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ELISAELISA
Dra Morella BouchardInstituto de Inmunología Clínica
Universidad de Los Andes
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ELISAELISAEnzymeEnzyme LinkedLinked ImmunoImmuno SorbentSorbent AssayAssay
Dra Morella BouchardInstituto de Inmunología Clínica
Universidad de Los Andes
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InteracciInteraccióón Antn Antíígeno Anticuerpogeno Anticuerpo
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Fuerzas que Fuerzas que participan participan
en la en la InteracciInteraccióón n AntAntíígeno geno
AnticuerpoAnticuerpo
Puentes de Hidrógeno
Enlaces Iónicos
Interacciones hidrofóbicas
Fuerzas de van der Waals
Enlaces Iónicos
ANTÍGENO ANTICUERPO
ENLACES NO COVALENTES
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CaracterCaracteríísticas del sticas del AcAc relacionadas con relacionadas con con el reconocimiento del con el reconocimiento del AgAg
EspecificidadDiversidadAfinidad y Avidez
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RESPUESTA HUMORALRESPUESTA HUMORAL
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ELISAELISA• Descrita por Engvall y Perlman en 1971
• Uno de los inmunorreactivos se absorbe a una fase sólida y el otro se marca con una enzima.
• La enzima reacciona con un sustrato formando un producto coloreado
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Ventajas del ELISAVentajas del ELISAMuy sensibleGran número de muestras procesadas simultáneamente. Resultados rápidosUtilización de reactivos menos tóxicosMenor costoCuantificación de sustancias diversas: hormonas metabolitos toxinasfármacos mediadores de inflamación proteínascitoquinas agentes infecciosos, etc.
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Fundamento del ELISAFundamento del ELISA
Ag o Acfijado a
una fase sólida
Ag o Acen la
muestra
Conjugado:Ac unido a
ENZIMASUSTRATO
CAMBIO DE
COLOR
++ +
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Componentes del ELISAComponentes del ELISAFASE SÓLIDAAntígeno AnticuerpoConjugado: ENZIMASUSTRATO
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SOPORTE SSOPORTE SÓÓLIDOLIDOMaterial del SoporteMaterial del Soporte Formas disponiblesFormas disponibles UniUnióónn
Nitrocelulosa Membranas,Láminas
No covalente
Polivinilo Placas, Láminas Covalente
Poliestireno Placas, Láminas, Perlas
Covalente
Látex, nylon, celulosa y sefarosa
Membranas, Láminas, Perlas
Covalente
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ANTANTÍÍGENOGENO
CompletoExtracto totalFracción PurificadaPéptido sintético
Proteína recombinante
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Anticuerpos Anticuerpos PoliclonalesPoliclonalesHeterogéneosReconocen epítopes diferentes del AgProducidos por numerosos clones de Linfocitos B
Anticuerpos MonoclonalesAnticuerpos MonoclonalesHomogéneosEspecificidad únicaProducidos por un único clon de Linfocitos BDisponibles en cantidades ilimitadas
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MUESTRAMUESTRA
Orina
LCRHecesOtros
Suero
Saliva
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ENZIMASENZIMAS
PeroxidasaFosfatasa alcalinaβ-galactosidasaPenicilinasaUreasaGlucosa oxidasa
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SUSTRATOSSUSTRATOS
Requerimientos del sustratoSolubles en aguaSolubles en aguaFFáácil de manipularcil de manipularNo tNo tóóxicos, no mutagxicos, no mutagéénicosnicosBajo costoBajo costo
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FosfatasaAlcalina
Peroxidasa
ρ-Nitrofenil Fosfato (ρNPP)
5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato /nitro azul de tetrazolium (BCIP / NBT)
Naftol AS-TR posfato /fast red RC
2,2´-azino-bis (3-etilbenziazoline-6-ácido sulfónico)
ο-fenilendiamino (OPD)
3,3´5,5´-tetrametilbencidina base o Dihidrocloruro (TMB)
3,3´-Diaminobencidina (DAB)
3-amino-9-Etilcarbazole (AEC)
4-cloro-1-Naftol (4C1N)
Púrpura
Amarillo
Verde
Naranja
Azul
Marrón
Rojo
Azul
FormaciFormacióón de colores por la accin de colores por la accióón n enzimenzimááticaticasobre diferentes cromsobre diferentes cromóógenosgenos
Rojo
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RevelaciRevelacióón de la actividad n de la actividad enzimenzimááticatica
Incorporación de ácidos o bases fuertes para detener la reacción
La cantidad de producto enzimático formado se determina leyendo la densidad óptica (DO) con un espectrofotómetro
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FASES DEL ELISAFASES DEL ELISA1. Titulación de la cantidad de Ag o Ac a utilizar para
sensibilizar la placa.2. Sensibilización3. Lavado 4. Bloqueo5. Lavado6. Incubación de las placas con las muestras y controles
positivos y negativos7. Lavado 8. Incubación del conjugado 9. Lavado 10.Incubación del sustrato 11.Detenimiento de la reacción enzimática12.Lectura de las placas
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BLOQUEOBLOQUEOBuffer de Buffer de bloqueobloqueo
ComposiciComposicióónn DesventajasDesventajas
Caseína 5% p/v leche sin grasaDeteriora rápidamente.Enmascara algunos antígenos
Caseína/Tween20 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de Tween20
Deteriora rápidamente.Enmascara algunos antígenos
Tween 20 O,2 %de Tween Podría generar algunos residuos
Gelatina Gelatina 0.2% (2mg/ml)
BSA 3% de BSA, Relativamente costoso
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LavadosLavados
Utilizados para separar los componentes unidos de los libres
Generalmente:
De 3 a 6 lavados por cada etapa
Duración de 30 seg a 1 min c/u
Se utiliza Buffer fosfato 0.01 a pH 7,2
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TIPOS DE ELISATIPOS DE ELISA
DIRECTO
INDIRECTO
COMPETITIVO
TIPO SANDWICH
MÉTODO AVIDINA-BIOTINA
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E E E E E E
S S S S S S
E E E E E E
E
S
AntAntíígenogenoBuffer de bloqueoBuffer de bloqueoMuestra (Anticuerpo)Muestra (Anticuerpo)
SustratoSustrato
ELISA INDIRECTOELISA INDIRECTO
Conjugado AnticuerpoConjugado Anticuerpo--EnzimaEnzima
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S
ELISA SANDWICHELISA SANDWICH
Anticuerpo fijado al
pozo
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S
ELISA SANDWICH
lavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
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S
ELISA SANDWICH
lavado lavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
Adición del conjugado
enzima-Anticuerpo secundario
E EE
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S
E EE
S
ELISA SANDWICH
lavado lavadolavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
Adición del conjugado
enzima-Anticuerpo secundario
Adición del sustrato y medición del color
E EE
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S
E EE
S
ELISA SANDWICH
lavado lavadolavado
Anticuerpo fijado al
pozo
Adición de la muestra
con Antígeno a ser medido
Adición del conjugado
enzima-Anticuerpo secundario
Adición del sustrato y medición del color
E EE
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INTERPRETACIINTERPRETACIÓÓN N DE RESULTADOSDE RESULTADOS
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INTERPRETACIINTERPRETACIÓÓN DE RESULTADOSN DE RESULTADOS
Incluir controles:Control del PBS (blanco)Control NegativoControl Positivo BajoControl Positivo Alto
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1/64 AB 1/256 BC 1/1024 CD 1/4096 DE 1/64 EF 1/256 FG 1/1024 GH 1/4096 H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Con
trol
ne
gativ
oC
ontr
ol
posi
tivo
B L
A N
C O
S
Paciente 1 2 3 4 5 876 9 10
19 2011 12 13 14 15 16 17 18Paciente
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REPORTE DE RESULTADOSREPORTE DE RESULTADOS
REPORTE CUALITATIVOPositivoNegativo
REPORTE CUANTITATIVOng o μg/ mlUnidades internacionales de ELISA (EIU)
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REPORTE DE RESULTADOSREPORTE DE RESULTADOS
Pruebas cuantitativas:Empleo de controles negativos, positivos bajos y positivos altos para construir curva de calibración.
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REPORTE DE RESULTADOSREPORTE DE RESULTADOS
Valor mínimo positivo
Promedio de los
Controles Negativos
2 ó 3 Desviaciones
estándar= x
Semicuantitativa
Cut off
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PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA PRUEBAS QUE SE REALIZAN CON LA TTÉÉCNICA DE ELISA EN EL IDICCNICA DE ELISA EN EL IDIC
ANTICUERPOS CONTRA AGENTES INFECCIOSOSToxoplasma Cisticerco AmibasCMV Hepatitis A-B-C Helycobacter pyloriEpstein Barr Rubeola HIV
ANTÍGENOS TUMORALESACE CA125 NSEAPS AFP CA19-9
AUTOANTICUERPOSANA FR ANCAAnticuerpos antitiroideos Anticardiolipinas
PROTEÍNAS PLASMÁTICASPCR
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GRACIASGRACIAS