Edit-R™ CRISPR-Cas9 基因加工系统

无需克隆的基因编辑“超级明星”

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Dharmacon™Edit-R ™ CRISPR-Cas9 基因加工系统

—— 无需克隆的基因编辑“超级明星”

Edit-R ™ CRISPR-Cas9 系统——基因编辑如

此简单

CRISPR-Cas 系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一

种适应性免疫防御机制，可以识别并沉默入侵的病毒及外源

DNA。近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR/Cas俨然已经成为科学界最炙手可热的热点之一，被广泛应用于

各类体内和体外体系的遗传学改造、转基因模式动物的构建，

甚至基因治疗领域。该体系其中一个最重要的优势是 Cas9 蛋

白可在多个不同的 crRNA 的引导下同时打靶多个基因组位点。

表 1. 目前主流的 CRISPR-Cas9 产品主要有如下几类：

市面上不同 CRISPR-Cas9 系统的区别和特点比较

单组份系统 双组份系统 三组分系统

Cas9 和 sgRNA 构建在同一质粒内

Cas9-sgRNA 质粒

Cas9 和 sgRNA 分别构建、不同的质粒，需构建 sgRNA 表达载体

Cas9 质粒

sgRNA 质粒

直接合成 crRNA 和

tracrRNA，无需克隆表达载体

Cas9 质粒

tracrRNAcrRNA

需要构建克隆，测序，质粒纯化步骤，操作繁琐，实验周期长。

需要构建克隆，测序，质粒纯化步骤，操作繁琐，实验周期长。

无法进行 knock-in 操作。

可构建任意感兴趣的 crRNAs；可结合

doner 进行 knock-in。

可构建任意感兴趣的

crRNAs；可结合 doner进行 knock-in。

无需构建克隆，无需测序，直接转染，实验周期短，省时省力。

Dharmacon Edit-R CRISPR-Cas9 系统通过提供可直接转染的

DNA 和 RNA 组分，避免费时费力的 sgRNA 表达载体构建，

极大地简化了基因编辑的工作流程。转入细胞的 crRNA 和

tracrRNA 直接参与基因打靶，避免了不易控制产物剂量且活

性受启动子和细胞环境影响极大的转录过程。使得研究者可

以对同一或不同基因的多个靶点迅速完成评估，详见图 1。

对比 RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统——没有更

好，只有更合适

RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统分别从 RNA 和 DNA 水平减少目的

基因表达，给研究者提供了截然不同的实验方法完成基因功

能的研究。当一种实验方法不能达到实验目的时，尝试另一

种方法往往可以成功。针对不同的实验需求，您可以选择最

适合您实验的方法，Dharmacon 同时提供高品质的 RNAi 和

CRISPR-Cas9 产品供您选择。

表 2. 对比 RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统

对比 RNAi 和 CRISPR-Cas9 系统

RNAi CRISPR-Cas9

作用机制

敲低 敲除

RNA 水平 DNA 水平

内源的 microRNA 作用途径

细菌的获得性免疫机制发展而来

效果持续时间 从瞬时到长时程 永久的

效率 > 75% 5-50%

表型 对细胞整体评估 通常需要筛选单克隆

设计规律 完全理解 稍有起色

脱靶机制 完全理解 不完全理解

非特异性作用 可引起免疫反应 未知

发挥作用的条件需要投递 siRNA 或 表达 shRNA

需要投递 Cas9 蛋白，crRNA/tracrRNA 或者sgRNA

设计局限性几乎在整个转录本上 都可以

需要紧邻 PAM 位点并打靶关键的外显子

基因敲入能力 不能便于精确插入或突变目的序列

HTS 成熟，可靠 尚未成熟

实验周期 短 长

致死基因可通过控制沉默效率 或通过诱导表达载体 研究其功能

一旦敲除，致细胞死亡

图 1. crRNA 与 tracrRNA 形成复合物介导 Cas9 核酸酶切割 PAM 上游目的

DNA 双链示意图。

Genomic DNA PAM

tracrRNA

crRNA 5’3’

5’

3’

3

Dharmacon ™ Edit-R——全新的基因编辑系

统，您的给力新帮手

• 原装进口产品，高品质保证

• 无需构建克隆和测序，省时省力，将宝贵的时间用于重

要的实验

• 可同时打靶多个基因

• 提供无内毒素高纯度质粒，可直接用于细胞转染

• 提供经 HPLC 纯化的 crRNA/tracrRNA，可直接用于细胞转

染，也可与其他类型 Cas 核酸酶共同使用，适应不同的

Cas 核酸酶系统

• 便捷易用的 CRISPR RNA Configurator 在线工具，设计

crRNA 不再困难

• 针对质粒和 RNA 共转染优化的 DharmaFECT Duo 转染试

剂，有效提高实验成功率

Edit-R SMARTCas9 核酸酶表达质粒——基因

编辑成功的关键

高效的基因编辑需要 Cas9 核酸酶有效的表达，Dharmacon Edit-R SMARTCas9 核酸酶表达质粒均编码根据人类密码子偏

好性优化过。不同的启动子在不同细胞或实验环境中的活性

相差甚远，Dharmacon Edit-R SMARTCas9 产品提供多达 6 中

不同启动子供您选择。

为了进一步富集 Cas9 阳性细胞，Dharmacon 提供整合

mKate2 荧光报告基因或 puromycin 抗性基因（PuroR）Edit-R SMARTCas9。您可以根据您的实验需要选择合适的质粒。

我们提供给您的所有质粒均为无内毒素干粉质粒，可直接用

于细胞转染。

图 3. 以设计一段敲除人的基因 PPIB（chr15:64448014-64455354）的

crRNA 为例，一段紧邻 PAM（红色，下划线）的上游序列被确定后，这段

20nt 的序列（绿色，加粗，下划线）需要输入 crRNA Configurator 在线设

计工具。在线工具将自动把其中的 DNA 核苷酸替换为相应的 RNA 核苷酸，

同时在其 3’ 端自动添加 22nt 的 CRISPR 重复序列（绿色）从而生成 42nt的基因特异性 crRNA。全长 crRNA 将被添加至购物车，并在提交订单后由

Dharmacon 合成。

Targeting the Human Gene PPIB Genomic DNA for Gene Disruption

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5

GTGTATTTTGACCTACGAATTGGCACATAAAACTGGATGCTTAACC

GTGTATTTTGACCTACGAAT

GUGUAUUUUGACCUACGAAU

GUGUAUUUUGACCUACGAAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG

5ʹ 3ʹ 3’ 5ʹ

PAM

Enrichment of edited cells by FACS

Enrichment of edited cells by antibiotic selection

SMARTCas9 (mKate2) Nuclease Expression

Plasmids

SMARTCas9 (PuroR) Nuclease Expression

Plasmids

Design target crRNAs

Select three to fivegenomic DNA targeting sites for incorporation into crRNAs

Cas9 expression plasmid, tracrRNA,custom crRNAs,DharmaFECT Duo Transfection reagent

Transfect

Cas9 expression plasmid

tracrRNA:crRNA5 daysOrder0 days

2-3 days

3-4 days

图 2. 利用 Edit-R CRISPR-Cas9 系统进行基因敲除的工作流程。

利用 Edit-R CRISPR-Cas9 系统进行基因编辑

Dharmacon Edit-R CRISPR-Cas9 系统包括了在哺乳动物细胞进

行基因编辑所需的三种组分：

• 根据哺乳动物基因密码子偏好性优化过的 Cas9 核酸酶表

达质粒；

• 化学合成的 tracrRNA；

• 根据您感兴趣的靶点设计并化学合成的 crRNA。

您可以选择专为此优化的 DharmaFECT Duo 转染试剂把三种

组分共转染到目的细胞中。

如何设计合成您要的 crRNAs

Dharmacon CRISPR RNA Configurator 程序可根据您感兴趣的

基因提供可用的 crRNA 列表，您只需从中选择您想要的序列。

如果您已经确定您的目的序列，您可以直接在 CRISPR RNA Configurator 程序中输入这段 20nt 目的序列，程序将自动生

成完整的 crRNA。将设计好的 crRNA 序列加入购物车订购并

由 Dharmacon 合成（图 3）。

图 4. CRISPR/Cas9 介导的切割效率。利用 Edit-R Cas9 核酸酶结合化学合

成的 crRNA 和 tracrRNA 在 HEK293T 细胞中完成目的基因切割。对照组为

单转染 Cas9 核酸酶质粒（-），实验组为 Cas9 质粒与 tracrRNA 以及针对

DNMT3B、PPIB 或 CDKN1A 设计的 crRNA 共转染（+）。转染 72 小时后直

接裂解细胞并 PCR 扩增包含目的位点的基因组片段。通过 T7EI 实验利用

T7 内切酶（NEB）进行 DNA 错配分析。酶切产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳。

引入的插入 / 缺失突变率如图中所示。

订购我们的产品

品名 货号 包装规格

含有 mKate2 荧光报告基因的 SMARTCas9 核酸酶表达质粒

Edit-R hCMV_mKate2-Cas9 U-004100-120 120 ug，干粉

Edit-R mCMV_mKate2-Cas9 U-004200-120 120 ug，干粉

Edit-R hEf1α_mKate2-Cas9 U-004300-120 120 ug，干粉

Edit-R mEf1α_mKate2-Cas9 U-004400-120 120 ug，干粉

Edit-R PGK_mKate2-Cas9 U-004500-120 120 ug，干粉

Edit-R CAG_mKate2-Cas9 U-004600-120 120 ug，干粉

含有 PuroR 抗生素筛选标记的 SMARTCas9 核酸酶表达质粒

Edit-R hCMV_PuroR-Cas9 U-005100-120 120 ug，干粉

Edit-R mCMV_PuroR-Cas9 U-005200-120 120 ug，干粉

Edit-R hEf1α_PuroR-Cas9 U-005300-120 120 ug，干粉

Edit-R mEf1α_PuroR-Cas9 U-005400-120 120 ug，干粉

Edit-R PGK_PuroR-Cas9 U-005500-120 120 ug，干粉

Edit-R CAG_PuroR-Cas9 U-005600-120 120 ug，干粉

含有 BlastR 抗生素筛选标记的 Cas9 核酸酶表达质粒

U-001000-120 120 ug，干粉

含有 BlastR 抗生素筛选标记的 mKate2 转染优化质粒

U-003000-120 120 ug，干粉

化学合成的 RNA

tracrRNA U-002000-120 5 nmol（120 μg），干粉

crRNA CTM-XXXXXX-XXX* 20 nmol，干粉

Edit-R 基因加工试剂盒 **

U-009000-120 1 kit

转染试剂

DharmaFECT Duo T-2010-01 0.2 mL

T-2010-02 0.75 mL

T-2010-03 1.5 mL

T-2010-04 1.5 mL × 5 管

* crRNA 的货号根据不同的序列和订购时间由订购系统生成

** Edit-R 基因加工试剂盒包含以下三种试剂 : • 含有 BlastR 抗生素筛选标记的 Cas9 核酸酶表达质粒 , 120 μg 干粉 (Catalog #U-001000-120) • tracrRNA, 5 nmol (120 μg) 干粉，(Catalog #U-002000-120) • mKate2 转染优化质粒，120 μg 干粉 (Catlog #U-003000-120)

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咨询热线：800-810-9118 400-810-9118

Edit-R CRISPR-Cas9 系统的实验研究—— 高效，特异，可靠

T7EI 实验可以检测切割效率，这一技术采用内切酶检测错配

方法来检测细胞内 NHEJ 而产生的插入或缺失。如图 4 所示，

Edit-R CRISPR-Cas9 系统可以精确切割目的位点并高效引入插

入 / 缺失突变。

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