Biomaterials Research (2008) 12(1) : 35-39

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Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

백서 모델에서 갑상선 절제술 후 Poloxamer/Alginate/CaCl2 유착방지제의 효과

Anti-Adhesive Effect of Poloxamer/alginate/CaCl2 after Thyroidectomyin a Rat Model

김준호1·이윤기

1·추보영

1·김남현

1·권성원

2·김광일

3·이진호

4·이영우

1*

Jun Ho Kim1, Yun Gee Lee1, Boyoung Chu1, Nam Hyun Kim1, Sung Won Kwon2, Kwang Il Kim3,Jin Ho Lee4, and Young Woo Lee1*

1(주) 바이오레인, 2포천중문의대 분당차병원 외과학 교실, 3

포천중문의대 분당차병원 병리학교실, 4한남대학교 신소재공학과

1Biorane Co., Ltd, R&D Center, 411 Gumkang Hitech Valley, Seongnam 462-724, Korea2Department of Surgery, Pundang CHA Hospital, Pocheon CHA Medical College, Pocheon 487-801, Korea3Department of Pathology, Pundang CHA Hospital, Pocheon CHA Medical College, Pocheon 487-801, Korea4Department of Advanced Materials, Hannam University, Daejeon 305-811, Korea(Received February 15, 2008/Accepted February 21, 2008)

This study was conducted to compare the effectiveness of Poloxamer/alginate/CaCl2 for reducing adhesion after thy-roidectomy in a rat model. Tissue adhesion is one of the major causes of well known postsurgical complications,including patient's pain, functional obstruction and difficult preoperative surgery. Several adhesion barriers have beendeveloped in the form of solution or membrane in an attempt to solve the postsurgical problems. However both typesof tissue barriers have some limitations in their practical applications. In order to overcome these problems, a tem-perature-sensitive Poloxamer/alginate/CaCl2 was prepared as an adhesion barrier. The sol-gel transition behavior wasmeasured using a viscometer. And in vitro gel stability test was performed. The anti-adhesion effect was evaluated usinga thyroidectomy model. Two week after surgery, the level of adhesion was graded from zero to two using a whole-number system. And also toxicity, inflammation and the adhesion prevention effect were evaluated. The LCST (lowercritical solution temperature) of the Poloxamer/Alginate/CaCl2 was 25oC. The gel stability of Poloxamer was improvedby adding cross-linked sodium Alginate/CaCl2. The adhesion grade was significantly lower in the experimental groupthan in the control. From the results, Poloxamer/alginate/CaCl2 is an excellent candidate material having highly effectiveanti-adhesion, low inflammatory response, and non-toxicity for clinical applications as a tissue adhesion barrier gel.

Key words: Adhesion prevention, Poloxamer, Alginate, Animal model, Thyroidectomy

서 론

착이란 서로 떨어져 있어야 할 장기나 조직들이 달라붙

는 현상이다. 이러한 유착 발생의 원인으로는 외상, 허

혈, 이물질 등이 있으며, 가장 큰 원인이 되는 것 중 하나는

수술이다. 수술 후 유착은 수술이라는 근본적인 침습적 특성으

로 인해 실제로 모든 수술 후에 발생할 수 있으며, 심각한 임

상적 후유증을 초래할 수 있다. 몇 가지 외과적 수술, 즉 골

반 수술 (자궁, 난관, 난소 수술), 결장수술 (대장 및 소장), 맹

장절제술, 담낭절제술 등이 특히 유착의 형성 경향이 큰 것으

로 알려져 있다. 복부와 골반수술 후 유착발생율은 55-94%

범위에 이르고 이런 수술을 받은 모든 환자 중 평균 80-85%

에서 유착이 형성된다.1-5) 이러한 유착은 장폐색증6), 만성통증,

성기능 장애, 불임 등의 원인이 되며, 비 수술적 치료로 증상

의 호전이 없으면 수술적 치료로 전환을 적극적으로 고려해야

하며7) 2차 수술 시 의사와 환자에게 많은 어려움을 준다. 2차

갑상선 절제술은 간헐적 수술 처치로서 이환율 증가와 관련되

며, 흉터에 의해 발생하는 정상조직면의 손실로 인한 반회후두

신경(recurrent laryngeal nerve) 손상과 부갑상선 기능저하증과

관련된다.8) 2차 갑상선 절제술의 주요 적응증은 갑상선 조직

의 제거 후 암의 발병, 갑상선 암의 재발, 단발성 혹은 다발

성 결정성 갑상선종 그리고 갑상선 중독증 등이다.9) 유착을 방

지하기 위해서 흉쇄유돌근의 안쪽 가장자리를 통한 역행 접근

이 추천된다.10)

두 손상된 조직 표면이 직접 닿지 않도록 사이에 처치해 주

는 제품을 유착방지제라고 하지만 종종 만족스럽지 못한 결과

를 낳기도 한다. 이는 제품 자체의 유착방지 효과 때문이기도

하지만, 제품의 처치가 용이하지 않은 이유도 있으므로 좀 더

효과적이고 잘 분해되며 적용이 쉬운 제품이 필요하다. 현재까

지 물리적 장벽 역할을 하는 유착방지제로는 용액 혹은 막*책임연락저자: twins@groupdsc.com

유

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Biomaterials Research 2008

(membrane) 형태로 제조되어 임상에서 쓰이고 있다. 일반 외

과와 산부인과에서는 유착방지제의 사용이 많이 시도되고는 있

으나, 용액형의 경우 쉽게 분해, 흡수되는 것으로 알려져 있으

며, 막 형태의 유착방지제는 형태의 변형, 사용상의 불편 등

여러 단점을 보이고 있다.

본 연구에서는, Poloxamer와 alginate를 주원료로 하는

Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제를 제조하여 lower critical

solution temperature (LCST) 및 젤 안정성을 평가하고자 하

였다. 또한, Ozgur 등 (2004)11)의 논문에 따라 Sprague-

Dawley rat의 갑상선 절제술 모델을 만들어 Poloxamer/

alginate/CaCl2 유착방지제를 처치한 실험군과 아무것도 처치하

지 않은 대조군에서의 유착 발생 정도 및 주요장기를 비교하

여, 유효성과 안전성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제의 제조

유착방지용 재료로서 polyethylene glycol-polypropylene

glycol-polyethylene glycol (이후 Poloxamer라 함; BASF,

Ludwigshafen, Germany), sodium alginate (Sigma, St. Louis,

USA)와 CaCl2를 사용하여 가교하였다. 위의 용액은 각각 실험

전에 120oC에서 20분간 고압증기 멸균한 후 사용하였다.

LCST 측정 및 젤 안정성 실험

Lower critical solution temperature (LCST)는 Brookfield

점도계(Model DV II, Brookfield Laboratories, Stoughton,

MA)를 이용하여 측정하였다. 10-40oC 사이에서 점도가 급격하

게 변하는 온도를 LCST라 정의하였다. 젤 안정성 실험은, 1)

Poloxamer 용액, 2) Poloxamer/alginate 용액, 3) Poloxamer/

alginate/CaCl2 가교 용액의 3가지를 각각 vial에 2 mL씩 분

주하여 37oC 인큐베이터에서 20분 이상 정치 후 같은 온도의

PBS를 동량 첨가하여 인큐베이터 내에서 정치하였다. 7일간 매

일 PBS를 교환 하였으며, 이때 잔류하는 젤의 용적을 측정하

여 처음 젤의 용적량과 백분율로 환산하였다.

유착방지 효과 및 주요 장기에 대한 독성 실험

유착방지 실험을 위한 동물은 Sprague-Dawley rat (male,

Daehan Biolink Co., Korea)을 사용하였으며, 10주령의 몸무

게 275~325 g의 것을 사용하였다. 모든 실험동물은 이의 사

용과 관리에 대해 식약청의 실시기준에 따라 관리되었다. 실험

동물은 대조군 10마리, 실험군 10마리로 총 20마리를 시술하

였고, 실험동물의 마취는 Zoletil 50 (0.2 mL/kg, virbac lab.,

France)과 Rompun (0.03 mL/kg, Bayer Korea., Korea)을 섞

어 근육 주사하였고, D-PRON (Handong Co., Korea)과

Gentamycin (Daesung Microorganism Institue, Korea)을 수

술 후 주사하였다. 마취가 되면 목 부위의 털을 제거한 뒤,

에탄올과 포비돈 용액으로 소독해 주었다. 사지를 결박하고, 마

취된 쥐의 목 부위를 약 2cm 가량 중심선과 수직 방향으로

절개한 후, 악하선과 근육이 손상되지 않도록 조심하면서 오

른쪽 갑상선을 노출시킨 뒤, 혈관겸자를 이용해 혈관을 묶어

두고 갑상선의 대부분을 절제 한 다음, 혈관을 결찰해 주었다

. 이때 과다 출혈이 발생할 경우 흡인기와 전기소작기를 이용

하여 지혈하였다. 이후 대조군에는 아무것도 처치하지 않고 봉

합하였으며, 실험군에는 근육과 갑상선 조직 사이에

Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제를 넣어 물리적 장벽 역할

을 해 주도록 하였다 (Figure. 1). 수술이 끝난 동물은 2주간

사육 후 희생시켜 유착정도를 측정하였으며, 각 군에서 각각 5

마리씩 간, 비장, 신장 등을 적출하여 H&E 염색을 시행한 후

Figure 1. Procedure of sialoadenectomy in a rat model. (a) incision, (b) exposure of trachea, (c) control, (d) injection of Poloxamer/alginate/CaCl2,and (e) suture.

백서 모델에서 갑상선 절제술 후 Poloxamer/Alginate/CaCl2 유착방지제의 효과 37

Vol. 12, No. 1

조직학적 소견을 관찰하였다. 유착정도는 0에서 2까지 분류하

였으며, 0 = 유착이 없는 경우, 1 = 유착이 얇게 형성되어

무딘 도구로도 쉽게 분리되는 경우, 2 = 유착이 두껍고 강하

게 형성되어 쉽게 분리되지 않고 분리하기 위해서는 예리한

도구가 필요한 경우로 분류하였다.11) 각 군에서 유착의 정도

를 앞에서의 기준에 따라 구분하여 평가하였으며 평가 시에는

평가자가 실험군을 알 수 없도록 맹검을 실시하여 객관성을 높

일 수 있도록 하였다. 유착정도의 측정값은 평균값과 이의 표

준편차(Mean±Standard Deviation)로 표시하였다. 측정값에 대

한 통계처리는 Student T-test를 이용하였고, p-value는 0.05

이하를 유의성 있는 것으로 보았다.

결과 및 고찰

Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제의 제조

생체 적합성 고분자인 Poloxamer에 sodium alginate와

CaCl2를 가교시켜 안정성을 가지며 주사주입 가능한 유착방지

제를 제조하였다.

현재까지 물리적 장벽 역할을 하는 유착방지제로는 용액 혹은

막(membrane) 형태로 제조되어 임상에서 쓰이고 있다. 용액형

유착 방지제는 수용성 생체 고분자 용액을 재료로 하여 제조되

고 있으며, dextran,12) heparin,13) carboxy methylcellulose

(CMC),14) hyaluronic acid(HA),15) chondroitin sulphate16) 등

의 용액이 사용된 바 있다. 막 형태의 유착방지제로는 Teflon

sheet, HA/CMC의 투명 필름(Seprafilm, Genzyme Biosurgery)

및 산화재생 셀룰로오스의 직물(Interceed, Johnson &

Johnson)이 사용되고 있다. 용액형의 경우 특정한 형태 없이

액체 상태로 녹아져 있으므로 수술 부위에 집중되지 못하고 복

강 내에 전체적으로 퍼져 있으며, 중력의 작용에 의해 아래쪽

에 고이게 된다. 또한 용액형은 가교되지 않은 고분자를 사용

하기 때문에 쉽게 분해, 흡수되는 것으로 알려져 있다. 반면,

막 형태의 유착방지제는 수술 부위에 고정되어 존재할 수 있

으므로 유착방지 효과가 액체형 보다 우수한 것으로 알려져 있

다. 하지만 막 형태의 유착방지제 또한 형태의 변형, 사용상의

불편, 복강경 수술 적용의 한계 등 단점을 보이고 있다. 생체

적합성인 Poloxamer는 소수성의 약물을 비교적 잘 녹이는 성

질이 있어 제약 분야에서 널리 이용되고 있으며, Poloxamer

내의 PEG (polyethylene glycol) 성분은 친수성으로 세포의 부

착을 막아 조직의 유착을 방지하는 것으로 알려져 있다. 하지

만 체액에 의해 희석되고 쉽게 흡수되어 유착방지 효능을 유

지시키기가 어려웠다. 이에 본 연구에서는 이를 극복하고자 약

하게 가교된 alginate를 첨가하여 Poloxamer의 안정성을 증가

시켰다. Alginate는 다당류의 일종으로 CaCl2와 같은 2가 양이

온에 의해 쉽게 가교되어 젤을 형성한다. 가교된 alginate는 생

체 적합성, 생분해성, 무독성 등의 특성17,18)으로 인해 약물이

나 세포의 담체로 널리 이용되고 있다.19,20) 하지만 일반적으로

사용되는 농도(2%)로 가교된 alginate는 너무 단단해 주사주입

이 불가능하여, 본 연구에서는 상당히 낮은 농도로 약하게 가

교하여 젤의 안정성을 적절히 유지시키는 한편 사용이 편리하

도록 하였다.

LCST 측정 및 젤 안정성 실험

제조된 Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제는 25oC 이하에

서는 졸(sol)형태로 흐름성이 있으며, 25oC 이상에서는 젤(gel)

을 형성하여 흐름성이 없어졌다. 또한, 다시 온도가 내려가면

졸을 형성하여 가역적으로 졸-젤 전이됨을 확인하였고, 이 제

재의 LCST는 약 25oC 임을 확인하였다(Figure 2). 따라서 이

유착방지제는 25oC 이하로 보관 시에는 흐름성이 있는 졸로

주사 주입이 가능하며, 체내에 투여되면 흐름성이 없는 젤이

되어 유착이 예상되는 위치에서 장벽 역할을 수행할 수 있을

것으로 생각된다. Gel 안정성 실험 결과 Poloxamer/alginate를

CaCl2 로 가교시킨 것이 Poloxamer 단독 혹은 Poloxamer/

alginate 혼합액에 비해 안정성이 늘어 7일 후에도 처음의

60% 이상의 젤이 잔류하고 있는 것을 확인할 수 있어 (Figure

3), Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제는 최소한 7일 까지는

장벽 역할을 할 수 있을 것으로 판단되어 진다.

유착방지 효과 및 주요 장기에 대한 독성 실험

연구기간 동안 수술에 의해 사망한 동물은 없었다. 유착 상

태를 육안으로 확인하기 위해, 시술시와 마찬가지로 조심스럽

게 목 부위를 절개하여, 갑상선을 적출한 부분의 유착여부를

확인하였다. 실험에서 대조군의 유착 등급이 1.35±0.75, 실험

군인 Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제의 유착 등급이

0.63±0.35으로 나타나 대조군에 비해 유착의 등급이 감소되었

음을 확인할 수 있었고, T-test 결과 p = 0.02로 나타나 통계

적 유의성을 확인할 수 있었다(Figure 4). 유착 형성 과정은

복잡하며, fibrinolytic mechanism의 부재, 변형과 염증성 세

포, 장간막 세포(mesenterical cells), 섬유모세포(fibroblasts) 등

다양한 세포의 증식과 이동을 포함한다. 또한 세포외 기질의

합성과 침착 등도 포함된다. 위의 유착기전에 근거하여 유착을

Figure 2. Sol-gel transition behavior of Poloxamer/alginate/CaCl2according to the environmental temperature. The lower critical solu-tion temperature was 25oC.

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Biomaterials Research 2008

방지하는 방법으로 몇 가지 방법이 제안되었다. 그 하나는 수

술시 손상을 최소화하는 것이다. 두 번째로는 스테로이드 및

소염제를 투여하여 염증을 감소시키는 방법이 있다. 그리고 세

번째로는 tPA(tissue plasminogen activator) 활성을 증가시키는

방법이 있으며, 마지막으로 최근에는 상처 면을 주변조직과 분

리시키기 위한 물리적 장벽을 사용하는 것이다. 장벽용으로 사

용하는 경우 조직의 상처가 치유되는 동안 물리적인 장벽으로

작용하며, 인접한 조직 사이에 유착이 형성되는 것을 막아주고

일정기간의 상처 치유가 끝난 후에는 분해 혹은 흡수되어 제

거되어야 한다. Poloxamer/alginate/CaCl2 유착방지제가 창상

조직을 precoating 하고 물리적 장벽으로써 작용하여 유착형성

을 방지한 것으로 판단된다. 따라서 Poloxamer/alginate/CaCl2유착방지제는 유착방지 효과에 있어 유효하다고 판단할 수 있

다. 또한 이 유착방지제는 체내에 투여하기 전에는 졸 상태로

되어 있어 쉽게 주사주입을 할 수 있었으며, 체내에 투여 된

후 젤이 되는 확인할 수 있었다.

수술 부위에 대한 심각한 염증이나 이상반응은 관찰되지 않

았으며, 주요 장기에 대한 안전성 및 독성검사를 위해서 각 군

마다 간, 비장, 콩팥의 조직학적 관찰을 하였으나, 대조군과 마

찬가지로 실험군에서 염증세포의 침윤이나 세포 또는 조직 괴

사 등의 이상반응이 없었다(Figure 5). 염증도 유착 형성에 중

Figure 3. In vitro gel stability test in three different compositions.Poloxamer/alginate/CaCl2 was most stable. *Poloxamer solution,†Poloxamer/alginate solution, ‡Poloxamer/alginate/CaCl2.

Figure 4. Comparison of average adhesion grade between the controland experimental groups.

Figure 5. Histological findings of liver, spleen, and kidney at 7 days postsurgery. (a) control group and (b) Poloxamer/alginate/CaCl2 treated exper-imental group. Abnormal features such as inflammatory responses and cell or tissue necrosis were not noted for two groups. Moreover, the his-tological observation showed no significant differences among the groups in the examined organ tissues (H&E stain, × 200).

백서 모델에서 갑상선 절제술 후 Poloxamer/Alginate/CaCl2 유착방지제의 효과 39

Vol. 12, No. 1

요한 원인이 되고 있다. 자궁유착의 경우 자궁내 상처부위에

염증이 일어나면 자궁내막이 얇아지거나 없어지면서 서로 붙게

된다. 본 연구에서는 수술부위에 대한 육안 관찰 결과 대조군

과 실험군의 염증 정도의 차이는 없었으며, 유착 정도는 실험

군이 낮게 나왔다. 결과적으로 Poloxamer/alginate/CaCl2 유착

방지제는 각각의 기관에 대해 손상을 줄 수 있는 독성의 여부

는 없는 것으로 확인 되었으며, 염증이나 이상반응이 없어 유

착방지제로서 더욱 적합하리라 생각된다.

결 론

본 연구에서는 25oC 부근에서 졸-젤 전이되는 Poloxamer/

alginate/CaCl2 유착방지 젤을 제조하였으며, 이 젤에 약하게

가교된 alginate를 첨가함으로서 젤의 안정성이 향상됨을 확인

하였다. 동물실험 결과 갑상선절제술 후 유착방지 효과에 있어

유효한 결과를 확인할 수 있었으며, 주요 장기들의 조직 염색

결과 안전성에 문제가 없음을 확인하였다. 따라서 제조된

Poloxamer/alginate/CaCl2 젤이 유착방지용 장벽으로서 우수한

후보 물질임을 알 수 있었다.

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