Emergent effects of heavy metal pollution at a population level:Littorina brevicula a study case

Sook-Jung Kim a, Mauricio Rodriguez-Lanetty a, Jae-Hwa Suh b, Jun-Im Song a*a Department of Life Sciences, Ewha Womans University, Seoul 120-750, South Korea

b Environmental Risk Assessment Division, Environmental Risk Research Department, National institute of Environmental Research,Inchun 404-170, South Korea

Curti CécileSuroy Maxime

M1 Biologie et écologie marine2007-2008

État des connaissances:

Littorina brevicula, Philippi, 1844

Littorina brevicula

L’exposition aux contaminants a des effets directs ou indirects sur la génétique des populations.

Bon indicateur biologique du niveau de pollution aux métaux lourds.

D’après Kang et al, 2000

Émergence de l’industrialisation et de l’urbanisation sur les côtes coréennes, notamment depuis les années 1970.Résistance notable de L.brevicula aux métaux lourds.

D’après Ryu et al, 2002

D’après Bickham et al, 1994

Étude a proprement parlé

Objectif : étudier la diversité génétique de L.brevicula entre des sites non pollués et des sites pollués.

Utilisation de deux marqueurs : l’ADNmt cyt b et l’ADNmt ND6.

Échantillonnage en décembre 1998 sur 6 sites.

Sites d’échantillonages dans la baie de Masan et la baie

d’Onsan sur la côte Sud-Est de la Corée du Sud

Dokdong

Isudo

Tangsa

Chundo

Daejung-chun

Jin-ha

Sites non pollués

Sites pollués

Dokdong

Isudo

Tangsa

Chundo

Daejung-chun

Jin-ha

Mesure des concentrations en métaux lourds dans les différents compartiments

A partir du tableau de données 1

Kim et al, 2003

Les différents haplotypes obtenus

7 haplotypes obtenus pour le marqueur cyt b (notés A, B, C, D, E, F, G)

14 haplotypes obtenus pour le marqueur ND6 (notés 1, 2, 3…..13, 14)

Fréquence des haplotypes de l'ADNmt ND6

00.10.20.30.40.50.60.70.80.9

1

Tangsa Jin-ha Isudo Chundo Daejung-chun

Dokdong

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Fréquence des haplotypes de l'ADN mitochondrial cyt b

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Tangsa Jin-ha Isudo Chundo Daejung-chun

Dokdong

A

B

C

D

E

F

G

A partir des tableaux de données 2 et 3

Kim et al, 2003

Analyse de clade emboités (NCA)

ND6

Réseau non raciné

Structure en clades emboîtées

Structure en clades emboîtées

2-1

Réseau non raciné

Cyt b

Groupement en fonction de l’histoire évolutive des haplotypes Regrouper tous les haplotypes pour former des clades Analyse contingente : association clade/localité

D’après Templeton, 1995

La distribution des haplotypes de ND6 a une relation avec l’état de pollution des sites

Marqueur ADN Clade

Populations Groupes

Statistique permutationnel ²א Probabilité

Statistique permutationnel ²א Probabilité

cyt b 1-1 29.69 0.54 7.09 0.2

ND6 1-1 56.06 0.39 13.18 0.02

  2-1 10.73 0.32 2 0.76

AMOVA : ne différencie pas les populations

Conclusions

Aucune différenciation génétique pour le marqueur cyt b entre les populations des sites pollués et non pollués

A contrario, le marqueur ND6 met en évidence une diversité génétique significative et une structure de population différente selon l’état de pollution du site :

- diversité haplotypique diminuée dans les sites pollués

- l’AMOVA permet de mettre en évidence un fort flux de gènes

- la structure génétique déduite de l’analyse de clades emboités indique que ce flux a certainement été limité

Les changements dans la diversité des haplotypes, leurs distributions et leurs fréquences pourraient être des effets émergeants provenant d’une pollution aux

métaux lourds au niveau de la population.

D’après Kovatch et al, 2000

CRITIQUES

Nombre de sites étudiés insuffisant

D’après Kang et al, 1999

Nombre d’organismes étudiés pour chaque site insuffisant

Les mêmes auteurs : pas de différenciation haplotypique entre les différentes populations de L.brevicula sur les côtes coréennes

D’après Kim et al, 2003, Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean waters

SitesCadmium Zinc

eau de mer (μg/L) sédiment (μg/g) organisme (μg/g) eau de mer (μg/L) sédiment (μg/g) organisme (μg/g)

sites non pollués

Tangsa 0.011± 0.002 0.52 ± 0.55   0.57 ± 0.12 103 ± 12..95  

Jin-ha 0.009 ± 0.002   0.11 ± 0.03 0.32 ± 0.17   30 ± 1.00

Isudo 0.007 ± 0.005 0.59 ± 0.31   0.29 ± 0.247 109 ± 13.11  

sites pollués

Chundo 0.045 ± 0.003 2.71 ± 0.3   6.14 ± 0.944 144 ± 13.79  

Daejung-chun 1.705 ± 0.012   11.81 ± 0.1 35.12 ± 0.70   88 ± 1.00

Dokdong 0.01 ± 0.002 11.2 ± 0.46   1.7 ± 0.408 230 ± 3.94  

SitesCuivre Plomb

eau de mer (μg/L) sédiment (μg/g) organisme (μg/g) eau de mer (μg/L) sédiment (μg/g) organisme (μg/g)

sites non pollués

Tangsa 0.3 ± 0.206 12 ± 0.85   0.036 ± 0.002 15.4 ± 7.13  

Jin-ha 0.12 ± 0.034   29 ± 1.00     0.33 ± 0.16

Isudo 0.17 ± 0.042 19 ± 2.74   0.11 ± 0.015 16.2 ± 3.85  

sites pollués

Chundo 1.75 ± 0.231 37.6 ± 9.12   0.042 ± 0.001 41 ± 16.25  

Daejung-chun 24.6 ± 0.343   126 ± 4.00     1.76 ± 0.89

Dokdong 0.61 ± 0.093 47.8 ± 2.36   0.12 ± 0.010 56.8 ± 3.30  

Concentrations en métaux lourds (Cd, Zn, Cu et Pb) dans les différents compartiments échantillonés

DONNEES???Même motif d’absence de données

D’après Petit, 2008papiers utilisant la méthode NCPA depuis

2000

Papiers sur la NCPA

% de papiers en phylogéographie

La NCA, peu fiable ?

En Août 2007, 1600 citations de la méthode de Templeton

Knowles & Madison (2002), Panchal & Beaumont (2007), Petit & Grivet (2002) aboutissent à la même conclusion : la méthode NCPA retourne trop de faux positifs

Raison avancée : les tests de permutation utilisés remanient les individus et pas les populations.

TempletonPetit

“ … je suggère que la méthode ne soit pas trop utilisée jusqu’à ce qu’elle ait été plus minutieusement évalué et de façon critique, ce qui devrait être facilité par les nouvelles procédures automatisées.”

Merci de votre attention

Bibliographie• Bickham, J.W., Sandhu, S., Hebert, P.D.N., Chikhi, L., Athwal, R., 2000. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural

populations: implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research 463, 33–51.• Kang, S.G., Choi, M.S., Oha, I.S., Wright, D.A., Koh, C.H. 1999. Assessment of metal pollution in Onsan Bay, Korea using Asian periwinkle

Littorina brevicula as a biomonitor. The Science of the Total Environment. 234,127-137 • Kang, S.G., Wright, D.A., Koh, C.H., 2000. Baseline metal concentration in the Asian periwinkle Littorina brevicula employed as a biomonitor

to assess metal pollution in Korean coastal water. The Science of the Total Environment 263,143-153• Kim, S.J., Rodriguez-Lanetty, M., Song, J.I., 2003. Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean waters. Hydrobiologia

505, 41–48.• Lee SH, Lee KW. Heavy metals in mussels in the Korean coastal waters. J Oceanol Soc Korea 1984;19:111-117.• Lee IS, Song JI, Park KS, Choe BL, Rho BJ. Bioaccumulation of trace metals by mussel Mytilus edulis from Korean coast. Korean J Ecol

1995;18:419-427 .• Lee IS, Rho BJ, Song JI, Kim EJ. The concentrations of heavy metals in sediment, seawater and oyster Crassostrea gigas in coastal

regions of industrial complex in Korea. Korean J Ecol 1996;19:261-270• Nadig, S.G., Lee, K.L., Adams, S.M., 1998. Evaluating alterations of genetic diversity in sunfish populations exposed to contaminants using RAPD assay. Aquatic Toxicology 43, 163–178.• Nevo, E., Noy, R., Lavie, B., Beiles, A., Muchtar, S., 1986. Genetic diversity and resistance to marine pollution: theory and practice.

Biological Journal of the Linnean Society 29, 139–144.• Park, K.S., Song, J.I., Choe, B.L., Kim, S.J., 1999. Amylase polymorphism of Littorina brevicula from polluted and unpolluted sites, Korea.

Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 63, 633–638.• Petit, R.J., 2008. The coup de grâce for the nested clade phylogeographic analysis. Molecular Ecology 17, 516-518.• Reid, D.G., 1996. Systematics and evolution of Littorina. Dorset Press, Dorchester, UK.• Street, G.T., Lotufo, G.R., Montagna, P.A., Fleeger, J.W., 1998. Reduced genetic diversity in a meiobenthic copepod exposed to a

xenobiotic. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 222, 93–111.• Templeton, A.R., 2008. Nested clade analysis : an extensively validated method for strong phylogeographic inference. Molecular Ecology.• Templeton, A.R., Crandall, K.A., Sing, C.F., 1992. A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction

endonuclease mapping and DNA sequence data. Genetics 132, 619–633.• Templeton, A.R., Routman, E., Phillips, C.A., 1995. Separating population structure from population history: a cladistic of the geographical

distribution of mitochondrial DNA haplotypes in the tiger salamander, Ambystoma tigrinum. Genetics 140, 767–782.

Nous remercions Mr Nevo pour nous avoir gracieusement envoyé l’une de ses publications et Mr Aurelle pour nous avoir orienté dans notre analyse critique.

• Bickham, J.W., Sandhu, S., Hebert, P.D.N., Chikhi, L., Athwal, R., 2000. Effects of chemical contaminants on genetic diversity in natural populations: implications for biomonitoring and ecotoxicology. Mutation Research 463, 33–51.

• Kang, S.G., Choi, M.S., Oha, I.S., Wright, D.A., Koh, C.H. 1999. Assessment of metal pollution in Onsan Bay, Korea using Asian periwinkle Littorina brevicula as a biomonitor. The Science of the Total Environment. 234,127-137

• Kang, S.G., Wright, D.A., Koh, C.H., 2000. Baseline metal concentration in the Asian periwinkle Littorina brevicula employed as a biomonitor to assess metal pollution in Korean coastal water. The Science of the Total Environment 263,143-153

• Kim, S.J., Rodriguez-Lanetty, M., Song, J.I., 2003. Genetic population structure of Littorina brevicula around Korean waters. Hydrobiologia 505, 41–48.

• Lee SH, Lee KW. Heavy metals in mussels in the Korean coastal waters. J Oceanol Soc Korea 1984;19:111-117.• Lee IS, Song JI, Park KS, Choe BL, Rho BJ. Bioaccumulation of trace metals by mussel Mytilus edulis from

Korean coast. Korean J Ecol 1995;18:419-427 .• Lee IS, Rho BJ, Song JI, Kim EJ. The concentrations of heavy metals in sediment, seawater and oyster

Crassostrea gigas in coastal regions of industrial complex in Korea. Korean J Ecol 1996;19:261-270• Nadig, S.G., Lee, K.L., Adams, S.M., 1998. Evaluating alterations of genetic diversity in sunfish populations exposed to contaminants using RAPD assay. Aquatic Toxicology 43, 163–178.• Nevo, E., Noy, R., Lavie, B., Beiles, A., Muchtar, S., 1986. Genetic diversity and resistance to marine pollution:

theory and practice. Biological Journal of the Linnean Society 29, 139–144.• Park, K.S., Song, J.I., Choe, B.L., Kim, S.J., 1999. Amylase polymorphism of Littorina brevicula from polluted

and unpolluted sites, Korea. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology 63, 633–638.• Petit, R.J., 2008. The coup de grâce for the nested clade phylogeographic analysis. Molecular Ecology 17, 516-

518.• Reid, D.G., 1996. Systematics and evolution of Littorina. Dorset Press, Dorchester, UK.• Street, G.T., Lotufo, G.R., Montagna, P.A., Fleeger, J.W., 1998. Reduced genetic diversity in a meiobenthic

copepod exposed to a xenobiotic. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 222, 93–111.• Templeton, A.R., 2008. Nested clade analysis : an extensively validated method for strong phylogeographic

inference. Molecular Ecology.• Templeton, A.R., Crandall, K.A., Sing, C.F., 1992. A cladistic analysis of phenotypic associations with

haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. Genetics 132, 619–633.• Templeton, A.R., Routman, E., Phillips, C.A., 1995. Separating population structure from population history: a

cladistic of the geographical distribution of mitochondrial DNA haplotypes in the tiger salamander, Ambystoma tigrinum. Genetics 140, 767–782.

Bibliographie

L.brevicula, Philippi, 1844

• Petit gastropode herbivore, abondant sur les rivages rocheux en Corée.

• Grazer dominant.• Taille minimale de maturation sexuelle : 6.5 mm

(longueur de coquille).

Littorina brevicula

• Prolifération en Hiver, T°C de l’eau < 12°C (Décembre à Avril).• Développement embryonique : ≈ 7 jours dans coquille.• Larve cilié pélagique.

L’ADN mitochondrial et les marqueurs cyt b et ND6

ADNmt = taux de mutation élevé du à sa petite taille = marqueur privilégié pour l’étude de la biodiversité moléculaire.

Cyt b code pour un composant de la chaîne respiratoire et est impliqué dans le transport d’électrons.

ND6 code pour la sous-unité déshydrogénase 6 de la NADH responsable de la phosphorylation oxydative. Fait partie d’un gros complexe enzymatique qui gère le transport d’électrons de la NADH vers l’ubiquinone.

Complément sur l’analyse contingente

test khi²

calcul de la valeur critique à l’aide de la table du ² א et du calcul du degré de liberté : valeur critique = 0.05

probabilité : fréquence avec laquelle ²א stat > ou = ²א obs . Cette probabilité n’est significative que si elle est inférieure à la valeur critique.

Marqueur ADN

Clade

Populations Groupes

Statistique permutationnel ²א Probabilité

Statistique permutationnel א² Probabilité

cyt b 1-1 29.69 0.54 7.09 0.2

ND6 1-1 56.06 0.39 13.18 0.02

  2-1 10.73 0.32 2 0.76

D’après Petit, 2008

Population bottleneck

La NCA, peu fiable ?

En Août 2007, 1600 citations de la méthode de Templeton

Knowles & Madison (2002), Panchal & Beaumont (2007), Petit & Grivet (2002) aboutissent à la même conclusion : la méthode NCPA retourne trop de faux positifs

Raison avancée : les tests de permutation utilisés remanient les individus et pas les populations.

TempletonPetit

Si on veut tester l’existence d’une structure génétique spatiale par permutation, il faut remanier les populations. Sinon, les processus affectant les fréquences des haplotypes, comme les événements bottleneck, sont confondus avec les processus historiques = trop de faux positifs

L’AMOVA

Met en évidence les relations génétiques entre les différents niveaux de subdivisions hiérarchiques

2 niveaux hiérarchiques établis : les groupes (pollués et non pollués) et les populations

Matrice de distance génétique calculée en utilisant le modèle à 2 paramètres de Kimura

Résultats de l’AMOVA parmi les populations de L.brevicula utilisant les données des ADNmt cyt b et ND6

→ différences non significatives parmi les groupes et parmi les populations au sein des groupes

→ la plupart de la variance moléculaire est expliqué au sein des populations (95.5%)

L’AMOVA

• Tiré de Excoffier et al publié en 1992

• Technique illustrée par l’étude de l’ADNmt humain et de ses sites de restriction

Extrême-OrientAfrique de

l’ouest

Europe

Moyen-Orient

Amérique centrale

Pour chaque population, les haplotypes trouvés sont montrés en cercles noirs

Comparaison des cibles, des résolutions et des coûts des différentes méthodes pour surveiller la diversité génétique au sein des populations naturelles.

D’après Bickham et al, 1994

Les différentes méthodes et leur coût en 1994

Les auteurs privilégient dans notre article l’utilisation de la NCA (malgré les problèmes mis en évidence). Cette analyse nécessite des données haplotypique qui sont obtenues par ces différentes méthodes :

Schéma des relations parmi les facteurs relié à la contamination chimique de l’environnement avec la diminution de la diversité génétique des populations.

D’après Bickham et al, 1994

Le modèle à 2 paramètres de Kimura

• Prend en compte le nombre de substitutions nucléotidiques pour estimer la distance évolutive entre deux séquences.

• Si un site homologue est occupé par des bases différentes, mais que les deux sont des purines ou des pyrimidines, la différence est de type I

• Si au contraire les bases différentes ne sont ni toutes deux des purines ou des pyrimidines, la différence est de type II

• K = - (1/2) ln {(1 - 2P - Q)• Les lettres P et Q représentent les fractions de sites nucléotidiques

montrant respectivement des différences de types I et II entre deux séquences comparées

Le site d’Ulsan (Dokdong)

Isozyme polymorphism as monitoring of marine environments: The interactive effect of Cadmium and Mercury pollution on the shrimp, Palaemon

elegans (Ben-Shlomo et Eviatar Nevo)

• Isozymes=enzymes qui diffèrent par leur séquence aminoacide mais qui catalysent la même réaction chimique

• La contamination par le Cd et le Hg agit comme un contaminant spécifique (ne fait qu’un)

• Inhibition compétitive des métaux lourds Hg et Cd avec le Mg au site actif de la PGM

• "il est urgent de trouver l’espèce optimale […] afin d’estimer les effets de la pollution à la fois quantitativement et qualitativement et l’utiliser pour sauvegarder la qualité de l’environnement marin“ 1988