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ndice:Introduccin a la cromatografa Conceptos y definiciones HPLC (Cromatografa lquida de Alta Resolucin) Estudio del cromatograma Componentes del HPLC Fase mvil Sistema de bombeo Sistema de inyeccin Columna Efecto del tamao de relleno de la columna Detectores Detector de ndice de refraccin Detector de absorbancia de radiacin UV Detectores utilizados con menor frecuencia Clasificacin de Cromatografas Cromatografa de reparto (o particin) Cromatografa de intercambio inico Cromatografa de exclusin molecular Cromatografa de adsorcin Glosario Bibliografa Pgina 3 Pgina 3 Pgina 4 Pgina 6 Pgina 8 Pgina 9 Pgina 10 Pgina 12 Pgina 12 Pgina 13 Pgina 13 Pgina 13 Pgina 14 Pgina 15 Pgina 15 Pgina 16 Pgina 17 Pgina 18 Pgina 18 Pgina 20 Pgina 21

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Introduccin a la cromatografaExisten diferentes mtodos para separar las diferentes sustancias que componen una muestra. Uno de los ms efectivos y que mejores resultados tiene es la cromatografa. El nombre de Cromatografa significa curva de colores, ya que el mtodo inicial se desarroll para separar los diferentes pigmentos que componen el color de los vegetales. Fue inventado por el botnico Mikhail Tswett en el ao 1906 y consista en una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio pulverizado, a la cual se le colocaba una muestra del extracto de los pigmentos y luego se haca circular ter de petrleo constantemente. Los pigmentos eran adsorbidos por el carbonato de calcio, pero a su vez eran arrastrados por el ter de petrleo; por lo tanto, los que tenan mayor afinidad al carbonato de calcio tardaran ms tiempo en salir por el extremo de la columna, mientras que los menos afines saldran ms rpido. A medida que salan los pigmentos de la columna se podan notar diferentes concentraciones, por lo que se poda realizar un grfico de concentraciones en funcin al tiempo que demoraba cada pigmento en salir de la columna desde que fue colocada la muestra. Posterior a la invencin de Mikhail Tswett, se continu estudiando este mtodo y se descubri que no solamente sirve para separar pigmentos de una planta, sino adems para mezclas mucho ms complejas, ya sea: qu tipo y qu cantidad de cada hidrocarburo contiene un combustible, o para estudiar la pureza de una droga, por ejemplo. A parte del mtodo original, se desarrollaron cromatografas de gases y cromatografa sobre papel, entre otras. La cromatografa es un mtodo de separacin por medio del cul puedo separar los diferentes compuestos que se encuentran en una mezcla compleja.

Conceptos y definicionesLa muestra se coloca sobre una fase mvil (puede ser lquida o gaseosa) y se desplaza junto a sta a travs de una fase estacionaria, que se encuentra fijada sobre un soporte slido o dentro de una columna. El principio de separacin del mtodo se basa en la diferencia de afinidades entre los diferentes compuestos respecto a la fase mvil y a la fase estacionaria, y segn qu tipo de compuestos se requieran separar, se elegirn diferentes fases mviles y estacionarias.

Por ejemplo, cuando se quiere separar dos sustancias con diferentes polaridades, se puede elegir un solvente polar y una fase estacionaria no polar o al revs. Si imaginamos una cromatografa con fase estacionaria polar y una fase mvil no polar dentro de una columna de vidrio para separar dos colorantes, lo primero que observaremos es la mezcla de ambos al principio de la columna, pero al cabo de un


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tiempo (con el agregado constante de fase mvil) vamos a notar en la columna una banda de un color arriba (gris claro) y otra banda de otro color (gris oscuro) ms abajo. La banda ms oscura descendi en la columna en conjunto con la fase mvil, que es no polar. Por otra parte, la banda ms clara qued ms retenida en la columna. Podemos decir entonces que el colorante ms claro es ms polar que el oscuro, y es por eso que qued ms retenido.

HPLC (Cromatografa lquida de Alta Resolucin)As como existen diferentes tipos de cromatografa segn lo que se desee separar, tambin existen diferentes formas de realizar la cromatografa, ya sea sobre un papel, una capa delgada, una columna, con altas presiones, con variaciones de temperatura, en fase gaseosa, etc. Uno de los mtodos ms utilizados hoy en da por su alta reproducibilidad, alta resolucin y precisin, sensibilidad y versatilidad, es la CLAR (en castellano, significa Cromatografa Lquida de Alta Resolucin) o HPLC (en ingles, High Performance Liquid Chromatography). Esta es utilizada en gran cantidad de industrias alimenticias, farmacuticas, qumicas, bioqumicas y petroqumicas entre otras, y sirve para analizar tanto a la materia prima con la que se trabaja como a los productos finales. La Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (de ahora en adelante HPLC), consiste en una cromatografa cuya fase mvil es lquida y la fase estacionaria esta conformada por partculas slidas muy finamente pulverizadas, la cual es atravesada por la muestra y la fase mvil por la ayuda de las altas presiones proporcionadas por una bomba (pueden alcanzar 400 bar o atmsferas de presin); el principio de separacin es la distribucin de las diferentes sustancias entre la fase mvil y la fase estacionaria. Originalmente, las cromatografas lquidas consistan en columnas de hasta 5 metros de largo y 5 centmetros de ancho, el tamao de las partculas de relleno ascenda a dimetros de hasta 200 m y las corridas duraban entre 2 y 12 horas. Estas condiciones proporcionaban muchos problemas ya que al quedar retenidas las muestras tanto tiempo en una fase lquida, se solapaban las bandas de las diferentes sustancias a separar por el simple hecho de la difusin en un lquido.


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Con los aos y mucho estudio los cientficos se fueron dando cuenta que al reducir el tamao de partculas de relleno de la columna, se obtena un mejor resultado de separacin, pero la corrida demoraba tanto tiempo ms que el efecto de la difusin aumentaba el solapamiento de bandas. A partir de 1960 aparece el HPLC, que constaba con columnas cuyas partculas de relleno tenan un dimetro de hasta 10 m, que aumentaba mucho la resolucin de las corridas, y empleaba altas presiones para aumentar la velocidad de corrida (entre 2 y 20 minutos). En esta nueva forma de realizar cromatografas no solo se optimiz el tiempo de la corrida y la precisin de los resultados, sino que adems se optimiz el tiempo de preparacin, ya que las columnas de la cromatografa clsica requeran ser rellenadas para cada aplicacin, mientras que una columna de HPLC puede ser reutilizada miles de veces.

Por otra parte, con un detector adecuado a la salida de la columna, se puede tener un estudio cuantitativo preciso de las muestras en tiempo real, y este entrega un cromatograma: En el cromatograma se pueden observar la intensidad de la seal del detector (eje de ordenadas) y el tiempo transcurrido desde que la muestra es inyectada. El pico pequeo observado a la izquierda es el tiempo de retencin de un compuesto no retenido, o lo que se llama el tiempo muerto(tm). Es el tiempo que tarda en salir la fase mvil sola desde que comienza la cromatografa. El segundo pico corresponde a un


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compuesto que es separado en la cromatografa, y el tiempo que tarda en salir desde que la muestra es inyectada es lo que se llama el tiempo de retencin (tr). Para lo que concierne a los clculos, no se utiliza el tiempo de retencin de los compuestos, sino que el tiempo de retencin relativo (tr); este no es otra cosa que la diferencia entre el tiempo muerto y el tiempo de retencin: t r ' = t r

tm

Estudio del cromatogramaCuando obtenemos los resultados de la cromatografa, no siempre son de total utilidad, y esto es debido a que muchas veces no logramos separar correctamente todos los componentes de la muestra. El factor de retencin (k) es un parmetro que permite saber cunto es retenido el componente en relacin al tiempo muerto, y se calcula como:

k' =

tr tm tr ' = tm tm

Para calcular la retencin relativa entre 2 compuestos (), lo que se hace es dividir la retencin de uno por la del otro; en pocas palabras:

=

k B ' t rB t m t rB ' = = k A ' t rA t m t rA '

Los platos tericos pertenecen a un modelo propuesto por Martin y Synge en 1941, y son una medida terica utilizada para saber qu tan bien pueden separarse los compuestos de una muestra particular en la columna (en otras palabras, como es la eficiencia de la columna).

Se denomina plato terico a cada etapa de equilibrio entre la fase mvil y estacionaria por la que pasa el compuesto en estudio. Cuantos ms puntos de equilibrio logre el compuesto (mayor cantidad de platos tericos), mejor va a repartirse entre ambas fases, logrando una mayor eficacia.Escuela Tcnica ORT - Depto. Qumica. Instituto de Tecnologa ORT - Biotecnologa

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Otro parmetro importante (parte de la teora de platos) es la altura de los platos tericos, que representa a la distancia entre los puntos de equilibrio. Cuanto menor es la altura de los platos tericos (menor es la distancia entre los puntos de equilibrio), mayor ser la eficacia de la columna. Tanto la cantidad de platos tericos como la altura de estos se obtienen a partir del cromatograma y de la longitud de la columna, y se pueden calcular utilizando las ecuaciones que figuran en el cuadro 2.

En 1956, Van Deemter propuso otra forma de calcular la altura de los platos, basndose en la teora cintica qumica, planteando una ecuacin dependiente de la velocidad del solvente. La velocidad promedio del solvente se calcula como resulta:

u= L

tm

, y con esta, la ecuacin de Van Deemter

H = A+

B + u *C u

A:

Caminos mltiples de flujo: A medida que pasa el

solvente a travs de la columna, este va tomando diferentes caminos, por lo que no todo lo que entra a la vez en la columna sale al mismo tiempo. Es independiente de la velocidad del solvente, solo depende del relleno de la columna.

B: Difusin longitudinal: Si el solvente atraviesa la columna muy lentamente, aparece el factor de difusin; lo que sucede es que los compuestos difunden tanto hacia delante como hacia atrs, ensanchando las bandas y dificultando la separacin.

C: Transferencia de masa entre las fases: Al trasladarse la muestra dentro de la columna, esta logra equilibrios entre la fase estacionaria y la fase mvil. Si el flujo del solvente que conforma la fase mvil es muy alto, lleva consigo a la muestra, evitando que se formen estos


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pequeos equilibrios, disminuyendo as la interaccin de la muestra con la columna y tambin la eficacia.

La ecuacin de Van Deemter plantea entonces una relacin entre el alto de los platos tericos y la velocidad del solvente. El grfico de la funcin (alto de los platos tericos en el eje vertical vs. velocidad en el eje horizontal) tiene un punto marcado en el cul la altura de los platos tericos es mnima. Esta sera la velocidad en la cul se obtendra mayor eficiencia.

La resolucin es una medida cuantitativa de determinacin del grado de separacin entre dos picos en una corrida cromatogrfica.

Rs =

2.(t rB t rA ) w A + wB

=

N 1 kB ' . . 4 1+ kB '

Grficamente se puede ver en el dibujo 1 como a medida que mejora la resolucin se obtiene una mejor separacin. Es importante que los picos no queden superpuestos y que estn bien definidos. Una resolucin de 1,5 logra separar a los picos hasta la lnea de base del grfico, mientras que una resolucin de 1 logra separar hasta un 90% de los picos (de todas formas, esa resolucin es aceptada para la mayora de los casos en lo que respecta a clculos de area bajo el pico).

La resolucin de una cromatografa debe ser mayor o igual a uno, pero no debe ser exageradamente grande, ya que al retener ms tiempo a los compuestos en la columna los picos se ensanchan, logrando as un peor resultado.

Componentes del HPLCEl HPLC consiste en una cromatografa cuyas columnas tienen un relleno de entre 2 m y 10 m. Es por eso que, para que el tiempo que demore la muestra en atravesar la columna sea razonable, es necesario aplicar altas presiones, que pueden variar entre 70 y 400 atmsferas. Es por eso que para realizar una cromatografa de este tipo


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es necesario un equipamiento complejo.

Un equipo para realizar HPLC tiene 8 componentes bsicos, como se encuentran diagramados en el ejemplo del dibujo 3, y son los siguientes: - Reservorio de fase mvil. - Sistema de suministro de solvente (bomba). - Inyector de muestra. - Columna. - Detector. - Reservorio de descartes. - Tuberas de conexin. - Mquina integradora.

Fase mvilLos reservorios de la fase mvil consisten en recipientes de vidrio o acero inoxidable de entre 200ml y 1000ml. A estos se conectan tubuladuras con un filtro adosado al extremo (de poros de entre 0,22 m a 0,45 m). Esto se debe a que, por ser el HPLC un sistema muy complejo, no se puede permitir el paso de impurezas en el solvente. Por el mismo motivo deben utilizarse solventes de calidad HPLC Es importante tambin que el solvente se encuentre desgasificado, ya que las burbujas de aire en el solvente pueden hacer ruido en el detector, otorgando informacin errnea en los resultados. Por eso, en muchos equipos hay agregados un desgasificador.

Los solventes utilizados como fase mvil del HPLC, al igual que para todo mtodo de cromatografa, tiene que ser acorde al tipo de cromatografa a realizar, pero adems debe cumplir determinadas condiciones para poder ser utilizado:

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Disolucin de la muestra: No nos servira utilizar como fase mvil un solvente que no disuelva a la muestra. En caso de no disolverla, esta no podra tener una relacin de interacciones entre la fase estacionaria y la fase mvil.

-

Alta pureza: No se puede utilizar un solvente comn en el HPLC, ya que al ser las columnas tan pequeas y con partculas de dimetros diminutos, pueden tapar el camino de salida, de forma que se arruina la columna. Por otra parte, al utilizarse detectores muy sensibles a la salida de la columna, las impurezas del solvente pueden proporcionar informacin falsa. Para evitar estas complicaciones se utilizan los solventes de calidad HPLC, con purezas del 99,99%.

-

Baja viscosidad: Esto es muy importante. Es ms complicado empujar a un solvente muy viscoso que a un solvente poco viscoso, por lo que se necesita ms presin.


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-

Inercia qumica: No nos sirve ningn solvente que reaccione con la muestra a trabajar o con la fase estacionaria de la columna, ya que los resultados que obtendramos no tendran relacin con el anlisis que estamos realizando.

Durante una cromatografa, ingresa constantemente fase mvil a la columna, y la composicin de esta determina de qu forma se van a separar los componentes de la muestra. La fase mvil puede ser suministrada de modo isocrtico, o sea, con composicin constante a lo largo del tiempo, o en gradiente, variando la composicin en funcin del tiempo. La elucin en gradiente por lo general mejora la eficiencia de la separacin, ya que consiste en variar la composicin de la fase mvil entre dos o tres solventes de polaridades (y otras propiedades, como la fuerza inica, pH, constante dielctrica entre otras) muy diferentes, haciendo que se acelere o retarde la salida de determinados picos. Para realizar una elucin en gradiente es necesario programar la variacin de solventes, ya sea continua o en etapas.

Sistema de bombeoEl sistema de bombeo es el encargado de empujar los solventes. Estos sistemas tienen que cumplir determinadas condiciones para poder ser utilizados en equipos: Poder generar presiones de hasta 400 atmsferas. Tener una salida libre de pulsos. Poder manejar caudales de entre 0,1ml/min y 10ml/min. Control de flujo con alta reproducibilidad (variacin mxima del 0,5%) Estar construido de elementos resistentes a la corrosin, ya sea tefln o acero inoxidable.

En los equipos de HPLC existen tres tipos de bombas, cada una con sus respectivos beneficios y complicaciones: Bomba reciprocante o a pistn Bomba tipo jeringa o de desplazamiento Bomba neumtica o de presin constante.


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La bomba reciprocante (que se utiliza en el 90% de los equipos) consiste en una cmara pequea en la que el solvente es enviado hacia adelante con el movimiento generado por un pistn. Las dos vlvulas en los extremos de la bomba controlan el flujo de entrada y de salida.

Cuando el pistn retrocede, trae solvente hacia la bomba, y se cierra la vlvula del extremo de entrada. Luego, cuando el pistn avanza, el solvente es expulsado en direccin a la columna. Este tipo de bomba genera pulsos por el movimiento del pistn, y es por eso que tiene a la salida un atenuador de pulsos. Por otra parte, el movimiento de pistn y el manejo de pequeos caudales permite realizar eluciones en gradiente y lograr altas presiones, sin importar la viscosidad del solvente o el relleno de la columna.

La bomba tipo jeringa o de desplazamiento consiste en una cmara de un volumen limitado, y un embolo empujado por un tornillo. Si bien puede impulsar al solvente totalmente libre de pulsos sin importar la viscosidad de este, solamente trabaja con un volumen finito y de forma isocrtica. Si se desea intercambiar solventes o realizar una elucin en gradiente, es necesario el uso de al menos dos bombas.

La bomba neumtica trabaja con presin de gases. Como se ve en el dibujo, la parte superior tiene una entrada de gas (arriba) a altas presiones, impulsando al pistn, dejando salir gas (abajo), ayudando al movimiento. Por otro lado, en la parte inferior ingresa el solvente, atravesando una vlvula que no permite retorno, y es expulsada a una alta presin por el movimiento del pistn. Si bien la bomba neumtica es econmica y trabaja sin producir pulsos, puede manejar solamente pequeos caudales, no permite realizar eluciones en gradiente y su presin de trabajo es menor a 140 atmsferas.


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Sistema de inyeccinLa inyeccin de la muestra es un punto crtico en la cromatografa. Es comn que no se inyecte siempre la misma cantidad de muestra, por lo que la reproducibilidad del mtodo se ve afectada. Tambin puede suceder que al sobrecargar a la columna de muestra, se vean ensanchamientos de bandas. Es por eso que se realizan inyecciones de cantidades menores a los 500l. El mtodo ms utilizado para inyeccin de muestras en el HPLC es el mtodo del lazo de muestreo, que consiste en caminos intercambiables del flujo de solvente. Este sistema permite el ingreso de muestra a muy altas

presiones (evitando la cada de presin en la columna) y cuentan con una muy alta precisin.

La muestra a utilizarse debe ser lquida o estar en solucin para poder ser inyectada al instrumento, y si se encuentra en estado slido, debe disolverse previamente en un solvente compatible con las fases mvil y estacionaria. La preparacin de la muestra es un punto crtico en lo que determina el tiempo de un anlisis cromatogrfico, que puede comprender entre 5 min y 2 horas. Las cantidades de muestra a inyectarse suelen variar entre 1l y 100l, segn la sensibilidad del detector que se utilice.

ColumnaA diferencia de la cromatografa convencional, en la cual se prepara un relleno nuevo para cada anlisis y se utilizan columnas de vidrio de hasta algunos metros de longitud, el HPLC utiliza columnas de acero inoxidable pre-armadas de entre 10cm y 30cm, cada una reutilizable cientos o miles de veces. El dimetro interior de la columna vara entre 4mm y 10mm y el de las partculas de relleno entre 3m y 10m.

La eficiencia de la columna es una forma de definir el que tan bien puede separar la columna a las diferentes sustancias que se encuentran en una muestra. Los factores ms determinantes de la eficiencia de una columna son el efecto del tamao del relleno de la columna, el tamao de la muestra y el ensanchamiento extra columna.


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Efecto del tamao de relleno de la columnaComo fue dicho antes, la separacin por medio de la cromatografa depende de una distribucin de la muestra entre la fase mvil y la fase estacionaria. La cantidad de masa de soluto que se puede transferir a la fase estacionaria es proporcional al cuadrado del dimetro de la partcula de relleno, por lo tanto, al disminuir el tamao de estas, la eficiencia de la columna aumenta radicalmente. En condiciones ptimas, nmero de platos tericos se puede calcular como:

N = 3500 * L

dp

,

donde L es la longitud de la columna (en cm) y dp es el dimetro de las partculas de relleno (en m). Al ser ms pequeas permiten un flujo ms uniforme, reduciendo el trmino A de la ecuacin de Van Deemter. Las columnas comerciales ms columnas tienen entre 40000 y 60000 platos tericos por metro de longitud.

En algunos casos se usan precolumnas (o columnas de guardia), pequeas columnas de relleno similar al de la columna, que se colocan previo a la columna. Estas precolumnas son columnas de sacrificio, es decir, columnas de descarte que evitan la entrada de contaminantes o impurezas del solvente a la columna, prolongando as su vida til.

DetectoresLos detectores tienen la funcin de monitorear en tiempo real la salida de solutos de la columna cromatogrfica, generando una seal elctrica proporcional al nivel de alguna propiedad de la fase mvil o los solutos que eluyen. Se dividen en dos grandes categoras:

-

Detectores de propiedades masivas: detectan propiedades como el ndice de refraccin, constante dielctrica o densidad de la fase mvil (vara segn la cantidad de soluto).

-

Detectores de propiedades del soluto: detecta concentraciones a partir de la absorbancia, fluorescencia o corriente de difusin. Este tipo de detectores son mil o ms veces ms sensibles que el primer tipo.

Detector de ndice de refraccinLa fase mvil pura atraviesa una cmara del detector, mientras que el saliente de la columna atraviesa otra.


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Estos dos compartimientos estn separados por un plato de vidrio dispuesto de forma tal que si no hay diferencia de ndice de refraccin entre ambas soluciones, el haz de luz no sea desviado. El desplazamiento del haz de luz respecto a una superficie fotosensible genera una variacin en la seal de salida; con esta informacin se realiza el cromatograma. En la tabla 2 se encuentran los ndices de refraccin de diferentes solventes utilizados como fase mvil en HPLC. Este tipo de detector es universal, es decir, responde a casi todos los solutos, pero no es tan sensible como otros detectores, y necesitan tener temperatura constante, ya que el ndice de refraccin vara segn la temperatura. Una gran desventaja que tiene este tipo de detector es que no se puede utilizar para una elucin en gradiente; los solventes tienen todos diferentes ndices de refraccin, y al variar los solventes, no se puede ajustar de forma exacta la referencia mientras varia la composicin de la fase mvil.

Detector de absorbancia de radiacin UVEs utilizado en ms del 70% de los equipos de HPLC. La seal que emiten es proporcional a la concentracin de soluto que atraviesa la celda y sirve para detectar compuestos que contengan uniones mltiples, ya sea alquenos, aromticos u otros. Mide la absorbancia de los compuestos que eluyen de la columna, pero como trabaja a bajas presiones, tiene un reductor de presin previo a la entrada. El grfico que se obtiene del integrador consiste en el logaritmo de la relacin de las seales (la seal a tiempo real sobre la seal de la fase mvil pura) en funcin del tiempo.

Se puede seleccionar las longitudes de onda del detector para la cromatografa y tambin existe la posibilidad de variar la longitud de onda de trabajo del detector a lo largo de la corrida, dependiendo del equipo con el que se cuente.

Estos detectores son muy tiles para anlisis cuantitativos repetitivos, o sea, los anlisis en los cuales se conoce previamente los componentes que conforman la muestra pero no sus cantidades.Escuela Tcnica ORT - Depto. Qumica. Instituto de Tecnologa ORT - Biotecnologa

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A continuacin una tabla de las diferentes longitudes de onda a la que absorben los solventes de trabajo del HPLC.

Detectores utilizados con menor frecuenciaDetectores de conductividad: Se utilizan como detectores universales de presencia de iones; la conductimetra no me permite saber qu iones hay en solucin, sino qu tanta corriente elctrica conducen. Como parte de los solventes utilizados son buffers (o soluciones reguladoras), no es posible utilizar este tipo de detectores para eluciones en gradiente.

Detectores electroqumicos: Miden la variacin de corriente elctrica asociada a la reduccin u oxidacin de los solutos que salen de la columna. Son altamente sensibles y son selectivos, pero no sirven para eluciones en gradiente.

Clasificacin de CromatografasLas cromatografas se clasifican, segn la fase estacionaria con la que se va a trabajar, en los siguientes grupos: - Cromatografa de reparto: Fase normal. Fase reversa.

-Cromatografa de intercambio inico -Cromatografa de exclusin molecular (o permeacin por geles) - Cromatografa de adsorcin (fenmeno superficial)


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Cromatografa de reparto (o particin)Es el tipo de cromatografa ms utilizado, y consiste en separar los componentes de una muestra en funcin a sus polaridades, y se subdividen en dos grupos, la cromatografa de fase normal y la cromatografa de fase reversa (o inversa).

La cromatografa de fase normal fue la primera cromatografa de reparto (por eso se la llama fase normal), y cuenta con una fase estacionaria muy polar (grupos silanos, Si-OH) y una fase mvil de polaridades moderadas a nulas (compuestos orgnicos, como por ejemplo ter de petrleo).

La cromatografa de fase reversa (o inversa) es opuesta a la cromatografa de fase normal y actualmente el tipo de cromatografa lquida ms utilizado. La fase estacionaria es no polar, y como fase mvil son utilizados solventes de polaridades altas (como por ejemplo agua) a moderadas (compuestos orgnicos polares).

En la siguiente tabla se ven algunas propiedades de los diferentes solventes utilizados en cromatografas. Entre ellas se encuentran la polaridad y la viscosidad.


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Por otra parte, tambin se puede separar a las cromatografas de reparto por ser del tipo lquido lquido o del tipo fase unida. La cromatografa del primer tipo est conformada por una fase estacionaria lquida adsorbida fsicamente sobre un soporte slido pulverizado en una columna, mientras que en el segundo caso la fase estacionaria esta adsorbida qumicamente a las partculas de soporte. El tipo de cromatografa de reparto de fase unida es el ms utilizado, ya que en el tipo lquido lquido, a medida que fluye la fase mvil a travs de la columna, se va arrastrando parte de la fase estacionaria, haciendo que la columna no sea reutilizable. Por el contrario, la cromatografa con fase unida, se retiene las partculas de soporte en la columna por lo que no se pierde fase estacionaria y la columna es reutilizable. Para elegir una columna para cromatografa de reparto, se debe saber la polaridad relativa de la fase estacionaria, la fase mvil y la muestra que se desea analizar, teniendo en cuenta que los hidrocarburos, los teres y las cetonas son las sustancias menos polares, mientras que los alcoholes, aminas, amidas y aldehdos son ms polares (el agua es la sustancia ms polar). Variando la fase mvil se puede modificar el valor de k y de .

Cromatografa de intercambio inicoLa cromatografa de intercambio inico, como dice el nombre, consiste en separar sustancias segn los iones que contengan. Se utiliza una columna de vidrio y la fase estacionaria (relleno de la columna)Escuela Tcnica ORT - Depto. Qumica. Instituto de Tecnologa ORT - Biotecnologa

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consiste en una resina de intercambio inico insoluble y de alto peso molecular (puede ser aninica o catinica, segn la o las especies a separar).

Tomando el ejemplo de la resina de intercambio aninico del cuadro 3, si en la muestra a separar hay sustancias con aniones, como por ejemplo Cl , estos iones sern retenidos en la columna, y a cambio de estos saldrn los aniones de intercambio junto con la fase mvil.-

Para este tipo de cromatografa se suelen utilizar detectores de conductividad elctrica, y en caso de que la diferencia de conductividades del solvente y la muestra sea muy poca, se puede utilizar a continuacin otra columna de intercambio inico que intercambie los iones de la fase mvil por otros que no se ionicen tan fcilmente.

Cromatografa de exclusin molecularTambin denominada cromatografa de permeacin por geles, y consiste en un proceso de separacin netamente fsica, en donde no se pone en juego ninguna interaccin entre la fase estacionaria y las partculas a separar.

La fase estacionaria, montada en una columna, est formada por pequeas molculas de polmeros o de slice que forman poros de diferentes tamaos entre s (entre 40A a 2500A). Separa a los compuestos segn sus tamaos, siendo los ms pequeos retenidos en los poros, mientras que los de mayor tamao son excluidos de los poros y salen ms rpidamente de la columna.

Cromatografa de adsorcinConsiste en una fase estacionaria slida polar y una fase mvil lquida no polar y sirve para separa pequeos compuestos solubles en solventes no polares. La fase estacionaria generalmente est conformada por almina (Oxido de aluminio de muy alta pureza) o slice (dixido de silicio de muy alta pureza), y puede estar montada como placa delgada sobre una plancha de aluminio o en una columna de vidrio. En este tipo de cromatografa, el orden de retencin de compuestos es, de mayor a menor: cidos carboxlicos sulfxidos sulfonas aminas y alcoholes aldehdos, cetonas y esteres nitrocompuestos teres sulfuros haluros hidrocarburos aromticos olefinas.

En este tipo de cromatografa, la nica forma de mejorar k y es modificando la composicin de la fase mvil (a diferencia de la cromatografa de reparto, en la cual tambin se puede modificar la fase


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estacionaria). Uno de los mejores parmetros para lograr eso es elegir a la fase estacionaria en funcin del ndice de polaridad de los solventes. Sirve para separar compuestos no polares de pesos moleculares no muy elevados y permite separar compuestos en ismeros.


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GlosarioCuba cromatogrfica: recipiente donde se desarrollan las cromatografas planas.(cubas cromatogrfica comerciales, vaso de precipitados, etc.) Fase mvil: solvente o solucin que se utiliza para la equilibracin de una columna cromatogrfica, para el desarrollo o la elucin de las mismas y para solubilizar las muestras. Su naturaleza depende de la cromatografa a realizar. Solvente de desarrollo: Fase mvil en las cromatografas planas, puede ascender por capilaridad o descender por gravedad. Elucin: Proceso de agregado de fase mvil en la regin superior de la columna cromatogrfica, con el fin de quitar las muestras adheridas en la fase estacionaria, o en su defecto, las que no se encuentran retenidas en ella. Solvente de elucin: Solvente con que se eluyen las muestras en cromatografa en columna Fase estacionaria: Componente fundamental de las cromatografas, de estado de agregacin variable (slido, liquido, enlazada) que participa en el equilibrio para la separacin de las muestras. El tipo de equilibrio en que participan depende de la naturaleza de la misma fase estacionaria. Las mas comunes son; exclusin, intercambio inico, afinidad, hidrofobicidad, adsorcion, etc. ndice de polaridad: Magnitud que indica la polaridad relativa de un solvente o de la mezcla de estos. Rf : Frente de referencia; Valor que se obtiene al medir la distancia recorrida por la muestra y dividirla por la distancia recorrida por el solvente de desarrollo. Es caracterstica de cada sustancia. Patrn: Sustancia de caractersticas conocidas que se utiliza como referencia para la comparacin con las muestras.


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Bibliografa:Mtodos instrumentales de Anlisis, Willard, Merrit & Dean.

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Anlisis Instrumental. D. A. Skoog y J. J. Leary. Mc.Graw-Hill., 1994.

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Anlisis Instrumental. K. A. Rubinson, Prentice-Hall, 2000.

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Anlisis Qumico Cuantitativo. D. C. Harris. Grupo Editorial Iberoamrica, 1992.

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Apuntes y guas - 63.15 Ctedra de Qumica Analtica Instrumental Facultad de Ingeniera Universidad de Buenos Aires Argentina.

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Apuntes y guas ctedra de Qumica Analtica Instrumental Facultad de Ingeniera Universidad de la Republica Uruguay

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Manual de entrenamiento Fundamentos de Cromatografa Lquida Centro de Capacitacin Analticas Analytical Technologies.

-

Manual de entrenamiento Desarrollo de Mtodos en HPLC Centro de Capacitacin Analticas Analytical Technologies.


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