“efecto del silenciamiento del factor
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS
AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO
NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“Efecto del silenciamiento del factor
auxiliar U2AF84 sobre el splicing de
pre-mRNAs de Entamoeba histolytica.”
T E S I S
Que presenta
IBQ. Morales Tovar Melissa Esther
Para obtener el grado de
Maestra en ciencias
En la especialidad
Bioquímica
Director de la tesis
Dr. Jesús Valdés Flores
México D.F. SEPTIEMBRE DEL 2015
Durante el desarrollo de este proyecto conté con la beca del
CONACyT con el número de registro 131030007 por lo que estoy
enteramente agradecida con la institución, por el apoyo brindado
para mi formación académica y profesional.
Agradezco al colegio de profesores del departamento de
Bioquímica, por brindarme la oportunidad de seguir aprendiendo,
por sus valiosas aportaciones y conocimientos brindados a mi
formación académica.
Este trabajo se realizó en el departamento de bioquímica del
Centro De Investigación y Estudios Avanzados del Instituto
Politécnico Nacional, bajo la asesoría del Dr. Jesús Valdés Flores,
con quien estoy realmente agradecida por tan gratificante
experiencia.
AGRADECIMIENTOS
Llegado a este momento de la vida, existen demasiados detalles que espero poder no
olvidar con el paso del tiempo, entre ellas a las personas que me han llevado hasta este
punto.
Primeramente al Doc Valdés y la Dra Eli, por aceptarme en el laboratorio, guiarme e
instruirme, darme buenos consejos, escucharme y apoyarme aun con mis constantes
errores, me han mostrado cuán lejos puedo llegar y que debo confiar en mí.
A Saraí, Helios el Doc Frank y Jackie; porque también fueron una guía, mis mentores
en la ciencia y amigos en todos los momentos, es por ellos que también he llegado a
este punto, y sé que sin duda continuaran compartiendo su conocimiento, experiencia y
cariño conmigo.
Al laboratorio 11, a JM, Martin, al chavo Ricardo, me han apoyado mucho, dado buenas
charlas y momentos muy gratos.
A mis amigos y compañeros de generación: Lupita, Karis, Carlos Jorge, Ross, Alexa,
Adrian y Tatis, porque solo nosotros sabemos cuán difícil ha sido llegar a donde
estamos, todo lo que pasamos, en las buenas y las malas; risas, lagrimas, enojos y
diferencias, nos han hecho lo que somos, hemos crecido juntos y creído uno en el otro,
no podría estar más feliz de compartir el camino con ustedes.
Finalmente pero más importante a mi madre, mi padre y hermanos, ellos lo son todo
para mi, orgullo, inspiración, confianza, talento, seguridad, apoyo, amor… sin ellos que
son el pilar más importante en mi existencia, no estaría aquí. Los amo a todos familia,
por mí, para ustedes todos mis logros les pertenecen, hoy y por siempre.
ÍNDICE
CONTENIDO PÁGINA
RESUMEN………………………………………………………………………….1
ABTRACT………………………………………………………………………….2
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….3
PROCESAMIENTO DE RNA…………………………………………………….3
CAPPING…………………………………………………………………………...4
SPLICING…………………………………………………………………………..5
POLIADENILACIÓN……………………………………………………………..5
BIOQUÍMICA DEL PROCESO DE SPLICING………………………………...7
DEFINICIÓN DEL 3´SS POR EL FACTOR AUXILIAR U2………………….10
ORGANISMO DE ESTUDIO: Entamoeba histolytica…………………………...13
SPLICING EN Entamoeba histolytica……………………………………………..14
ANTECEDENTES………………………………………………………………...17
JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………21
HIPÓTESIS………………………………………………………………………. .22
OBJETIVOS……………………………………………………………………….22
OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………..22
OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………………………………………….22
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL……………………………………………...23
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………...25
RESULTADOS……………………………………………………………………36
DISCUSIÓN……………………………………………………………………….49
CONCLUSIONES………………………………………………………………...54
PERSPECTIVAS…………………………………………………………………55
APENDICE………………………………………………………………….56
REFERENCIAS…………………………………………………………….61
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Visión contemporánea de la expresión génica ............................................. 4
Figura 2. Reacciones de transesterificación realizadas por el spliceosoma .................... 7
Figura 3. Etapas de ensamblaje del spliceosoma con el pre-mRNA, mostrando
secuencialmente la interacción de los snRNPs con el intrón. ....................................... 8
Figura 4. Dominios de interacción del factor auxiliar de U2 ..................................... 11
Figura 5. Estructura de las secuencias consenso contenidas en el intrón, en los sitios de
splicing 5´y 3´, el punto de ramificación y el tracto de polipirimidinas respectivo ....... 11
Figura 6. Ciclo de vida del parásito intestina E. histolytica ....................................... 14
Figura 7.Frecuencia de las variantes de splicing organizadas por grupos filogenéticos. 15
Figura 8. Análisis bioinformático del gen de U2AF84.. ............................................ 19
Figura 9. Estrategia experimental de trabajo para el silenciamiento del gen que codifica
para la proteína U2AF84. ....................................................................................... 24
Figura 10. Condiciones de amplificación de U2AF84, durante 30 ciclos. .................... 25
Figura 11. Mapa del vector de silenciamiento psAP2Gunma. ................................... 25
Figura 12. Condiciones para la amplificación durante 28 ciclos del fragmento rRNA
18S. .................................................................................................................... 32
Figura 13. Condiciones para la amplificación durante 30 ciclos del fragmento Actina. 33
Figura 14. Condiciones para la amplificación durante 35 ciclos del fragmento Cdc2. . 33
Figura 15. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento ClC-B. 33
Figura 16. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento RabX13.
.......................................................................................................................... 33
Figura 17. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento Sam50. 34
Figura 18. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento MybS6. 34
Figura 19. Perfil electroforético de las clonas candidatas .......................................... 36
Figura 20.Perfil electroforético de los plásmidos psAP2Gunma y pGsi84 purificados por
columna .............................................................................................................. 37
Figura 21.Trofozoítos de E. histolytica de la cepa G3 .............................................. 37
Figura 22. Análisis de la expresión de U2AF84 en trofozoítos de E. histolytica ........... 38
Figura 23. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de Actina en
trofozoítos transfectados ....................................................................................... 41
Figura 24. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de Cdc2 en
trofozoítos transfectados. ...................................................................................... 42
Figura 25. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de RabX13
en trofozoítos transfectados.. ................................................................................. 44
Figura 26. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de Sam50 en
trofozoítos transfectados. ...................................................................................... 45
Figura 27. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de ClC-B en
trofozoítos transfectados. ...................................................................................... 47
Figura 28. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de EhMybS6
en trofozoítos transfectados. .................................................................................. 48
Figura 29. Análisis bioinformático para comparar los datos de la secuenciación de los
plásmidos con los nucleótidos correspondientes a los 400 pares de bases de U2AF84. . 57
Figura 30. Reacción de (-)RT-PCR del transcrito de Actina, de las transfectantes a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418. ......................................................... 58
Figura 31. Reacción de (-)RT-PCR del transcrito de Cdc2, de las transfectantes a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418. ......................................................... 58
Figura 32. Reacción de (-)RT-PCR del transcrito de RabX13, de las transfectantes a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418. ......................................................... 59
Figura 33. Reacción de (-)RT-PCR del transcrito de ClC-B, de las transfectantes a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418. ......................................................... 59
Figura 34. Reacción de (-)RT-PCR del transcrito de MybS6, de las transfectantes a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418. ......................................................... 60
Figura 35. Reacción de (-)RT-PCR del transcrito de MybS6, de las transfectantes a
concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418. ......................................................... 60
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características generales de los intrones en el parásito E. histolytica ............. 17
Tabla 2. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de U2AF84. .................... 25
Tabla 3. Oligonucleótidos empleados para la secuenciación de las clonas positivas..... 27
Tabla 4. Reactivos para la preparación de un gel de poliacrilamida al 8%. ................. 29
Tabla 5. Concentraciones de MgCl2 empleadas en la reacción de PCR para cada
transcrito de estudio. ............................................................................................ 31
Tabla 6. Oligonucleótidos empleados en la reacción de PCR para cada uno de los
transcritos de estudio. ........................................................................................... 32
Tabla 7. Señales intronicas de los transcritos seleccionados de E. histolytica .............. 39
Tabla 8. Reactivos para la preparación de medio TYI-S-33. ..................................... 56
ABREVIATURAS
ADN o DNA: ácido desoxirribonucléico.
ARN o RNA: ácido ribonucléico.
BSA: suero bovino adulto.
bp: pares de bases
cADN: ácido desoxirribonucleico complementario.
hnARN: ácido ribonucléico heterogéneo nuclear.
kDa: kilo Daltones.
mARN: ácido ribonucleico mensajero.
nt: nucleótidos.
RRM: motivo de reconocimiento de RNA.
SINEs: elementos cortos intercalados.
siRNA: pequeño ácido ribonucléico de interferencia.
snRNP: ribonucleoproteinas pequeñas nucleares.
SOB: medio súper óptimo.
ss: sitio de splicing.
TSG: silenciamiento génico transcripcional.
U2AF: factor auxiliar de U2.
UHM: motivo de homología U2AF.
ULM: motivo de ligando UHM.
1
RESUMEN
El splicing del pre-mRNA es un mecanismo fundamental de regulación génica y
diversifica el proteoma en eucariontes. La bioquímica del splicing involucra dos
reacciones de transesterificación catalizadas por un complejo masivo de
ribonucleoproteinas pequeñas nucleares (snRNP) conocido como spliceosoma, que
incluye a las snRNPs U1, U2 y U4/U6•U5. Asociado a las proteínas del snRNP U2, el
factor auxiliar U2 (U2AF) participa activamente durante el proceso de splicing. U2AF
consta de dos subunidades de 35 y 65 kDa, conservadas evolutivamente, esta proteína se
ha descrito en organismos como levadura (Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe) mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) y humano
(Homo sapiens).
Particularmente en el parásito intestinal Entamoeba histolytica, causante de la
amebiasis, los estudios proteómicos de ribonucleopartículas de mensajero identificaron
36 proteínas de splicing de E. histolytica, entre ellas a una proteína con homología a
U2AF65 que en E. histolytica tiene un peso molecular de 84 kDa. Hasta ahora no se ha
estudiado la función de ningún componente de splicing en este organismo y debido a los
dominios extra que presenta este factor auxiliar putativo U2AF84, es de interés en el
presente trabajo determina0r su importancia durante el proceso de splicing en pre-
mRNAs modelo de E. histolytica, por medio del silenciamiento de los transcritos que
codifican para U2AF84.
El silenciamiento se corroboró por medio de ensayos de western blot los cuales sugieren
que U2AF84 se encuentra silenciada en las amebas transfectadas con los plásmidos
silenciadores en un 69%. Consistente con la naturaleza co-transcripcional del splicing,
observamos perturbaciones en la transcripción de algunos transcritos estudiados y más
importantemente detectamos la acumulación del pre-mRNA de RabX13, Sam50 y
EhMybS6.
Nuestros resultados indican que U2AF84 participa en el splicing amebiano y
probablemente constituya el ortólogo de U2AF65 humano.
2
ABSTRACT
Pre-mRNA splicing is a fundamental mechanism in gene regulation and proteomic
diversity in eucarionts. Splicing biochemistry involve two transesterification reactions.
These reactions are catalyzed by the spliceosome, a massive complex formed by the U1,
U2, U5 and U4-U6 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs). A stable binding of U2
snRNP produce a pre-spliceosome complex that is independent of ATP which requires
several auxiliary factors. U2 auxiliary factor is a non-snRNP protein required for the
binding of U2 snRNP to the pre-mRNA branch site. U2AF compromises two
polypeptides ̴ 35 (U2AF35) and ̴ 65 kDa (U2AF65) in approximately 1:1 stoichiometry
and has been described in organisms such as yeast (Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe), fruit fly (Drosophila melanogaster) and human (Homo
sapiens).
Particularly in the human protozoan parasite Entamoeba histolytica the causative agent
of amebiasis, proteomic studies probed thirty-six splicing proteins of which an U2AF65
homolog was identified in this parasite with the characteristic that its molecular weight
is 84 kDa.
Until now none of the splicing components have been studied in E. histolytica and
because the extra domain that presents this putative auxiliary factor it is for interest to
determine its role in the pre-mRNA splicing process by silencing the transcript that code
for U2AF84.
We demonstrated that U2AF84 is silenced in a 69% in the transfected trophozoites by
western blot assay. Consistent with the co-transcriptional splicing nature, we observed
perturbations in the transcription of some studied transcripts and more important we
detected the accumulation of the transcripts RabX13, Sam50 and EhMybS6.
Our results suggest that U2AF84 is participating in the ameba splicing process and
probably is the ortholog of human U2AF65.
3
INTRODUCCIÓN
PROCESAMIENTO DEL RNA
La naturaleza hereditaria de cada organismo se define por su genoma, el cual contiene el
juego completo de información necesaria para construirlo. Funcionalmente se divide en
genes. Cada gen es una secuencia de ácidos nucléicos que representa uno o más
productos génicos (Lewin, 2008).
El proceso en el cual la información codificada en un gen es descodificada en una
proteína particular se denomina expresión génica. Sin embargo, el gen no es traducido
directamente en una proteína sino a través de la síntesis de ácido ribonucleico mensajero
(mRNA) intermediario.
La expresión génica ocurre a través de un proceso de dos etapas:
▪ Transcripción
La información contenida en el ácido desoxirronucléico (DNA) genera un ácido
ribonucléico heterogéneo nuclear (hnRNA) de cadena sencilla idéntico en secuencia a
una de las cadenas de DNA por la acción de la RNA polimerasa II.
▪ Traducción
La secuencia de nucleótidos del mRNA es interpretada en una secuencia de
aminoácidos que conforman una proteína. Esta interpretación es llevada a cabo por la
maquinaria ribosomal conformada por un tercer tipo de RNA, el RNA ribosomal
(rRNA) y un conjunto de proteínas ribosomales, y la participación de un RNA
adaptador llamado RNA de transferencia (tRNA) aminoacilado.
En eucariontes la transcripción se lleva a cabo en el núcleo pero el producto de RNA
debe ser transportado al citoplasma para ser traducido. Los hnRNA producto de genes
eucariontes no son funcionales y se someten a varias reacciones de procesamiento para
de esta manera producir los mRNA funcionales correspondientes. Los RNAs maduros
nucleares son transportados activamente al citoplasma como componentes de
4
ribonucleoproteinas (Lodish et al., 2000; Lewin, 2008). La figura 1 esquematiza los
principales procesos durante la expresión génica.
Figura 1. Visión contemporánea de la expresión génica. Los recientes descubrimientos de los pasos que
regulan la expresión génica (desde transcripción hasta traducción) sugieren que es una subdivisión de un
proceso continuo. Cada etapa se encuentra fisca y funcionalmente conectada a la siguiente, asegurando que no
se omita ningún paso. Modificado de Orphanides, 2002.
El procesamiento cotranscripcional de mRNA en células eucariontes incluye tres
grandes procesos: capping, splicing y poliadenilación.
CAPPING
Durante la síntesis del RNA naciente por la enzima RNA polimerasa II una vez que
alcanza una longitud de 25 a 30 nucleótidos (nt), se añade la molécula 7-metilguanosina
al extremo 5’. Este paso es catalizado por la enzima dimérica de capucha (capping) que
se asocia con el dominio carboxilo-terminal (CTD) fosforilado de la RNA polimerasa II.
5
Debido a que esta enzima de capping no se asocia con la polimerasa I o III, este proceso
es especifico para los transcritos producidos por la RNA polimerasa II. Una subunidad
de esta enzima remueve el γ-fosfato del extremo 5´ del RNA naciente que emerge del la
superficie de la RNA polimerasa II. La otra subunidad transfiere la mitad de GMP
proveniente del GTP al grupo 5´-difosfato del transcrito naciente, creando la estructura
5´-5´-trifosfato guanosina. Finalmente metiltransferasas transfieren el grupo metilo del
S-adenosilmetionina la posición N7 de la guanina y los oxígenos en la posición 2´de la
ribosa al final del extremo 5´del RNA naciente (Lodish et al., 2000), dando lugar al cap-
0, estructura mínima necesaria que provee resistencia a la degradación.
SPLICING
La estructura de la mayoría de los genes eucariontes es discontinua, de manera que
requieren de la remoción de secuencias que interrumpen el gen o intrones a fin de
“restaurar” sus marcos de lectura y asegurar su correcta expresión (Davis et al., 2007).
Este proceso se denomina splicing y es llevado a cabo por el spliceosoma, una
maquinaria molecular de multi-megadaltones, y única en su tipo ya que su composición
de proteínas, de RNAs pequeños nucleares (snRNAs) y las interacciones RNA-proteína
que ocurren entre ellas cambian antes, durante y después del proceso catalítico por lo
cual es considerada una enzima altamente dinámica (Wahl et al., 2015).
La escisión de intrones y ligación de exones se lleva a cabo gracias a dos reacciones
consecutivas de transesterificación, involucrando el sitio de splicing 5´ (5´ss), al punto
de ramificación (branch point sequence o BPS) y el 3´ss. El proceso de ensamblaje más
importante implica el reclutamiento de las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares
(snRNPs) U1, U2, U5 y U4/U6, además de una plétora de proteínas no relacionadas a
los snRNPs (Wahl et al., 2015). Más adelante describiré la bioquímica del splicing y las
interacciones RNA-proteína para la obtención de los transcritos maduros.
POLIADENILACIÓN
El último evento en la maduración del pre-mRNA involucra el corte y la poliadenilación
de dicha molécula. Primero se forma un complejo inestable con el factor específico de
corte y poliadenilación (CPSF) de 360 kDa, conformado por cuatro polipéptidos
6
reclutados en la caja AAUAAA rio arriba de los elementos con una secuencia rica en A.
Posteriormente tres proteínas adicionales: el factor estimulador de corte (CStF) de 200
kDa, el heterodímero llamado factor de corte I (CFI) de 150 kDa y un segundo factor de
corte (CFII), se unen al complejo de CPSF-RNA. Finalmente y justo antes la
degradación endonucleolítica 35 nt rio abajo de la caja AAUAAA, la polimerasa
poli(A) (PAP) se une al complejo y de esta manera el sitio 3´ generado es rápidamente
poliadenilado. Siguiendo el corte en el sitio de poli(A), la poliadenilación procede en
dos fases. La adición de aproximadamente 12 residuos de adenina que ocurre
lentamente, seguido de una rápida adición de 200 a 250 residuos. Esta fase rápida
requiere de la unión de copias múltiples de la proteína de unión de poli(A) con un
motivo RNP. Esta proteína se designa como PABII, la cual se une a la corta cola de
adeninas que inicialmente es adicionada por PAP, estimulando la polimerización de
adeninas adicionales. También es la responsable de que la polimerasa poli(A) finalice la
polimerización cuando la cola poli(A) alcanza la longitud de 200 a 250 residuos (Lodish
et al., 1999).
7
BIOQUIMICA DEL PROCESO DE SPLICING
Las dos reacciones consecutivas de transesterificación, involucran en el primer paso el
grupo hidroxilo 2´ de la adenosina conservada en el BPS que realiza un ataque
nucleofílico al 5´ss produciendo la liberación del exón 5´ y un lariat intermediario con
una ramificación fosfodiester 2´-5´. El ataque nucleofílico efectuado por el 5´ exón al
3´ss permite la ligación de los exones y liberación del lariat (Ritchie et al., 2009)
(Figura 2).
Figura 2. Reacciones de transesterificación realizadas por el spliceosoma. Modificado de Ritchie et al., 2009.
8
Durante el ensamblaje del spliceosoma, una compleja red de RNA y
ribonucleoproteinas se forma entre el pre-mRNA y los RNAs de los snRNPs del
spliceosoma denominados U1, U2, U4, U5 y U6 snRNA.
En eucariontes superiores se han identificado más de 70 proteínas del spliceosoma y en
levaduras aproximadamente 40. Estas tienen una función esencial en los primeros pasos
del splicing, es decir, en el reconocimiento y emparejamiento de los sitios de splicing 5´
y 3´ (Will et al., 1997).
A través de numerosas interacciones proteína-proteína, y proteína-RNA, contribuyen a
la formación de la estructura tridimensional catalítica activa del spliceosoma. Las
proteínas del spliceosoma también parecen ser la fuerza motora detrás de muchos
cambios conformacionales en el RNA que ocurren durante el proceso de splicing.
Además de sus actividades de ATPasa y helicasa, las proteínas muy probablemente
llevan a cabo funciones enzimáticas adicionales, por ejemplo como proteínas cinasas,
GTPasas, chaperonas, o isomerasas (Will et al., 1997).
El ensamblaje del spliceosoma inicia con la formación del denominado complejo
comprometido o temprano (E), en el cual los sitios de splicing 5´ y 3´ son inicialmente
reconocidos por el snRNP U1 y el factor de splicing U2AF (factor auxiliar del snRNP
U2) respectivamente (Figura 3). La participación del U2AF en la definición del 3’ss
será descrita más adelante.
Figura 3. Etapas de ensamblaje del spliceosoma con el pre-mRNA, mostrando secuencialmente la interacción
de los snRNPs con el intrón. Modificado de Lührmann R. Max Planck Institute for Biophysical Chemistry
2008.
9
En eucariontes superiores la formación del complejo temprano depende de un conjunto
de interacciones moleculares que involucran principalmente miembros de la
superfamilia de proteínas ricas en residuos de arginina y serina llamados proteínas SR,
las cuales se caracterizan por poseer un dominio rico en dipéptidos de residuos de
argininas y serinas (dominio SR) y a menudo poseer uno o más dominios de unión a
RNA (RBDs).
Como resultado de su organización modular, las proteínas SR pueden unir el pre-mRNA
y reclutar otros factores a través de interacciones proteína-proteína o proteína-RNA que
involucra dichos dominios RS. Además de aumentar la asociación del snRNP U1 con el
5´ss, las proteínas SR promueven la asociación de U2AF con el sitio de splicing 3´ y se
sabe que se forma una red de interacciones entre la subunidad de 70 KDa, el snRNP U1
y U2AF durante la formación del complejo E.
Subsecuente a la formación del complejo E, los pre-spliceosomas son formados por la
interacción dependiente de ATP del snRNP U2 con el BPS. La unión del snRNP U2
involucra el apareamiento de bases entre el snRNA U2 y la secuencia del punto de
ramificación, facilitada y estabilizada por varias proteínas incluyendo el factor de
splicing 1 (SF1) y la subunidad de ̴65 kDa de U2AF, denominada U2AF65. Un
subconjunto de proteínas del snRNP U2 también tiene una función importante en el
reclutamiento de dicho snRNP con el pre-mRNA. Estas proteínas incluyen a los
complejos heteroméricos de splicing SF3a y SF3b, que son esenciales para el
ensamblaje del pre-spliceosoma y son parte funcional de la forma 17S del snRNP U2.
Los pre-spliceosomas son transformados en spliceosomas por la asociación del
complejo pre-ensamblado que contiene a los snRNPs U4/U6 y U5. Después de la
asociación de los tres snRNPs, U6 se disocia de U4 y forma un nuevo dúplex con el
snRNA U2 y el pre-mRNA mientras que los pares de bases del snRNA U5 se
encuentran unidos únicamente con unos cuantos nucleótidos pobremente conservados
de los exones que se encuentran en los sitios de splicing 5´ y 3´. Por lo tanto, el anclaje
y posicionamiento de U5 claramente debe depender de interacciones proteína-proteína y
proteína-RNA adicionales (Will et al., 1997).
10
Durante el proceso de splicing los snRNAs experimentan numerosos rearreglos
conformacionales que parecen ser catalizados por proteínas pertenecientes a la
superfamilia de helicasas DEAD/H-box. Cinco helicasas putativas, que son esenciales
para el splicing fueron identificadas en levadura y tres de ellas Prp2p, Prp16p y Prp5p
han demostrado poseer actividad de ATPasa estimulada por la presencia de RNA. En el
caso de la actividad de ATPasa de Prp5p, es preferencialmente estimulada por todo el
snRNA U2, identificando a este como un candidato para su actividad putativa de
helicasa (Will et al., 1997).
Las interacciones proteína-proteína y proteína-RNA dentro del spliceosoma, también
parecen estar reguladas por proteínas cinasas y fosfatasas. Ciclos de fosforilación y
desfosforilación han sido detectados durante el proceso de splicing y se sabe que el
estado de fosforilación de proteínas SR, afecta tanto el ensamblaje como la actividad
catalítica del spliceosoma (Will et al., 1997).
DEFINICIÓN DEL 3´ss POR EL FACTOR AUXILIAR U2
Las dos subunidades de U2AF, U2AF35 de ̴35 kDa y U2AF65 de ̴65 kDa,
respectivamente, son componentes esenciales de la maquinaria de splicing (Prigge et
al., 2010).
En animales y plantas, dos tercios del carboxilo (C)-terminal de U2AF65 se compone de
tres dominios, dos de los cuales son los motivos de reconocimiento de RNA (RRM)
canónicos y que contactan directamente al tracto de polipirimidinas del pre-mRNA
adyacente al 3´ss (Sickmier et al., 2006; Zamore et al., 1991). El tercer dominio C-
terminal es un dominio de interacción proteína-proteína, definido como motivo de
homología U2AF (UHM). El UHM se une a motivos de ligando UHM (ULM), que
invariablemente contienen un residuo de triptófano (W). U2AF65 posee un ULM el cual
interactúa con el UHM de otras proteínas incluyendo a U2AF35 (Rudner et al., 1998) y
también interactúa con otras proteínas de splicing como SF1, a través de la vía
ULM:UHM. (Manceau et al., 2006). Por su parte U2AF35 contiene una región de débil
homología al dominio de unión a RNA tipo RRM y un C-terminal SR, que actúa como
mediador de las interacciones proteína-proteína, como en otros factores de splicing (Wu
et al., 1993; Zhang et al., 1992).
11
En el amino N-terminal de U2AF65 predomina un dominio SR, que promueve el
ensamblaje del pre-spliceosoma, contactando el BPS y modulando la interacción entre
el BPS y el complejo snRNP U2 (Gama-Carvalho et al., 2001). Los dominios SR se
encuentran en muchas proteínas de splicing y son usualmente mediadores de las
interacciones proteína-proteína (Graveley, 2000). La figura 4 muestra los dominios e
interacciones conocidas de U2AF con el pre-mRNA y otros factores de splicing.
Figura 4. Dominios de interacción del factor auxiliar de U2. El extremo N-terminal de la subunidad 65 posee
un dominio rica en SR, seguida de una región rica en prolinas que interactúan con el RRM1 de U2AF35; este a
su vez reconoce el 3´ss. U2AF65 también contienen los RRM1 y RRM2 para el reconocimiento del tracto de
polipirimidinas, en tanto que el RRM3 contacta el N-terminal de SF1, otro factor de splicing necesario para la
formación del complejo SF1-U2AF-RNA ya que está comprometido en el reconocimiento del BPS. Tomado de
Kent, et al., 2003.
Las secuencias consenso para el 5´y 3´ss en eucariontes superiores ha sido determinada
a través de comparaciones de las secuencias intronicas conocidas (Shapiro et al., 1987).
Estas se ilustran en la figura 5.
Figura 5. Estructura de las secuencias consenso contenidas en el intrón, en los sitios de splicing 5´y 3´, el punto
de ramificación y el tracto de polipirimidinas respectivo. Modificado de Ritche et al., 2009.
12
La secuencia consenso del 5´ss es AG/GU(A/G)AGU, mientras que el sitio aceptor de
splicing contiene un tracto de polipirimidinas seguido de la secuencia CAG/G
(YnNCAG/G) en el 3´ss. El BPS se considera dentro de la secuencia consenso 3´ss, a
pesar de que es altamente degenerada (Green, 1991; Krainer, 1988).
Con excepción de la secuencia GU y AG del 5´y 3´ss, las secuencias del sitio de
splicing contienes diversas variaciones del consenso. Debido a este bajo nivel de
conservación, secuencias similares al consenso se encuentran presentes dentro de los
exones e intrones. En general, las secuencias que presentan una mejor adecuación a este
consenso tienen mejor capacidad de unión a los factores de splicing (Nelson et al.,
1989; Zamore et al., 1992) y son empleadas como auténticos sitios de splicing
(Ohshima et al., 1987; Brunak et al., 1991). Estos sitios son considerados “sitios
fuertes”, mientras que los “sitios débiles” o los sitios con una pobre conservación de la
secuencia consenso tienden a ser inactivos o usados ineficientemente, por lo que la
fuerza de este sitio de splicing es determinante en la selección del mismo (Fu et al.,
1988; Lowery et al., 1988; Peterson et al., 1989; Hoshijima et al., 1991).
El reconocimiento temprano del 3´ss en los intrones en eucariontes superiores se lleva a
cabo gracias al factor auxiliar U2AF. De las dos subunidades que la componen la de 65
kDa contacta directamente el tracto rico en polipirimidinas que precede al 3´ss, mientras
que la subunidad de 35 kDa interactúa con el dinucleótido AG de la unión intrón-exón.
En contraste con U2AF65, que es esencial para el splicing, U2AF35 no pareciera ser
requerido para el procesamiento de intrones con tractos de polipirimidinas fuertes,
conocidos como intrones independientes de AG (Reed, 1989). Sin embargo U2AF35 es
esencial para intrones con tractos de polipirimidinas cortos o débiles (Valca, 1999; Wu
et al., 1999). El mecanismo en el cual las dos subunidades de U2AF actúan en el
reconocimiento del 3´ss débil continúa sin ser claro. Acorde al modelo actual las
desviaciones de las secuencias consenso de reconocimiento resultan en una disminución
en la afinidad de U2AF65 por el pre-mRNA (Smith et al., 2000). En esta circunstancia la
unión de U2AF35 al dinucleótido AG puede incrementar la afinidad de U2AF debido a
que el heterodímero realiza un contacto RNA-proteína adicional, que si se tratara solo
de la subunidad de 65 kDa (Valca, 1999; Wu et al., 1999).
13
Algunos intrones, snRNAs y proteínas asociadas a splicing se han caracterizado en
diversos eucariontes de ramificación profunda o temprana, denominados como
“eucariontes basales”. En consecuencia, los intrones y la maquinaria básica de splicing
pudieron haber ocurrido en linajes tempranos y probablemente del ancestro común.
(Wilihoeft et al., 2001; Nixon et al., 2002; Collins et al., 2005)
ORGANISMO DE ESTUDIO: Entamoeba histolytica
Respecto a los organismos de ramificación temprana, el organismo para este estudio es
Entamoeba histolytica. Es un parásito protozoario, agente causal de la amibiasis y de
100,000 muertes anuales (WHO/PAO/UNESCO, 1997).
Los parásitos se transmiten en forma de quiste a través de agua o alimentos
contaminados, haciendo la incidencia de esta enfermedad mayor en aéreas de bajas
condiciones sanitarias. La mayor mortalidad ocurre en Asia, Centro América,
Sudamérica y África (Mondal et al., 2006), sin embargo puede afectar a ciertas
poblaciones de países desarrollados (Haghighi et al., 2002; Haghighi et al., 2003). La
prevalencia de esta enfermedad (estimada en 1986) sugiere que el 10% de la población
mundial está infectada por este parásito (Walsh, 1986). La infección produce diferentes
resultados, el 90% permanece asintomático, mientras que el 10% restante desarrolla
síntomas de la amibiasis invasiva (Stanley, 2003).
El ciclo de vida del parásito consta de dos estadios, que consisten en la forma infectiva
de quiste y la forma patogénica motil, el trofozoíto. La infección inicia con la ingesta de
los quistes. El desenquistamiento en el intestino produce 8 trofozoítos por quiste, los
cuales colonizan el intestino grueso, proliferando en el lumen y unidas a la mucosa y
células epiteliales (Tanyuksel et al., 2003). En la figura 6 se ilustra el ciclo de vida de
este parásito en el hospedero.
14
Figura 6. Ciclo de vida del parásito intestinal E. histolytica. Una vez ingeridos los quistes maduros estos se
desenquistan siguen dos vías, la primera es la división de los trofozoítos en el intestino grueso, provocando
colonización no invasiva del mismo, enfermedad intestinal como diarrea o colitis invasiva o enfermedad
extraintestinal como abscesos en el hígado. La segunda vía es el enquistamiento y excreción por las heces.
Modificado de Centers for Disease, Control and Prevention, Division of Parasitic Diseases.
SPLICING EN Entamoeba histolytica
Aun cuando el splicing ocurre en todos los dominios de la vida, los métodos empleados
y la frecuencia de este proceso varían de organismo en organismo. Bacterias y archeas
carecen de la vía spliceosomal y emplean el auto-splicing de intrones. Muchos
eucariontes de ramificación temprana incluyendo a los protistas Giardia,
Cryptosporidia, Trypanosoma, Entamoeba y Trichomonas poseen pocos o no poseen
15
intrones. Por la similitud en el mecanismo de splicing entre el grupo de intrones II
(auto-splicing) en procariontes y los intrones eucarióticos se sugiere que su formación
se engendro tardíamente. Debido a que el grupo de intrones II son elementos genéticos
móviles que se propagan por retrotransposición, los ancestros de los intrones
spliceosomales probablemente fueron contenidos en términos de las señales para su
escisión. Por lo tanto los intrones spliceosomales tempranos pueden haber empleado un
método de reconocimiento del sitio de splicing similar a la definición intrónica
(McGuire et al., 2008). En la figura 7 se muestra la frecuencia de las variantes de
splicing en diferentes organismos de los diversos grupos filogenéticos.
Figura 7. Frecuencia de las variantes de splicing organizadas por grupos filogenéticos. Las dos barras indican
la frecuencia relativa, de cada variante de splicing. En el caso de eucariontes de ramificación temprana como
E. histolytica la retención intrónica es la forma de variante de splicing. Tomado de McGuire et al., 2008.
16
Por ejemplo, el 5’ss está bien conservado en hongos hemiascomicetos (Schwartz et al.,
2008) y en Entamoeba histolytica (Wilihoeft et al., 2001; Davis et al., 2007) pero no en
eucariontes superiores y en algunos protozoarios; en cambio el 3’ss tiene una estructura
bien definida en todos los organismos estudiados hasta hoy, conformada por el
trinucleótido T/CAG (Schwartz et al., 2008). Por su parte la BPS aunque conservada en
Saccharomyces cerevisiae y otros hemiascomicetos (TACTAAC, en la que la adenosina
ramificada aparece subrayada), en plantas, metazoarios y protozoarios aparece como
una secuencia poco conservada (Schwartz et al.,, 2008). En humanos, por ejemplo está
definida por la secuencia yUnAy (Gao et al., 2008).
Aunque algunos reportes detallan porciones del mecanismo de splicing amebianos, aún
falta mucho por descubrir. Por ejemplo, se han identificado los elementos en cis como
los sitios de splicing 5’ (GUUUGU) y 3’ (UAG) que están bien conservados tanto
evolutivamente como entre los distintos intrones amebianos. Sin embargo, el BPS sólo
ha sido identificado in silico y no es tan conservada como en los mamíferos o en
levaduras (Wilihoeft et al., 2001; Davis et al., 2007; Lohia et al., 1993; Plaimauer et al.,
1994).
17
ANTECEDENTES
La mayor parte del conocimiento del mecanismo de splicing viene de estudios en
organismos modelo como H. sapiens y S. cerevisiae. Sin embargo, poco se sabe de los
mecanismos que rigen este proceso en protozoarios. Por ejemplo, se sabe que ocurre cis
splicing en Trichomonas vaginalis (Vanácová et al., 2005) y Gardia lamblia (Nixon et
al., 2002; Roy et al., 2012; Kamikawa et al., 2011), que existe trans splicing en Giardia
lamblia y en Trypanosomatidos (Murphy et al., 1986; Preußer et al., 2012) y que el
splicing alternativo es un evento prevalente en E. histolytica (13% en la variante de
retención intrónica) (Davis et al., 2007; McGuire et al., 2008; Hon et al., 2013). Así, es
importante extender los estudios sobre el mecanismo de splicing en eucariontes de
ramificación temprana porque éste claramente difiere o presenta sutilezas distintas a las
de los organismos modelo.
La mayoría de los eucariontes de ramificación temprana, entre ellos el phylum
Amebozoa (Eichinger et al., 2013), tienen muy pocos intrones o carecen de ellos.
Notablemente, aunque en los 9,938 genes reportados del protista Entamoeba histolytica
se han detectado unos 3 mil intrones, (Loftus et al., 2005), en solo unos cuantos se ha
comparado la secuencia genómica con la del cDNA y han sido validados por RT-PCR
(Davis et al., 2007; Wilihoeft et al., 2001; Lohia et al., 1993; Willhoeft et al., 1999;
Plaimauer et al., 1994; Urban et al., 1996; Sanchez-Lopez et al., 1998; Marchat et al.,
2008). Algunas de las características de sus intrones se presentan en la tabla 1.
Intrones
Número 2,553
Contenido de CG (%) 19.3
Longitud promedio (bp) 74.1
Longitud total (bp) 189,260
Tabla 1. Características generales de los intrones en el parásito E. histolytica. Modificado de Lorenzi et al.,
2010.
En cuanto a los factores de splicing en trans, el desconocimiento es aún mayor ya que
tan solo se han identificado los snRNAs U2, U4, U5 y U6 (Davis et al., 2007; Miranda
et al., 1996) y no se han identificado ni caracterizado ninguna de las 200-300 proteínas
18
que conforman el spliceosoma amebiano, que previamente se ha deducido in silico
(Collin et al., 2005). Del mismo modo se han deducido las DExH/A RNA helicasas
amebianas, de las cuales solo a una se la ha probado función de relajación del RNA
dependiente de ATP (Marchat et al., 2008) pero ninguna de ellas ha sido implicada en el
proceso de splicing.
Como describimos anteriormente, el factor U2AF35/65 es un dímero proteico conservado
en la mayoría de las especies, que participa en el proceso de splicing, reconociendo el
BPS y el posteriormente el sitio de splicing 3´. En E. histolytica, el posible ortólogo de
U2AF65, U2AF84, identificado por análisis bioiformáticos (Loftus et al., 2005), fue
inmunoprecipitado en complejos de ribonucleoproteínas de mensajero provenientes de
trofozoítos de amebas irradiadas con luz ultravioleta (Valdés et al., 2014). Así, U2AF84,
junto con otras 35 proteínas se convirtieron en los primeros factores de splicing cuya
función se manifestó in vivo.
A partir de análisis bioinformático realizado en nuestro laboratorio en las bases de datos
del National Center for Biotechnology Information (NCBI), se encontró que el gen que
codifica para U2AF84 en E. histolytica posee diversos dominios, y se muestran en la
figura 8, en orden:
I) Región SR, en el N-terminal, el cual permite el reclutamiento de otros
factores de splicing del snRNP U1 y U2, mediando las interacciones
proteína-proteína.
II) Un residuo de prolina (P), el cual probablemente interactúan con el RRM de
U2AF35.
III) Tres regiones de motivo de reconocimiento de RNA (RRM1, RRM2 y
RRM3), en la porción media. Los análisis de experimentos en este factor
indican que son RRM1 y RRM2 los que reconocen el tracto de
polipirimidinas (Kent et al., 2003). Sin embargo en estudios realizados en
los ortólogos de U2AF65, prp2 y Mud2 en Schiziosacharomicces pombe y
levadura, respectivamente, el reconocimiento del tracto de polipirimidinas se
19
lleva a cabo por un dominio adicional RRM3, que coincidentemente también
está presente en U2AF84 de E. histolytica.
IV) El dominio C-terminal inicia con un dominio que no tiene homología con
proteína alguna reportada. Al final del C-terminal le sigue el dominio KH-
QUA2. Este dominio se encuentra en el factor SF1 (Jacewicz et al., 2015), y
está implicado en el reconocimiento de punto de ramificación del pre-
mRNA, regulando la estabilidad del complejo SF1-U2AF65-RNA, al
interactuar con el motivo UHM del RRM3 de U2AF65 (Liu et al., 2001;
Selenko et al., 2003; Mackereth et al., 2011).
Figura 8. Análisis bioinformático del gen de U2AF84. Comparado con los dominios caracterizados en H.
sapiens el transcrito correspondiente al organismo E. histolytica, posee el dominio SR, una prolina que podría
interactuar con U2AF35, las tres regiones de reconocimiento de RNA (RRM1, RRM2 y RRM3) y el dominio
KH-QUA2 perteneciente al factor SF1. Datos de NCBI (NM_007279.2 y EHI_098300).
Sin embargo, aun cuando U2AF84 se halla asociada al spliceosoma, no se conoce si
tiene alguna función relevante en dicho complejo, de modo tal que sería deseable
realizar experimentos conducentes a demostrar su participación en el splicing. Para ello
podrían realizarse ensayos de silenciamiento de U2AF84 y medir el efecto que tal
silenciamiento causaría sobre el splicing amebiano.
SILENCIAMIENTO DE GENES EN E. histolytica.
El amebaporo (AP) es un factor central de virulencia de E. histolityca. Existen tres
isoformas de la proteína pequeña de AP (77 aminoácidos), como péptidos maduros
potencialmente activos, localizados dentro de gránulos citoplasmáticos del trofozoíto
(Bracha et al., 1999; Leippe, 1997). En estudios realizados por Bracha y colaboradores
en 2003, mostraron que el silenciamiento del gen apa-a, que codifica para la proteína
AP en trofozoítos de E. histolytica, resultó en una considerable disminución de la
virulencia amebiana. Para efectuar el silenciamiento génico transcripcional (TGS) del
producto del gel apa-a realizaron una construcción que contenía la región 5´ enfrente de
20
dicho gen (Bracha et al., 2003). Además encontraron que es posible silenciar productos
de genes adicionales toda vez que las secuencias 5´ de tales genes sean insertadas
contiguamente a las secuencias rio arriba del gen apa-a (Bracha et al., 2006). Con esa
estrategia encontraron que es necesaria la presencia de fragmentos de retrotransposones
que alteran la expresión de genes adyacentes. Interesantemente estos retrotransposones
se encuentran ampliamente distribuidos en el genoma de E. histolytica. Dichas
secuencias, necesarias para el silenciamiento, se conocen como elementos cortos
intercalados (SINEs), localizadas rio arriba de los genes silenciados y que están
seguidas de una región rica en T (Anbar et al., 2005). Así el TGS puede ser una
herramienta biológica útil en el estudio de la función de los factores de splicing
amebianos.
JUSTIFICACIÓN
21
La escisión de intrones en el pre-mRNA resulta ser un proceso fundamental y
conservado en la expresión génica de eucariontes. En el organismo de ramificación
temprana Entamoeba histolytica hasta la fecha no se ha estudiado la función de ningún
factor de splicing. Sin embargo a través de los estudios proteómicos de
ribonucleopartículas de mensajero realizados en el parásito intestinal E. histolytica se
identificaron 36 proteínas de splicing, entre ellas el factor auxiliar de U2 (U2AF), con
un peso molecular de 84 kDa.
En el presente trabajo nos proponemos demostrar que U2AF84 participa en el proceso de
splicing y es ortólogo de U2AF65.
HIPOTESIS
22
Si U2AF84 participa en el splicing en E. histolytica, la disminución de su
expresión por silenciamiento provocará una disminución en la remoción
intrónica de los transcritos de este parásito.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Analizar el efecto del silenciamiento de U2AF84 sobre el splicing de pre-mRNAs
blanco.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Construir el plásmido silenciador pGsi84.
Silenciar la expresión de U2AF84 en trofozoitos de E. histolytica.
Evaluar los niveles de RNA y proteína de U2AF84 en los trofozoitos de E.
histolytica en los cuales se silenció su expresión.
Analizar el efecto del silenciamiento de U2AF84 en la presencia de las variantes
con y sin retención intrónica de los genes blanco RabX13, Cdc2, ClC-B, Sam50,
EhMybS6 y Actina, así como el impacto de dicho silenciamiento sobre la
transcripción de dichos genes.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
23
Para cumplir el objetivo general se realizó la construcción del plásmido silenciador
pGsi84 y se transfectó en trofozoítos de Entamoeba histolytica de la cepa G3, cuya
característica es el silenciamiento del gen que codifica para la proteína de ameboporo,
sin encontrarse transfectada con la construcción de apa-a. La transcripción del plásmido
silenciador psAP2Gunma está dirigida por el promotor del amebaporo amebiano, de
modo que al ser transfectado en trofozoítos carentes de este gen se incrementa la
expresión del transcrito silenciador. El silenciamiento transcripcional se obtiene al
clonar los primeros 400 pb de la secuencia codificante del gen blanco en el vector
psAP2Gunma entre los 2 elementos del retroposón SINE1 presentes en el vector que
una vez transcritos producirán RNAs cuya estructura secundaria es susceptible de ser
reconocida por la maquinaria canónica para la producción de siRNA, es decir serán
degradados por Dicer para luego ser cargados al sistema silenciador de RISC.
Para la construcción del plásmido silenciador pGsi84 se siguió la siguiente estrategia:
a) Se clonó los primeros 400 nucleótidos correspondientes a U2AF84, en el vector
de silenciamiento psAP2Gunma.
b) Se transformaron células competentes de E. coli y a partir de las colonias
obtenidas, se analizó la producción del plásmido pGsi84 por ensayo de mini-
preparación y digestión con enzimas de restricción.
c) Finalmente se secuencio el plásmido para corroborar la presencia de los 400
nucleótidos.
Para el silenciamiento en trofozoítos de E. histolytica, la estrategia experimental que se
siguió fue:
a) El plásmido silenciador pGsi84 generado y el plásmido con el vector vacio se
transfectó en trofozoítos de E. histolytica empleando el reactivo superfect.
b) Las amebas transfectantes se seleccionaron a las 24 horas posteriores a la
transfección con el antibiótico G418, iniciando con 1 μg hasta una concentración
de 10 μg.
24
Posterior a la selección con antibiótico G418, se analizó el efecto del silenciamiento del
gen de U2AF84 determinando el nivel de proteína. Para ello, la estrategia experimental
fue:
a) Se obtuvieron extractos totales de proteína provenientes de las transfectantes en
las diferentes concentraciones de antibiótico G418 y se analizó la disminución
de la proteína U2AF84 por fraccionamiento en gel de poliacrilamida (PAGE) y
ensayo de western blot.
Finalmente para el análisis del silenciamiento de U2AF84 la selección de los transcritos
a monitorizar, se realizó por medio de:
a) Análisis in silico de las señales intrónicas de los transcritos RabX13, Cdc2, ClC-
B, Sam50, EhMybS6 y Actina.
b) Comparación de la disminución del producto procesado y aumento del pre-
mRNA en función de las diferentes concentraciones de antibiótico G418.
Alternativamente, se compararon los niveles totales de los transcritos por
analizar también en función de la concentración de G418.
Lo anterior se esquematiza en la figura 9.
Figura 9. Estrategia experimental de trabajo para el silenciamiento del gen que codifica para la proteína
U2AF84.
25
MATERIALES Y MÉTODOS
CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO SILENCIADOR pGsi84
El plásmido silenciador pGsi84 se obtuvo al amplificar los primeros 400 nucleótidos del
gen correspondiente a U2AF84 de E. histolytica a partir de DNA genómico. Este
fragmento se amplificó con los oligonucleótidos presentados en la tabla 2 y las
condiciones de PCR que se muestran en la figura 10.
Gen Nombre Secuencia de oligonuceótidos (5´→ 3´)
U2AF84 FStu
RSac
AAAAGGCCTATGGCAGGAAGGTATG
CCATGAGCTCTTAATTGTTGAGATATTT
Tabla 2. Oligonucleótidos empleados para la amplificación de U2AF84.
Figura 10. Condiciones de amplificación de U2AF84, durante 30 ciclos.
El producto de PCR obtenido se clonó en el vector de silenciamiento psAP2Gunma. El
cual se esquematiza en la figura 11.
Figura 11. Mapa del vector de silenciamiento psAP2Gunma.
26
Este vector se trató con las enzimas de restricción SacI y StuI (NEB No. catálogo
#R3156 y #R0187L). Para la digestión se emplearon 4 µL de buffer 1, 1 µL de BSA y
una unidad de la enzima SacI y StuI, en un volumen final de 30 µL. La reacción se
incubó a 37 °C durante una hora. Posteriormente se inactivaron las enzimas a 65 °C por
15 minutos y se monitoreo 2 µL en un gel de agarosa al 1%.
Para la reacción de ligación la relación vector:inserto fue 1:3, en 4 µL de buffer de
ligación 5x y una unidad de ligasa T4 (Invitrogen No. catálogo 15224-017), en un
volumen final de 30 µL. La reacción se dejo incubando a 16 °C toda la noche.
La ligación se empleo para transformar bacterias competentes de E.coli de la cepa
TOP10 y TBE. Se mezcló suavemente 200 µL de la cepa y 5 µL de la ligación
dejándolo incubar en hielo por 20 min, para posteriormente incubar a 42 °C por 45
segundos y se dejó nuevamente en hielo por 2 minutos. Posteriormente se adicionó 800
µL de medio súper óptimo (SOB). Se incubó en agitación a 37 °C por 1 hora con 20
minutos. Finalmente se tomó una alícuota de 100 µL y se espatuló en cajas con medio
solido Luria-Bertani con ampicilina (100 µg/mL) y se incubó en la obscuridad a 37 °C
toda la noche. Las colonias obtenidas se sembraron en tubos con 3 mL de medio Luria-
Bertani con ampicilina (100 µg/mL) se incubaron en agitación a 37 °C toda la noche.
Las bacterias se colectaron por centrifugación (13,000 rpm por 2 minutos) y se
extrajeron los plásmidos por miniprep acorde a la técnica descrita por Del Sal y col.
(1998). Las bacterias se resuspendieron en 300µL de buffer STET (sacarosa 3% (w/v),
tritón X-100 0.1% (v/v), EDTA 50 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0), se adicionó 10 µL de
lisozima (10 µg/ µL) y se dejó incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Las
muestras se calentaron a 90 °C por 1.15 minutos y se centrifugaron a 15,000 rpm por 15
minutos. Se removió la pastilla y se adicionó 10 µL de CTAB 5%. Nuevamente se
centrifugaron las muestras a 15,000 rpm por 10 minutos, se elimino el sobrenadante.
La pastilla se resuspendió en 300 µL de NaCl 1.2 M, posteriormente se adicionó 700 µL
de etanol absoluto y se centrifugó a 15,000 rpm por 15 minutos. La pastilla resultante se
lavó con 300 µL, se centrifugó a 15,000 rpm por 5 minutos, se decanto el sobrenadante
27
y la pastilla de DNA se resuspendió en 50 µL de H2O miliq. Se monitorizaron 5 µL del
plásmido en un gel de agarosa al 1% en TAE (Tris-acetato 4 mM, EDTA 1 mM).
Los plásmidos recombinantes seleccionados se trataron con las respectivas enzimas de
restricción SacI y StuI, empleando para la digestión 4 µL de buffer 1, 1 µL de BSA y
una unidad de la enzima SacI y StuI, en un volumen final de 20 µL y monitoreando las
digestiones en un gel de agarosa al 1%. Con lo que se permitió identificar el fragmento
correspondiente a los primeros 400 nucleótidos del gen de U2AF84.
Las candidatas positivas se enviaron a secuenciar, empleando los oligonucleótidos de la
tabla 3.
Gen Nombre Secuencia de oligonuceótidos (5´→ 3´)
psAP2Gunma psAP2-FP
psAP2-RP
AAAAGGCCTATGGCAGGAAGGTATG
CCATGAGCTCTTAATTGTTGAGATATTT
Tabla 3. Oligonucleótidos empleados para la secuenciación de las clonas positivas.
Una vez que se corroboró la secuencia, las clonas positivas se crecieron en 50 mL de
medio líquido, se centrifugaron a 10,000 rpm por 5 minutos a 4 °C y el plásmido se
purificó empleando una MegaPrep con el kit “QIAGEN PlasmidMidi”. Finalmente se
cuantificó por espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm.
CULTIVO DEL PARÁSITO E. histolytica.
Los trofozoítos de E. histolytica de la cepa G3, se cultivaron en tubos de cristal con
rosca de 12 mL a 37 ºC con medio TYI-S-33, descrito por Diamond et al., en 1978 la
formulación de este medio se describe en el anexo de este trabajo. Una vez que los
tubos alcanzaron una confluencia del 70-80 % se enfriaron en un baño de hielo-agua
durante 15 minutos, se resuspendieron los trofozoítos y finalmente se resembraron 500
μL en tubos con medio fresco.
28
TRANSFECCIÓN DEL PLÁSMIDO SILENCIADOR pGsi84 EN
TRAFOZOITOS DE E. histolytica.
La transfección de trofozoítos de E. histolytica se realizó de la siguiente forma a partir
de dos tubos de 12 mL con medio TYI-S-33 a una confluencia de entre el 80-90% de
amebas se sembró una caja de 25 cm2, llenándola completamente con medio TYI-S-33,
transcurridas las 24 horas se verificó que hubiese la formación de una monocapa de
amebas (confluencia entre el 90-95%). Se retiró el medio, adicionando 5 mL de medio
TYI-S-33 frio. Cuidadosamente se levantó la monocapa pipeteando el medio frio hasta
homogenizarlo, posteriormente se realizó un conteo de amebas en una cámara de
neubauer.
En una caja de 6 pozos se sembraron entre 500,000-600,000 amebas por pozo, se
adicionó 5 mL de medio TYI-S-33 completo tibio y se incubaron a 37 °C con CO2
durante 30 minutos.
Durante los 30 minutos de incubación se realizó en esterilidad la mezcla de
transfección, en tubos Eppendorf de 1.5 mL se mezclaron 20 µg de los respectivos
plásmidos control y silenciador, 100 µL de medio M199 (suplementado con HEPES 25
mM, Cisteína 5.7 mM, Ácido ascórbico 1 mM, pH. 6.8) (Life technologies 11150-059)
y 20 µL de superfect (Quiagen No. catálogo 301305) dejándolo incubar a temperatura
ambiente por 10 minutos. En un tubo cónico de 15 mL se preparó medio M199
completo con suero bovino adulto (BSA) al 15% (Microlab No. catálogo 50140)
Transcurrido el tiempo de incubación se retiró el medio TYI-S-33 y se hicieron dos
lavados con 1 mL de medio M199 previamente precalentado a 37 ºC.
Se combinó la mezcla de superfect con 900 µL de medio M199 completo con BSA y se
adicionó lentamente gota a gota sobre la monocapa de amebas formada en cada uno de
los pozos. Posteriormente se incubó a 37 ºC por 4 horas. Al termino de este periodo de
tiempo se enfrió la placa en un baño de hielo-agua durante 15 minutos y se colectó el
medio con las amebas, las cuales se sembraron en tubos de 12 mL con medio TYI-S-33
e incubándolas a 37 ºC durante 24 horas.
Transcurrido ese tiempo se inicia la selección con el antibiótico G418 (Life
technologies No. catálogo 11811098) a una concentración de 1 µg/mL, la concentración
fue aumentando conforme los tubos alcanzaron una confluencia de 80%, hasta llegar a
29
10 μg de antibiótico. Una vez que se establecieron los cultivos a las concentraciones de
antibiótico deseadas, se expandieron en cajas de 25 cm2.
ENSAYO DE WESTERN BLOT
Los extractos de proteína total se obtuvieron por dos métodos uno con buffer de lisis
(Tris HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, Triton X-100 1% e inhibidor de proteasas E-
64 10 μM) y el segundo acorde al protocolo de extracción de proteínas con TRIzol
(Invitrogen No. Catálogo 15596-026).
Se preparó un gel de poliacrilamida al 8% con las siguientes cantidades:
Reactivo Gel Separador Gel Condensador
Acrilamida 3.3 mL 225 µL
Tris-HCl 3.8 mL (pH 8.8) 250 µL (pH 6.8)
SDS (10%) 100 µL 20 µL
H2O 2.7 mL 1.545 mL
PSA 50 µL 10 µL
TEMED 10 µL 5 µL
Tabla 4. Reactivos para la preparación de un gel de poliacrilamida al 8%.
Las muestras se mezclaron con buffer de carga 4X y agua, posteriormente se calentaron
durante 3 min a 92 °C, se centrifugó y cargo de 25-30 µg de proteína. Las muestras se
cuantificaron por el fluorometro Quibit 2.0 acorde a las indicaciones del proveedor.
(Invitrogen No. catálogo Q32866).
El gel se corrió en un buffer de corrida para proteínas 1X (Tris-base 30 g/L, Glicina 144
g/L y SDS 10%) a 120 V, 350 mA y 100 W durante 1:30 horas.
Posteriormente se realizó la transferencia a una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN
0.45 µM No. catálogo NBA085C001EA) empleando buffer de transferencia (Glicina 39
mM, Tris-base 48 mM, SDS 0.037% y Metanol 20%) a 86 V, 300 mA y 100 W por 2
horas. Una vez finalizado se tiño con rojo de Ponceau, para verificar la transferencia de
proteínas y se lavó con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10.1 mM y
KH2PO4 1.8 mM).
30
Se bloqueo la membrana con suero bovino adulto (BSA) al 3% en PBS, a 37 °C en
agitación por 2 horas, después se lavó la membrana 6 veces durante 5 minutos con PBS-
Tween20 0.5%.
Se incubó con el anticuerpo primario anti U2AF65 de cabra, el cual reconoce el N-
terminal de la proteína (Santa Cruz No. catálogo sc-19958) en PBS a una dilución
1:2000 durante toda la noche, se lavó 6 veces durante 5 min con PBS-Tween20 0.5%.
Se incubó con el anticuerpo secundario Ig de conejo anti-cabra (Invitrogen Zymax No.
catálogo #81-1620) en PBS-Tween20 0.5% a una dilución 1:10000. Se lavó 8 veces
durante 2:30 minutos con PBS- Tween20 0.5%, después un lavado de 10 minutos de
nuevo con PBS-Tween20 0.5% y finalmente un lavado con PBS.
Como control de carga se empleó el anticuerpo primario anti Histona H3 de conejo
(Meckmillipore No. catálogo #97275), a una dilución 1:1000 y anticuerpo secundario Ig
de cabra anti-conejo (Zymax No. catálogo AQ132P) a una dilución 1:5000, empleando
los mismos tiempos de bloqueo incubación y lavado.
Finalmente se procedió a revelar la señal de la membrana en placas fotográficas Kodak
film (Ref. 604 0331), con solución quimioluminiscente (Perkinelmer No. catálogo
NEL103001EA). Se enjuagaron y dejaron secar para su posterior análisis.
ENSAYO RT-PCR
A partir de la extracción de RNA total con el protocolo de TRIzol (Invitrogen No.
catálogo 15596-026) cada una de las muestras a 1, 5 y 10 μg/mL de G418 se trato con
DNAsa I (Promega No. catálogo #M6101), de 5-8 μL de muestra, 5 μL de buffer para
RT 5X y 1μL de DNAsa I, en un volumen final de 25 μL, se incubó a 37 ºC por 1 hora,
el RNA se trato posteriormente con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y precipitó con
etanol. EL RNA total se cuantificó por espectrofotometría a una longitud de onda de
260 nm y por el fluorometro Quibit 2.0 acorde a las indicaciones del proveedor.
(Invitrogen No. catálogo Q32866).
31
Ya cuantificado para la reacción de retrotranscripción en un tubo Eppendorf de 1.5 mL
se empleo 1 μg de RNA total de cada muestra, se adicionó 1 μL de solución de
deoxinucléotidos DNTP´s 10 mM, 1 μL de oligonucleótido reverso del transcrito de
interés 10 mM y se llevo a un volumen de 13 μL. Se incubó a 65 ºC durante 5 minutos y
luego en hielo por 2 minutos. Después se adicionó 4 μL de buffer FS 5X y 2 μL de DTT
0.1 M. Se incubó a 37 ºC por dos minutos, transcurrido ese tiempo se adicionó 1 μL de
MMLV-RT (Invitrogen No. catálogo 28025-021) esta mezcla final se dejó incubando a
37 ºC durante 1 hora. Finalmente se inactivó a 75 ºC por 10 minutos.
Para las reacciones de PCR, se tomó 2 μL de la RT respectiva y se adicionó en un tubo
Axygen de 0.2 mL junto con 1.25 μL de buffer para PCR 10X, 0.25 μL de DNTP´s 10
mM, MgCl2 a diferentes concentraciones, dependiendo del transcrito a amplificar, estas
se presentan en la tabla 5, 0.63 μL de oligonucleótidos F y R según el transcrito que se
fuera a amplificar (tabla 6), 0.14 μL de Taq polimerasa (Invitrogen No. catálogo 10342-
053) y se llevo a un volumen final de 12.5 μL con H2O miliQ.
Como control negativo se realizó la reacción de PCR del RNA total sin tratar con
retrotranscriptasa, las figuras se presentan en el anexo de este trabajo.
Transcrito Concentración de MgCl2 μL para la reacción de PCR
rRNA 18S 1 mM 0.25 μL
Actina 1.5 mM 0.38 μL
Cdc2 1.5 mM 0.38 μL
ClC-B 2.5 mM 0.63 μL
RabX13 3 mM 0.75 μL
Sam50 2.5 mM 0.63 μL
MybS6 2.5 mM 0.63 μL
Tabla 5. Concentraciones de MgCl2 empleadas en la reacción de PCR para cada transcrito de estudio.
32
Transcrito Nombre Secuencia de oligonuceótidos (5´→ 3´)
rRNA 18S FRibEh239F
RRibEh88R
ATTGTCGTGGCATCCTAACTCA
GCGGACGGCTCATTATAACA
Actina EhACT F
EhACT R
GAGCTGTATTCCCATCCATTGTTG
CTTTCAGCAGTAGTGGTGAAAGC
Cdc2 Cdc2 F
Cdc2 R
CAATTAGGAGAAGGAACATATGG
GTGGTTTCATATCTCTGTGAAG
ClC-B Chlo F
Chlo R
ATGGAACAAAATTTACCCTC
AAGCAACACCACATCCAGAAGC
RabX13 Rab2 F
Rab2R
CGTTGTTGGAGACTCTTCAGTTGG
GACCCATTTCAGTTGAAACAGTTC
Sam50 FSam50
RSam50
GCAATGACAACAAGAATGCAA
AAGAAACCCCAACTCCACAA
EhMybS6 S6 FWD
S6 REV
TCAAGTTCGTTCTCATGCAC
CTAGAACAATTGGTTCGAAGG
Tabla 6. Oligonucleótidos empleados en la reacción de PCR para cada uno de los transcritos de estudio.
A continuación se presentan las condiciones de amplificación de cada uno de los
transcritos.
Figura 12. Condiciones para la amplificación durante 28 ciclos del fragmento rRNA 18S.
33
Figura 13. Condiciones para la amplificación durante 30 ciclos del fragmento Actina.
Figura 14. Condiciones para la amplificación durante 35 ciclos del fragmento Cdc2.
Figura 15. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento ClC-B.
Figura 16. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento RabX13.
34
Figura 17. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento Sam50.
Figura 18. Condiciones para la amplificación durante 40 ciclos del fragmento MybS6.
Los respectivos productos se monitorizaron en geles de agarosa al 2% y 2.5% en el caso
de Sam50 y EhMybS6. Se cargaron 3 μL de cada muestra con 2 μL de buffer de carga
(glicerol en H2O 30%, azul de bromofenol 0.25% xileno cianol FF 0.25%). Se corrieron
a 120 V durante 50 minutos, se tiñeron en una solución de bromuro de etidio durante 13
min, se enjuagaron con H2O durante 10 min y se obtuvo la imagen correspondiente en
el foto-iluminador (Dnr, MINI Bis Pro), con el software Gel Capture.
35
ANALISIS DE IMAGENES
Para el análisis de las imágenes obtenidas, se empleo el software ImageJ. Para obtener
los valores de densitometría de los ensayos de western blot y calcular la eficiencia de
silenciamiento de U2AF84, se obtuvieron las densidades de intensidad del área bajo la
curva tanto de U2AF84, como de la histona H3, el cual se utilizó como control de carga.
Con los valores obtenidos se efectuó el cociente de la densidad de intensidad de U2AF84
entre la densidad de intensidad de H3. Los valores se normalizaron contra el vector
vacio a escala de 1. Debido a que nuestro esquema experimental compara dos plásmidos
transfectados en amibas originarias del mismo cultivo se realizó el análisis estadístico
de T-student para dos muestras pareadas con el software GraphPad Prism.
En el caso de los valores de densitometría para los ensayos de RT-PCR, se obtuvieron
los valores IntDen de cada una de las bandas, siendo el rRNA 18S el control de carga.
Posteriormente cada uno de los valores de los transcritos a las diferentes
concentraciones de antibiótico se dividieron entre el valor obtenido del control de carga
para normalizarlos. Se graficaron los cocientes de los valores obtenidos para pGsi84
considerando como 1 el valor de los vectores vacíos a cada concentración de antibiótico
G418. Para los transcritos estudiados los valores se graficaron como el porcentaje total
de la expresión de las variantes de RNA correspondientes a los transcritos estudiados.
36
RESULTADOS
OBTENCIÓN DE LA CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO SILENCIADOR
pGsi84
Para obtener el plásmido silenciador pGsi84, mini-preparaciones de DNAs plasmídicos
obtenidos de las clonas candidatas de las ligaciones del inicio del gen de U2AF84 en el
vector psAP2Gunma se trataron con las enzimas de restricción SacI y StuI. Los
resultados obtenidos se presentan en la figura 19.
Figura 19. Perfil electroforético de las clonas candidatas. A) Monitoreo del plásmido silenciador obtenido por
miniprep, el carril 1 corresponde al vector psAP2Gunma vacio y los carriles 2 al 7 corresponden a las colonias
candidatas seleccionadas. B) Digestión de los plásmidos obtenidos con las enzimas de restricción SacI y StuI.
En el carril m se indican los marcadores de 1 kb, el carril 1 corresponde al vector psAP2 Gunma vacío y los
carriles 2, 3, y 4 corresponden a los plásmidos de las colonias candidatas positivas (2, 3 y 5).
Como se observa en las respectivas imágenes, la selección de los plásmidos se realizó
acorde al patrón de migración en comparación al vector vacio. La diferencia de tamaño
en los plásmidos de las colonias candidatas contra el tamaño del vector vacio
psAP2Gunma permitió elegir las clonas que posteriormente se trataron con las enzimas
SacI y StuI (candidatos 2, 4, 5 y 7). Como se aprecia en la figura 19B, liberaron un
inserto de aproximadamente 400 bp, por excepción de la candidata 7. Estas candidatas
positivas se secuenciaron y posteriormente se realizó el análisis bioinformático para
verificar que correspondiera al fragmento correspondiente a U2AF84, dicho análisis se
presenta en la figura 29 en el apéndice.
37
Los plásmidos una vez purificados por columna se cuantificaron y se monitorizaron en
gel de agarosa al 1%, mostrados en la figura 20. Posteriormente se transfectaron en
trofozoítos de E. histolytica de la cepa G3, mostrados en la figura 21.
Figura 20. Perfil electroforético de los plásmidos psAP2Gunma y pGsi84 purificados por columna. El carril 1
corresponde al vector psAP2Gunma y el carril 2 al vector pGsi84.
Figura 21.Trofozoítos de E. histolytica de la cepa G3.
Transcurridas las 24 horas de la transfección se realizó un cambio a medio TYI-S-33
suplementado con 1 µg/mL de antibiótico G418. Cuando se observó aproximadamente
un 80% de confluencia se incrementó la dosis de antibiótico a 2 µg/mL, y nuevamente
al alcanzar el 80% la confluencia a esa dosis se incremento a 3 µg/mL de antibiótico.
Este proceso se continúo hasta alcanzar una concentración de 10 µg/mL de antibiótico.
Transcurridas varias semanas se obtuvieron cultivos estables de transfectantes a 1, 5 y
10 µg/mL de G418 en medio TYI-S-33. De las transfectantes resultantes se obtuvieron
extractos totales de proteínas y RNA para efectuar los ensayos de western blot y RT-
PCR respectivos.
38
INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE U2AF84 EN TRANSFECTANTES DE
E. histolytica.
Para evaluar la inhibición de la expresión de U2AF84, a partir de extractos totales de
proteína se realizó ensayo de western blot. Los resultados obtenidos de la
inmunodetección de U2AF84 se presentan en la figura 22. Se puede apreciar la
disminución de este factor auxiliar en las transfectantes silenciadas comparadas con
aquellas transfectadas con el vector vacío.
Figura 22. Análisis de la expresión de U2AF84 en trofozoítos de E. histolytica. A) Western blot por triplicado de
extractos totales de proteínas de trofozoítos transfectados con el vector vacío (psAP2G) y con el vector
silenciador de U2AF84 (pGsi84) seleccionados con 10 µg/mL de antibiótico G418. Se reveló con un anticuerpo
anti-U2AF65 y como control de carga se utilizó un anticuerpo contra histona H3. B) Análisis densitométrico de
la eficiencia de silenciamiento de U2AF84 en E. histolytica. Utilizando el software ImageJ, para cada señal de
U2AF84 y de H3 se obtuvieron las densidades de intensidad de las aéreas bajo las curvas. Para las
cuantificaciones relativas se dividió el valor de IntDent para ambos vectores entre el valor de IntDent de H3 y
los valores se normalizaron respecto al vector vacio.
39
Normalizado respecto al vector psAP2G (100% de expresión), la expresión de U2AF84
en las transfectantes pGsi84 a una concentración de 10 µg/mL de G418 disminuyó en
un 69%. El ensayo se realizó por triplicado, con una media de 0.31 y un error estándar
de ±0.045 y acorde al análisis densitométrico, el resultado es estadísticamente
significativo con una p=0.004 obtenida al realizar un análisis de T-student para muestras
pareadas.
El ensayo de western blot también se realizó en las muestras correspondientes a las
concentraciones de 1 y 5 µg/mL de antibiótico G418, sin embargo para el caso de 1
µg/mL G418 no se observaron cambios en la expresión de U2AF84 mientras que a 5
µg/mL G418 la disminución es poco perceptible (datos no mostrados).
EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE U2AF84 SOBRE
ALGUNOS PRODUCTOS GENICOS DE E. histolytica.
Para probar el efecto del silenciamiento de U2AF84 sobre el splicing, y posiblemente la
transcripción, se seleccionaron distintos productos génicos amebianos. Los criterios de
selección fueron las señales de los intrones de sus pre-mRNA, es decir las
características de sus tractos de polipirimidinas (pY), la longitud de los mismos y su
proximidad al 3´ss (Tabla 7).
Pre-
mRNA
Longitud del
intrón (nt)
Características de las secuencias intrónicas (5´→ 3´)
BPS, pY y 3´ss
Actina S/I S/I
Cdc2 79 taaaaaaagataaaaagaaagtactgataaaatatag
RabX13 130 ttatcttgtaaataaatataaactaacttttatttag
Sam50 71 tatatttaattaagataaatgtaagactaaaagaaaaaaaattaaagaatag
ClC-B 1I 56 aattaattgaaaaataaataagttctgatcgttttag
MybS6 56 ttcttaaaaaaaattccatgaaatactaacttttatag
Tabla 7. Señales intronicas de los transcritos seleccionados de E. histolytica. Acorde a la secuencia consenso
NCURAY, en rojo se muestra la adenosina del punto de ramificación (BPS), en magenta el 3´ss y en negro el
tracto de polipirimidinas (pY).
40
Como control negativo se midió el pre-mRNA sin intrones del gen de Actina. Los
elementos intrónicos de los transcritos Cdc2, ClC-B, RabX13 y EhMybS6 ya han sido
reportados (Lohia & Samuelson 1993; Guzmán-Medrano et al., 2005; Nakada-Tsukui et
al., 2010), en tanto que los de Sam50 se infirieron considerando aquellos de RabX13 y
EhMybS6, dado que sólo existe el reporte de que tanto las formas procesadas y con
retención de intrón codifican para proteínas cuyos pesos moleculares corresponden con
los mensajeros respectivos (Dolezal et al., 2010; Meneses et al., 2010).
Considerando la estructura de los mensajeros mencionados, se realizaron ensayos de
RT-PCR usando como templado cDNA obtenido a partir del RNA extraído de amebas
transfectadas con vector vacío ps2APG o el vector pGsi84 seleccionados con distintas
concentraciones de G418. Los productos amplificados se cuantificaron en relación al
transcrito del rRNA 18S.
Transcrito del gen de Actina
Para el control negativo por la ausencia de intrón se empleo Actina cuyo producto
esperado es de 535 bp. En la figura 23 se presentan los resultados obtenidos de la RT-
PCR. Aún cuando existen en apariencia cambios en la cantidad de producto entre los
carriles de vector vacio y de pGsi84 a las distintas concentraciones de antibiótico (Fig.
23A), estas diferencias no se mantienen una vez normalizados los valores contra los
productos del rRNA 18S, que esencialmente permanece sin cambios en todos los
tratamientos (Fig. 23B).
Por lo tanto, podemos concluir que el transcrito de Actina no sufre modificaciones en
sus niveles de expresión, en ninguna de las transfectantes silenciadas a las diferentes
concentraciones de G418, el análisis de la expresión del transcrito se presenta en la
gráfica 1.
41
Figura 23. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de Actina en trofozoítos
transfectados. A) Reacción de RT-PCR del transcrito de Actina, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5
y 10 µg/mL de G418, el producto de la PCR es de 535 bp. B) RT-PCR del transcrito rRNA 18S, de las
transfectantes a concentraciones de 1, 5 y 10 µg/mL de G418, el producto de la PRC es de 173 bp.
Gráfica 1. Determinación del efecto del silenciamiento de U2AF84 del transcrito de Actina. Expresión de Actina
en las transfectantes silenciadas, normalizada contra rRNA 18S. En azul se presenta el grupo de transfectantes
control (obscuro) y silenciada (pálido) a una concentración de 1 µg/mL de G418, en morado a 5 µg/mL de
G418 y en verde a 10 µg/mL de G418. En cada caso, usando el software ImageJ, se obtuvieron los valores
IntDen de cada tratamiento y fueron normalizados respecto a los valores de la expresión del rRNA 18S (Fig.
23B). Se graficaron los cocientes de los valores obtenidos para pGsi84 considerando como 100% el valor de los
vectores vacíos a cada concentración de antibiótico.
0
20
40
60
80
100
Gun1 84-1 Gun5 84-5 Gun10 84-10
Ex
pre
sión
norm
ali
zad
a d
e
Act
ina
(%)
42
Transcrito del gen de Cdc2
El siguiente transcrito en estudio es Cdc2, el cual posee un intrón, sin embargo este no
posee un tracto de polipirimidinas, el producto esperado con intrón es de 440 bp y sin
intrón de 361 bp. La figura 24 se presenta los resultados obtenidos de la RT-PCR. En
todos los casos se obtuvo solamente el producto correspondiente al mRNA sin intrón.
Interesantemente, a bajas concentraciones de G418 no se observan diferencias entre las
distintas transfectantes, pero a 5 g/mL de G418 se observó un ligero incremento no
significativo en la transfectantes silenciadas, en tanto que aquellas seleccionadas a 10
g/mL de G418 mostraron un nivel de expresión menor de Cdc2, tal y como lo muestra
la cuantificación (Grafica 2).
Figura 24. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de Cdc2 en trofozoítos
transfectados. Reacción de RT-PCR del transcrito de Cdc2, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418. Los productos de PCR obtenidos corresponden todos a mensajeros completamente
procesados.
Gráfica 2. Determinación del efecto del silenciamiento de U2AF84 del transcrito de Cdc2. Expresión de Cdc2 en
las transfectantes silenciadas, normalizada contra rRNA 18S. Los valores se analizaron como se describe en la
gráfica 1.
0
20
40
60
80
100
120
Gun1 84-1 Gun5 84-5 Gun10 84-10
Ex
pre
sión
norm
ali
zad
a d
e C
dc2
(%)
43
Transcrito del gen de RabX13
RabX13 posee un intrón largo cuyo tracto de polipirimidinas está bien definido y es
cercano al 3´ss. Los productos de la reacción de PCR son con intrón de 510 bp y sin
intrón de 374 bp. La figura 25 muestra desde la concentración de 1 µg/mL de G418, en
las transfectantes silenciadas hay una acumulación del pre-mRNA y la disminución del
transcrito maduro. A la concentración de 10 µg/mL de G418 hay una disminución de
ambos transcritos, probablemente por alguna perturbación en el proceso de trascripción.
En la gráfica 3 se presentan los valores obtenidos normalizados contra el rRNA 18S.
Como el total de los transcritos detectados comprende los productos del pre-mRNA y el
mRNA, la cuantificación de los mismos se representan como porcentajes de una barra,
así las barras correspondientes a las transfectantes silenciadas a las distintas
concentraciones de antibiótico muestran un incremento de color obscuro, reflejando una
acumulación del pre-mRNA en función de la ausencia incrementada del factor U2AF84.
44
Figura 25. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de RabX13 en trofozoítos
transfectados. Reacción de RT-PCR del transcrito de RabX13, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418, el producto con intrón es de 510 bp y sin intrón de 374 bp.
Gráfica 3. Determinación del efecto del silenciamiento de U2AF84 del transcrito de RabX13. Expresión de
variantes de RNA de RabX13 en las transfectantes silenciadas, normalizada contra rRNA 18S. Los valores se
analizaron como se describe en la gráfica 1 y se representan como el por ciento del total de los productos
detectados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Gun1 84-1 Gun5 84-5 Gun10 84-10
Ex
pre
sión
norm
ali
zad
a d
e R
ab
X1
3(%
)
mRNA
pre-mRNA
45
Transcrito del gen de Sam50
El transcrito del gen de Sam50 posee un intrón, también un tracto de pirimidinas, sin
embargo este se encuentra 39 nt río arriba del 3´ss. Los productos de PCR esperados
son con intrón de 935 bp y sin intrón de 763 bp, que se presentan en la figura 26.
De forma similar que con el transcrito de RabX13, se puede observar un aumento en el
pre-mRNA en las transfectantes silenciadas comparándolas con los controles a las
diferentes concentraciones de antibiótico G418. Estos valores se muestran en la
siguiente gráfica (Gráfica 4), que ha sido normalizada contra el rRNA 18S y cuyos
valores se representan en porcentaje.
Figura 26. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de Sam50 en trofozoítos
transfectados. Reacción de RT-PCR del transcrito de Sam50, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418, el producto con intrón es de 935 bp y sin intrón de 763 bp.
Gráfica 4. Determinación del efecto del silenciamiento de U2AF84 del transcrito de Sam50. Expresión de
variantes de RNA de Sam50 en las transfectantes silenciadas, normalizada contra rRNA 18S. Los valores se
analizaron como se describe en la gráfica 1 y se representan como el por ciento del total de los productos
detectados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Gun1 84-1 Gun5 84-5 Gun10 84-10Ex
pre
sión
norm
ali
zad
a d
e S
am
50
(%)
mRNA
pre-mRNA
46
Transcrito del gen de ClC-B
El transcrito del gen de ClC-B posee dos intrones, sin embargo en este trabajo se estudio
el primer intrón, el cual posee un tracto de polipirimidinas muy pequeño. El producto
esperado con intrón es de 652 bp y sin intrón de 596 bp.
La figura 27 muestra que mayoritariamente se amplifica el producto que corresponde al
transcrito sin intrón. A bajas concentraciones de G418 no se observa diferencias en la
expresión tanto del pre-mRNA como del transcrito maduro entre las transfectantes
control y silenciadas, mientras que a concentraciones de 5 g/mL de G418 se observa
un incremento del pre-mRNA en las transfectantes silenciadas comparadas con su
control; a la concentración de 10 g/mL de G418 el nivel de expresión del pre-mRNA
vuelve a disminuir en las silenciadas (Gráfica 5).
47
Figura 27. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de ClC-B en trofozoítos
transfectados. Reacción de RT-PCR del transcrito de ClC-B, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418, el producto es de 596 bp. Los productos de PCR obtenidos corresponden todos a
mensajeros completamente procesados.
Gráfica 5. Determinación del efecto del silenciamiento de U2AF84 del transcrito de ClC-B. Expresión de
variantes de RNA de ClC-B en las transfectantes silenciadas, normalizada contra rRNA 18S. Los valores se
analizaron como se describe en la gráfica 1 y se representan como el por ciento del total de los productos
detectados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Gun1 84-1 Gun5 84-5 Gun10 84-10
Ex
pre
sión
norm
ali
zad
a d
e C
lC-B
(%)
mRNA
pre-mRNA
48
Transcrito del gen de EhMybS6.
El último de los transcritos de estudio es EhMybS6, el cual posee un intrón cuyo tracto
de pirimidinas es muy pequeño en comparación con el de RabX13 pero este se
encuentra yuxtapuesto con el 3´ss. Los productos esperados son con intrón de 191 bp y
sin intrón de 135 bp.
En este caso no se observó una disminución del mensajero entre los tratamientos, sin
embargo a partir de la concentración de 5 µg/mL de G418, se observó acumulación del
pre-mRNA en las transfectantes silenciadas, misma que incrementó a la concentración
de 10 µg/mL de G418. En la grafica 6 se presentan los valores obtenidos y
normalizados contra rRNA 18S.
Figura 28. Perfil electroforético para determinar la expresión del transcrito de EhMybS6 en trofozoítos
transfectados. Reacción de RT-PCR del transcrito de EhMybS6, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5
y 10 µg/mL de G418, el producto con intron es de 191 bp y sin intrón de 135 bp.
Gráfica 6. Determinación del efecto del silenciamiento de U2AF84 del transcrito de EhMybS6 Expresión de
variantes de RNA de EhMybS6 en las transfectantes silenciadas, normalizada contra rRNA 18S. Los valores se
analizaron como se describe en la gráfica 1 y se representan como el por ciento del total de los productos
detectados.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Gun1 84-1 Gun5 84-5 Gun10 84-10
Ex
pre
sión
nora
mil
zad
a d
e
Eh
Myb
S6
(%)
mRNA
pre-mRNA
49
DISCUSIÓN
Entamoeba histolytica es un eucarionte de ramificación temprana, cuyo genoma está
compuesto de 8201 genes de los cuales 2553 contienen intrones (Lorenzi et al., 2010).
Dichos intrones poseen las señales correspondientes para su reconocimiento por parte
del complejo proteína-RNA conocido como spliceosoma, que esta conservado en la
mayoría de los organismos. Con base en las predicciones bioinformáticas y análisis in
silico sobre los factores y snRNPsU2, U4 y U5 se han propuesto las interacciones RNA-
proteína y las diversas vías alternativas de splicing en este parásito (Davis et al., 2007).
Debido a que en los estudios de análisis proteómicos realizados recientemente (Valdés
et al., 2014) entre las 32 proteínas relacionadas con factores de splicing allí detectadas,
particular e interesantemente de las proteínas relacionadas con el snRNP U2, se detectó
el factor auxiliar de U2 que en el particular caso de E. histolytica su peso es de 84 kDa,
decidimos efectuar los ensayos de silenciamiento y verificar que su ausencia tuviera un
impacto sobre los productos de splicing de distintos pre-mRNA.
La eficiencia de silenciamiento por el sistema de RNA de interferencia para trofozoítos
transfectantes de la cepa G3 fue de 69%. En otros estudios donde se realiza el
silenciamiento basado en RNA de interferencia el rango de silenciamiento dependiendo
del gen va del 40 al 80% (Zhang et al., 2011).
Con base en que U2AF65 en especies como humano, Drosophila o en levadura, cuyo
ortólogo es Mud2, resulta fundamental en el reconocimiento de tracto de pirimidinas
para efectuar el reclutamiento de los snRNP U1 y U2 formando el complejo pre-
catalítico (Ritchie et al., 2009), resulta razonable que el silenciamiento no resulte 100%
efectivo. Esto es, dada la importancia de este factor se espera que su ausencia total sea
deletérea.
De acuerdo a lo anterior, y como se analizará más adelante, el silenciamiento de este
gen presenta alteraciones en el proceso de transcripción de algunos de los transcritos de
estudio así como la esperada acumulación de pre-mRNA.
50
Dentro de las secuencias de reconocimiento intrónicas el tracto de pirimidinas es el que
interactúa directamente con el motivo de reconocimiento de RNA RRM1 y RRM2 de
U2FA65, al mismo tiempo que interactúa con la subunidad pequeña U2AF35 y esta
última con el sitio de splicing 3’ para el reclutamiento del spliceosoma y permitir la
escisión del intrón.
Para probar la dependencia de la presencia de U2AF84 en el proceso de splicing en E.
histolytica, en distintos transcritos analizados el primero probamos el transcrito de
Actina. Se comprobó que la expresión de este no se vio afectado por el silenciamiento
de U2AF84 ya que al carecer de intrón no requiere de este factor auxiliar para su
procesamiento.
Algo similar se observó en el caso de Cdc2. Aun cuando este transcrito posee intrón, no
posee tracto de pirimidinas (Lohia et al., 1993) por lo que se espera que la definición
del 3´ss sea un poco diferente. De acuerdo con esto y como se puede notar en la figura
17, únicamente se presenta el mRNA que es de 361 bp, por lo que la disminución de
U2AF84 no tuvo efecto sobre su procesamiento, es decir que la escisión de este intrón se
efectúa sin la presencia de este factor auxiliar.
Respecto a la dependencia o independencia de la presencia de U2AF, estudios in vitro
usando extractos nucleares de células HeLa depletados del heterodímero de U2AF,
probados en dos grupos de transcritos, unos dependientes de AG (con pY débiles) y
otros independientes a AG (con pY fuertes), a los cuales se les añadió el heterodimero
U2AF35/65 o la subunidad de 65 kDa solamente, mostraron que en los transcritos
independientes de AG, tanto el heterodímero como de la subunidad de 65 kDa
restablecieron el splicing. En cambio en los transcritos dependientes de AG, la
subunidad de 65 kDa no logró restablecer la reacción de splicing. Los autores
concluyeron que la afinidad de U2AF65 es baja debido a la debilidad del tracto de
pirimidinas, por lo que la interacción de la subunidad de 35 kDa resulta necesaria para
una unión eficiente y el consecutivo reclutamiento del spliceosoma (Wu et al., 1999).
51
Con base en lo anterior en el transcrito RabX13 se observó una acumulación del pre-
mRNA desde la concentración de 1 µg/mL de G418. Este fenómeno se explica por el
tracto de pirimidinas largo y bien definido cercano al sitio de splicing 3´, por lo que
podemos clasificarlo como un transcrito independiente de AG, de modo que el
silenciamiento de U2AF84 afecta directamente su procesamiento.
Sam50 es otro transcrito cuyo procesamiento se vio afectado por la disminución de
U2AF84, aun cuando a las 3 condiciones de concentración de antibiótico existe la
acumulación de pre-mRNA, a concentraciones de 10 µg/mL de G418, se observa
claramente el incremento del transcrito no maduro en las transfectantes silenciadas.
Acorde al análisis de las secuencias intrónicas para este caso, el transcrito posee un
tracto de pirimidinas definido pero más alejado del sitio de splicing 3´. Sin embargo con
base a nuestros resultados este transcrito estaría entre los transcritos independientes a
AG.
Estudios en Schiziosacharomicces pombe y levadura mostraron que las mutaciones del
RRM3 de prp2 y Mud2, ortólogos de U2AF65 en humano no puede efectuar el proceso
de splicing en transcritos donde el tracto de pirimidinas está bien definido y se
encuentra entre el punto de ramificación y el sitio de splicing 3´ (Sridharan et al., 2007)
y que es requerido para el correcto splicing in vivo (Banerjee et al., 2004). Por su
comportamiento con los transcritos de RabX13 y Sam50 es probable que U2AF84 sea el
ortólogo en ameba de los factores auxiliares de humano, mosca de la fruta y levadura.
En el caso del intrón 1 del transcrito de ClC-B, tanto como en el del transcrito de
EhMybS6, estos poseen pY pequeños y cercanos al sitio de splicing 3’. La ausencia de
U2AF84 afecta el splicing de ambos transcritos de manera similar, al menos para una de
las concentraciones de G418 utilizadas, es decir, se puede apreciar la acumulación de
pre-mRNA, aunque de una manera discreta e intermedia entre los transcritos no
afectados y los transcritos independientes de AG. Aparentemente el intrón 1 de ClC-B y
MybS6 corresponden a transcritos cuyos tractos de pirimidinas poseen 5 a 6 residuos y
son mucho menos competitivos en splicing, de modo que para que se efectué el proceso
de splicing es necesaria la intervención de todas las secuencias intrónicas (v.g. 3´ss), así
52
como que dichas secuencias sean más cercanas al consenso y finalmente se requiere la
participación de la subunidad U2AF35 (Coolidge et al., 1997).
La configuración de las secuencias alrededor del 3’ss de estos intrones es similar a los
estudiados en transcritos msl-2 de Drosophila, en el que se encontró que la subunidad
de 35 kDa que interactúa con la secuencia AG del sitio de splicing ayuda a la
estabilización de la subunidad de 65 kDa cuando la distancia del tracto de pirimidinas y
el sitio de splicing 3´ es corto, es decir un pY débil (Valca, 1999).
En estudios no publicados por Valdés y colaboradores, se encontró que la disminución
de la expresión nuclear de U2AF84 resulta en la sobreexpresión de U2AF45, otro posible
ortólogo de U2AF65. Estos datos, en conjunto con la inmunoprecipitación de U2AF29 (el
posible ortólogo de U2AF35) en partículas de riobnucleoproteínas amebianas reclutadas
in vivo (Valdés et al., 2014) sugieren dos baterías de splicing en amebas: una para
procesar transcritos independientes de AG en la que U2AF84 realizara todas las
funciones en la definición del 3’ss, y otra que procese los transcritos dependientes de
AG, que involucra a SF1 (detectado en ambos ensayos realizados por Valdés y
colaboradores), U2AF29 y U2AF45 para realizar dicha función. El efecto mixto
provocado por el silenciamiento de U2AF84 sobre los transcritos de ClC-B y EhMybS6
pudiera reflejar una competencia entre la actividad de ambas maquinarias.
Aunque nuestros experimentos están limitados por el bajo número de replicados
biológicos, consideramos que las observaciones repetidas entre los distintos transcritos
refuerza nuestras conclusiones.
Otra observación encontrada fue la disminución del pre-mRNA en algunos de los
transcritos de estudio, tal es el caso de RabX13, Cdc2 y ClC-B. Una posible explicación
de este fenómeno es la probable perturbación en el proceso de la transcripción. En el
estudio realizado por Listerman et al., en el 2006, con ensayos de ChIP muestra la
relación entre la RNA polimerasa II y algunos factores de transcripción entre ellos
U2AF65, el cual se acumula en transcritos que poseen intrón al ser tratados con
captotecina. Este compuesto inhibe la elongación al bloquear a la topoisomerasa I,
encargada de relajar la estructura superenrollada del DNA. Adicionalmente con ensayos
53
de inmunoprecipitación se encontró que cuando la RNA pol II se encuentra fosforilada
en la Ser2 (que es cuando se encuentra en la fase de elongación activa)
coinmunoprecipita con U2AF65, y dicha inmunoprecipitación se pierde cuando los
complejos se incuban con RNAsa A, lo que se sugiere una interacción Pol II-U2AF65
mediada por RNA.
Lo anterior se relaciona coherentemente con el fenómeno observado para estos
transcritos y resulta de interés para estudios posteriores en el modelo de ameba.
54
CONCLUSIONES
La construcción del plásmido silenciador pGsi84 así como el establecimiento de cepas
amebianas transfectantes con los plásmidos psAP2Gunma y pGsi84 a distintas
concentraciones del antibiótico G418 nos permitieron obtener las herramientas
moleculares y biológicas necesarias para analizar el efecto del silenciamiento de
U2AF84 sobre distintos pre-mRNAs amebianos.
Obtuvimos una disminución del 69% en la expresión de U2AF84 en las transfectantes
silenciadas.
Como se esperaba el silenciamiento de U2AF84 no tuvo un efecto en el procesamiento
de los transcritos Actina y Cdc2 debido a que no poseen un tracto de pirimidinas
definido.
El silenciamiento de U2AF84 resulto en la acumulación de transcritos no maduros con
tractos de pirimidinas definidos RabX13 y Sam50 a las diferentes concentraciones de
antibiótico G418, lo que sugiere que en la selección del 3´ss de estos transcritos
participa U2AF84.
Los transcritos ClC-B y EhMybS6 poseen tractos de pirimidinas pequeños, para estos
casos el silenciamiento de U2AF84 resulto en una acumulación discreta de pre-mRNA a
altas concentraciones de antibiótico G418, esto sugiere la participación de otros factores
de splicing como U2AF35 en la selección del 3´ss.
A altas concentraciones de G418 se observo una disminución en la señal de los
transcritos Cdc2, ClC-B y RabX13, probablemente por perturbaciones en el proceso de
transcripción.
Finalmente los resultados obtenidos parecen indicar que U2AF84 posee la función
correspondiente a U2AF65 en humano y Drosophila, Mud2 y prp2 los ortólogos en
levadura y en S. pombe respectivamente, por lo que probablemente sea el ortólogo en E.
histolytica.
55
PERSPECTIVAS
Debido al limitado estudio de los factores de splicing involucrados procesamiento de m-
RNA amebiano, se plantean nuevos objetivos con el fin de dilucidar sobre la
participación de U2AF84 en el procesamiento de transcritos en E. histolytica, tales
como:
➢ Efectuar las repeticiones del ensayo de RT-PCR de los transcritos estudiados.
➢ Corroborar el silenciamiento de U2AF84 por ensayo de RT-qPCR.
➢ Realizar ensayos de eritrofagocitosis para dilucidar cambios en la función de
fagocitosis en trofozoítos de la cepa G3 de E. histolytica silenciados.
➢ Analizar el efecto de silenciamiento de U2AF84 en trofozoítos de E. histolytica
de la cepa HM1:IMSS, con la construcción de un plásmido silenciador a partir
de vector de silenciamiento pKT3M.
56
APÉNDICE
ELABORACIÓN DE MEDIO TYI-S-33
Para preparar 2 litros de medio TYI-S-33 incompleto se pesan las cantidades de los
siguientes reactivos de la tabla 8.
Reactivo Cantidad a pesar
Biosato 68.96 g
Glucosa 20.91 g
NaCl 4.59 g
KH2PO4 1.38 g
K2HPO4 2.3 g
L(+) Ácido ascórbico 0.57 g
L-cisteína 2.87 g
Citrato ferrico 0.057 g
Tabla 8. Reactivos para la preparación de medio TYI-S-33.
Una vez disueltos todos los reactivos en agua se ajusta el pH a 6.8 y se afora a 2 litros.
Se filtra y alícuota en volúmenes de 200 o 400 mL en botellas de cristal. Posteriormente
estas se esterilizan a 121 ºC 15 lb, durante 15 minutos. La autoclave se purga y retiran
con cuidado los frascos. Estos se dejan enfriar y se envuelven en papel aluminio para
finalmente congelarlos.
Para completar el medio se preparan alícuotas de suero completo, que consiste en
mezclar 400 mL de suero bovino adulto inactivado (Microlab No. catálogo 50140), 64
mL de vitaminas Diamond 40X (Sigma No. catálogo 58980C) y 11.2 mL de una mezcla
de antibióticos (estreptomicina y bencilpenicilina). Se hacen alícuotas de 40 mL en
tubos cónicos de 50 mL.
Por cada 200 mL de medio incompleto, se adicionan 40 mL de suero completo.
57
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE LOS PLASMIDOS SILENCIADORES
SECUENCIADOS
Figura 29. Análisis bioinformático para comparar los datos de la secuenciación de los plásmidos con los
nucleótidos correspondientes a los 400 pares de bases de U2AF84. El alineamiento se realizó con el programa
SDSC Workbench.
Lo que el resultado muestra es en azul los residuos conservados y comparando las
clonas que se obtuvieron y secuenciaron contra el gen de U2AF84 corresponden a los
primeros 400 nucleótidos.
58
(-)RT-PCR DE LOS TRANSCRITOS DE ESTUDIO
A continuación se presentan las figuras correspondientes a los controles negativos de las
reacciones de PCR para cada transcrito, para corroborar que la amplificación de
transcritos proviniera de RNA y no de DNA genómico.
Figura 30. Reacción de (-) RT-PCR del transcrito de Actina, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418.
Figura 31. Reacción de (-) RT-PCR del transcrito de Cdc2, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y 10
µg/mL de G418.
59
Figura 32. Reacción de (-) RT-PCR del transcrito de RabX13, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418.
Figura 33. Reacción de (-) RT-PCR del transcrito de ClC-B, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y 10
µg/mL de G418.
60
Figura 34. Reacción de (-) RT-PCR del transcrito de MybS6, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418.
Figura 35. Reacción de (-) RT-PCR del transcrito de MybS6, de las transfectantes a concentraciones de 1, 5 y
10 µg/mL de G418.
61
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