bisogna attendere che si solidifichi, diventando un gel. Una volta fatto viene trasferito nell'apparato di elettroforesi. Dobbiamo scegliere che percentuale di agarosio mescolare con la soluzione tampone, perchè più è alta la percentuale di agarosio, più il gel è spesso e va a discriminare frammenti di DNA sempre più piccoli. La concentrazione più bassa è lo 0,8 e non si scende al di sotto, perchè altrimenti il gel che si ottiene è troppo poco maneggevole perchè troppo molle. Anche troppo duro (maggiore di 2%) non è maneggevole, perchè il DNA migra con troppa difficoltà, perchè le matrici (maglie) dell'agarosio sono troppo strette.

Altri fattori che influenzano la velocità di migrazione sono, ad esempio, • Forma del DNA. Può essere superavvolto (più veloce), lineare o circolare (più lento).• Voltaggio. Questo a seconda che noi vogliamo che la corsa sia più o meno rapida. Per avere ottima

risoluzione il gel deve essere sottoposto ad un voltaggio 5V/cm• Composizione del tempone di corsa. La presenza di ioni in soluzione permette la conducibilità

elettrica e quindi la mobilità elettroforetica del DNA. Soluzioni tampone contengono EDTA (1-2 mM) pH 8, Tris-borato(TBE)/Tris-acetato(TAE), 50 mM.L’agarosio viene sciolto nello stesso tampone di corsa

• Peso molecolare• Dimensione. La velocità è inversamente proporzionale al lg 10 bp• percentuale di Agarosio che compone il gel.

Il principio su cui si basa è la capacità di separare molecole cariche grazie all'applicazione di un campo elettrico

Quando faccio elettroforesi, l'agarosio è bagnato da un tampone. Come faccio a mettere il DNA (liquido) nei pozzetti (che contegono liquido costituito dalla soluzione tampone) e far sì che rimanga qui, prima di mettereil voltaggio, senza che prima mi diffonda nel liquido (prova a pensare a quando metti un liquido in un bicchiere con dell'altro liquido: i due liquidi vanno a mescolarsi)? Per andare a finire nel pozzetto il DNA deve essere caricato nel tempone di caricamento (loading buffering). Questo contiene glicerolo (che è pesante e fa andare il DNA a fondo nel pozzetto) e due coloranti (blu di bromoferolo e xilene cianolo) che miconsentono di seguire il DNA nel suo percorso. Il blu di bromoferolo (che dà il colore blu) migra con la stessa velocità di un frammento di 300 bp, mentre lo xilene (che dà il colore verde) migra alla stessa velocità di un frammento di 4000 bp. Se quindi vedo il blu a metà, vuol dire che il dna da 300 bp è arrivato anche lui a metà.Questa non è la colorazione del DNA (quella si fa con bromuro di etidio), ma serve solo a vedere se i miei frammenti sono o meno usciti dal gel. Non è la colorazione del DNA perchè questi coloranti NON SI INTEGRANO CON IL DNA.Il dna, quando migra durante l'elettroforesi, migra fintanto che c'è la differenza di potenziale. Quindi se me lodimentico rischio che mi scappa via dall'altra parte fintanto che la differenza di potenziale è mantenuta.

Per vedere il DNA, invece, uso un colorante fluorescente, il bromuro di etidio (mutageno, quindi non posso toccare con le mani e ha uno smaltimento particolare), che ha la proprietà di intercalarsi nel DNA (e anche un pochino nel gel di agarosio, ma poco) ed emette una fluorescenza quando mettiamo il gel al transilluminatore (sotto i raggi UV). A questo punto siamo in grado di visualizzare il DNA. Questo lavoro divisualizzazione lo facciamo quando la corsa decidiamo che è finita (prima finisco la corsa e poi visualizzo, non posso finire la corsa, visualizzare e poi farla riprendere). Il bromuro di etidio riduce la velocità di migrazione del 15%.Poi facciamo una fotografia e vediamo i vari frammenti. Per sapere la dimensione, uso un DNA ladder (scala di DNA) di dimensioni note e lo confronto con i DNA che ho. Quando coloro con etidio bromuro, questo andrà a colorare anche i marcatori di dimesione (DNA ladder) cheho inserito come riferimento per capire la misura dei frammeni che ho. Questi marcatori vengono fatti migrare insieme ai campioni di DNA come riferimento dimensionale.

CLONAGGIO DEL DNA È utilizzata di routine. Clonare significa fare tante copie tutte identiche tra di loro. Noi ci riferiamo al clonaggio di un tratto di DNA = significa ottenere copie molteplici della molecola di DNA di partenza tutte identiche tra loro. Per clonare devo seguire varie tappe:

1. Ligasi: inserimento della molecola che voglio clonare in un vettore. 2. Trasformazione: Il vettore lo devo inserire in una cellula in grado di amplificarlo. L'obiettivo è

infatti fare molteplici copie. Per farlo devo operare un procedimento chiamato trasformazione. 3. Selezione: vado a selezionare le cellule trasformate che mi interessano (quindi quelle con il vettore +

il frammento che sto andando a clonare)4. Crescita colonie: le cellule trasformate vengono amplificate per procedere alla purificazione del

DNA di interesse

Vediamo il primo punto, la LIGASI.Attraverso la tecnologia del dna ricombinante (=tecnologia che va a modificare il DNA, che definiamo quindi a fronte di queste modifiche "DNA ricombinante"), la sequenza di dna di interesse viene inserita in uncostrutto, detto vettore. Il vettore plasmidico più comune è PGEM.Per fare questo il vettore (che è un plasmide ed è quindi DNA circolare) deve essere tagliato e le estremità della sequenza di DNA di interesse devono essere legate alle due estremità del vettore aperto, permettendo dinuovo la chiusura. Per chiudere devo ligare. Quella che ottengo è una molecola nuova, formata da vettore + DNA che ho inserito.

Uso una proteina che fa dei tagli del DNA, gli enzimi di restrizione. Ma questi tagliano solo dopo aver riconosciuto delle specifiche sequenze di DNA, altrimenti no. Quindi l'inserto che voglio inserire deve avere dei frammenti esterni che siano compatibili con il pezzo che è stato tagliato, di modo che la ligasi possa chiudere (devo contare che io taglio con protrusioni).

Gli enzimi di restrizione sono delle endonuclesi, ossia enzimi in grado di tagliare la doppia elica del DNA lontano dalle estremità della molecola.Il ruolo bioloico di questi enzimi è di protezione e salvaguardia della cellula: nei procarioti questi enzimi sono essenziali per il taglio e la degradazione di filamenti estrenei al genoma (come ad esempio quello deribante da un'infezione fagica).Ogni enzima di restrizione riconosce una particolare sequenza di DNA, motivo per cui questi enzimi possonoessere sfruttati per tagliare la molecola di DNA in modo specifico, controllato e prevedibile. Tali sequenze (dette sequenze di restrizione), di 6,8 o 4 nucleotidi, sono spesso palindrome.Esistono 3 classi di enzimi di restrizione. Gli enzimi di tipo 1 e 3 portano le attività di restrizione e di metilazione nella stessa molecola e non sono usati in biologia molecolare a causa della loro aspecificità di taglio. Gli enzimi di classe 2, invece, portano le due attività su molecole distinte e sono caratterizzati da una elevata specificità di taglio.L'attività degli enzimi di restrizione si misura in unità di enzima. L'enzima di restrizione va mantenuto in ghiaccio, altrimenti non funziona. Insieme all'enzima di restrizione è venduto anche un buffer (tampone) per quel dato enzima di restrizione. Viene segnato come 10x -> vuol dire che il buffer deve essere diluito 10 volte: in 10 microlitri ne metto 1.

non tutti gli enzimi di restrizione producono lo stesso taglio. Ne ho alcuni, come SMA, che tagliano in maniera piatta. Difficilissimi da usare.ECOR1 invece produce delle estremità sporgenti al 5'. Sono gli enzimi più facili per clonare, perchè se uso un enzima che fa un taglio che protrude al 3', è più difficile da usare.

Le ligasisonoenzimiche

catalizzano la formazione di legami fosfodiesterici tra estremità 3' OH e 5'P di molecole di DNA adiacenti. Le ligasi funzionano SOLO CON ATP.Nel primo passaggio della reazione la ligasi reagisce con ATP per formare un complesso covalente ligasi AMP, il quale, a sua volta, reagisce con il fosfato 5' su un lato del nick, trasferendo AMP al gruppo fosfato. Ilpassaggio finale è l'attacco, a opera del gruppo 3'-OH che ripreistina l'integrità dello scheletro zucchero fosfato.Nel buffer della ligasi c'è ATP, quindi è molto delicato. Infatti ATP a temperatura ambiente si degrada facilemente.

Le estremità "coesive" facilitano i compito della ligasi, perchè le estremità tendono ad appaiarsi tra loto. In queste condizioni le ligazioni si effettuano generalmente tra 4 e 37°C, per un tempo variabile tra 1 e 24 ore.Se, invece, bisogna ligare estremità "blunt" (smussate) , la ligazione è più difficile e si effettua a bassa temperatura e a più elevata concentrazone di enzima e di frammenti da ligare per favorire l'incontro delle molecole da ligare.La DNA ligasi più utilizata è quella codificata dal batteriofago T4, un enzima, ATP-dipendente, ottenuto dalle cellule di escherichia coli infettate dal fago T4. Seppur a minor efficienza, la T4 DNA ligasi è capace diligare tra loro anche estremità piatte.

Il vettore è una molecola circolare. Noi lo digeriamo (per aprirlo e consentine l'inserimento del frammento diDNA che vogliamo clonare) con ECOR1 (quindi nel vettore deve esserci solo un sito ECOR1). Se, ad esempio, ne esistessero due, aggiungendo ECOR1, si apre il vettore in due punti e quindi avrei la liberazione di un frammento. Quando aggiungo la ligasi, il frammento di DNA che mi interessa clonare, deve essere aggiunto al vettore. Ma se io aggiungo la ligasi, può anche succedere che le molecole del vettore (precedentemente aperte) si richiudano senza che il frammento di DNA che mi interessa clonare si sia inserito all'interno del vettore. Come faccio a evitare questa cosa? Defosforilo il vettore (in particolare tolgo il fosfato al 5') usando la fosfatasi alcalina (CIP): così tolgo la possibilità alle molecole di vettore di chiudersi senza inserto (perchè se non c'è il fosfato, la ligasi non funziona). La parte 5' comunque si riesce a chiudere, ma solo con l'inserto, perchè il fosfato l'ho tolto da 5', ma lo metto nell'inserto.

Esistono vari tipi di vettori che sono scelti a seconda delle dimensioni dell'inserto. • Plasmidi. Sono i più usati. Sono molecole circolari extracromosomiali di DNA. Sono in grado di

replicarsi senza essere integrati nel genoma batterico. Possono essere facilmente purificati, ossia separati dal genoma batterico.Presentano ◦ la sequenza ORI, sequenza di origine della repolicazione, che fa sì che il plasmide si possa

replicare in maniera autonoma all'interno della cellula. ◦ MCS (Multi Cloning site o polylinker). Sequenza in cui sono raggruppate sequenze

riconosciute da diversi enzimi di restrizione, e nella quale viene inserito l'inserto. Questa regioneè di solito ingenierizzata in modo tale da essere compresa tra un promotore e un sito terminatore.

◦ Inserto, il DNA esogeno◦ sequenza codificante per un gene che conferisce un vantaggio selettivo, come ad esempio il

gene di resistenza per ampicillina. Questo perchè, una volta ottenuta la molecola ricombinante, noi la dobbiamo trasformare nei batteri. Poi vanno identificate le colonie di batteri che all'internohanno il vettore ricombinante. Questo lo possiamo fare perchè il vettore ha un marcatore di resistenza a un antibiotico. Faccio crescere i batteri in un terreno con l'antibiotico, cosicchè

possano sopravvivere solo i batteri che mi interessano, ovvero quelli con il vettore, che all'interno ha il fattore di resistenza all'antibiotico che ha consentito loro di sopravvivere.

Vantaggi dei plasmidi:▪ Sono più maneggevoli degli altri vettori. È più difficile danneggiarlo o introdurre

interruzioni a singola elica durante le manipolazioni sperimentali.▪ più facili da estrarre. I principali metodi di separazionedei plasmidi dal cromodoma batterico

si basano sulla denaturazione degli acidi nucleici e sulla loro successiva rinaturazione. Mentre i plasmidi, di piccole dimensioni, rinaturano rapidamente, il grosso cromosoma batterico non riesce a rinaturare velocemente e viene selettivamente eliminato. La velocità dirinaturazione plasmidica è inversamente proporzionale alla dimensione. Quanto più piccoli sono, quindi, tanto più facile è il loro isolamento

▪ è più facili introdurlo in un batterio. L'efficienza di trasformazione è inversamente proporzionale alla dimensione plasmidica.

• fagi. Ora ono più usati, perchè servono ada esprimere dei geni in cellule primarie (come cellule staminali), dove non è possibile utilizzare vettori plasmidici, perchè sono difficili da manipolare

• cosmidi• BAC• VAC

Gli ultimi 3 sono usati solo raramente e per scopi molto specifici come la creazione di librerie. Si usano per DNA di grandi dimensioni.

Usiamo i plasmidi. Una volta ottenuta la molecola ricombinante, ne vogliamo grandi quantità, quindi dobbiamo usare la trasformazione batterica (= inserimento di DNA esogeno nella cellula batterica). È diversa da trasfezione (= introduzione di DNA eterologo in una cellula eucariotica)Per le cellule animali la trasformazione è il passaggio da una cellula normale a una tumorale. Ma noi qui ci riferiamo alla trasformazione nei procarioti.

La trasformazione batterica avviene o con elettroporazione o con cloruro di calcio (trattamento chimico).Nell'elettroporazione ke cellule sono poste in piccoli contenitori (Cuvette) in una soluzione che contiene DNA. Sono quindi sottoposte a un breve impulso elettrico che produce transitoriamente l'apertura dei pori nelle loro membrane in diversi punti.Uso il cloruro di calcio perchè devo usare sostanze chimiche che vadano ad interferire con la parete batterica e la membrana dei batteri, creando dei pori. A questo trattamento, aggiungo anche uno shock termico (facciopassare i batteri da un ambiente molto freddo a uno molto caldo).

Dopo aver operato la trasformazione, ovvero dopo aver introdotto il DNA ricombinante nei batteri, possiamoavere vari risultati. Possiamo avere batteri vuoti (dove il dna ricombinante non è penetrato), dei batteri solo con il vettore, ma non l'inserto, oppure batteri con vettori + inserto. Se noi come metodo di selezione usiamo l'antibiotico, andiamo ad eliminare SOLO le colonie vuote, perchè il gene di resistenza all'ampicillina è contenuto nel vettore e NON nell'inserto. Una volta fatto questo mi trovo davanti a due possibilità.

1. Vado a far crescere in maniera separata le colonie, poi estraggo il plasmide e lo faccio digerire ancora dall'enzima di restrizione; a questo punto guardo se ho un solo frammento (questo frammentoè il vettore aperto, allora sto guardando una colonia solo con inserto e non con il vettore) oppure un vettore + un frammento (sto guardando le colonie che avevano vettore + inserto).

2. Oppure si può usare il sistema dell'alfa complemementazione. Noi usiamo un vettore che ha un promotore (LAC) che regola la trascrizione e produzione di betagalattosidasi. Se introduco l'inserto in mezzo a questo promotore, allora il promotore non funziona e quindi non ho beta galattosidasi.Se il promotore funziona, si produce beta galattosidasi (questo avviene però se l'inserto non è stato aggiunto). Se aggiungo un substrato cromogenico, in presenza di beta galattosidasi si ha metabolismo del colorante che precipita e diventa blu-> le colonie sono blu -> ho solo vettore e non inserto. Se ho inserito il vettore, questo va a rompere il promotore per beta galattosidasi che quindi non viene prodotta -> colonie bianche -> no inserto.

PCR (= Polymerase Chain Reaction)È una tecnica di clonaggio in vitro. È una tecnica di amplificazione del DNA (può amplificare un tratto di DNA per più di un milione di volte in poche ore).

Noi capiamo la PCR perchè sappiamo come si duplica una molecole di DNA. La dnapolimerasi per funzionare ha bisogno di un primer, senza non duplica il DNA. Per RNA polimerasi è diverso, perchè non ha bisogno di primer.I filamenti del DNA sono a doppia catena con 2 estremità 3' e 5'. l'innesco è un innesco a RNA. Poi la DNApolimerasi elimina il primer di RNA con del DNA. Nel tubo in cui avviene la PCR mettiamo:

• lo stampo, che viene anche chiamato template. Il template è il tratto di DNA che deve esser copiato• DNA polimerasi che ha una caratteristica in più rispetto a quella normale, perchè deve essere

termostabile (= deve resistere ad alte temperature, 95°C). Infatti nella PCR abbiamo denaturazione del Dna.

• desossinucleotidi trifosfati, che sono i mattoncini di cui l'enzima si serve per replicare DNA.• Un buffer (tampone) che contiene il magnesio, perchè è il cofattore principale delle polimerasi. A

volte la PCR non esce perchè la concentrazione di magnesio non è quella giusta. • Due oligonucleotidi (primer) complementari alle regioni fiancheggianti la sequenza di interesse da

amplificare che disegniamo noi a seconda delle nostre necessità. I due primers saranno complementari uno allo stampo (primer senso s o foreward) e l'altro al fiamento di senso (primer anti-senso as o reverse) nelle due regioni nelle regioni fiancheggianti. Hanno una lunghezza intorno ai 20 nucleotidi. Il contenuto di guanina e citosina non deve essere molto alto, perchè altrimenti i primer si appaiano con difficoltà. Dopo che ho scelto la sequenza che voglio amplificare, controllo che non ci siano troppa guanina e citosina nelle estremità e quindi poi nei primer: se questo avviene cambio un po' le cose.

Metto tutti i componenti nella provetta e poi li metto nella macchina della PCR (un termociclatore, dove è possibile modificare le temperature), che prevede un certo numero di cicli di reazione (da 20 a 30 cicli di reazione). Ogni ciclo consiste di 3 fasi che avvengono a diverse temperature.

1. Fase di denaturazione: lo stampo deve essere denaturato a 90-95°C2. Appaiamento /annealing: i primer devono appaiarsi alla sequenza di DNA complementare. Avviene

a tra i 40-60 °C -> ogni oligonucleotide ha una temperatura di appaiamento caratteristica, quindi a seconda dei primer che usiamo, avremo temperature diverse, che stanno all'interno di questo range. Quando noi usiamo temperature di 60° saremo più stringenti e quindi facciamo sì che quel nucleotide si leghi proprio a quella sequenza. Se invece uso temperture più basse posso favorire anche degli appaiamenti aspecifici, facendo unire cose che non sono perfettamente complementari

3. sintesi del DNA. Avviene a 72°C, temperatura ottima per Taq polimerasi (deriva da il termus acquaticus, un battere termofilo, quindi una polimerasi che resiste ad alte temperature). Tuttavia questa polimerasi non ha attività esonucleasica (non corregge errori che può avere fatto), Ce ne sono (PFU) anche altre che incorporano meno errori della Taq quando sintetizzano il DNA: la DNA polimerasi infatti ha un'attività esonucleasica, in modo che se compie degli errori questi vengono corretti, ma Taq non ha questa attività. Ma nei libri troviamo Taq polimerasi, sia perchè costa meno, sia perchè storicamente era la più usata; ora, tuttavia, tutti usano la PFU, anche se costa di più.

Questi cicli li ripetiamo 30-35 volte. Alla fine abbiamo un'amplificazione esponenziale.

Come faccio a capire se ho amplificato la cosa giusta? Il prodotto di PCR lo carico in un pozzetto e faccio elettroforesi per vedere se la sequenza ottenuta è lunga quanto mi aspetto (confrontando il prodotto di PCR con un ladder, un indicatore di pesi).

Mettiamo che io mi aspetto una sequenza di 700 basi. Chi ha fatto giusto? 2 e 4.Il 3 non ha messo il templato.1 ha messo una temperatura sbagliata in fase 2, troppo bassa. Quindi i primer si sono legati in maniera aspecifica, e quindi anche ad altri frammenti che non dovevano legare i primer, ma lo fanno perchè a basse temperature i primer si legano in maniera aspecifica.

Per avere un'ottima PCR devo stare attento a varie cose:• concentrazione di magnesio• scelta dell'enzima e della sua concentrazione• progettazione dei primers. Questi sono di norma compresi tra 20 e 30 nucleotidi e non dovrebbero

mai essere <a 16 e non devono avere troppa guanina o citosina.

Per progettare una PCR devo:• scegliere la strategia, se stampo di DNA o di RNA. • Conoscere le dimensioni della regione da amplificare.• Usare programmi per progettare primers nella regione scelta. Per fare questo devo conoscere regole

generali (quella della guanina citosina, ad esempio). Una volta progettati li faccio fare da un'industriae me li faccio arrivare.

• Verificare la valadità biologica dei primers con BLASTN, che è un programma per pc. In quante regioni di DNA il primer che ho fatto può andarsi a legare? Questa è la domanda che faccio al programma e mi serve per capire se il primer che ho fatto è o meno aspecifico (va a legarsi dappertutto o solo nel punto che mi interessa?).

• Verificare la sequenza tramite sequenziamento del prodotto di amplificazione ottenuto, non basta basarsi solo sull'elettroforesi.

PCR è una tecnica molto sensibile e rapida che permette di analizzare tanti campioni e tante sequenze diverseche derivano dallo stesso campione. Inoltre può amplificare anche un DNA che non è molto puro.

Tuttavia questa tecnica ha degli svantaggi: • c'è un elevato rischio di contaminazione (falsi positivi)• l'efficienza variabile di amplificazione a seconda della sequenza (a volte posso decidere di cambiare

la sequenza da amplificare perchè quella che volevo non rispetta alcune regole e quindi non va bene, ma altre volte non posso permettermi di cambiare)

• devo conoscere le estremità del frammento che voglio amplificare; quindi posso non conoscere la parte interna della sequenza di DNA che voglio amplificare, ma almeno le estremità le devo conoscere per poter progettare i primer giusti.

• Non possiamo amplificare dei frammenti grandissimi (non possono essere maggiori di 5.000 basi).• Alcune DNApolimerasi possono incorporare degli errori nel corso dell'amplificazione, soprattutto

quelle che non hanno attività esonucleasica, come la Taq polimerasi -> mancanza di proof reading.

RT-PCRè una PCR fatta dopo aver fatto una retrotrascrizione. È usata per identificare uno specifico RNA messaggero. Questa volta quindi partiamo dall'RNA messaggero (purificato dalla poliadenilazione, che tutti gli RNA hanno, tranne che quello che codifica per gli istoni). Per purificarli usiamo delle oligodT (complementari alle adenine, che quindi le portano via e rimuovono la poliadenilazione). Da qui andiamo a sintetizzare il cDNA. Una volta ottenuto il cDNA (DNA complementare a RNA messaggero che vogliamo considerare), lo usiamo come un DNA normale e facciamo una normale PCR. Vogliamo misurare la quantità di mRNA per un dato gene che la cellula produce: tanto mRNA = tanta espressione.

Quando andiamo a fare una PCR, se immaginiamo un grafico e mettiamo sulle x il numero di cicli e su y il logaritmo della quantità di DNA. Il prodotto di PCR (quello che sesaminiamo alla fine dell'amplificazione) dipende dalla quantità di stampo utilizzato e 2^n (n= numero di cicli). Se noi andiamo a vedere bene il grafico, vediamo che durante l'amplificazione abbiamo una fase di crescita esponenziale, poi lineare e poi una fase di plateu. Qui la quantità di prodotto non dipende più dalla quantità di templato iniziale. Per usare la PCR in maniera quantitativa (ovvero per sapere QUANTO di quel gene viene prodotto in quel momento preciso), dobbiamo usare tecniche di misurazione applicate alla fase lineare, quando la quantità di prodotto è proporzionale alla quantità di templato.

Usiamo la PCR quantitativa per fare uno studio di espressione genica. La molecola di partenza è RNA. Quando noi studiamo qualcosa, lo facciamo tramite confronto: quindi andiamo a studiare l'espressione genica di una cellula in confronto a quella di un'altra (sana oppure non sottoposta a farmaco oppure sotopostaa stress ossidativo, ecc....).Dobbiamo quindi estrarre RNA, che è un RNA totale, che contiene tutte le specie di RNA (t, m, r). Devo andare a isolare solo mRNA. Come faccio? Con il metodo visto prima per isolamento degli acidi nucleici, vado a isolare RNA totale e lo faccio passare in una colonna con un polimero di oligo T. Solo Mrna si legherà a oligo t (perchè ha la coda di poli A). Poi purifico tutto e ottenfo mRNA. Dopo aver ottenuto mRNA, comunque ho quello di tutta la cellula, mentre mi serve quello specifico del gene di interesse. Come lo identifico? Tramite un'elettroforesi, che mi consente di trovare il gene che cerco in base alla sua lunghezza.

Dopo aver estratto e purificato RNA andiamo a fare il c DNA, che è la copia di DNA complementare all'RNA messaggero che ho purificato. Questo lo facciamo grazie a una trascrittasi inversa.

Noi possiamo ripetere le fasi della PCR per 30 volte (x) e nelle y la quantità di DNAVoglio trovare un sistema per misurare la quantità di amplificato che ottengo: io voglio studiare un gene e voglio sapere QUANTO ce n'è. Per farlo devo usare una PCR quantitativa. Ad esempio voglio sapere quanto gene Myc una cellula tumorale esprime rispetto a una cellula normale. Quando ho fatto la PCR in maniera non quantitativa vedo che vado a fare moltissime copie e poi raggiungo un plateu, oltre il qual non ho più copie. Nella PCR classica ho il mio prodotto nel tubo e poi faccio elettroforesi per vedere se quello che ho ottenuto è corretto. Devo utilizzare una tecnica che lavora nella fase della curva in cui la quantità che viene amplificata è proporzionale al templato alla molecola di RNA di partenza. Quindi faccio una real time, nel senso che uso delle tecniche che nel tempo reale vanno a misurare quanto si amplifica quando la curva sale e non quando raggiunge il plateu. Guardo quindi nella fase esponenziale.

L'effetto plateu durante l'amplificazione del DNA si raggiunge per vari motivo:• i primer finiscono• l'enzima finisce• i filamenti tendono a reannilaare (tornano a formare doppia elica di DNA)

Per questo a un certo punto non riesco più a ottenere copie di DNA -> non ho più prodotto -> nel grafico ho plateu.

Quello che misuro alla fine della PCR (intesa come fase di plateu) non dipende dalla quantità iniziale di templato (templato che abbiamo visto può essere DNA o cDNA). Parto sempre dalla stessa quantità di RNA,

ma voglio sapere quanto RNAmessaggero di Myc c'è. Se io andassi a misurare il prodotto finale della PCR quando questa ha raggiunto il plateu, non andrei a trovare questa misura (quanto myc c'è nel campione utlizzato) perchè il plateu è indipendente dalla quantità di quell'RNA messaggero per quel gene. L'unico modo per sapere quanto RNA messaggero è presente in quel gene di quella PCR è andare a misurare quando la PCR è nella fase esponenziale, fase in cui è proporzionale alla quantità di templato.

Per fare questo noi utilizziamo una fluorescenza che viene rilevata dalla macchina in tempi reali, mentre sta avvenendo l'amplificazione: più fluorescenza è rilevata dalla macchina, più abbiamo espressione. Si chiama real time, perchè misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, cioè quando l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendodi ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale end-point (che quindi guarda nella fase di plateu).

Il prodotto di RT-PCR non viene analizzato su gel di agarosio, perchè è la macchina (computer) che analizza la fluorescenza quando arriva alla fase esponenziale.

La macchina registra la fluorescenza dopo che la fluoescenza emessa ha superazo un livello soglia, che vieneindicato come Ct (Cycl threshold). Ogni gene raggiunge questo livello soglia dopo un tot di cicli. Se il numero di cicli è basso significa che il gene è più espresso, perchè la soglia di emissione di fluorescenza è raggiunta prima. Se invece sono necessari tanti cicli perchè la macchina registri la fluorescenza, vuol dire che quel gene è meno espresso.

Come registriamo questa fluorescenza? Dobbiamo usare sostanze che emettono la fluorescenza. Usiamo 2 modalità:

• cybergreen -> colorante che si intercala nella doppia elica di DNA (in particolare nel solco minore). Mano a mano che la dnapolimerasi fa dna, si intercala il cybergreen -> la fluorescenza è proporzionale al numero di copie dell'amplicone. . È poco specifico (perchè si intercala a random in tutte le sequenze, compresi i dimeri di primer), ma costa meno. Spesso viene usata in laboratorio.

• TaqMan -> sono delle sonde ad ibridazione specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti. La sonda che noi ordiniamo è specifica per il gene di cui vogliamo studiare l'espressione: dobbiamo sintetizzare un oligonucleotide (è la sonda TaqMan) complementare a una sequenza interna del gene che vogliamo studiare. Per disegnarla usiamo delle linee guida presenti su internet e, dopo averla disegnata, la ordiniamo, perchè sono le industrie che le fabbricano. È una GFP (Green Fluorescent Protein).

La

sonda Taq man, quindi è molto specifica e per questa più costosa. La sonda presenta all'estremità 5' un fluorocromo (reporter)e a 3' una sequenza che spegne il fluorofero (quencher). La dna polimerasi avanza e sintetizza un frammento 5'->3' che mano a mano che avanza mangiucchia la taqman e quando l'ha mangiata tutta si spegne. È come un interruttore: quando la DNA polimerasi arriva e cliva R, questa causa un'emissione di fluorescenza, quando arrivae cliva Q, allora la fluorescenza non c'è più (effetto di Q è quello che spegnere la fluorescenza). Questo perchè i fotoni di R sono assorbiti da Q.

SOUTHERN BLOTSi chiama perchè è stata inventata dal signor Southern. La Northern si chiama così per contrapporla al Southern. Il southern serve a determinare la presenza o assenza di frammenti genici, oppure per studiare struttura e organizzazione di un gene. Ci serve conoscerla perchè, nonostante ci siano nuove tecniche, ancora viene utilizzato per studiare i polimorfismi, diagnosi di paternità, ecc...

Procedura:• Isolare dna genomico• Digerirlo con enzima di restrizione specifico (che va a tagliare delle sequenze specifiche). Se

digerisco un DNA genomico, otterrò tantissimi frammenti (perchè ci sono molte sequenze che vengono riconosciute dall'enzima di restrizione).

• Elettroforesi dei frammenti di DNA su gel di agarosio, che serve per separare tutti questi frammenti che ho ottenuto.

• Denaturare il DNA per separare i filamenti complementari• Trasferire il DNA su membrana per capillarità• Ibridazione con una sonda marcata.

Isolo il DNA genomico e lo digerisco con enzima di restrizione. A questo punto ottengo tanti frammenti che voglio e vado a separarli tramite elettroforesi. Da qui coloro con etidio di brumuro -> non vedo bande discrete, ma strisciate, perchè le bande sono tantissime e tutte vicine, quindi mi appaiono come delle strisciateCon il southern vado a trasferire il DNA separato su gel di agarosio (= che ha fatto elettroforesi) su un filtro che può essere o di cellulosa (che si usava una volta) o di nylon. Il dna si trasferisce per capillarità dal gel di agarosio alla membrana. Dopo il trasferimento il DNA è fissato covalentemente alla membrana. Se usiamo lanitrocellulosa la cuociamo, se usiamo il nylon, crosslinkiamo il nylon al DNA con gli UV (questo serve per fissare covalentemente DNA alla membrana).Sul filtro abbiamo rappresentato tutto il genoma diviso in frammenti, ma io voglio sapere se il gene che mi interessa (Myc ad esempio) è amplificato, e non mi interessa del resto. Quindi devo ibridizzare il filtro dove è depositato il DNA con una sonda rappresentativa del gene che voglio studiare: uso un oligonucleotide che va a legarsi alla sequenza di Myc che mi interessa. Per vedere questa sonda, si usa una sonda radioattiva. Poi faccio una radiografia (metto il filtro in una cassetta autoradiografica) e vedo il gene che sto studiando. Questa volta osservo delle bande discrete.

Questo sistema viene usato ancora per lo studio della variabilità genetica e la tecnica che utilizzo è RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Si usa per identificare polimorfismi in 2 individui diversi. Noi andiamo con un enzima di restrizione: in 1 rileva il sito e taglia, nel 2 il sito di restrizione non esiste (perchè c'è un polimorfismo) -> quando verrà ibridizzato con una sonda per esporare la zona genica, vedremo un frammento più grande di quello che vedremo nell'1 (perchè in 1 abbiamo il sito di restrizione e qui l'enzima ha tagliato, in 2 invece, non essendoci il sito, non si ha avuto taglio e quindi il frammento è più grande).

Il southern ha anche altre funzioni:• analisi forense• diagnosi di malattie ereditarie• individuazione di agenti patogeni nelle infezioni -> prendono il dna dalla sede dell'infezione e vado a

usare come sonda la sonda del virus: se c'è infezione ho il segnale di ibridizzazione, altrimenti no• analisi filogenetiche• mappatura del genoma• controllo degli OGM (presenza di organismi geneticamente modificati)

Il southern è molto specifico: o il legame avviene oppure no e questo è un vantaggio. Tuttavia ha degli svantaggi: richiede troppo tempo (ci vuole circa una settimana) e richiede anche discrete quantità di DNA; per questi motivi non viene più molto usato. Ora ci sono sistemi che analizzano tantissimi geni tutti insieme e in molto meno tempo

NORTHERN BLOTSi usava prima di RT-PCR. Andiamo a studiare la quantità di specifici RNA -> serve a studi di espressione genica.Dobbiamo isolare RNA totale.

• separarlo con elettroforesi su gel di agarosio. Per rna si preferisce fare un gel denaturante (=che contiene formaldeide o formalmide), perchè RNA tende a ripiegarsi su se stesso: se uso sostanze denaturanti la molecola non si ripiega su se stessa e quindi corre meglio. Sul gel di agarosio vedo

soprattutto le due forme 28s e 18s di RNA ribosomiale. RNA messaggero non riesco a visualizzarlo, perchè è troppo poco.

• Trasferire su membrana con la tecnica del Southern. Se vado a illuminare il gel (dopo averlo coloratocon bromuro di etidio) dopo che è avvenuto il blotting (trasferimento) e vedo che è vuoto, vuol dire che il trasferimento è avvenuto correttamente.

• Ibridare con una sonda radiattiva. Queste sonde vanno a legarsi specificatamente con mRNA che vogliamo studiare. La sonda marcata è aggiunta alla membrana con l'RNA da analizzare in tubi da ibridazione + soluzioni di ibridazione + sostanze denaturanti.I segnali vengono rilevati tramite audiordiografia: la membrana viene lavata, messa nell'autoradiografo con sopra una lastra fotografica che deve essere impressionato e messa a -20°C.

Il procedimento è lo stesso, ma qui voglio studiare l'espressione di quel singolo gene. (non fare lavaggio)Nella lastra abbiamo il segnale che corrisponde al gene che stiamo studiando.

Con opportuni lavaggi (si fa bollire in acquia distillata a 100°C e SDS) possiamo eliminare tutto ciò che abbiamo ibridizzato e usare la stessa membrana, ma con un'altra sonda.

Ecco alcune appicazioni del Northern blot:Potrei chiederemi: in quali tessuti è espresso il gene che sto studiando? Per vedere se è espresso dappertutto faccio un Northern blot. Prendo cellule da tutti i tessuti, estraggo gli RNA, li carico, bla bla bla e poi vedo se la sonda rileva l'espressione di quel dato gene in tutti i tessuti. C'è un tessuto che ne esprime più di un altro? Guardo l'intensità delle bande che ho ottenuto. Vedo che il cuore ha una banda, ma in un punto diverso dagli altri e di dimensioni più piccole: vuol dire che il cuore ha uno splicing alternativo di quel gene.Perchè ho bande più spesse di altre? Dipende dalla quantità di RNA.Come faccio a dire che non ho bande perchè non ho espressione di un gene e non perchè magari non ho caricato quel dato gene? Faccio ibridizzazione con sonde che vanno a legare geni che so essere espressi in tutte le molecole dell'organismo (come l'actina, la G6PD).

Lezione 27/3ELETTROFORESI DELLE PROTEINEtecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico apprlicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. I fattori che inflenzano la mobilità di una moelcola nel campo elettrico sono:

• la carica della molecola• il gradiente di voltaggio del campo elettrico• la resistenza all'attrito del mezzo di supporto•

L'appaecchoatura è costituita da un alimentatore elettrico, da una cella elettroforetica e da un supporto verticale.

Utilizziamo un gel di poliacrilamide, preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilamide in presenza di Nnmetilene-bis-acrilamide. È composta da due molecole di acrilamide legate con un gruppo metilene ed è un agente che fa cross legami (legami crociati).

In questo modo si formano lunghe catene di acrilamide tenuure insieme tra loro da legami crociati derivanti dall'inserzione occasionale di bis acrilammide.Questo gel di poliacrilamide è molto idrofilico e trattiene grosse quantità di acqua.

Noi eseguiamo un'elettroforese denaturante o detta anche SDS page. Per semplificare l'analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la separazione eletroforetica si vasi solo sulle dimensioni delle catene polipepticiche.Ciò si ottiene denaturando le proteine con il deterfente Sodio Dodecil Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS. Poichè rischio che sia la diversa forma delle proteine a farle migrare diversamente nello spazio e non la loro lunghezza, utilizzo SDS che modifica la forma delle proteine (perchè le denatura) e anche la loro carica, perchè le ricopre e le indirizza verso il polo +.

La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente si baserà quasi esclusivamente sulle dimensioni delle molecole proteiche per cui proteine più piccole si muovono più rapidamnte attrvaerso il gel, mentre quelle con dimensioni maggiori sono più rallentate e migrano più lentamente. Si aggiunge anche beta mercaptoeranolo, che rompe i ponti disolfuro eventualmente presenti.

Stacking gel è presente in percentuale fissa e fa sì che tutti i campioni arrivino allo stesso livello, poi inizia lacorsa che separa le proteine (fa in modo che partino tutte dalla stessa linea di partenza). La parte in cui corrono è il separating gel.

Abbiamo poi l'elettroforesi in condizioni native, in cui le proteine mantengono la loro attività biologica e carica nativa.

Esiste un altro tipo di separazione delle proteine, l'isoelettrofocalizzazione,c he si separano sulla base del loro punto isoelettrico. Nel gel di crea una scala di ph e la miscela è messa in un pozzetto. Viene messo un campo elettrico. Le proteine migrano finchè non arrivano al punto in cui si trova il loro punto isoelettrico

Abbiamo poi elettroforesi bidimensionale (finora era monodimensionale). Viene fatta una isoelettrofocalizzazione e poi un elettroforesi su gel di poliacrilamide; questo passaggio è detto "separazione su 2^ dimensione". Così posso separarle sia per differenza di ph che per differenza di dimensione.

Applicazioni di SDS-Page• analisi quantitativa delle proteine nel campione di interesse. EX: voglio vedeere se nel mio campione

è più espressa una proteina transattivante rispetto a una normale.• Analisi qualitativa delle proteine• determinazione del peso molecolare di proteine sconosciute.

Abbiamo un gel e sui vari pozzetti abbiamo caricato vari campioni, dopo aver fatto stacking e separating gel.Il gel è verticale. Abbiamo collegato gli elettrodi e fatto correre. Ora dobbiamo colorare il gel per vedere il risultato. Posso usare un colorante che si chiama Comassie: il gel è immerso nel colorante sciollto in acido acetico ed etanolo e poi vedo le varie bande del campione e vedo le proteine totali che hanno pesi molecolari diversi e andranno a formare tante bande una vicino all'altra. Oppure possiamo colorare il gel con una miscela di sali d'argento e formaldeide: gli ioni d'argento reagisconocon i gruppi basici e tiolici delle proteine e così le colorano. È più sensibile del Comassie e si usa per studi più particolari e approfonditi delle proteine.

Quando noi facciamo un'elettroforesi delle proteine dobbiamo caricare dei marcatori, in cui le bande corrispondono a pesi molecolari predefiniti come riferimento.

WESTERN BLOTDopo aver fatto la corsa elettroforetica devo trasferire su fogli di nylon o nitrocellulosa che sono posti in un apposito cestello a forma di sandwich immerso in un tampone nel quale ci sono due elettrodi parallei. La corrente, perpendicolare al gel trasferisce le proteine su un foglio di nitrocellulosa. Nel southern o northern non mettavamo gli elettrodi e il trasferimento avveniva per capillarità, perchè mettavamo delle concentrazioni di sale. La differenza di potenziale favorisce il trasferimento delle proteine dal gel alla nitrocellulosa (o nylon). Questo si chiama elettroblotting.

Il western blotting serve per studiare proprio quella proteina specifica e vogliamo vedere come è espressa in quella data cellula da cui l'abbiamo estratta. Noi per studiare le proteine usiamo un anticorpo specifico per la proteina e lo mettiamo sul foglio di nitrocellulosa. Ma non lo vediamo. Perciò dobbiamo elaborare un metodo che ci permette di rivelare quanto anticorpo si è legato a quell'antigene e per farlo usiamo un anti-anticorpo coniugato, che ha attività enzimatica. Se aggiungo il substrato, l'anticorpo con attività enzimatica reagisce e dà un'emissione di luce e la lastra fotografica è impressionata da questa luce e così riesco a vedere il segnale. È una chemiluminescenza e quindi questo test è fatto senza radiattività.Quello che ottengo è molto simile al northern e al southern.

DA QUI IN POI LE TECNICHE SONO QUELLE DELL'ERA POST-GENOMICA

TECNOLOGIA DEI MICROARRAYUsata per espressione genica globale. Come funzionaHo vari oligonucleotidi messi su un supporto solido. So precisamente ognuno a che gene è complementare ( più che gene, frammento di gene). Poi metto il mio CDNA (che deriva da mrna di cui voglio conoscere l'espressione) precedentemente marcato, e vedo che cosa succede.: se ho la luce -> è avvenuto il legame -> sono uguali. Se non ho la luce il legame non è avvenuto.In base a quanta luce ho capisco anche quanto quel dato gene è espresso.

Comparative genome HybridizationPrendo il DNA che voglio studiare e lo marco in verde. Prendo quello di controllo (che so essere giusto) e lo marco in rosso. Mescolo tutto sulla piattaforma con i microarray, se vedo un puntino rosso significa che ho un maggiore legame del controllo rispetto al pz e quindi potrei avere una delezione e/o il tumore sottoesprime una proteina.Se vedo verde, significa che ho un maggior legame del pz e che quindi il tumore sovraesprime una proteina.Se vedo giallo siagnifica che sia rosso che verde si legano nella stessa quantità, non ce n'è uno che prevale.

Devo pensare a ogni emissione di luce come alla somma di molte emissioni, ognuna data dal legame di un pezzettino di sonda con c DNA. Inoltre ogni sonda non è riportata una volta, ma tante.

I microarray consentono di visualizzare l'espressione di migliaia di geni tuttti in una volta sola (al contrario degli altri sistemi con i quali si poteva vedere solo un gene per volta). Ora sul vetrino posso avere migliaia disonde di DNA per evidenzare l'espressione di migliaia di proteine. Ogni sonda va su un gene specifico. Il DNA microarray (comunemente conosciuto come gene chip, dna chip o biochip).Nel northern blot il target è tutto l'RNA messaggero e la sonda che usiamo è radiattiva. Nel DNA microarray andiamo a depositare sul vetrino la rappresentazione di tutto il genoma e marchiamo rna che vogliamo testare (target). Sfruttano quindi una tecnica di ibridizzazione inversa (= fisso tutte le sondesul supporto e vado a marcare l'acido nucleico target).Abbiamo vari tipi di microarray.

Gli array (ovvero i chip) sono sintetizzati con una tecnica detta fotolitografiaca, perchè la deposizione sfrutta la luce. Con la luce viene depositato il DNA in determinate posizioni. Sintesi litografica -> è una tecnica molto accurata in questo caso gli oligonucleotidi sono sintetizzati in situ. Tuttavia c'è lo svantaggio che la massima lunghezza che gli oligonucleotidi possono raggiungere è 25 nucleotidi, ma questo non dà specificità al microarray: servono 3 oligonucleotidi che legano quel dato gene +3 con mismatch per il controllo negativo -> in tutto 6 spot. La lettura dei segnali avviene tramite scansione e ibridizzazione. I segnali di ibridizzazione corrispondono a un chiaroscuro. E ogni grado di chiaroscuro corrisponde a un numero e quindi a una traduzione quantitativa.

I microarray si possono sfruttare per diverse applicazioni, a seconda di quello che abbiamo dull'array. Se abbiamo cDNA (che è la copia dell'RNA messaggero) sulle sonde, faccio un profilo di espressione di tutti i geni e in una volta vedo tutti i geni che una cellula esprime. In questo caso ibridizzo con mRNA.Se ho tutto il genoma sulle sonde, lo uso per un'analisi del numero di copie di geni (copy number analysis / comparative genomic hybridization, che serve a vedere se abbiamo un aumento del numero di copie. In questo caso ibridizzo con DNA.Posso avere una rappresentazione delle varianti geniche, per vedere i polimorfismi, ecc...Oppure posso avere una rappresentazione dei promotori.Profili di espressione. Per studiare un profilo di espressione non uso un northern, ma un microarray. Lo studio dei profli di espressione ha questi obiettivi: per capire i meccanismi patogenetici, l'effetto di farmaci, la classificazione clinica, per marcatori diagnostici e prognostici...

L'informazione genetica è uguale in tutte le cellule, che però sono diverse per i profili di espressione. Noi vogliamo confrontare diversi tipi cellulari (cervello e rene, oppure normale e patologico) sulla base di diversiprofili di espressione genica. Vogliamo studiare l'attività di 30.000 geni contemporaneamente. Noi estriamo i trascritti dalla cellule di controllo e da quella tumorale, facciamo il cDNA, coloriamo i trascritti e li mettiamo a ibridizzare con il microchip, che contiene una rappresentazione di tutti i 28.000 geni.Usiamo il rosso (per la cellula di controllo) e verde (per la cellula tumorale): se sovrappongo rosso verde ottengo giallo. Quindi, se ho il giallo i geni sono uguali, ma se trovo spot solo verdi o solo rossi, avrò geni che si comportano in maniera diversa o nel normale o nel tumorale (infatti non si appaiano).Noi così otteniamo il profilo di espressione genica globale possiamo effettuare una comparazione, però è necessario che noi analizziamo i dati, perchè la tecnica si ferma qui.Noi dobbiamo tradurre queste immagini in numeri (in base all'intensità del segnale)e dare dei nomi a questi geni.

Ci sono vari tipi di analisi che posso attuare.• analisi comparativa. L'obiettivo è identificare differenze nel comportamento trascrizionale globale di

uno stesso tipo cellulare in due condizioni diverse (malato/ normale, trattato/ non trattato). • Analisi assoluta. Posso ricavare dei dati assoluti dallo studio che posso poi comparare con altri in

tempi e luohi divesi, senza il bisogno che i 2 campioni vengano analizzati simultaneamente. Questo consiste nel valutare se il segnale c'è, se no o se non è valutabile.

• analisi di raggruppamento: Il suo obiettivo è identificare dei geni che permettono il raggruppamento di casi clinici o condizioni specifiche, in base a determinate caratteristiche di espressione genica.

Identificazione di marcatori di malattia.Si effettua l'analisi di profili di espressione di una casistica ben caratterizzata ("training set")...seguendo questo approcio molti studi hanno desritto profili molecolari specifici di situazione paologiche. Nell'ambito di un dato tumore, si è andati a identificare un sottotipo nuovo. Nell'ambito della diagnosi vengono definiti i vari sottotipi. I profli di espressione hanno identificato, nell'ambito dello stesso tipo tumorali, dei sottotipi molecolari. Questo è importante perchè a quel sottotipo va fatta una terapia diversa, oppure quel gruppo ha una prognosi diversa. Quindi lo studio dei profili di espressione è stato utile per la diagnosi e la classificazione di sottotipi che definiamo molecolari. Li definiamo così perchè sono stati identificati in base all'espressione di un determinato gruppo di geni, utilizzando i microarray. Questo processo è detto "diagnosi molecolare".

I dati ottenuti con i microarray vanno ulteriormente elaborati e validati con un sistema indipendente, come PCR: con PCR vedo se i geni evidenziati come diversi lo sono davvero.

Uso lo studio dei profili di espressione per studiare i tumori, ecc...Seguendo questo tipo di approccio molti studi hanno descritto profili molecolari specifici per situazioni patologiche, descrizioni che servono a diagnosi, terapia e prognosi e prevenzione.EX: I profili di espressione hanno identificato, nello stesso tipo tumorale (tipo dal punto di vista istologico), dei sottotipi molecolari. Questi sono importanti perchè a quel sottotipo va fatta una terapia diversa, ha una prognosi diversa, ecc... Li chiamo sottotipi molecolari, perchè quello che classifica quei sottotipi sono i geni. Permette la distinzione tra leucemie mieloblastiche e linfoblastiche, perchè c'è un dato gruppo di geni che è più espresso in un tipo di leucemia piuttosto che in un'altra. Altrimenti queste leucemie sarebbero altamente indifferenziate. Questo ci serve perchè, a seconda del tipo di leucemia, avrò una terapia specifica. Lo studio dell'espressione genica a consentito la classificazione molecolari di melanomi cutanei, la predizione dell'out-come di tumori embrionali del SNC, classificazione dei carcinomi del polmone, ecc... Anche a scopo predittivo è stato molto utile, per prevedere, ad esempio, lo sviluppo del tumore alla mammella.Quindi è molto utile nell'ambito della ricerca di base.

Ci sono specifiche funzioni bersagliate nei campioni di analisi? (tradotto: tutti questi geni che sono stati evidenziati nei campioni di analisi come "diversi", sono tutti accomunati dall'operare su un dato pathway, su una data funzione all'interno dell'economia della cellula?)

Devo capire se il gruppo di geni che ho identificato come diversi (confrontando geni di una cellula normale edi una cell tumorale, per esempio), impattano tutti sulla stessa via di segnalazione. Quando noi studiamo il profilo di espressione, abbiamo un risultato che non coinvolge la modificazione di un singolo gene, ma di molti e quindi non si avrà modificazione di una singola funzione, ma di molte. Voglio sapere se esiste un minimo comune denominatore, se tutti questi geni che io ho evidenziato come "diversi" regolano delle vie di segnalazione comuni all'interno della cellula, ad esempio il differenziamento cellulare, la proliferazione, ecc... -> quindi, seppur con funzioni diverse, voglio sapere se operano tutti nello stesso ambito. Per capirlo devo studiare la letteratura, ovvero interpretare i dati che mi vengono forniti da questi test. Per farlo mi aiuto con strumenti informatici che mi consentono di accedere a delle banche dati, consultando le quali troverò le risposte alle mie domande.

Quindi i risultati ottenuti con i microarray vanno ulteriormente elaborati.

Per analisi comparative questa elaborazione consiste nella validazione dei dati ottenuti, con delle medotiche diverse. Una delle tecniche che possiamo utilizzare è la RT-PCR. A questo punto siamo sicuri che quella variazione che abbiamo visto è vera. A questo punto devo capire che cosa fanno i geni che ho individuato come diversi. Questo è facile perchè ci serviamo di strumenti bioinformatici che riescono a raggrupparci i geni in maniera funzionale.

Una volta identificati i geni di nostro interesse vogliamo poterli studiare in più condizioni, senza dover sempre analizzare l'intero trascrittoma. Una volta identificati i geni alterati, posso generare dei microarray più piccoli contenenti solo i geni selezionati. Quindi vado a fare dei micro-array che si chiamano CUSTOM.EX. Ho fatto microarray e ho identificato 25 geni diversi tra cellula normale e tumorale. A queso punto, per fare screening uso un microarray più piccolo e faccio ibridizzare il campione con un chip che abbia solo quei25 geni che mi interessano e non TUTTI i geni. Questo rende il tutto più maneggevole e e soprattutto molto più economico.

Noi possiamo analizzare le variazioni anche tramite PCR quantitativa, che chiamiano high throughtput (= ampio spettro). Esiste la possibilità di ordinare PCR quantitative precostituite per un numero definito di geni (ad esempio 96) dove vado a validare solo quei 96 geni. Ordino 96 taqman diverse per evidenziare 96 geni diversi.

Vantaggi e svantaggiLa PCR è più sensibile, valida i risultati del microarray (perchè è un metodo alternativo), ma costa MOLTO di più (la Taqman, infatti, è molto costosa).

Vediamo come esempio il tumore della mammella. I profili di espressione genica sono stati utili per la classificazione del tumore della mammella. In particolare è stato identificato un sottotipo nuovo, quello "basale", con un decorso e un trattamento farmacologico diverso dagli altri due tipi di tumore alla mammella.Prima, con l'esame istologico, non si identificava questo tipo.

L'identificazione del profilo di espressione mi va a identificare un gruppo con una prognosi diversa.

Lo studio dei profili di espressione ha anche prodotto una quantità infinita di pubblicazioni, perchè in tutto il mondo tutti li hanno usati per diagnosticare, prognosticare, ecc... E molti risultati sono stati discordanti tra loro o perchè le popolazioni di studio non erano omogenee tra loro, o perchè nell'analisi dei dati ho utilizzatodelle piattaforme diverse.

La conclusione è che i profili di espressione genica non risultano sempre informativi ai fini diagnostici e prognostici. Affinchè risultati degli studi siano validi, devono essere crossvalidati in diverse parti del mondo.

Il 6 febbraio del 2007 è stato reso pubblico il mammanatriv, il primo test di espressione genica approvato perla diagnostica. Predice il rischio metastatico del tumore alla mammella in stadio precoci, studiando lo studio di livelli di espressione di 70 geni. Se un pz ricade in un gruppo ad alto rischio, la pz deve sottoposti a esami con frequenza maggiore e assumere determinati farmaci o no, ecc... In questo modo andiamo a personalizzare il trattamento delle pazienti.

Esistono anche i tissue mAcroarray. Rappresentano sempre un'analisi su larga scala (highthroughtput). Sul vetrino mettiamo tanti tessuti e ogni pallino sul vetrino rappresenta un dato tessuto. Possiamo farlo utilizzando campioni di tessuti normali o campioni di tessuto tumorale (i campioni sono inclusi in paraffina). Noi ci costruiamo un tissue macroarray selezionando tanti blocchetti di paraffina, ogni blocchetto co un tessuto. Da questo blocchetto prelevo un pezzettino che andrà a rappresentare un puntino sul vetrino. Interessante è quello il tissue macroarray di progressione: posso valutare in quale fase della malattia è espresso il marcatore che sto studiando, perchè sul vetrino ho tessuti diversi, ognuno per un diverso stadio della malattia.

Possiamo ibridizzare mRNA marcato specifico rappresentativo di quel gene -> ibridizzazione in situ (ISH). Oppure possiamo ibridizzare l'anticorpo contro la proteina che studiamo nel tessuto -> facciamo immunoistochimica (IHC). La tecnologia dei macroarray consente il processamente parallelo di un gran numero di geni, velocizzando così molto la clinica. È a basso costo e ad alta risoluzione.

Il tissue macroarray può essere utile come approccio complementare. Studio i geni, i profili di espressione con il microarray di DNA e poi i risultati li posso validare un tissue macroarray.

METODO DI SEQUENZIAMENTOUno è il metodo di Maxam e Gilbert che non viene più utilizzato, ma lo dobbiamo sapere. Era un metodo non enzimatico, non un metodo di sintesi del DNA, come quelli attuali. Questo metodo utilizza una degradazione chimica del DNA.Come funziona? Faccio una marcatura con P32 per rendere visibili i frammenti al 5'. taglio il DNA in 4 provette e in ognuna di queste ci sono dgli enzimi che tagliano uno specifico nucleotide (solo T o T+D, ecc...). poi faccio correre su elettroforesi (in colonne separate per ogni provetta, ma adiacenti) e leggo i risultati. Questi risultati li posso leggere grazie alla marcatura.

Metodo di Gilbert. È importante sapere che non è un metodo di sintesi (non ha dna polimerasi), ma trattamenti chimici che agiscono a livello dei singoli nucleotidi. Piperidina va a tagliare dove la sostanza ha modificato

• devo ricordare che è un metodo non enzimatico• chimico che usa sostanze tossiche• la pipiridina taglia il dna• i frammenti sono caricati su gel di poliacrilamide• viene fatta autoradiografia

Ma oggi questo metodo non si usa più.Il metodo che viene largamente utilizzato ora (anche se esistono dei metodi della post genomica) è il metodoSanger. Questo metodo è stato inventato da Sanger che ha ricevuto un nobel per la chimica nel 1980. questo è un metodo per sequenziare il dna diverso, perchè usa dei nucleotidi particolari, che sono chiamati terminatori di catena e sono dideossinucleotidi. Il metodo sanger è un metodo a terminazione di catena. Lui era un chimico e ha capito che poteva modificarei 4 nucleotidi e utilizzare anche un terminatore di catena, il dideossinucleotide. Questo sequenziamento coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di dna. Non è quindi un metodo chimico, ma di sintesiò. Questi filamenti sono complementari al filamento stampo (di cui vogliamo conoscere la sequenza). Dato che è un metodo di sintesi, deve usare la DNA polimerasi (che è la sequesnasi o la klenow). Ha delle caratteristicheNel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad uno stampo a singola elica ha bisogno di:

• un innesco specifico/primer.• marcatura. il deossinucleotide è marcato con fosforo radiattivo 32 o zolfo 35 (rispetto al fosforo 32 è

più maneggevole perchè ha un'emivita di una settimana e quindi più breve e poi perchè per lavorare il fosforo ho bisogno di schermi e quindi è abbastanza scomodo. Quando usi lo zolfo 35, la plastica èsufficiente come schermo e quindi non te ne serve altro ed è più maneggevole per l'operatore.

A questo punto ho il filamneto di cui voglio conoscere la sequenza (nero), il primer che aggiungiamo, la dna polimerasi e, se utilizziamo un nucleotide (in questo caso ipotizziamo la guanina) marcato con zolfo, quando

si incorpora la G, questa sarà marcata, mentre le altre basi complementari al filamento di cui vogliamo conoscere la sequenza saranno fredde (non marcate con isotopo). Ma oltre a questo, abbiamo anche dei terminatori di sequenza, che sono dei dideossinucleotidi trifosfato, 1 per ogni reazione di sequenza. Si chiamano terminatori della catena perchè sono uguali ai nucleotidi normali ma, in posizione 3', manca l'ossigeno. Sonoterminatori di sequenza perchè, quando la polimerasi li incorpora, la polimerizzazione della catena si blocca: noi sappiamo che dove si blocca è perchè nel filamento complementare esisteva una C (nel caso in cui io abbia usato un dideossi G).

Dntp = deossinucleotidi. Hanno un'idrossile in posizione 3', che consente l'aggiunta di altri nucleotidi. Non ha ossidrile il dideossi, non può quindi aggiungere altrinucleotidi e per questo è un terminatore di sequenza.

Il filamento nero è quello di cui vogliamo conoscere la sequenza. Poi abbiamo un mix di deossinucleotidi. Poi faccio 4 provette: in una metto il deossi A, in un'altra il terminatore C, e cos' via per tutti le basi. Quando incontra una c il complementare è una g e aggiunge una g che termina la saquenza (se siamo nella provetta dove il terminatore di basi è una g).tutte questi frammenti li carichiamo e facciamo un gel di poliacrilamide, ogni provetta una colonna.Abbiamo, a seconda dei vari terminatori, varie colonne. Usiamo poliacrilamide perchè i frammenti sono piccoli. Il gel è verticale. Se faccio un autoradiografia vedo le bande perchè era radiattivo. Leggo la sequenza dal basso verso l'alto in maniera manuale. Adesso si usano delle sostanze fluorescenti invece del determinatore radiattivo. Inoltre non si usa più un sistema manuale di sequenziamento. Il principioè però sempre lo stesso. Ora ai terminatori di sequenza si legano delle sostanze fluorescenti e noi valutiamo le diverse emissioni che sono riportate dalle macchine come picchi.

METODO DI SEQUENZIAMENTO DI NUOVA GENERAZIONENon devo sapere di preciso come funziona. Questo non significa che il metodo Sanger è stato abbandonato. Infatti, ogni volta che si utilizza un metodo NGS, si fa la validazione del risultato con il metodo Sanger (ovviamente non di tutto il genoma, perchè ci vorrebbe troppo tempo, ma solo di quel pezzettino di interesse). È utilizzato, quindi, ancora in tutto il mondo.

Per ogni azienda (o piattaforma) esiste una modalità diversa di sequenziamento. Esistono inoltre dei vantaggie degli svantaggi (economici e qualitativi) tra le diverse industrie. Illumina/solexa è la piattaforma più utilizzata in tutto il mondo e i dati di NGS che troviamo pubblicati sulle riviste scientifiche sono ricavate da questa piattaforma. Da sapere in generale di che cosa si parla il sequenziamento di ultima generazione. Caratteristica principale di Sanger è l'utilizzo dei dideossinucleotidi.

Voglio sequenziare 300 pazienti con un tumore per capire quali mutazioni e con che frequenza queste mutazioni ci sono nei pazienti malati. Per farlo non userò un metodo Sanger, perchè lungo e costoso. Perciò si usano i metodi di ultima generazione. I vari centri si uniscono tra loro per decidere di sequenziare il genoma di un grande numero di pazienti. In Italia esiste "Allenaza contro il Cancro", è un'istituzione di cui se ne occupa il Ministero della Salute. Vari ospedali in tutta Italia ne fanno parte: come obiettivo hanno quello di campionare i vari tipi di tumore, le varie linee primarie (ovvero le linee di cellule staminali tumorali) in tutta Italia. Questo comporta uno sforzo enorme, perchè il campione (tessuto) non è facile da raccogliere (sono o paraffinati o congelati). Questi campioni raccolti paraffinati o congelato vengono centralizzati e sequenziati con i metodi NGS. Con questi metodi e le piattaformi illumina posso caratterizzare le mutazioni che differenziano un paziente da un altro.

Il principio generale del NGS si basa sul principio del sequenziamento di cluster clonali. Abbiamo quindi del DNA frammentato (infatti per sequenziare il DNA, qualunque metodo utilizzi, otteniamo dei frammenti di DNA) che viene amplificato e vengono prodotti miliarsi di cloni (= tante molecole identiche tra loro), tramite la PCR. Questo processo è detto amplificazione clonale. Il processo, che inizia con una singola molecola target, prevede la creazione di target clonali durante un processo intermedio di amplificazione. Copie multiple identiche sono infatti necessarie per avere un alto rapporto segnale/ rumore (=risultato altamente specifico). Questo è il principio del sequenziamento di nuova generazione.

Perchè ci sono voluti 10/13 anni per sequenziare l'intero genoma, quando ora ci sono metodi che vanno a sequenziare il genoma in un giorno spendendo pochissimi soldi? Perchè prima si usava il metodo Sanger, cheera un metodo ad alta processività -> hanno usato dei robot e nonostante tutto hanno impiegato moltissimo tempo. Questo perchè il Sanger prevedeva frammentazione casuale del DNA genomico.

Come si frammenta il DNA? Il DNA si frammenta o con enzimi di restrizione o con metodi fisici come gli ultrasuoni (sonicatore).Una volta frammentato, ogni frammento andava clonato nei batteri e bisognava poi trasformarlo nei batteri (vedi prima). Le colonie andavano poi raccolte, purificate e sequenziate con il metodo Sanger, che utilizza unelettroforesi capillare per ottenere l'eettroferogramma con tante sequenze di piccoli frammenti che andavano assemblate.Per questo ci sono voluti così tanti anni, nonostante ci fossero i robot che automatizzassero tutto il sistema. Il NGS ha abolito il clonaggio nei batteri; noi ora frammentiamo il DNA e poi per ogni frammento otteniamoun clone amplificando con la PCR. Quindi abbiamo migliaia di rappresentazioni di quel frammento senza dover ricorrere ai batteri, cosa che ci porta via un sacco di tempo. Questa è la differenza sostanziale tra le duetecniche che fa sì che sia molto più veloce ed economico NGS.

Nel sequenziamento di nuova generazione si ha:1. preparazione della libreria con la frammentazione casuale del DNA genomico e con la ligazione

degli adattatori. Gli adattatori sono sequenze ligate a frammenti di DNA indipendentemente dalla loro sequenza che funzionano da primer, altrimenti la DNA polimerasi non funziona. Infatti, non posso mettere il primer della sequenza che sto sequenziando, dato che, appunto perchè la sto sequenziando, non la conosco. Uso quindi come primer questi adattatori universali, su cui si attacca la mia DNA polimerasi, consentendomi così di fare la PCR.

2. amplificazione clonale dei frammenti3. sequenziamento mediante due metodi: sintesi o ligazione4. processamento delle immagini5. mappatura delle reads (ogni lettura del singolo frammento è chiamata read) su un genoma di

riferimento (o assemblaggio de novo). Il sequenziamento è più efficace se abbiamo più reads dello stesso frammento e quindi più possibilità di avere un'informazione corretta.

Vantaggi delle piattaforme di nuova generazione:• non si usa più la subclonazione, ovvero non usiamo più le cellule batteriche di E. Coli. Questo porta

all'eliminazione del bias della clonazione e aumento della rapidità nel preparare le librerie, toglie i problemi nella gestione della colonia batterica

• Ciascuna sequenza viene da una molecola di DNA unica• Fornisce un'eccezionale risoluzione per molti tipi di esperimenti • meno costi• meno tempo, perchè i dati di sequenza sono prodotti anche in parallelo.

Svantaggi delle piattaforme di nuova generazione:• sono prodotte sequenze più corte. Nel Sanger, con un frammento di 500 basi, potevo leggere fino a

350 400 bp. Ora si possono leggere correttamente solo sequenze più corte. All'inizio si leggevano solo sequenze di 30-60 bp, ora di 100 bp. Ma la tecnologia è in evoluzione.

• La mole enorme di dati "traumatizza" le infrastrutture informatiche. Per ogni corsa vengono prodotti fino a vari tera di dati grezzi, il processamento delle read tramite pipeline informatiche (esegue i dati in parallelo e non in serie), cosa che richiede molta capacità di calcolo ed è necessario prendere accurate decisioni su cosa salvare e su cosa cancellare. Quindi bisogna avere delle struture bioinformatiche adatte a processare tutti questi dati che vengono prodotti. Inoltre servono i bionformatici che abbiano le giuste pipeline per processare tutto questo e la giusta dose di memoria informatica per farlo.

• Difficoltà di assemblare sequenze corte de novo, soprattutto per il problema delle sequenze ripetute complicato ancora di più rispetto a Sanger (lunghezza media 700-750bp). Queste piccole sequenze che ottengo le devo poi ricombinare.

Quando utilizzo uno di questi medoti NGS ottengo tutta una serie di frammenti (le reads). Come faccio a ricomporli? Ho bisogno di una sequenza di riferimento. Quale? Quella codificata nel 2000 con il metodo Sanger. Senza Sanger, infatti, il NGS non potrebbe esistere. Quando si vuole vedere se il genoma di un paziente è mutato, invece, si fa una biopsia e si estrae il DNA e losequenzio con NGS. Questa volta non utilizzo come genoma di riferimento quello del 2000, ma il genoma

(sano) del paziente di cui vogliamo studiare la mutazione nel tumore, genoma che estraiamo dal sangue del paziente. Perchè confronto il DNA mutato con quello dello stesso paziente e non con quello del 2000? perchè voglio vedere se la mutazione che riscontro è una mutazione somatica (e quindi incorsa nel corso della vita del paziente, non già presente alla sua nascita) oppure un polimorfismo (quindi presente già dalla nascita nel suo genoma e non causata da fattori ambientali).A volte succede che nelle cliniche e negli ospedali si conservano i campioni paraffinati, ma non il sangue di paziente e questo è un problema.

Tutte le piattaforme next-gen offrono la possibilità di produrre ‘paired-end read’, cioè la sequenza può esserederivata da ciascuna delle due estremità di ogni frammento della libreria. Esistono differenze nella distanza tra le due read pair-end, basate su un diverso approccio/piattaforma. In generale, le reads paired-end offronovantaggi che dipendono dalla complessità del genoma e dall’applicazione/tipo di esperimento.

La piattaforma più usata è quella Illumina. Ecco come funziona:Viene preparato lo stampo (template) -> viene frammentato il DNA -> lo stampo include il DNA da seguenziare ligato a delle sequenze adaptor a cui si legano dei primer universali (in questo modo il frammento può essere amplificato dalla DNA polimerasi che ha bisogno di un primer). Il template è attaccatoo immobilizzato su una superficie solida o un supporto, permettendo così di fare milioni di reazioni di sequenza contemporaneamente. Nei vetrini ci sono delle camerette in cui c'è lo stampo frammentato.A questo punto viene fatta l'amplificazione clonale del template per amplificare il segnale fluorescente e questo forma cluster di cloni di DNA, ognuno dei quali è spazialmente separato.Il sequenziamento si basa su una terminazione ciclica reversbilile (al contrario del Sanger che è irreversibile)che comprende l'incorporazione di nucleotidi fluorescenti di 4 colori diversi -> viene fatto imaging (=trasmessa la fluorescenza) per determinare l'identità dei nucleotidi incorporati-> dopo che questa fluorescenza è stata registrata, il nucleotide che si è appena attaccato si stacca, si ha il lavaggio, e si ha l'attacco di un altro nucleotide e così via per tanti cicli. Quindi abbiamo dei terminatori reversibili -> non è che quando sono incorporati la sintesi si blocca, ma vengono inglobati e poi si staccano (diverso da quello che avviene per il Sanger).

Queste nuove tecniche danno meno falsi positivi e meno problemi tecnici partendo da un campione congelato (= quando hanno prelevato il tumore un pezzo lo hanno messo a -80°C, mentre l'altro è messo in paraffina) che quindi è meglio di quello in paraffina. La parte in paraffina serve a fare i tests di immunoistochimica. Quando è fatta una biopsia il materiale non è tanto e quel poco che c'è serve come fresco (per isolare le colture primarie), come congelato e come paraffinato (per la diagnosi immunoistochimica). Ora questa procedura (il congelamento) si fa, perchè esistono le biobanche, ma in passato questo non si faceva. Quindi la maggior parte dei materiali pubblicati, specie in passato, derivano da materiale parffinato e quindi ci sono molti falsi positivi. Questo porta alla necessità di validare i risultati che ottengo (a fronte del fatto che il materiale che ho sequenziato è più suscettibile a falsi positivi perchè paraffinato); come? Con Sanger.Quindi uso Sanger perchè non ho il campione di sangue a cui fare riferimento e perchè il campione paraffinato mi dà un risultato che necessita di essere validato, perchè ricco di falsi positivi.

Quali sono le applicazioni?DNA sequencing -> Identificazione di variazioni genitiche e di come queste variazioni possono contribuire allo sviluppo della malattia.Ecc...Si possono sequenziare solo gli esoni (exon sequencing): questo riduce i tempi e i costi di sequenziamento. Ha permesso di scoprire la patogenesi tumorali, e di altre malattie. EX.Un altro lavoro consente di sequenziare il soma di 14 pazienti affetti da schizofrenia e hanno identificato delle nuove mutazioni in questo gruppo di pazienti.

Il NGS è stato utile anche per comprendere dei meccanismi cellulari ed è applicato anche in altre maniere. Inparticolare ora viene fatto un RNA sequencing, anche lui fatto su larga scala. Questa tecnica NGS ci sonsente non solo di sapere quali geni sono più espressi nella cellula (cosa che ci dicevano anche i microarray), ma anche la loro sequenza, dandoci quindi un maggior numero di informazioni (splicing alternativi, ecc...). Per questo ora nei vari laboratori non si usa più microarray.

Un'altra applicazione del NGS è lo studio dei promotori, che avviene attraverso la ChIP sequencing. La ChIP (Chromatine Immuno Precipitation) consiste nell'immunoprecipitazione della cromatina, che si attua tramite anticorpi contro gli istoni che si legano nella regione di DNA che voglio far precipitare. ChIP sequencing aggiunge alla ChIP normale anche il sequenziamento della cromatina che è stata precipitata, permettendomi quindi di studiare quello specifico DNA che interagisce specificatamente con quelle proteine.Si ottiene così un profilo epigenetico.

Si sta cercando di fare un single cell sequencing e quindi sequenziamento a livello della singola cellula. Questo perchè il tumore ha una popolazione eterogenea e a me interessa conoscere tutte le mutazioni di tutte le cellule che compongono il tumore -> si vuole risolvere l'eterogeneità del tumore.

Ci sono delle mutazioni che sono responsabili dello sviluppo del tumore. Queste mutazioni sono state scoperte tramite NGS. Il metodo a volte è stato un whole genome (sequenziato intero genoma), a volte un exone genome (solo degli esoni).

Problemi e sfide dei NGS.• Le generazione rapida di un'enorme quantità di dati di sequenza rappresenta una sfida per la gestione

di questi dati. • Bisogna validare l'associazione tra genotipo e fenotipo (quella mutazione è responsabile di quel

fenotipo). • Bisogna introdurre uno standard di controllo di qualità per i dati disequenza: tutti i dati usano delle

piattaforme; quando noi analizziamo questi dati dobbiamo anche essere sicuri che la piattaforma sia stata usata nella maniera corretta -> è quindi molto imprtante identificare i falsi positivi dai falsi negativi. Questi problemi sono stati presi a cuore dal Sequencing Quality Progect. La problematica, quindi, è vera ed è stata analizzata scientificamente da organismi specifici.

Nonostante queste sfide e queste problematiche, NGS ha permesso lo sviluppo della medicina personalizzata.Vado a raggruppare i pazienti a seconda delle loro caratteristiche genomiche, caratteristiche che identifico tramite queste tecniche di sequenziamento.EX: a seconda del corredo genetico di quel paziente so se quel farmaco gli darà o meno problemi.