en kræftcelles egenskaber (udvalg):

En kræftcelles egenskaber (udvalg):

Deler sig ukontrolleret

Normal celle Kræftcelle

Er resistent over for "programmeret celledød"

Kan danne metastaser

Tumordannelse – ophobning af forandringer i cellens generTumordannelse – ophobning af forandringer i cellens generTumordannelse – ophobning af forandringer i cellens generTumordannelse – ophobning af forandringer i cellens gener

Gen-forandringerGen-forandringer

Normale cellerSpirende kræftceller

Fuldmodne kræftceller

To hovedtyper af cancerrelaterede generTo hovedtyper af cancerrelaterede generTo hovedtyper af cancerrelaterede generTo hovedtyper af cancerrelaterede gener

1. Tumorsuppressor-gener1. Tumorsuppressor-gener

Gener, der forhindrer en normal celle i at blive til en kræftcelleGener, der forhindrer en normal celle i at blive til en kræftcelle- skal - skal inaktiveresinaktiveres for at have en kræftfremkaldende effekt for at have en kræftfremkaldende effekt

1. Tumorsuppressor-gener1. Tumorsuppressor-gener

Gener, der forhindrer en normal celle i at blive til en kræftcelleGener, der forhindrer en normal celle i at blive til en kræftcelle- skal - skal inaktiveresinaktiveres for at have en kræftfremkaldende effekt for at have en kræftfremkaldende effekt

2. Proto-oncogener2. Proto-oncogener

Gener, der kan omdanne en normal celle til en kræftcelleGener, der kan omdanne en normal celle til en kræftcelle- skal - skal aktiveresaktiveres for at have en kræftfremkaldende effekt for at have en kræftfremkaldende effekt

2. Proto-oncogener2. Proto-oncogener

Gener, der kan omdanne en normal celle til en kræftcelleGener, der kan omdanne en normal celle til en kræftcelle- skal - skal aktiveresaktiveres for at have en kræftfremkaldende effekt for at have en kræftfremkaldende effekt

Inaktivering af Inaktivering af tumorsuppressor-tumorsuppressor-genergenerInaktivering af Inaktivering af tumorsuppressor-tumorsuppressor-genergener

772211 33 44 55 665’5’ 3’3’MutationMutationMutationMutation

T182IT182IT182IT182I

MetyleringMetylering MetyleringMetylering 772211 33 44 55 665’5’ 3’3’

CHCH33CHCH33 CHCH33CHCH33 CHCH33CHCH33

DeletionDeletionDeletionDeletion 772211 33 665’5’ 3’3’

Inaktivering af Inaktivering af tumorsuppressor-tumorsuppressor-genergenerInaktivering af Inaktivering af tumorsuppressor-tumorsuppressor-genergener

772211 33 44 55 665’5’ 3’3’MutationMutationMutationMutation

T182IT182IT182IT182I

Mutation: Ændring i rækkefølgen af baser i DNA-kodenMutation: Ændring i rækkefølgen af baser i DNA-koden

-Arg-Lys-Met-Lys-Pro-Trp-Leu--Arg-Lys-Met-Lys-Pro-Trp-Leu-

-CGG-AAG-ATG-AAG-CCC-TGG-TTG--CGG-AAG-ATG-AAG-CCC-TGG-TTG-

Normal:Normal:** DNADNA

ProteinProtein

Efter mutation:Efter mutation:

-Arg-Lys-Met-Lys-His-Trp-Leu--Arg-Lys-Met-Lys-His-Trp-Leu-

-CGG-AAG-ATG-AAG-CAC-TGG-TTG--CGG-AAG-ATG-AAG-CAC-TGG-TTG-** DNADNA

ProteinProtein

Påvisning af mutationer

Mutant Normal

A C G T A C G T

Ile Asn254 254

ACTA

C/TT/AACCA

[

2 - Identifikation ved sekvensanalyse1 – Påvisning ved PCR/DGGE

1 3 4 5 62 7 98

DNA meltingDNA melting

Gradual heatingGradual heatingAbrupt heatingAbrupt heating

--

++

Incr

easi

ng d

enat

uran

t co

nc.

Incr

easi

ng d

enat

uran

t co

nc.

Ele

ctro

phor

esis

Ele

ctro

phor

esis

Wild-type DNAWild-type DNA Mutant DNAMutant DNA

**

**

****

**

**

Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)

PCRPCR

DGGEDGGE

Mutant DNAMutant DNA

Wild-type DNAWild-type DNA

**

**

**** HomoduplicesHomoduplices

HomoduplicesHomoduplices

HeteroduplicesHeteroduplices

Heteroduplex analysisHeteroduplex analysis

**

HeteroduplicesHeteroduplices

**

ACCCGTCAGATGCGATGTGGGCAGTCTACGCTAC

CH3 CH3

CH3CH3

DNACH3 CH3

CH3CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

Maintenance methylation (after DNA replication):


CH3 CH3


CH3 CH3

CH3CH3

DNMT1

Promoter Exon 1 Exon 2

Transcription

CpG island

DNA methylation => transcriptional silencing

X

Bisulfite modification of DNA Bisulfite modification of DNA

5’-CCGACCG-3’5’-CCGACCG-3’

CH3 CH3 CH3 CH3

Methylated DNAMethylated DNA

5’-CCGACCG-3’5’-CCGACCG-3’

Sodium bisulfiteSodium bisulfite

5’-UCGAUCG-3’5’-UCGAUCG-3’

CH3 CH3 CH3 CH3

5’-UUGAUUG-3’5’-UUGAUUG-3’

5’-TCGATCG-3’5’-TCGATCG-3’

PCRPCR

5’-TTGATTG-3’5’-TTGATTG-3’

Unmethylated DNAUnmethylated DNA

Detection of aberrant APC methylation by melting curve analysisDetection of aberrant APC methylation by melting curve analysis

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

Methylated APCMethylated APCUnmethylated APCUnmethylated APC

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

#8#8

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

#7#7

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

#10#10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

80 82 84 86 88 90

Temperature (°C)

-dF/

dT

#9#9

Ac

Ac Ac

Ac

Ac Ac

Ac

Ac Ac

Ac

Ac Ac

Ac

Ac Ac

A c

Ac Ac

M B DM B D

M B D

M B DM B D

M B D

HD

HD

HDHDHD

HDHDHDHDHDHD

HDHDHD

MBD Methyl-CpG-binding domain protein

HDHD Histone deacetylase

Core histones

Ac

M B DM B DM B D

M B D

M B D

M B D

HDHD

HD

HDAcHDHDHDHD

M B D

Ac

Ac

AcAcAc

Ac

Ac

AcAcAcAcAc

Ac

AcAc

Ac

Ac

Ac

Ac

AcAc

Ac

M B DM B DM B D

M B D

M B D

M B D

HDHD

HD

HDAcHDHDHDHD

M B D

Reactivation of gene transcription

Inhibitors of histone deacetylases(Trichostatin A)

AcAc Ac

Inhibitors of DNA methylation(5-aza-2’-deoxycytidine)

TSA + 5

-aza

-Cdr

TSA5-

aza-

Cdr

HO2

ER

GAPDH (control)

MDR1

CacNa1g

Reactivation of gene transcription in breast cancer cells (MDA-MB-231)by inhibition of DNA methylation and/or histone deacetylation

Methotrexate (MTX)

A reduced folate analogue

Used in the treatment of various malignancies

Acquired resistance is a major problem in cancer treatment

Cellular uptake occurs mainly via the reduced folate carrier (RFC)

Methotrexate (MTX)

A reduced folate analogue

Used in the treatment of various malignancies

Acquired resistance is a major problem in cancer treatment

Cellular uptake occurs mainly via the reduced folate carrier (RFC)

MTX

Lysosome

MTX

MTX

FPGS

MTX(glu)nMTX(glu)n

MTX

GGH

MTX

FH2 FH4

DHFRPurine synthesis (ATP, GTP)

UMPTMP

DNA Nucleus

MTX

RFC

MTX

MTX

MTX

FPGS

MTX(glu)nMTX(glu)n

MTX

GGH

MTX

2 4

DHFR(ATP, GTP)

MTX

0

20

40

60

80

100

0.001 0.01 0.1 1 10 100MTX concentration (µM)

Ce

ll n

um

be

r (%

of

con

tro

l)

MDA-MB-231

MCF-7

0

20

40

60

80

100


Ce

ll n

um

be

r (%

of

con

tro

l)

MDA-MB-231

MCF-7

MDA-MB-231 breast cancer cells are inherently MTX resistantMDA-MB-231 breast cancer cells are inherently MTX resistant

0

20

40

60

80

100


Ce

ll n

um

be

r (%

of

con

tro

l)

vector

RFC.3

RFC.5

RFC-EGFP.1

RFC-EGFP.2

0

20

40

60

80

100


Ce

ll n

um

be

r (%

of

con

tro

l)

vector

RFC.3

RFC.5

RFC-EGFP.1

RFC-EGFP.2

Transfection of MDA-MB-231 cells with RFCTransfection of MDA-MB-231 cells with RFC

Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990

RFC promoter methylation in MDA-MB-231 cellsRFC promoter methylation in MDA-MB-231 cells

UU

MM

Methylation-specific PCRMethylation-specific PCR

MCF-7

MCF-7

MDA-MB-231

MDA-MB-231

Sss I

Sss I

PBLPBL

H 2O

H 2O


RFC

0.2 µ

M 5

-Aza

-CdR

0.1 µ

M 5

-Aza-C

dR

TSA + 0

.5 µ

M 5

-Aza-C

dR

TSA + 0

.2 µ

M 5

-Aza

-CdR

TSA0.5

µM

5-A

za-C

dR

G AP DH

M DA-MB-231M CF-7

M

500 bp600 bp

300 bp

200 bp

H O2

Reactivation of RFC expression by 5-aza-2’-deoxycytidine


00

2020

4040

6060

8080

100100

0.010.01 0.10.1 11 1010 100100

MTX concentration (µM)MTX concentration (µM)

Cel

l nu

mb

er (

% o

f co

ntr

ol)

Cel

l nu

mb

er (

% o

f co

ntr

ol) ControlControl

DPMDPM

5-aza-CdR5-aza-CdR

5-aza-CdR + DPM5-aza-CdR + DPM

5-Aza-2’-deoxycytidine + dipyridamole increases MTX sensitivity in MDA-MB-231 cells

5-Aza-2’-deoxycytidine + dipyridamole increases MTX sensitivity in MDA-MB-231 cells

Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990




Er resistent over for "programmeret celledød"

Kan danne metastaser

Skematisk fremstilling af celledelingscycklus

En celle i deling

Checkpoint: Kontrolpunkt, hvor celledeling stopper, og DNA-skader repareres, inden delingen går videre

Checkpoints kontrolleres af proteiner – oncogener og tumorsuppressorer

Nogle aktører i kontrol af cellecyklus (G1)

Normalt DNA: Proteinet varetager sin funktion og holder cellens deling i skak

Muteret DNA: Proteinet er defekt, og cellens deling løber løbsk

Forskellige gen-forandringer kan have samme effekt

Genetiske forandringer i Genetiske forandringer i p16-Rb-Cdk4p16-Rb-Cdk4-signalvejen i -signalvejen i modermærkekræftmodermærkekræft

123456789

101112131415161718192021222324

Rb Cdk4p16

p53 – DNA’ets vogterp53 – DNA’ets vogter

p53

Ved begrænset DNA-skade stopper p53 cellecyklus

Ved omfattende DNA-skade inducerer p53 celledød

MånederMåneder

Ingen mutationerIngen mutationer

00

,2,2

,4,4

,6,6

,8,8

11

00 2020 4040 6060 8080 100100 120120 140140 160160

Ove

rleve

lse

Ove

rleve

lse

Lymfekræft: Sammenhæng mellem Lymfekræft: Sammenhæng mellem overlevelse og mutationer i overlevelse og mutationer i p16 p16 og og p53p53

Lymfekræft: Sammenhæng mellem Lymfekræft: Sammenhæng mellem overlevelse og mutationer i overlevelse og mutationer i p16 p16 og og p53p53

Mutationer i entenp16p16 ellereller p53p53Mutationer i entenp16p16 ellereller p53p53

Mutationer i bådep16p16 ogog p53p53Mutationer i bådep16p16 ogog p53p53

Nedarvning af modermærkekræftNedarvning af modermærkekræft

en kræftcelles egenskaber (udvalg):

Documents