Un Escherichia coli sintético ecosistema depredador-presaimpact factor of 8.626

Desde su reciente aparición, la biología sintética ha mostrado gran potencial para la generación de sistemas útiles en la práctica mientras que sirve como una aproximación a la decodificación biológica “principios de diseño”. Un desafío clave en esta área es identificar general las estrategias escalables que permitan la construcción de circuitos cada vez más complejos de genes con rendimiento fiable, así como para desarrollar nuevas plataformas tecnologicas para la caracterización de un circuito cuantitativo. El ecosistema depredador-presa sirve como un excelente modelo para este desafío. Como un componente esencial de la dinámica ecológica, el natural sistema depredador-presa ha sido analizado ampliamente por modelado y experimentos. En comparación con otros tipos de interacciones ecológicas (por ejemplo, mutualismo y competencia), la depredación a menudo genera dinámicas más ricas y, como tal, representa un desafío mayor para ingeniería de novo. En este estudio, hemos construido circuitos de gen sintético que convierten dos poblaciones de Escherichia coli en un sistema sintético depredador-presa. A largo plazo, la cuantificación de la dinámica del sistema, que requirió una versión mejorada (Figura S1) del recientemente desarrollado microchemostat (Balagadde et al, 2005), validó la función diseñada. Además de la superación de los límites de la programación y caracterización de las complejas dinámicas celulares, nuestro sistema puede servir como un sistema modelo para abordar las cuestiones derivadas de su contrapartes naturales.

Resultados y discusión

Como se muestra en el Cuadro 1A, dos poblaciones de E. coli ('Depredador' y 'Presa') se comunican y regulan la densidad de los demás a través de la percepción de quórum sensing (QS), un mecanismo por el cual muchos bacterias transmiten y responden a los cambios en su densidad de población local (Camilli y Bassler, 2006). Dos módulos QS, LuxI / LuxR de Vibrio fischeri y LasI/ LasR de Pseudomonas aeruginosa, se utilizaron para habilitar dos vías de comunicación entre el depredador y las poblaciones de presas. Cuando la densidad de presas es bajo, las células predadoras mueren debido a la expresión constitutiva de un gen suicida (ccdB). En las células de presa un acil-homoserina lactona (AHL), 3OC6HSL, es sintetizada por LuxI. A medida que aumenta la densidad de presas, 3OC6HSL se acumula en el cultivo y, a concentraciones suficientemente altas, es obligado por el regulador transcripcional LuxR en el depredador las células que conducen a una mayor expresión de un gen de antídoto (CCDA) para rescatar los depredadores. Las células depredadores a su vez producen otro AHL 3OC12HSL , por LasI que penetra en la presa las células donde se vinculados por LasR, que activa la expresión de el gen ccdB asesino induciendo, 'depredación.' Este sistema satisface la definición más amplia de la depredación de los ecosistemas de dos especies, donde una especie (presa) sufre del crecimiento de la segunda (depredador) y los beneficios anteriores a partir del crecimiento de la primera (Taylor, 1984). Sin embargo, se diferencia del canónico sistema depredador-presa en dos aspectos. En primer lugar,de actuar como una fuente de alimento, la presa proporciona un 'antídoto' a muerte programada del depredador. En segundo lugar, existe una competencia entre el depredador y la presa por nutrientes en un co-cultivo, que es generalmente ausente en sistemas naturales depredador-presa.

Empleamos ecuaciones diferenciales ordinarias para modelar el principal eventos cinética durante el funcionamiento de este circuito (véase Información complementaria y Figura S5 para más detalles). El modelo predice la extinción, la convivencia o la dinámica oscilatoria (Recuadro 1B) dependiendo de lasvelociades de crecimiento celular, la muerte celular controlado por AHL, así como la producción y degradación de los AHL. De acuerdo con el análisis de bifurcación (recuadro 1b, panel izquierdo), cuanto mayor sea la matanza CcdB constante de velocidad (DC1), más altala probabilidad de un comportamiento oscilatorio robusto: el aumento de dc1 amplía significativamente la región de parámetro que da lugar a la oscilación (región obligado por los loci de puntos bifurcación de Hopf). Nuestros experimentos indican que la original LacZα-CcdB proteína de fusión, que fue utilizado en nuestro el circuito de control (You et al, 2004), pueden carecer de la necesaria toxicidad (datos no mostrados). Para superar esta limitación, nosotros construimos un nuevo LacZα´- CcdB proteína mediante la supresión de 32 aminoácidos en LacZα, lo que resultó en un aumento de ocho veces en potencia en comparación con la proteína de longitud completa (Suplementario Figura S2). La proteína de fusión LacZα´-CcdB se denomina 'CcdB "en este documento.

Se ha demostrado anteriormente que tanto LasR activa y activa LuxR pueden iniciar la expresión de genes en el promotor luxI (PluxI) (Gray et al, 1994) (Figura S3).Por lo tanto, PluxI fue utilizado para accionar tanto el gen de la CCDA en las células de depredadores (Regulada por LuxR) y el gen ccdB en las células presa (Regulado por LasR).

Recuadro 1 Un ecosistema sintético depredador-presa. (A) El sistema consta de dos tipos de bacterias manipuladas de controlando cada uno supervivencia y la muerte a través de dos diferentes señales de QS. Cajas exteriores representan las paredes celulares. Las flechas representan la activación o la producción; flechas romas representan la inhibición o muerte. CcdB ('B') se controlado por Plac/ara-1 en el depredador y la presa en PluxI. CCDA ('A') es controlado por PluxI. El sistema de lux se muestra en azul y el sistema de LAS de color verde. Los genes en el QS depredador son controlados por PLtetO-1, y los de la presa por Plac/ara-1. Los círculos negros representan 3OC6HSL y diamantes rellenos representan 3OC12HSL. La interaccion presa-depredador es activada por IPTG. Véase el texto principal y la información complementaria para obtener más detalles. (B) Analisis de bifurcación del modelo en términos de la muerte constante dc(dc1 (depredador) =dc2 (presa)) y la tasa de crecimiento kc (= kc1 (depredador) = kc2 (presa)) (panel izquierdo). La construcción del modelo se describe en las ecuaciones S14-S17. Una línea que une los puntos de bifurcación de Hopf delimita tres regiones: (i) la dominación presa, (ii) la oscilación depredador-presa y (iii) la dominación depredador.Dinámicas típicas de población para los conjuntos de parámetros específicos se ilustran para cada región (panel derecho).

Para acelerar el rescate de los depredadores por suseñal de supervivencia (3OC6HSL), el correspondiente sistema de QS fue coloca bajo el control del promotor PLtetO-1 (Lutz y Bujard, 1997), que es constitutivamente activa en las cepa E. coli MG1655. Esta estrategia simultáneamente acelera la síntesis 3OC12HSL y así mata a la presa. Para asegurar suficiente de matanza del depredador, hemos implementado los circuitos de inducción CCDB en un alto número de copias del plásmido (p15A origen de replicación con un número de copias de ~20 por célula). Este ecosistema sintético es activado por isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), que induce la expresión ccdB en el depredador y el sistema QS de la presa. Para optimizar los niveles de expresión de proteínas y sincronizar la temporización de los componentes del circuito, hemos probado muchas combinaciones de promotores, orígenes de replicación y las cepas huespedes bacterianas, y redujo nuestra atención a una configuración (Figura complementario S4A). Salvo que se indique de lo contrario, el circuito de depredador se implementó en la cepa MG1655 de E. coli, el circuito de la presa en el Top10F0´. Finalmente, unadesestabilizado gen de la proteína verde fluorescente (GFPuv-LVA) fue introducido en el depredador (Suplementario figura S4A) para capturar los cambios dinámicos y diferenciar el depredador de las poblaciones de células presa en cultivos mixtos.

Se verificó la función básica de cada población independientemente usando IPTG y la AHL correspondiente suministrada exógena (Figura 1). En el cultivo que no contiene ni APAGADOIPTG ni 3OC6HSL, las células depredadores crecieron a un nivel relativamente alto ladensidad en medio LBK (Figura 1A). El crecimiento fue significativamente inhibido en el cultivo que contenia 1 mM de IPTG, que plenamente indujo la expresión ccdB. Sin embargo, las células de los depredadores indujeron con IPTG fueron rescatados por 3OC6HSL (100 nM), quecuando obligado por LuxR puede iniciar la expresión CCDA. Depredadores rescatados (con IPTG y 3OC6HSL) crecieron ligeramente más lento que los de la condición OFF (Figura 1A), posiblemente debido a la carga metabólica implicada en la expresión de los componentes del circuito, neutralización incompleta de CcdB por CCDA, o ambos. Como se muestra en la Figura 1B, las células de presa son capaces de crecer en la posición OFF cultivo (sin inductores), así como un medio que contiene sólo IPTG pero falleció cuando ambos IPTG y 3OC12HSL estaban presentes. Un aparato para el continuo cultivo de microorganismos en un estado estacionario

La población de presas IPTG inducida creció más lento en comparación con la del cultivo OFF. Este menor crecimiento de retraso podría ser un resultado de la carga metabólica del componentes del circuito, la expresión basal nivel CcdB debido a diafonía entre 3OC6HSL y LasR, o ambos.

Figura 1 comportamientos individuales de crecimiento (sin interacción) de (A) depredador y (B) células de presa en medios líquidos. Para cada condición, 6 ml de medio que contiene LBK cloranfenicol y kanamicina se inoculó con una sola colonia bacteriana y se dividió en tres cultivos de 2ml: 'Off' cultivos no contenía inductores, "+IPTG" cultivos contenian 1 mM IPTG y '+IPTG+AHL "contenia 1mM IPTG y 100 nM AHL, respectivamente. Después de 20 h de incubación (barras grises), las densidades ópticas (OD) de estos cultivos se midieron con un lector de microplacas(ver información complementaria). Las barras de error representan la desviación estándar de cultivos por triplicado.

Este sistema sintético depredador-presa representa uno de los circuitos sintéticos más complicados reportado hasta la fecha. A largo plazo la caracterización de tales circuitos, es esencial para la verificación de la dinámica de diseñado, presenta una mayor desafío tecnológico. Medición del rendimiento de circuito convencionales en macroscópicas (tubo de ensayo) cultivos ha insinuado una dinámica oscilatoria (datos no mostrados). Pero insuficiente resolución temporal debido a la ardua y tiempo de consumo proceso implicado en la adquisición de estos datos hizo estas observaciones concluyentes. Además, la estabilidad de corta duración delcircuito en las poblaciones de tamaño macro (Desai et al, 2007) podría sólo proporcionan una visión fugaz del comportamiento programado: la función se perdió antes de que el comportamiento de los circuitos pudiera ser apreciablemente observada. Para este fin, hemos recurrido a una recientemente desarrollada plataforma microchemostat (Balagadde et al, 2005), una tecnología de alto rendimiento que económicamente pueden realizar la caracterización rápida de circuitos sintéticos bajo una matriz de condiciones con capacidades sin precedentes incluyendo a largo plazo, mediciones no invasivas de poblaciones microbianas propiedades de la población bajo condiciones de estado estable con resolución única célula y la automatización avanzada. Igualmente importante, el microchemostat de tamaño micro población(~102-104 células en comparación con al menos ~109 en cultivos macroescala)reduce el número de eventos de la división celular por unidad de tiempo y por lo tanto, retarda la evolución microbiana abajo (Desai et al, 2007). Este aspecto facilita el seguimiento del comportamiento programado de las poblaciones de bacterias durante cientos de horas a pesar de la fuerte presión de selección para evadir el control de población (Balagadde et al, 2005).

Además, el desafío de monitoreo en tiempo real de composición de la comunidad se encontró con una ingeniería revisión al canal reactor microchemostat apermitir que una sola célula de resolverse la cuantificación de fluorescencia(Figura S1). Además, hemos reducido el volumen del reactor de ~16 a ~9 nl para reducir aún más la población bacteriana en cada reactor, que se ha demostrado que ayuda estabilizar un controlador de población durante el cultivo a largo plazo (Balagadde et al, 2005). Esta estrategia también nos permitió aumentar el número de reactores en paralelo por cada chip de 6-14 para mayor rendimiento. La Figura 2A ilustra la dinámica típicas oscilatorios de poblaciones de depredadores y presas en la microchemostat con un período de ~180 h (IPTG = 5 mM, la tasa de dilución (D) = 0,1125 h-1).Inicialmente, cuando la densidad de la presa fue baja, el crecimiento depredador fueinhibida debido a la expresión constitutiva de CcdB. A la inversa, la presa creció a una densidad alta ( ~35 000 células por reactor) en ~10h. La densidad de las presas más elevada llevó a rescatar la población depredador, que se recuperó de ~5000 células por reactor para˃20 000 células por reactor en ~10h. El incremento de densidad de depredador a su vez resultó en la muerte de las células de la presa, lo que lleva a una drástica reducción en la densidad de presas (~35 000 células por reactor a sólo unas cuantas células por reactor). La disminución de la densidad de la presa condujo al rescate insuficiente de las células de los depredadores y la subsiguiente disminución de la densidad de depredadores en ~35 h. La población de las presas se recuperó ~10 h más tarde. En resumen, el sistema dio dinámica oscilatoria entre el depredador y la población de la presa que claramente se asemejan a las observadas en ecosistemas naturales depredador-presa.El diseño de los reactores en paralelo microchemostat facilita la investigación de respuesta del circuito para cambiar los parámetros del circuito. La Figura 2B ilustra un conjunto típico de dinámica del ecosistema sintético depredador-presa para varios niveles de circuitos de inducción. Sin inducción (IPTG = 0), depredador y la presa tenía interacciones insignificantes circuito- impulsados . Puesto que el depredador (cepa MG1655) crece más rápido que la presa (cepa Top10F´), la población de la presa fue finalmente (después de ~50 h) conducido a la extinción (las fluctuaciones de la densidad de presas alrededor de 0 celulas por reactor eran artefactos numéricos de formación de procesamiento de imágenes, consulte la información complementaria para detalles). Los más altos niveles de IPTG niveles (≥5 mM) han suscitado dinámica oscilatoria entre el depredador y las poblaciones de presas.

Estos resultados sugieren el cruce de una bifurcación de Hopf punto utilizando el nivel de IPTG como el parámetro de control (véase también Figuras complementario S6 y S7A). Este aspecto se ilustra con el análisis de bifurcación (Figura 2C) que representa laefectos de IPTG en la producción 3OC6HSL por la presa y CcdB expresión por parte del depredador. A niveles suficientemente bajos de IPTG, hay depredación mínima programada entre dos poblaciones y la interacción principal es la competencia. Como resultado, la población de depredadores domino debido a su ventaja de crecimiento, que conduce al fracaso de la presa. El aumento de IPTG más allá de un nivel crítico permite cruzar de un punto de bifurcación de Hopf y provoca dinámicas oscilatorias.El modelo predice además dos características destacadas del comportamiento depredador a altos niveles de inducción de IPTG. En primer lugar, la dinámica de respuesta son mucho más lento en comparación con los bajo niveles de inducción de IPTG (Figura 2C, inserción). En segundo lugar, esas dinámicas implican densidades mínimas de depredadores que se acercan a cero. Ambos aspectos son cualitativamente consistentes conlos datos experimentales (paneles superiores de la Figura 2B; complementaria Figura S7A), aunque los datos no excluyen la posibilidad que el sistema puede llegar a aproximarse estado estacionario. Porque del volumen miniaturizada del reactor microchemostat(~9 nl), el depredador (o presa) la población es propensa a caer por debajo del límite de detección (~75 células por reactor) durante una oscilación canal (Figura 2B, fila 1, columnas 1 y 2; desde ~10 a ~80 h) y en casos severos, consiguiendo el fracaso(Figura 2B, fila 1, columna 3).

Figura 2.-Caracterizacion a largo plazo de la dinámica del sistema mediante el microchemostat. (A) la dinámica típicas oscilatorios del sistema con un período de ~180 h (IPTG = 5 mM, la tasa de dilución = 0,1125 h-1). (B) la dinámica del sistema para diferentes niveles de inducción con IPTG. La tasa de dilución microchemostat fue 0,1125 h-1. Sin inducción, Las células presa son acabadas. A nivel IPTG aumentado (IPTG≥5 mM), dinámica oscilatoria se suscitó en varios reactores. (C) Bifurcación diagrama de la densidad de depredadores en comparación con el nivel de IPTG. El recuadro muestra el periodo de oscilación como una función de IPTG. Cursos de tiempo de las dos poblaciones en las concentraciones de IPTG diferentes se ilustran.

Del mismo modo, se analizó el impacto de la tasa de dilución (D) en la dinámica del sistema. La figura 3A ilustra la dinámica de coexistencia en D= 0,11 h-1, lo que sugiere una fase inicial de largo plazo de oscilaciones. Sin embargo, un incremento en D (a 0,2 h-1) condujo a una fase amortiguadas dinámica oscilatoria con mucho más corto períodos (~50 h). Se observó respuesta similar con una configuración del circuito distinto: depredador (Top10F´) y la presa (Top10F´) (Figura 3B; ver también S4B Figura complementario).Estas poblaciones inicialmente coexistieron con una baja tasa de dilución (D=0,15 h -1). Se Cambiaron a oscilaciones amortiguadas con periodos cortos (~30 h) a un incremento en D (a 0,23 h -1).Mayor incremento en D (a 0,31 h-1) en ~250 h condujo a depredador a muerte. El análisis de Bifurcación cualitativo representa las observaciones experimentales que un aumento en la tasa de dilución puede conducir a una disminución significativa en el período de las oscilaciones(Figura 3C, inserción). Otras simulaciones muestran que un aumento en D puede cambiar una oscilación lenta, sostenida (Figura 3C, parte inferior izquierda panel) para un rápido, oscilación amortiguada (Figura 3C, medio fondo panel). Células predadoras fueron acabadas si D es demasiado grande (Figura 3C, panel inferior derecho).Estos resultados del modelado cualitativo cuenta por las observaciones experimentalesde la dependencia de la dinámica de los sistemas tasa de dilución .Notamos que la respuesta de dilución del sistema a un cambio en D es muy sensible a las condiciones predominantes de funcionamiento.*************Al conectar D de 0,11 a 0,2 h-1, el sistema ya sea exhibe una oscilación amortiguada o se aproxima a un estado de equilibrio (la tercera fila, Figura complementario S7A, donde IPTG =50 µM).La sensibilidad de la oscilación amortiguada a perturbaciones de un parámetro o condiciones iniciales

Figura 3 Dependencia de la dinámica de los sistemas sobre la tasa de dilución (D). (A) la dinámica depredador y experimentales de las poblaciones de presas en D diferente en el microchemostat: para el par de depredador (MG1655) y presa (Top10F´). (B) Para el par de depredador (Top10F´) y presa (Top10F´). (C) Diagrama de bifurcación período oscilatorio frente a D. inserción es el período de oscilación dinámica frente a D. sistemas cualitativamente diferentes (sostenido y oscilaciones amortiguadas, y el estado de equilibrio) se puede obtener por la variación de D. Estos experimentos se llevaron a cabo en IPTG=50 µM.

cualitativamente puede explicar este fenómeno (Suplementario figura S7c, recuadros). Desde oscilaciones amortiguadas son dinámicas transitorios, variaciones pequeñas en el control de la tasa de dilución microchemostat o diferentes fases iniciales del depredador y de las poblaciones de presas puede impactar significativamente el comportamiento de oscilación.Inspirándose en la naturaleza, los biólogos sintéticos han creado circuitos que operan en las células individuales (y Elowitz Leibler, 2000; Gardner et al, 2000; Atkinson et al, 2003; Funget al, 2005; Levskaya et al, 2005), en las poblaciones individuales (Kobayashi et al, 2004; You et al, 2004; Basu et al, 2005; Anderson et al, 2006) y entre las poblaciones (Brenner et al, 2007). Nuestros estudios representa un mayor avance masalla de los reciente esfuerzos en la construcción de los ecosistemas sintéticos (Shou et al, 2007; Weber et al, 2007), en términos de la complejidad del sistema y resolución de caracterización. Proporciona un marco para explorar la naturalidad existentes de componentes celulares pueden ser reunidos para programar y coordinar altamente su comportamiento celular complejo. Además, los ecosistemas sintéticos como el nuestro puede servir como sistemas bien definidos para explorar cuestiones evolutivas y ecológicas con respecto a, por ejemplo, la generación y el mantenimiento de la biodiversidad (Chesson, 2000; Nowak y Sigmund, 2004). Convencionalmente, los experimentos típicos que implica sistemas de microorganismos se limitan al uso de nutrientes la concentración y la velocidad de dilución como los parámetros de control único (Fussmann et al, 2000; Becks et al, 2005).

En comparación, nuestro sistema permite la manipulación directa de los parámetros intrínsecos, tales como la tasa de crecimiento, tasa de mortalidad y la fuerza de la comunicación célula-célula. En este sistema, hay una clara y explícita asignación entre las construcciones genéticas y las correspondientes dinámica de la población, lo que puede facilitar futuros estudios de cómo las interacciones moleculares son manifestadas en el modelo temporal de dinámicas de la población, un tema central en ecología (Bohannan y Lenski, 2000; Foster et al, 2007). La naturaleza genérica de nuestro diseño del sistema hace que sea portable a otras interacciones ecológicas, incluyendo el mutualismo, la competencia, comensalismo y amensalismo (mayo, 1974). La virtual ilimitada configuracion que son posibles con estos básicos elementos nos permitirá examinar más a fondo la interacción entre la regulación de genes y medio ambiente, y la población dinámica. Con un control adicional sobre la población de mezcla o segregación, será posible programar las poblaciones bacterianas para imitar el desarrollo y la diferenciación en organismos multicelulares.

Materiales y métodos

Microquimiostato diseño y fabricación

La asamblea general de que el lector se describió anteriormente(Balagadde et al, 2005). Las células en el microchemostat fueron imágenes a través de microscopía de campo claro o de fluorescencia. Iluminación en cada caso fue sincronizada a la operación de chip utilizando dos obturadores electrónicos (Uniblitz persianas electrónicas, AG Heinz Inc., Lake Forest, CA, EE.UU.).Imágenes digitales fluorescentes y de contraste de fase-se capturaron usando una cámara de carga acoplaun dispositivo refrigerado (monocromo SRV Retiga 2000 RV de QImaging Corporation). Labview software fue utilizado para controlar el funcionamiento sincronizado de estos componentes y el chip de toda operación.

El recuento de células microscópico

Dentro de la altura de 3 µm de la sección de formación de imágenes (en comparación con el 10 µm altura de otro tipo), las células fueron fotografiados en un limitado suficientementeplano horizontal delgada a fin de que todos ellos podrían estar en el foco simultáneamente.Esto también mejora la resolubilidad por la disminución de la superposición célula-célula en el plano horizontal

(Figura S1).El número total de células en cada reactor continuo fue determina directamente a través automatizado brillante microscopía de campo por contando el número de células presentes en una sección de la cámara de crecimiento volumen conocido. Típicamente, un conjunto de ocho imágenes de contraste de fase fue tomada en la sección de formación de imágenes de cada reactor a través del campo brillante microscopía, con mezcla de rotación de la cultura en el medio consecutivo instantáneas. Algoritmos de procesamiento de imágenes en Matlab se utilizaron paradeterminar el número medio de células en cada conjunto de imágenes, desde la que los totales celulares determinadas como se ha descrito previamente (Balagadde et al, 2005).Para determinar la composición de las comunidades de poblaciones mixtas, una dela especies (depredador o presa) fue etiquetado con una etiqueta fluorescente gfpuv. La señal fluorescente se determinó por recuento directo de células fluorescentes en un conjunto de típicamente cuatro imágenes adquiridas a través microscopía de fluorescencia automatizada, utilizando el filtro adecuado gfpuv set: excitación 395/40 y la emisión de 510/40. Por lo tanto, la densidad no fluorescente, obtenida restando la fluorescencia del conteo total de células, representado la densidad de la segunda población. Según este enfoque, los miembros de una especie "fluorescente" que no son suficientemente brillantes para ser capturado por los algoritmos de procesamiento de imágenes son contadas como células de especies no fluorescentes. Esto podría ser una fuente de ruido en el número de células reportados para cada especie. En el futuro, este problema podría abordarse mediante la asignación de un marcador fluorescente diferente para cada especies involucradas en el experimento.Una platina motorizada del sistema (Prior Scientific, Rockland, MA, EE.UU.) documentación activar simultánea de múltiples microchemostat

Los plásmidosLos plásmidos utilizados en este estudio se muestran en la Figura S4. Para construir placCcdBs (p15A origen, KanR), 96 pares de bases entre dos sitiosNSTI en la región codificante de LacZα-CcdB (pZErO-2), se eliminaron y el gen resultante lacZα´-ccdB, junto con su ascendente promotor lac, se clonó en pPROLar.A122 (BD Biosciences Clontech).ptetLuxRLasI-luxCcdA (SC101 origen, CMR) se construyó en varias pasos. En primer lugar, el gen LasI junto con su sitio de unión al ribosoma era clonado a partir de la P. aeruginosa (PAO1) cromosoma en el plásmido pLuxR (Collins et al, 2005), donde fue colocada aguas abajo de laluxR gen. En segundo lugar, el casete de luxR-Lasi se clonó en el plásmido pPROTet.E132 (Clontech) para generar ptetLuxRLasI, donde el casete está bajo el control de un promotor PLtetO-1 (Lutz y Bujard, 1997). Siguiente, el gen de la CCDA se clonó a partir del plásmido F, PCR-fusionado con un PluxI promotor de pluxGFPuv (Collins et al, 2005), y se inserta en ptetLuxRLasI, en dirección opuesta desde el cassette de PLtetO-1-LasR-Lasi.Finalmente, el origen de replicación ColE1 de este plásmido fue sustituido con el origen SC101, que se clonó a partir del plásmido repressilator (Elowitz y Leibler, 2000). pLasRLuxI-luxCcdBs (p15A origen, KanR) fue construido en varias etapas. En primer lugar, el gen se clonó LasR a partir de la P. aeruginosa (PAO1) cromosoma en pPROLar.A122 (Clontech) colocándolo bajo el control del promotor de Plac/ara-1 generar pLasR. En segundo lugar, la luxI genewas PSND-clonado fromplasmid 1 (Weiss y Knight, 2000) en pLasR donde se coloca directamente abajo del gen LasR, generando pLasRLuxI. En tercer lugar, un pluxIlacZa0- ccdB casete se clonó a partir pluxCcdBs plásmido, que se derivados de pluxCcdB mediante la eliminación de 96 pares de bases entre dos sitios Nst1 (véase más arriba).

Stress response protein NST1El plásmido ptetGFPuv (LVA) (ColE1 origen, CmR) fue construido por la inserción de una porción N-terminal de GFPuv amplificado por PCR con un cebador, incluyendo un sitio KpnI rio arriba del codón de iniciación y un cebador recocido a la interna sitio AvaII, y una parte C-terminal de GFPuv

(LVA) amplificado por PCR a partir de PINV-4 (Weiss, 2001) con un cebador recocido a la interna sitio AvaII y un cebador incluyendo BamHI rio abajo de la etiqueta de LVA en KpnI y BamHI digerido-pPROTet. E132 (BD Biosciences Clontech).

Cepas, condiciones de crecimiento y los datos macro escalaadquisiciónMG1655 y Top10F´ cepas de E. coli celulas (Invitrogen) se utilizaron a menosse indique lo contrario. Para las pruebas de respuesta IPTG / AHL en la Figura 1, se utilizó3OC6HSL (Sigma Aldrich) y 3OC12HSL sintetizado por E Toone (Departamento de Química de la Universidad de Duke), que han sido formuladas y se almacena como referencia (Collins et al, 2005).PH-tamponada LBK medios de comunicación (que contiene 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 7 g de KCl l-1) se utilizó para el cultivo líquido. Los medios se tamponaroncon 100 mM de ácidos débiles (tuberías se utilizó un pH de 6,2 y 6,6, y MOPS para pH 7,0), y el pH se ajustó mediante la adición de KOH 5M.Antibióticos (50 µgml-1 cloranfenicol y µgml 50-1 kanamicina) anhidrotetraciclina y se añadieron. IPTG más 0,05% de arabinosa (1 mM) se utiliza para activar el circuito. Los cultivos se agitaron en un 12 ml tubo de cultivo a 37oC y 250 rpm Un cultivo iniciador de la células de depredadores o las células de presa se inoculó a partir de una sola colonia y crecido por separado por lo menos durante 10 h, y después se diluyó 1000-veces en 4 ml de medio fresco.

Medio Microchemostat, preparación precultivoy las condiciones de crecimientoLBK medio se utilizó en todos los experimentos microchemostat menosse indique lo contrario. Poblaciones de depredadores y presas de forma independienteprobado para la función de circuito de acuerdo con el procedimiento ilustrado enFigura 1. Soluciones de glicerol de valores (30 ml) se crearon utilizando la pruebaculturas depredadores y presas andwere colocado en un congelador? 801C para largo plazoalmacenamiento. Estas poblaciones de mini-se utilizaron para preparar pre-cultivos paramicrochemostat experimentos posteriores.Precultivos fueron preparadas por inoculación de un medio 2 ml estérilmuestra con 10 ml de células preparada previamente almacenadas mini-glicerolsolución y agitación a 280 rpm para B9 horas a 371C (arriba VWR bancoincubadora, modelo 1575R). El precultivos se usaron luego para semillamicrochemostat reactores con células B20 nl? 1. Para medir depredador-presa dinámica del circuito en la microchemostat, las células fueron cultivadas en pH7.0 medio tamponado LBK. Todos los medios fueron suplementados microchemostatcon 5 gl? 1 albúmina de suero bovino como un anti-adhesiónadyuvante. Los plásmidos circuito depredador-presa se mantuvieron con50 mgml? 1 de kanamicina y 15 mgml? 1 cloranfenicol. Todos los experimentosse realizaron dentro de un microscopio de plexiglás incubadora acontrol de la temperatura de crecimiento a 37oC.

Bifurcación de Hopf se refiere al nacimiento local o la muerte de una solución periódica (auto-excitado oscilación) de un equilibrio como un parámetro cruza un valor crítico