기기분석 액체크로마토그래피(hplc)...

• 카이랄 센터를 가지는 혼합물의 분리에 활용됨• 카이랄 정지상으로 충진된 칼럼을 활용함

ex) 정지상인 R만 충진된 경우 혼합물 R/S 와 결합하면 각각 R-R과 R-S 가 되어 다른 화합물처럼 인식되어 분리가 가능해짐

카이랄 크로마토그래피기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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이온교환 크로마토그래피• 이온교환 수지

기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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크기배제크로마토그래피

• 입자크기 : 4㎛, 5㎛, 10㎛, 37㎛, 55㎛, 75㎛• 형태 : spherical, irregular• pore 크기 : 50Å ~ 300Å


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• pore 크기 : 50Å ~ 300Å

컬럼보관시 주의할 사항

column 보관도 충진제와 반응하지 않는 용매로 채워 입구와출구를 막아 상온 또는 냉장(4℃정도)에서 보관한다.

① polar bonded phase column : hexane 등으로 채워 보관


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① polar bonded phase column : hexane 등으로 채워 보관

② Non-polar bonded phase column-> 세척 후 60~70 % 유기용매(CH3CN, MeOH)로 채워 보관

장기 보관 시는 100 % CH3CN, MeOH로 채워 보관

컬럼보관시 주의할 사항③ ion exchange column

무기 양이온 column 장기간 - 10% CH3CN/90% H2O단기간 - Mobile phase

무기 음이온 column 장기간(72시간 이상) - 10% CH3CN in H2O단기간 - H2O나 eluent

유기 양이온 column 장기간 - 50% ethanol/50% H2O


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유기 양이온 column 장기간 - 50% ethanol/50% H2O 0.2% sodium azide (미생물 오염 방지)단기간 - 물로 채워 4℃ 보관

유기 음이온 column 물로 채워 4℃ 보관, 절대로 buffer는 채우지말 것

④ size exclusion column지용성 GPC column - shipping solvent로 채워 보관수용성 GPC column - 0.05 sodium azide가 포함된 H2O

컬럼의 세척 및 재생법

① Normal phase column100% MeOH, 100% CH2Cl2 column 부피의 10배 정도 흘려주고100% heptane이나 isooctane으로 column 부피의 20배 정도 흘려준다.(이때 용매에 H2O가 500ppm 이상 함유되지 않아야 한다.)


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② Reverse phase column100% H2O → MeOH → Chloroform → MeOH → H2O순서로column부피의 10배 정도 흘려준다.

Mild cleaning : 이동상으로 H2O를 사용하여 흘려주면서 매 5분마다DMSO/H2O(50:50) 200㎕를 두 번 injection 한다.

컬럼의 세척 및 재생법③ ion exchange column

무기 음이온 column 100mM Borate/Gluconate buffer → 유속 1㎖/min 이하로 흘림

무기 양이온 column 1N HNO3(0.5~1㎖/min) overnight 시킴유기 음이온 column H2O → 0.1M NaOH → H2O → 30% 초산

→ H2O →0.1M NaOH → H2O


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→ H2O →0.1M NaOH → H2O column 부피의 4배 정도 흘림

유기 양이온 column H2O를 흘리면서 0.1N NaOH(1~2mL)를 주입H2O를 흘리면서 20~30% acetic acid solution(1~2mL)를 주입

④ size exclusion column - 이동상으로 흘려 세척함

이동상


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이동상


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이동상


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검출기1. 역할 : 컬럼에서 분리된 시료가 일정한 간격으로 검출기를 통

과할 때 시료의 존재 및 양을 일정한 규칙에 의해 인식하여전기적인 신호로 바꾸어 준다.

2. 종류 : * 가변파장 검출기(Variable Wavelength Detector) * 다이오드 어레이 검출기(Diode-Array Detector)


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* 다이오드 어레이 검출기(Diode-Array Detector)* 형광 검출기(Fluorescence)* 굴절률 검출기(Refractive Detector)* 전기화학 검출기(electrochemical Detector)* 전도도 검출기(Conductivity Detector)

검출기의 특징1. sensitivity (signal to noise ratio가 높은 것)

일반적 혹은 선택적 감응, detection limit가 낮은 것2. linearity (선형적 감응)3. flow rate, temperature, pressure 등 조건의 변화에 안정할 것

(gradient가 가능할 것)


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(gradient가 가능할 것)4. low dead volume5. 시료를 변화 시키지 말아야 한다. (nondestructive)6. 싸고 사용이 편리 (cheap, reliable, easy)

검출기의 종류 및 감도 특성


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UV-Vis 검출기• 원리

- 광원에서 특정 파장의 빛이 광로를 거쳐 검출기 셀 내의 시료에투입되면 특정 파장의 빛이 시료에 흡수

- 검출기에 얼마 만큼 빛이 흡수 되었는가를 전기적인 신호로 나타내고 이 신호의 크기를 이용하여 시료의 정량 분석이 이루어짐

• 사용 범위


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• 사용 범위- 많은 용질들이 자외선을 흡수 하고, 검출기의 감도가 상당히 높기

때문에 HPLC 검출기로 가장 많이 사용되고 있음- 사용이 간편하고, baseline 안정화 시간이 짧고 파장 선택 조절이

가능- 흡수가 없는 용매를 사용한 기울기 용리(gradient elution)에 적합

UV-Vis 검출기


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UV-Vis 검출기


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UV-Vis 검출기종류 : Fixed type, variable type, PDA (photo diode array) type

1. 고정형 : 광원에 따라 정해진 몇 개의 파장만을 사용한다2. 가변형 : 190~600 nm 사이의 파장 중에서 원하는 파장을 지정

하여 사용.


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하여 사용.Deuterium type - 190~380 nmtungsten type - 190~600 nm

3. PDA (photo diode array) type : 190~800nm의 전파장을 동시에scan 할 수 있다.

PDA의 장점(DAD)

1. 신속한 전파장 스펙트럼 확인 : 보다 많은 분석 정보 제공2. 다파장 검출 : 감도와 선택성을 증가시키기 위한 기술로 사용3. 탁월한 파장 재현성 : 스펙트럼 비교를 통한 신뢰성 확보4. 기기의 신뢰성 : 움직임 부분의 최소화로 인한 높은 신뢰성 제공

과 기기 사용 효율의 최대화


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과 기기 사용 효율의 최대화5. 빠른 검교정 : 모든 파장에 대하여 동시에 가능

PDA의 장점(DAD)


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PDA의 장점(DAD)


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형광(Fluorescence) 검출기• 원리

- 시료에서 발광하는 형광의 세기는 시료의 양(농도)에 비례하는 원리- 시료가 형광을 방출 할 때 혹은 시료를 형광을 낼 수 있는 화학기를

원하는 분석 물질에 붙여서 형광 유도체로 만들었을 때 사용- 감도가 아주 좋지만, 오직 형광을 내는 제한된 범위의 분석 물질에

대해 서만 사용 가능


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대해 서만 사용 가능- 유기물의 약 10%는 자체 형광을 냄 (유도체화 하지 않고도)

• 사용 범위- UV 보다 100 ~ 1000 배 정도 선택성이 높음- 생화학, 의학, 공중보건, 약리학, 석유 화학 분야- Polycylic armatic, Aflatoxin류, Amino acid류

형광(Fluorescence) 검출기기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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형광(Fluorescence) 검출기기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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굴절률 (Refractive index)검출기• 원리

- Reference cell과 sample cell에 포함된 시료와 용매의 굴절률 차이가 존재하게 되고, beam이 광전관 중심으로부터 deflect 되고검출기의 신호가 변함

- 자외선 검출기 보다 감도 약 1000배 낮고, 검출기가 이동상의 조성에도 영향을 받기 때문에 기울기 용리 에는 사용되지 않음

- 압력과 온도 변화에 민감하여 흐름 속도가 일정해야 하며, 온도


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성에도 영향을 받기 때문에 기울기 용리 에는 사용되지 않음- 압력과 온도 변화에 민감하여 흐름 속도가 일정해야 하며, 온도

변화도 0.01 ℃이내로 일정해야 함

• 사용 범위- 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용할 수 있으나,

감도가 낮기 때문에 미량 분석에는 사용되지 않고, 자외선 흡수가 없는 거의 없는 탄수화물과 지방족 중합체와 같은 물질에 일반적으로 적용

굴절률 (Refractive index)검출기기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

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Electrochemical detector• 원리

- 분석물질을 전기를 이용하여 강제로 산화/환원하여 검출- 분석 물질이 쉽게 산화 되거나 환원되어야 하므로 약간 선택적- 예를 들어 페놀, 방향족 아민 과산화물, 머캅탄은 산화에 의해 검출되고, 케톤, 알데히드, 방향족 할로겐은 환원에 의해 검출(환원반응에는 많이 이용하지 않는데 그 이유는 용존 산소 제거의 어


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반응에는 많이 이용하지 않는데 그 이유는 용존 산소 제거의 어려움이 있음)

• 특징- 검출될 수 있는 분석 물질에 대해서는 아주 감도가 높고, 검출 한계가 나노 암페어 까지 측정가능

- 전해질이 녹아 있는 수용액이나 다른 극성 용매가 필요하며, 이것은산소가 전혀 없어야 함

- 이 검출기는 흐름 속도와 온도 변화에 민감함

- 당류 (락토오스, 프룩토오스, 글루코오스) 들을 NaOH 용액으로 컬럼을 통해

분리 하여 구리 전극으로 산화 시켜 전류를 측정함으로 양을 결정할 수 있음

- 작업 전극은 일정전위기에 의해 Ag/AgCl에 대해 +0.55 V로 유지됨

당은 구리 표면에서 산화되며 물의 환원은 (H2O+e- →1/2H2 + OH-) 보조전극

에서 일어남 (버드 드라이 맥주의 분석결과)


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Conductivity detector기기분석기기분석__액체액체크로마토그래피크로마토그래피(HPLC)(HPLC)

28http://home.dongguk.edu/user/milab

사용범위 : 양이온, 음이온 등 이온성 화합물 분석에 이용전도도 값은 온도에 따라 변하므로 온도가 일정해야 Baseline 안정화에 쉽게 이를 수 있음

기기분석 액체크로마토그래피(hplc)...

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