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Botanisches Institut der Universitat Karlsruhe

Der EinfluB von Stickstoffmangel auf die Lipochinon- und Isoprenoid-Synthese der Chloroplasten von Hordeum vulgare L.

LUDWIG VERBEEK und HARTMUT K. LICHTENTHALER

Mit 7 Abbildungen

Eingegangen am 30. Marz 1973

Summary

The influence of nitrogen deficiency on the lipoquinone and isoprenoid synthesis of chloroplasts of Hordeum vulgare L.

The synthesis of all thylakoid prenyl-lipids is lower during nitrogen deficiency than in normal green cultures. The inhibition observed is of different degree for the individual lipid classes: carotenoids, chlorophylls, prenyl chains, and the isoprenoid lipoquinones. 1. Carotenoid synthesis in nitrogen deficient (-N) and in normal green plants (+ N) is

strongly correlated with chlorophyll synthesis. The synthesis of both lipid classes is regulated with the formation of thylakoids. A specific change of chloroplast metabolism during nitrogen deficiency towards a promotion of the synthesis of the nitrogen-free carotenoids has not been observed.

2. The formation of the isoprenoid plastid-quinones during nitrogen deficiency is much less inhibited than that of carotenoids and chlorophylls. This is equally due for the naphthoquinone K1 and the benzoquinone derivates.

3. On a chlorophyll basis the synthesis of vitamin K1 and of the benzoquinones, plastoquinone-9 (+ hydroquinone) and a-tocopherol (+ a-tocoquinone), is enhanced during nitrogen deficiency. It is assumed that a higher level of endogenous aromatic precursors, as caused by the inhibition of protein synthesis, is responsible for this promotion.

4. During nitrogen deficiency the reduced benzoquinone forms a-tocopherol and plastohydroquinone-9 are synthesized to a higher degree than in the controls. This is an indication for their deposition in the osmiophilic plastoglobuli.

5. On a chlorophyll a basis during nitrogen deficiency there are formed a relative higher portion of chlorophyll b, a lower portion of fJ-carotene, but more xanthophylls, and in the group of lipoquinones somewhat less plastoquinone-9 (+ hydro quinone) and more a-tocopherol (+ a-tocoquinone) than in the controls. It is postulated that a lower concentration of IAA (reduced synthesis of IAA during nitrogen deficiency) is responsible for these synthesis shifts within the lipid classes.

6. Inhibition and promotion of the synthesis of the different prenyl lipids is discussed in connection with their biosynthesis.

Einleitung

5tickstoffarmut bewirkt in der Pflanze eine Reihe von Stoffwechselanderungen. So bleibt das Blattflachenwachstum zuruck (BOUMA and DOWLING, 1966) die Photo-

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syntheseleistung (COz-Aufnahme pro Blattflacheneinheit) wird geringer (THURSTON, 1959; BOUMA, 1970) und nach einer gewissen Mangelzeit werden auch die Chlorophylle abgebaut (SCHURMANN, 1967; BOUMA, 1970). Andererseits wird bei einzelligen Grtinalgen im N-Mangel die Synthese von Sekundarcarotinoiden angeregt und auch der Fettgehalt erhoht (AACH, 1953; DERSCH, 1960; CZYGAN, 1968; SCHURMANN, 1967). Es ware daher denkbar, dag im N-Mangel auch die Gesamtcarotinoidund Gesamtprenylsynthese, die ebenfalls von Acetyl-CoA ausgeht, erhoht ist.

Chlorophylle und Lipochinone mit ihren isoprenoiden Seitenketten gehoren zusammen mit den Carotinoiden zur Gruppe isoprenoider Plastidenlipide (Prenyllipide), die bei Spinat etwa 25-30 Ofo des Gesamtlipidgehaltes der Chloroplasten ausmachen (LICHTENTHALER und PARK, 1963). Phytosterine sind zwar ebenfalls zu den Prenyllipiden zu zahlen, kommen jedoch in Chloroplasten nur in Spuren vor (EICHENBERGER und MENKE, 1966). Aufschlug tiber die Gesamtprenylsynthese der Chloroplasten erhalt man daher durch Bildung der Summe aus Carotinoiden und Prenylketten (Seitenketten der Lipochinone und Chlorophylle). Die bisherigen Untersuchungen zeigten, dag zwischen Thylakoid- und Proteinsynthese und der Bildung der Prenyllipide ein enger Zusammenhang besteht. Entsprechend reduzieren Hemmstoffe der RNA- und Proteinsynthese die durch Licht ausgeloste Bildung von Thylakoiden und Prenyllipiden (BECKER, 1971).

Da der Benzochinon- und Naphthochinonring, wie die aromatischen Aminosauren, tiber den Shikimisaureweg gebildet wird (THRELFALL und WHISTANCE, 1971), konkurrieren im Chloroplasten Lipochinon- und Proteinsynthese um die aromatischen Produkte des Skikimisaureweges. Die nach Abschlug der Blattergrtinung einsetzende Bildung tiberschtissiger Benzochinone (insbesondere Plastohydrochinon-9 und a-Tocopherol) (LICHTENTHALER, 1969 a, 1971), die in den Plastoglobuli abgelagert werden (LICHTENTHALER und WEINERT, 1970), ist auf die Drosselung der Bildung von Thylakoiden zurtickzuftihren, wodurch mehr endogene aromatische Precursor ftir die Lipochinonsynthese zur Verftigung stehen. Entsprechend darf man auch bei Stickstoffmangel und dadurch gestorter Proteinsynthese einen starkeren FluB aromatischer Metabolite in Richtung Lipochinone erwarten.

In der vorliegenden Arbeit wird daher an einer hoheren Pflanze untersucht, ob Stickstoffmangel die Bildung von isoprenoiden Lipochinonen und anderen Prenyllipi den fordert oder hemmt.

Methodik

Die Gerstenkeimlinge (Hordeum vulgare L.) wurden zunachst im Dunkeln auf aqua dest. bei 25° C angezogen und am 4. Tag in den Langtag (16 h Licht, Osram-Fluora-Lampen, 40 W, 4000 Lux) bei 60 Ofo reI. Luftfeuchtigkeit gebracht. Am 6. Tag (= Nullwert der Untersuchung) wurden gleich groBe Pflanzen, deren Wurzeln zu diesem Zeitpunkt gut entwickelt sind, entweder auf eine modifizierte Nahrlosung nach VAN DER CRONE gebracht (Kontrollen) bzw. in eine Nahrlosung ohne NH4N03 (N-Mangelkulturen). Die Pflanzen wurden danach bis 15 Tage auf den entsprechenden Nahrlosungen gehalten und nach 3, 6, 10 und 15 Tagen geerntet. Die volle Nahrlosung hatte folgende Zusammensetzung:

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EinfluB v. Stickstoffmangel a. d. Lipochinon- u. Isoprenoid-Synthese d. Chloroplasten 247

Makronahrstoffe mg/l Spurenelemente mg/l

NH4NOa 500 HaBOa 3,0 K2S04 500 MnS04 2,5 MgS04 . 7H2O 500 Na2Mo04 1,0 CaS04 . 2H2O 500 ZnS04 2,5 Caa(P04)2 500 NaCI 5,0 FeS04 • 7H20 0,5 % 2,2ml (als Fe-EDTA)

Fur die Analyse wurden jeweils 100 Pflanzen (Blatter und SproB) mit Aceton und Petrolbenzin extrahiert. Die Trennung der Prenyllipide erfolgte dunnschichtchromatographisch (HAGER und BERTENRATH, 1966; LICHTENTHALER, 1968). Die Lipochinone und Carotinoide wurden quantitativ nach LICHTENTHALER (1968 a, b) erfaBt und die Chlorophylle nach der Methode von ZIEGLER und EGLE (1965). Die Ergebnisse sind Mittelwerte von mehreren Versuchsserien.

Ergebnisse

Eine vollkommen stickstofffreie Nahrlosung ftihrt in der Regel rasch zu Abbauvorgangen, die Chloroplasten degenerieren, und die Pflanze stirbt abo Will man die Umstellung des Stoffwechsels, d. h. die speziellen Syntheseleistungen der Pflanze im N-Mangel studieren, sollte man der Nahrlosung eine geringe Menge Stickstoff zugeben. IYartiber hinaus ist zu beachten, daB die Analysen nur in dem Zeitraum durchgeftihrt werden, bevor der N-Mangel manifestiert ist und die Abbauvorgange einsetzen.

Gerstenkeimlinge sind jedoch tiber das Endosperm zunachst ausreichend mit Stickstoff versorgt, so daB im Rahmen dieser Untersuchung die Nahrlosung der Mangelkulturen vollkommen nitratfrei gelassen wurde, urn die N-Mangeleffekte zu induziereno Die ohne zusatzlichen Stickstoff angezogenen Hordeum-Keimlinge zeigen noch his zu 21 Tagen ein zwar vermindertes, aber deutliches Wachstum, das sich in Langenzunahme und Erhohung des Chlorophyllgehaltes auBert. Danach horen die Syntheseleistungen auf, die Blatter vergilben.

a) Trockengewicht. Bringt man die auf aqua dest. gekeimten Pflanzen am 6. Tag (Ausgangswert) auf volle bzw. eine stickstofffreie Nahrlosung, so zeigen sich 3 Tage spater (9. Tag) nur geringe Unterschiede im Trockengewicht (Abb. 1). 15 Tage spater (21. Tag) betragt das Trockengewicht der Kontrollen jedoch das 2,3fache jenes der N-Mangelpflanzen. Auch in der SproB- bzw. Blattlange und in der Blattbreite ist der Stickstoffmangel gut zu erkennen (Tab. 1).

b) Chlorophylle. Ahnlich wie beim Trockengewicht bestehen im Gesamtchlorophyllgehalt zwischen Normalkulturen und N-Mangelpflanzen nach 3 Tagen nur geringe Unterschiede. Nach 15 Tagen (21. Tag) weisen die Kontrollen jedoch einen 3,lfach hoheren Chlorophyllgehalt als die Mangelkulturen auf (Tab. 2). Diese Feststellung trifft im Prinzip ftir die beiden Chlorophylle a und b zu (Abb. 2). Wahrend



60 QI N C 40 0 a: !!!. 20 g'

0 0

Trockengengewl chI

P - N ----. _ .... ---_ -.. .. -

6 9 12 16 21d

Aller der Pflanzen

Abb. 1: Zunahme des Trockengewichts von Hordeum-Keimlingen mit normaler Sticks-tOffversorgung (+ N) und in N-Mangelkulturen (-N) .

Tab. 1. MeBdaten von 21 Tage alten Hordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+N) bzw. ohne Stickstoff (-N).

+N -N

SproBHinge 41 mm 19mm Blattbreite 6,5 mm 4mm Trockengewicht 47 mg 21 mg

sich jedoch bei den Kontrollen im Zuge der stark erhohten Chlorophyllsynthese das Verhaltnis Chlorophyll alb in Richtung auf hohere Zahlenwerte verschiebt (2,5 -+

3,8), bleibt es bei den N-Mangel-Pflanzen auf dem Ausgangswert (2,5 -+ 2,6).

QI N

5 5: ~

~

Chlorophyll a .N 300 Chlorophyll b

200

100

O+---~~~~--~~~r-~

o 6 9 12 16 21 d

Alter der Pflanzen

Abb. 2: Synthese von Chlorophyll a und b in Normalkulturen (+ N) und N-Mangelkulturen (-N) von Hordeum vulgare.

Tab. 2. Gehalt an Prenyllipiden in Hordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (-N). Angaben in flg pro Pflanze (x+c = Carotinoide ; a+b = Chlorophylle a und b; Kl = Vitamin K!; Benzochinone = Summe cler hier erfaBten Lipochinone Plastochinon-9 + Hydrochinon und a-Tocopherol + a-Tocochinon) .

Normalkulturen (+ N) N-Mangelpflanzen (- N) Alter Tage der N3:hr- a+b alb x+c Benzo- Kl a+b alb x+c chinone K j

Keim- losung chinone Benzo-lingc

6. O. 28,3 2,5 12,3 5,20 0,12 28,3 2,5 12,3 5,2 0,12 9. 3. 85,2 2,6 18,5 11,95 0,32 77,1 2,6 13,7 9,9 0,32

12. 6. 130,2 2,7 27,0 19,28 0,48 92,3 2,6 15,1 14,12 0,34 16. 10. 267,0 3,1 43,8 28,70 0,65 110,7 2,6 16,9 19,5 0,41 21. 15. 406,0 3,8 73,8 40,30 0,81 129,6 2,6 20,5 25,7 0,52

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c) Carotinoide. Wahrend der Versuchsdauer von 21 Tagen ist in den N-Mangelpflanzen, wie auch bei den Normalkulturen, ein standiger Anstieg des Carotinoidgehaltes zu beobachten (Tab. 2). Allerdings ubertrifft der Carotinoidgehalt der Kontrollen jenen der gleichaltrigen N-Mangelpflanzen urn das 3,6fache. Die verminderte Carotinoidsynthese bei N-Mangel betrifft aile hier erfaihen Einzelcarotinoide (Abb. 3, Lutein und /I-Carotin). Als Folge des N-Mangels zeigt sich eine leichte Verschiebung der Antei!e der einzelnen Carotinoide am Gesamtcarotinoidgehalt (Tab. 3). So

30 30 f)-Carotin Lutein

G) N C 20 2 .2 c: G)

.;;; 10 -N

10 - N =l ------_. -_ .. ---_ .. __ e---

0 0 0 6 9 12 16 21 d 0 6 9 12 16 21 d

Alter der Pflanzen

Abb. 3: Bildung von p -Carotin und Lutein in Hordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (-N).

Tab. 3. Prozentanteil der einzelnen Carotinoide am Gesamtcarotinoidgehalt von Hordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (- N).

Ausgangs- Normalkulturen Mangelpflanzen wert (6d) (+N) (-N)

(16d) (21d) (16d) (21d)

p-Carotin 29,6 35,0 37,5 31,7 31,6 Lutein 37,0 40,6 41,7 38,0 38,7 Violaxanthin 16,1 13,0 11,3 14,1 13,8 Neoxanthin 11,8 6,4 5,1 9,5 10,0 Neoxanthin A 0,9 1,3 1,3 1,6 1,8 Antheraxanthin 3,2 2,2 2,0 2,4 2,1 Luteinepoxid 1,4 1,5 1,1 2,7 2,0 Carotinoide 100,0 0/ 0 100,0 100,0 100,0 100,0

erhoht sich, bezogen auf den Ausgangswert, in den Normalkulturen der Prozentantei! von /I-Carotin (29,6 --+ 37,5) und Lutein (37,0 --+ 41,7) kontinuierlich, wiihrend der Anteil der iibrigen Xanthophylle, insbesondere von Violaxanthin und Neoxanthin, verringert wird. In den N-Mangelpflanzen hingegen verandert sich die Carotinoidzusammensetzung gegeniiber dem Ausgangswert kaum, obwohl sich auch hier eine minimale Verschiebung zugunsten von tJ-Carotin und Lutein andeutet. Die Carotinoidsynthese liefert also im N-Mangel weniger /I-Carotin und Lutein und da-

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fiir in etwas starkerem Mage (nach 21 Tagen zu ca. 9010) die iibrigen starker oxidierten Xanthophylle. Sekundarcarotinoide, die bei Algen auftreten (DERSCH, 1960; CZYGAN, 1968), werden im N-Mangel bei Hordeum nicht gebildet. Die hier beschriebene Tendenz ist deutlich so lange zu erkennen, wie einer Neusynthese von Carotinoiden stattfindet. Setzen hingegen bei manifestem N-Mangel Degenerationserscheinungen ein - bei Hordeum-Keimlingen ist dies nach 25 Tagen der Fall -, so werden neben Chlorophyllen auch Carotinoide, und zwar zunachst iiberwiegend I:]-Carotin abgebaut, so dag es dann zu einer beachtlichen Verschiebung der prozentualen Carotinoidzusammensetzung kommt. Diese praemortalen Abbauvorgange haben aber nichts mehr mit der hier erfagten Umstellung des Stoffwechsels bei verminderter Stickstoffversorgung zu tun.

d) Lipochinone. Die hier erfagten Benzochinonderivate Plastochinon-9, Plastohydrochinon-9, a-Tocochinon und sein Chromanol a-Tocopherol sowie das Naphthochinon Vitamin K1 werden auch bei Stickstoffmangel bis zum 21. Tag neu synthetisiert (Tab. 2, Abb. 4). 1m Gegensatz zu den Carotinoiden und Chlorophyllen, die in den Kontrollen in 3,1- bis 3,6fach hoherer Konzentration vorliegen, ist der Gehalt an Benzochinonen in den Normalkurven 1,57- und jener von Vitamin Kt, nur 1,56mal hoher als in den N-Mangelpflanzen.

Hauptkomponente der Prenylchinone ist das Plastochinon-9, das zusammen mit seinem Hydrochinon im Ausgangswert (6-d-Pflanzen) 73,6010 des Lipochinongehaltes ausmacht. 1m Laufe der Entwicklung der Pflanzen geht bei den Kontrollen, wie auch im N-Mangel, der Anteil von Gesamt-Plastochinon-9 zuriick, wobei sich der Anteil von Gesamt-a-Tocopherol erhoht (Tab. 4). Dariiber hinaus wird in den N-Mangelpflanzen jeweils ein signifikanter, leicht hoherer Anteil an Gesamt-a-Toco-

10 0<-Tocopherol I,D

? O-""""OM ___ .--' /<-~

0,8

" 6 0 . 0' - N

N 0,6 ---~ 0:: - "" ., E -; #. '

it , ,,- 0,' ", .'

!. 0,2 CI ~ 0 0,0

0 9 12 16 21d 0 9 12 16 21d

30 Plastochinon - 9 6 Plastohydrochinon -9

........ _ ..... .. -N .N --0:: 20

P -c -it ;,'~N !. , CI 10 .... - ......... . , ~ _-.-- - N

_ .. . 0 ....... •

0 0 0 6 9 12 16 21d 0 12 16 21d

Alter der Pflanzen

Abb. 4: Bildung von isoprenoiden Benzochinonen in Hordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (-N).


Einflui) v. Stickstoffmangel a. d. Lipochinon- u. Isoprenoid-Synthese d. Chloroplast en 251

Tab. 4. Prozentanteil der einzelnen Prenylchinone am Gesamtlipochinongehalt von HordeumKeimlingen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (- N).

Ausgangs- Normalkulturen Mangelpflanzen wert (6d) (+N) (-N)

(16d) (21d) (16d) (21d)

Vitamin K j 2,3 2,2 2,0 2,1 2,0 Plastochinon-9 60,1 46,7 53,5 37,5 43,2 Plastohydrochinon -9 13,5 18,6 16,0 24,7 20,4 a-Tocopherol 20,7 29,4 26,0 32,4 31,2 a-Tocochinon 3,4 3,1 2,5 3,3 3,2

Lipochinone 100,0 Ofo 100,0 Ofo 100,0 Ofo 100,0 Ofo 100,0 Ofo

Gesamt-Plastochinon-9 73,6 0/0 65,3 69,5 62,2 63,6 (mit Hydrochinon) Gesamt-a-Tocopherol 24,1 Ofo 32,5 28,5 35,7 34,4 (mit IX-Tocochinon)

pherol (+a-Tocochinon) gebildet als in den Kontrollen; entsprechend geringer ist dann der Anteil an Gesamt-Plastochinon-9 (+ Hydrochinon). 1m jeweiligen KcAnteil gibt es zwischen Kontrollen und Mangelpflanzen keine Unterschiede. Weiter ist zu erkennen, dag sich bei den N-Mangelkulturen die reduzierten Benzochinonformen Plastohydrochinon-9 und a-Tocopherol in starkerem Mag anreichern als in den Kontrollen (Tab. 4).

e) Gesamtprenylsynthese. Aus der Summe der Seitenketten von Chlorophyllen und Lipochinonen sowie der Menge an Carotinoiden lagt sich das Ausmag der Prenylsynthese abschatzen. Die Zusammenstellung zeigt, dag die Gesamtprenylsynthese im N-Mangel wesentlich geringer ist als in den Kontrollen (Tab. 5, Absolutwerte). Die verminderte Syntheseleistung der N-Mangelpflanzen betragt aber noch 34,6 Ofo jener der Kontrollen und liegt somit etwas uber der Bildungsrate von Chlorophyll a und Carotinoiden. Bezieht man zu vergleichenden Zwecken auf 100 f-lg Chlorophyll a, so ist die Prenylsynthese im N-Mangel leicht haher als in den Kontrollen. Dies diirfte vorwiegend auf die ca. 2,2fach hahere Synthese an Lipochinonen zuruckzufiihren sein, deren Synthese im N-Mangel gefardert ist (Tab. 5).

Gliedert man in die einzelnen Prenylketten auf (C20-Rest in Phytylrest der Chlorophylle, des K j und im a-Tocopherol, CwRest bei Plastochinon-9 und CwRest bei Carotinoiden), so zeigt sich, dag im Laufe der Entwicklung bei den normal versorgten Pflanzen der Prozent-Anteil der C40 - Karper an der Gesamtprenylsynthese abnimmt, wahrend jener an C20-Karpern (vorwiegend fur Chlorophylle) stark zunimmt (Tab. 5). Diese Tendenz ist auch im N-Mangel zu erkennen, allerdings sinkt hier der prozentuale Anteil der C4o-Ketten starker ab als in den Kontrollen. In den Kontrollen nimmt auch der relative Anteil von C4s-Ketten ab, wahrend er in den N-Mangelpflanzen deutlich ansteigt. Der Prozentanteil der Phytylreste (C20 ) am Gesamtprenylgehalt ist in den Normal- und N-Mangelkulturen hingegen weitgehend gleich.

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252 L. VERBEEK und H. K. LrCHTENTHALER

Tab. 5. Bildung und prozentuale Zusammensetzung von Prenylketten in Hordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (- N). Angaben in fig pro Pflanze bzw. in 010.

Ausgangs-wert

Normalkulturen (+ N) Mangekulturen (-N)

6d 9d 12 d 16 d 21 d 9d 12 d 16 d 21 d

C2o-Ketten:

von Chlorophyll a + b 8,8,ug 26,4 40,8 82,6 126,0 23,9 28,6 34,3 40,1 von Gesamt-a-

Tocopherol 0,7 2,6 4,3 5,9 7,3 2,4 3,3 4,4 5,5 von Vitamin Kl 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,2 0,2 0,2 0,3

Summe der C2o-Ketten 9,6 29,2 45,4 88,9 133,8 26,5 32,1 38,9 45,9

C4s-Ketten: 3,3 6,3 10,2 16,0 23,2 5,3 7,6 10,3 13,7

(von Plastochinon-9)

C 4o-Ketten: 12,3 18,5 27,0 43,8 73,8 13,7 15,1 16,9 20,5

(Carotinoide)

Gesamtprenylketten 25,2 54,0 82,6 148,7 230,8 45,5 54,8 66,1 80,1 (in .ug/Pflanze)

Prozentuale Zusammensetzung:

C2o -Ketten 38,1 010 54,2 55,0 59,8 57,8 58,3 58,6 58,8 57,4 C 4o -Ketten 48,8 010 34,2 32,7 29,5 32,0 30,1 27,6 25,6 25,6 C4s -Ketten 13.2% 11,6 12,3 10,7 10,2 11,6 13,8 15,6 17,0

Gesamtprenylketten 100,0010 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

f) Vergleich der einzelnen Stoffklassen. Will man das Ausmag der Synthese der einzelnen isoprenoiden Stoffklassen (Carotinoide, Chlorophylle, Benzochinone und Vitamin K 1 ) unter Normalanzucht und N-Mangelbedingungen miteinander vergleichen, so bietet sich entweder die Bezugnahme auf 100 fJ,g Chlorophyll a an, oder man betrachtet die jeweiligen Verhaltnisse der einzelnen Stoffklassen zueinander.

In dem Ausgangswert (6 Tage alte Pflanzen) sind pro 100 fJ,g Chlorophyll noch recht hohe Gehalte an Carotinoiden (61 fJ,g) und Benzochinonen (27,5 fJ,g) vorhanden. Dies hangt damit zusammen, daB in den erst en Tagen der Keimung, besonders aber auch bei der hier vorliegenden Dunkelanzucht, bevorzugt Carotinoide und Lipochinone gebildet werden, wahrend die Chlorophyllbildung erst im Licht einsetzt. Bei den Normalkulturen eilt dann im weiteren Verlauf der Pflanzenentwicklung die Chlorophyllsynthese jener der anderen Prenyllipide voraus, wodurch sich bei Bezugnahme auf Chlorophyll a der Anteil von Carotinoiden, Benzochinonen, Vitamin Kl und auch jener von Chlorophyll b erniedrigt (Abb. 5). Dieses Verhalten ist typisch fur wachsendes Blattgewebe und wurde sowohl bei anderen Keimlingen als auch wahrend der Blattentfaltung bei Fagus und Ficus festgestellt (LrcHTENTHALER, 1969 a, 1971).

Auch bei den N-Mangelpflanzen ist, bezogen auf den Ausgangswert, bei Chlorophyll b und den Carotinoiden diese Tendenz zu erkennen. Allerdings ist die Konzentration an Chlorophyll b deutlich hoher als in den Kontrollen. Die Gehalte an

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Einflu£ v. Stickstoffmangel a. d. Lipochinon- u. Isoprenoid-Synthese d. Chloroplasten 253

In Chlorophyll b

60 75

40 50

" 25

O+--~-~~-~-~ 6 9 12 16 21d o 6 9 12 16 21d

.. ;;: 60

Carotonolde Benzochlnone 30

:0.

40 20

.. ___ _ ~_-__ --. N:.;. ~ 10 10 · Vitamin K, _ N -N 20

~ .N 6 9 12 16 21d 6 12 16 21d

Alter der Pflanzen

Abb. 5: Verlauf der Synthese von Prenyllipiden und Prenylketten in Hordeum-Keimlin gen bei Anzucht mit (+ N) und ohne Stickstoff (-N), bezogen auf 100 fig Chlorophyll a.

Tab. 6. Gehalt eug) an Prenyllipiden und Prenylketten in 21 Tage alten H ordeum-Keimlingen bei Anzucht mit (+ N) bzw. ohne Stickstoff (- N ), bezogen auf 100 ,ug Chlorophyll a.

Normal-kulturen

(+ N)

Chlorophyll a 100 Chlorophyll b 27 Carotinoide 23,1 Vitamin K j 0,25 Benzochinone 12,6

Plastochinon-9 6,9 Plastohydrochinon -9 2,1 a -Tocopherol 3,4 a -Tocochinon 0,32

C 2o-Ketten 41,8 C 4o -Ketten 23,1 C45-Ketten 7,2

Gesamtpren ylketten 72,1

Mangel-Kulturen

(-N)

100 38 21,8

0,55 27,3

12,0 5,7 8,7 0,87

48,0 21,8 14,6

85,3

N-Mangel

Normal

1,41 X

2,2 X 2,15 X

1,74 X 2,71 X 2,56 X 2,71 X

1,17 X

2,09 X

1,19 X

Carotinoiden entsprechen etwa jenen der Kontrollen. Das Verhaltnis a + b/x + C

ist also in beiden Fallen etwa gleich. Anders verhalt es sich mit der Bildung der isoprenoiden Benzochinone und des

Naphthochinons Vitamin K j • Der Anteil beider Stoffgruppen nimmt, bezogen auf Chlorophyll a, in den N-Mangelpflanzen im Zuge der Entwicklung nicht ab, son-

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dern kontinuierlich zu, SO dag man direkt von einer Forderung der Kt- und Benzochinonsynthese im Stickstoffmangel sprechen kann (Abb. 5). Die Forderung ist fur Naphtho- und Benzochinone etwa gleich stark (nach 21 Tagen ca. 2,2, Tab. 6). Entsprechend bleibt auch das Verhaltnis Benzochinone/Kt in den Kontrollen und Mangel pflanzen gleich. Die Forderung ist hierbei fur das Plastohydrochinon-9 starker als fiir seine oxidierte Form (Tab. 5). Druckt man die verminderte Syntheseleistung der N -Mangelpflanzen in Prozent jener der Kontrollen (= 100 %) aus, so erhalt man nach 21 Tagen fUr Chlorophyll a eine Syntheseleistung von nur 29,4 %, fUr Chlorophyll b von 41,40./0, fur Carotinoide von nur 27,8 %, fur die Naphtho- und Benzochinone hingegen die relativ hohen Werte von 64,3 und 63,7 %.

Diskussion

Aile im Rahmen dieser Arbeit erfagten Prenyllipide sind funktionelle Bestandteile der photochemisch aktiven Thylakoide. Chlorophylle und Carotinoide sind quantitativ und das Naphthochinon Vitamin Kt zu wenigstens 95 Ofo in den Thylakoiden, an Protein gebunden, lokalisiert. Entsprechend bestehen in normal grunen Pflanzen zwischen Chlorophyll-, Carotinoid- und Kt-Synthese eindeutige Korrelationen. Bel der Blattenfaltung oder Blattergriinung werden die drei Stoffgruppen, immer in bestimmtem Verhaltnis zueinander, aber nur so lange angereichert, wie auch noch Thylakoide gebildet werden (LrcHTENTHALER, 1969 a, 1971). Beim Abbau von Thylakoiden, z. B. bei der Chloroplastendegeneration oder der Entwicklung von Chromoplasten aus Jungchloroplasten, werden hingegen Carotinoide (Primargarnitur), Vitamin Kt und die Chlorophylle nicht mehr neu gebildet, sondern sukzessive abgebaut (LrcHTENTHALER, 1968 b, 1969 b). Die Bildung dieser Prenyllipide wird also eindeutig im Zusammenhang mit der Thylakoidsynthese reguliert. Bei normal ernahrten grunen Pflanzen ist daher die Hohe der Vitamin Kt-, Carotinoid- oder Chlorophyllsynthese ein ungefahres Mag fur die Menge neugebildeter Thylakoide.

Anders verhalten sich jedoch die isoprenoiden Benzochinonoderivate der Chloroplasten. Plastochinon-9, sein Hydrochinon, a-Tocochinon und a-Tocopherol sind zwar ebenfalls in Thylakoiden lokalisiert, werden jedoch daruber hinaus zusatzlich in den osmiophil en Plastoglobuli des Plastidenstroma deponiert, die vorzugsweise die reduzierten Benzochinonformen a-Tocopherol und Plastohydrochinon-9 enthalten (LrcHTENTHALER und WEINERT, 1970). Die Bildung dieser Prenylbenzochinone ist nicht eindeutig mit der Thylakoidsynthese reguliert, sondern lauft nach AbschluB der Blattergrunung weiter, wahrend der Gehalt an Carotinoiden, Vitamin K t und Chlorophyllen dann auf einem konstanten Pegel gehalten wird (LrcHTENTHALER, 1969 a, 1971). Allerdings sind auch hier Unterschiede zu erkennen. So liefert die Benzochinonsynthese wahrend der Thylakoidsynthesephase etwas mehr Plastochinon-9 (+ Hydrochinon), bei gestorter Thylakoidsynthese (Etiolement, Chromoplastenentwicklung) hingegen einen hoheren Anteil an a-Tocopherol (+ a-Tocochinon) (LrcHTENTHALER, 1969 b).

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Die Untersuchungen bei Stickstoffmangel zeigen, daG die Synthese aller hier erfaG ten Prenyllipide gegenuber jener der Kontrollen reduziert ist. Die Hemmung betrifft Chlorophylle und Carotinoide etwa gleichermaGen, jedoch wesentlich starker als die Bildung del' Plastidenchinone. Da bei N-Mangel vielfach die Fettsynthese erhaht ist und der Carotinoidbaustein Isopentenylpyrophosphat, ahnlich wie Fettsauren, aus Acetyl-CoA unter Verbrauch von ATP und NADp· H2 gebildet wird, hatte man im N-Mangel gegebenenfalls eine verstarkte Bildung von Carotinoiden erwarten kannen. Dies ist jedoch nicht der Fall. Das AusmaG der Carotinoidsynthese wird vielmehr durch die Hahe der Chlorophyllbildung bestimmt. Diese Korrelation zeigt, daG auch im N-Mangel die Bildung der Carotinoide, wie jene der Chlorophylle, streng mit der Thylakoidsynthese reguliert wird.

Die Hemmung der Chlorophyllsynthese im N-Mangel ist verstandlich, da Stickstoff weder fur die Bildung des Porphyrinringes noch fur die Bildung von Thylakoidprotein, an das die Chlorophylle gebunden werden, in ausreichendem MaGe zur Verfugung steht. Die Bildung des Phytylrestes, der im N-Mangel verstarkt in Vitamin K1 und a-Tocopherol eingebaut wird, ist jedenfalls nicht ausschlaggebend fur die reduzierte Chlorophyllsynthese. Desgleichen kann auch die Hemmung der Carotinoidsynthese nicht in einer Starung der Prenylsynthese liegen, da die Lipochinone mit ihren C2o-Seitenketten im N-Mangel verstarkt gebildet werden. Durch N-Mangel scheint vielmehr in der Biosynthesekette der Carotinoide die Bildung jenes Enzyms, das zwei Molekule Geranyl-geranyl-pyrophosphat zu Phytoen dimerisiert, blockiert zu sem (vgl. Abb. 6). An spaterer Stelle in der Biosynthesekette der Carotinoide

Isopentenyl -®-®

~ J. Drmer:sierung

Geranyl - Geranyl -®-®" •

1 ~ IN-Jangell

Phytyl-®-® I~ •

1 ~

I

Carotin aide (C40l

Chlorophylle

Vitamin Kl_

",-Tocop'herol

1 ex.-Tocochinon

C45 Solanesyl-®-® -----+. Plastochinon-9

Abb. 6: Bildung von Prenyllipiden in Hordeum-Keimlingen bei Stickstoffmangel.

kann die Hemmung nicht liegen, da in den N-Mangelkulturen weder Phytoen nach Phytofluen oder andere biogenetische Vorstufen von p-Carotin aufgefunden werden.

Bezogen auf Chlorophyll a, das im N-Mangel wie in Kontrollen ein ungefahres MaG fur die Thylakoidsynthese darstellt, ist die Bildung von K1 und den Benzochinonen im Stickstoffmangel eindeutig gefardert. Diese Farderung durfte vorwiegend



darauf zuruckzufiihren sein, dag im N-Mangel wegen der reduzierten Proteinsynthese weniger aromatische Aminosauren wie Phenylalanin und Tyrosin gebildet werden und daher mehr aromatische Vorstufen, insbesondere Hydroxylphenylpyruvat, fur die Benzochinonsynthese zur Verfugung stehen (Abb. 7). Die vorliegende Untersu-

Zuckerstoffwechsel Proteine PEP. Erythrose - 4 P 1

1 IN - Mangelf-. I'

< Phenylpyruvat • , Phenylalanin ---> Zimtsaure

Sh,k,m,saure 1 1 1 j Hydroxyphenylpyruvat.....--..... Tyrosin ---+ p-Cumarsaure

.c4 (?) 1 ~i 1 1,4 - Narthochinon Homo7ins~ Proteine 1 Desmethylvitamin K1 Plastohydro· IX. Tocopherol Anthocyane 1 chinT

9

. 1 Vitamin K1 Plastochinon-9 cx:- Tocochinon

Abb. 7: Schematische Darstellung der Biosynthese von Lipochinonen und Anthocyanen (nach LICHTENTHALER, 1972).

chung zeigt somit, dag die Synthese der lipophilen Naphtho- und Benzochinone in Chloroplasten uber eine Substratversorgung der an der Biosynthese beteiligten Enzyme reguliert wird. Da letztere bei N-Mangel starker gesattigt sind, fuhrt dies zu der beobachteten hoheren Lipochinonsynthese. In diesem Zusammenhang ist von Interesse, dag auch eine Futterung von Gerstenkeimlingen mit Shikimisaure, Phenyl alan in oder Tyrosin (Applikation uber die Wurzel) zu einer Forderung der Lipochinonsynthese in Plastiden fuhrt (LICHTENTHALER, 1972). Ein ahnlich starkerer Metabolitflug aromatischer Vorstufen in Richtung Zimtsauren wird auch als Grund fur die im N-Mangel gesteigerte Anthocyansynthese angenommen (KRAUSE und REZNIK, 1972).

Nicht zu erklaren ist, weshalb im N-Mangel neb en den isoprenoiden Benzochinonen auch die Bildung des Naphthochinons Kl gefordert ist, dessen Synthese in normalgrunen Pflanzen korreliert mit jener der Chlorophylle und Carotinoide ablauft. Die Biosynthese von Kl verlauft tiber Shikimisaure, an die sehr wahrscheinlich ein CrKorper unter Bildung des Naphthochinons angelagert wird (vgl. Abb. 7). Die Forderung der K 1-Synthese durfte daher einerseits auf die hohere endogene Konzentration an Shikimisaure zuruckzufuhren sein und andererseits aber auch auf ein verstarktes Angebot an C- (oder Ca-)Korpern, die unter Normalbedingungen fur die Synthese von Aminosauren benutzt werden.

Neben den vorgenannten Effekten hat N-Mangel innerhalb der einzelnen Stoffklassen auch spezifische Wirkungen auf die Bildung der Einzelkomponenten. So liefert die Chlorophyllsynthese im N-Mangel relativ mehr Chlorophyll b als a, die Ca-

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Einflufl v. Stickstoffmangel a. d. Lipochinon- u. Isoprenoid-Synthese d. Chloroplasten 257

rotinoidsynthese mehr Xanthophylle als p-Carotin und die Benzochinonsynthese einen hoheren Anteil an a-Tocopherol (+ a-Tocochinon) als Gesamt-Plastochinon-9. Bei so vielen Einzelleistungen ist die Frage zu stellen, wodurch diese Verschiebungen innerhalb der Lipidgruppen ausgelost werden. Denkbar ware, daB sie auf eine geringere Konzentration an P-lndolessigsaure (IES) in den N-Mangelpflanzen zuriickzufiihren sind, da IES gerade die umgekehrten Effekte bewirkt, wie N-Mangel. So erhoht zusatzliches lES-Angebot bei Raphanus-Keimlingen die Syntheserate aller hier erfaBten Prenyllipide, wobei mehr Chlorophyll a als b, ein hoherer Anteil an Plastochinon-9 gegeniiber Tocopherol (+ a-Tocochinon) gebildet wird und bei den Carotinoiden ein hoherer Anteil an p-Carotin (STRAUB und LICHTENTHALER, 1973). DaB die Bildung des stickstoffhaltigen Phytohormons lES im N-Mangel gehemmt ist, darf als sicher angenommen werden.

lm Zusammenhang mit der Forderung der Lipochinonsynthese im N-Mangel ist die Frage zu stellen, wo in Chloroplasten die Lipochinone deponiert werden. Ein kleinerer Teil von allen Prenylchinonen ist ohne Zweifel entsprechend ihrer Funktion auch im N-Mangel in den photochemisch aktiven Thylakoiden enthalten. Der Rest, sehr wahrscheinlich der iiberwiegende Teil, diirfte in den osmiophilen Plastoglobuli lokalisiert sein. Hierfiir spricht einerseits die Beobachtung, daB N-Mangel die reduzierten Benzochinonformen a-Tocopherol und Plastohydrochinon-9, die Hauptkomponenten der Plastoglobuli, gebildet werden. Andererseits wurde bei Impatiens balsamina nachgewiesen, daB im N-Mangel sich die GroBe und Anzahl der Plastoglobuli erhohen (TEVINI, 1971).

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft danken wlr fUr die Unterstutzung dieser Untersuchungen.

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Prof. Dr. HARTMUT K. LICHTENTHALER, Botanisches Institut (Pflanzenphysiologie), D-75 Karlsruhe, Kaiserstr. 12.

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