vergleichende untersuchungen an chloroplasten, die durch...

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Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Vergleichende Untersuchungen an Chloroplasten, die durch Isolierungs-Operationen in nicht-wäßrigem und in wäßrigem Milieu erhalten wurden

I I . Kritik der Reinheit und Ferment-Lokalisationen in Chloroplasten

V o n U L R I C H H E B E R

Aus dem Institut für Landwirtschaftliche Botanik der Universität Bonn (Direktor: Prof. Dr. H. ULLRICH)

(Z . Naturforschg. 15 b , 100—109 [1960] ; e ingegangen am 30. Oktober 1959)

Auf dem Wege über Enzymbestimmungen an Chloroplasten und der Gesamtzelle läßt sich die Ver-unreinigung aus nicht-wäßrigem Milieu isolierter Chloroplasten mit Cytoplasmaprotein ermitteln. Sie belief sich bei sorgfältiger Reinigung der Chloroplasten auf 6 Prozent. Unter Berücksichtigung der Verunreinigung ergibt sich ein Chloroplastenanteil am Gesamtprotein von 55 — 60% (vgl. den voran-gegangenen Beitrag). Da bei Isolierung von Chloroplasten aus wäßrigem Milieu nur 25 — 35% erhal-ten wurden, müssen bei diesem Verfahren bis zu 50% der Chloroplasten-Proteine durch Auswaschen verlorengegangen sein. Die Gefahr des Auswaschens ist bei verschiedenen Enzymen unterschiedlich groß: So wird Aldolase wenig von einem Auswaschungsverlust betroffen, während die Aktivität der Äpfelsäuredehydrogenase bei der Isolierung um mehr als 90% zurückging. Infolge der Verlustmög-lichkeit durch Auswaschen läßt sich der tatsächlich in den Chloroplasten lokalisierte Anteil der unter-suchten Fermente an der Gesamtaktivität der Zelle nur an Chloroplasten bestimmen, die aus nicht-wäßrigem Milieu isoliert wurden. Diese Bestimmung wurde für acht untersuchte Fermente vorgenom-men : Ein hoher Anteil des Aldolase-Gehaltes, etwa 50% der Gesamtaktivität der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, 30% der Aktivität der Äpfelsäuredehydrogenase und 10—20% der Glutaminsäure-decarboxylase- und Katalase-Aktivität sind in den Chloroplasten lokalisiert, während Glutaminsäure-dehydrogenase, Pyruvatkinase und Glutamat-Pyruvat-Transaminase dort wahrscheinlich nicht vor-kommen.

Im vorangegangenen Beitrag wurde, abhängig von der angewandten Isolierungsmethode der Chloro-plasten, gefunden, daß der Anteil des Chloroplasten-proteins am Gesamtprotein etwa 3 0 bzw. 6 0 % be-trug. Der zweite Wert wurde auf Grund von Unter-suchungen an Chloroplasten erhalten, die aus nicht-wäßrigem Medium isoliert wurden. Er erscheint den tatsächlichen Verhältnissen weit besser angenähert als der erste Wert, doch ist er insofern noch unsicher, als die verwandten Chloroplasten durch Cytoplasma verunreinigt sein können. Die Höhe einer Verunrei-nigung läßt sich über Fermentbestimmungen fest-legen, wie im folgenden gezeigt werden soll. Gleich-zeitig geben diese Einblicke in die Verteilung von Enzymen innerhalb der Zelle.

Methodik

1. M a t e r i a l

Zur Untersuchung kamen — wie im vorangegangenen Beitrag — Blätter von Winterweizen und der Saubohne.

2. I s o l i e r u n g v o n C h l o r o p l a s t e n ,

P r o t e i n - u n d C h l o r o p h y l l b e s t i m m u n g e n Die Isolierung von Chloroplasten wurde in wäßrigem

und in nicht-wäßrigem Milieu durchgeführt. Zur Ferment-bestimmung wurden die Chloroplasten im allgemeinen

in 0,05-m. Tris-Puffer, ph 7,5 suspendiert. Protein-bestimmungen erfolgten nach K j e l d a h l , Chlorophyll-bestimmungen nach ARNON 1. (Zur näheren Methodik vgl. den vorangegangenen Beitrag.)

3. G e w i n n u n g v o n „ G e s a m t - P r o t e i n u

Frische Blätter wurden mit dem Doppelten ihres Ge-wichtes an 0,05-m. Tris-Puffer, ph 8,5 homogenisiert, das Homogenisat 15 Min. bei 2000 g zentrifugiert und die überstehende grüne Lösung zu den Fermentbestim-mungen verwendet. Sie enthält je nach Art und Alter der verwendeten Blätter zwischen 70 und 95% des Ge-samtproteins der Blätter.

Gefriergetrocknete Blätter wurden in ganz analoger Weise aufgearbeitet, jedoch unter Verwendung von ent-sprechend mehr Puffer. Vor der Proteinextraktion wur-den sie jedoch einer ganz ähnlichen Behandlung unter-zogen wie das Blattmaterial, aus dem Chloroplasten ge-wonnen wurden, um vergleichbare Verhältnisse zur Chloroplastengewinnung zu schaffen: Die Blätter wur-den mit CCl4/Petroläther im Verhältnis 70/30 homo-genisiert, alle Festbestandteile nach einigem Stehen in der Mischung unter Zugabe von weiteren 40 Teilen Petroläther sedimentiert und getrocknet. Erst dieses Trockenpulver wurde zur Proteinextraktion verwandt. Die resultierenden Eiweißlösungen enthielten etwa 55% des Gesamtproteins der Blätter. Ein erheblicher Teil des Proteins ist also durch die Gefriertrocknung und an-schließende Behandlung mit organischem Lösungsmittel unlöslich geworden. Dies ist im wesentlichen bei Gerüst-eiweißstoffen, und zwar bei Lipoproteiden der Fall, nicht

1 D. J. ARNON, Plant Physiol. 24, 1 [1949].

jedoch bei den von uns untersuchten leicht löslichen Fer-mentproteinen.

4. I s o l i e r u n g v o n „ C y t o p l a s m a " - E i w e i ß

Eine Gewinnung von einigermaßen reinem Cyto-plasmaprotein aus Blättern in einem wäßrigen Medium erscheint uns nicht möglich, obwohl verschiedentlich auf solche Art gewonnene Extrakte als Cytoplasmaprotein bezeichnet worden sind. Zwar läßt sich aus Homogenisa-ten bei hoher Zentrifugalbeschleunigung leicht alles grüne Protein sedimentieren, doch enthalten nach unse-ren Erfahrungen alle resultierenden Lösungen beträcht-liche und unkontrollierbare Mengen lösliches, ungefärb-tes Chloroplastenprotein.

An Cytoplasma angereicherte Fraktionen erhielten wir dagegen mit Sicherheit, wenn wir bei der Isolie-rungsoperation der Chloroplasten im nicht-wäßrigen Milieu die ersten sedimentierten Fraktionen sammelten. Sie enthielten etwa 10% Zellwandbestandteile, 10% Pro-tein und 80% leicht lösliche niedermolekulare Stoffe, die offenbar vorwiegend Vakuolenbestandteile darstellen. Die Verunreinigung mit Chloroplastenprotein war aus dem Chlorophyllgehalt des so erhaltenen „Cytoplasma"-Proteins und dem Chlorophyll/Protein-Quotienten der isolierten Chloroplasten zu errechnen. Je nach Verwen-dung verschiedener Fraktionen schwankte der Chloro-phyllgehalt zwischen 1,0 und 1,2% gegenüber dem durch-schnittlichen Chlorophyllgehalt des mit organischem Lösungsmittel behandelten Gesamtproteins von 3,6 Pro-zent. Das erhaltene Protein ist also keineswegs frei von Chloroplasten-Proteinen, doch können an ihm vorgenom-mene Fermentbestimmungen zur Kontrolle der Ferment-gehalte des Cytoplasmas herangezogen werden, die aus Bestimmungen an Chloroplasten und am Gesamtprotein errechnet wurden.

5. F e r m e n t b e s t i m m u n g e n

Es wurde das Vorkommen und die Verteilung folgen-der Fermente untersucht: Katalase, Glutaminsäure-decarboxylase, Glutaminsäuredehydrogenase, Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Glutamat-Pyruvat-Transamin-ase, Aldolase, Pyruvatkinase und Äpfelsäuredehydro-genase. Zur Bestimmung der ersten beiden Fermente wurde die manometrische Meßmethodik herangezogen. Im Gegensatz zu bestehenden Bedenken 2 wurde diese zu reproduzierbaren Werten führend befunden, sofern Eich-kurven aufgenommen wurden: Der Gasausstoß der Fer-mentreaktion ist nicht proportional der Fermentkonzen-tration. Auf eine Bestimmung der Fermentkonzentration in üblichen Einheiten wurde kein Wert gelegt, da rela-

2 A. C . M A E H L Y and B. CHANCE , Methods of Biochemical Ana-lysis I, 357, New York 1954.

3 F . BRUNS , Biochem. Z . 3 2 5 , 1 5 6 [ 1 9 5 4 ] . 4 O . W A R B U R G U. W . CHRISTIAN , Biochem. Z . 3 1 4 , 1 4 9 [ 1 9 4 3 ] . 5 G . BEISENHERZ, H . J . BOLTZE, T H . BÜCHER, R . CZOCK, K . H .

GARBADE, E . M E Y E R - A R E N D T u. G . PFLEIDERER, Z . Natur-forschg. 8b , 555 [1953].

6 B. CHANCE and A. C . M A E H L Y , Methods in Enzymology I I ,

764, New York 1955.

tive Werte für unsere Zwecke genügten und es vorteil-haft schien, eine möglichst einheitliche Definition der Fermentaktivität zu finden. So legten wir als Einheit der Fermentkonzentration im manometrischen Test einen Gasausstoß von 1 mm3 in 100 Sek. bei 25 °C fest. Alle weiteren untersuchten Fermente wurden auf photometri-schem Wege, und zwar mit Ausnahme der Aldolase, deren Bestimmung nach B R U N S 3 erfolgte, im optischen Test nach W A R B U R G und C H R I S T I A N 4 bestimmt. Als Ein-heit definieren wir bei diesen Bestimmungen nach BEI-SENHERZ und B Ü C H E R 5 die Enzymmenge, die die DPN-H-Extinktion in 100 Sek. bei 340 m/u um 0,188 ändert. Unter spezifischer Aktivität verstehen wir die Enzym-menge in Einheiten pro Gramm Protein: Die erhaltene Enzymaktivität wird auf die Gewichtseinheit Protein be-zogen, die in den Blättern vor der Extraktion vorhan-den war, bzw. auf die Gewichtseinheit Chloroplasten-protein ohne Rücksicht darauf, welcher Anteil dieses Eiweißes löslich ist. Das erscheint insofern gerechtfertigt, als alle untersuchten Enzyme leicht löslich sind, während der tatsächlich extrahierbare Anteil des Gesamtproteins mit dem Alter der Blätter und mit der Extraktions-methode nicht unbeträchtlich schwankt.

Im einzelnen wurde die Bestimmung der Fermente unter den bei den folgenden Autoren angegebenen Be-dingungen vorgenommen: Katalase nach C H A N C E und M A E H L Y 6, Glutaminsäuredehydrogenase nach O L S O N und A N F I N S E N (Methode 2 ) 7 , Glutamat-Oxalacetat-Trans-aminase nach L A D U E und Mitarbb. 8, Glutamat-Pyruvat-Transaminase nach F R A N K E N 9, Pyruvatkinase nach B Ü C H E R und P F L E I D E R E R 10, Äpfelsäuredehydrogenase nach M E H L E R und Mitarbb.11 sowie Aldolase nach B R U N S 3 .

Glutaminsäuredehydrogenase wurde folgendermaßen bestimmt: Im Hauptraum eines W a r b u r g - Gefäßes befinden sich in 3,6 ml Wasser 6 / /Mole M g S 0 4 , 100 / /Mole Phosphat, ph 6,0, und Ferment, im Seiten-arm 800 / /Mole Glutamat, ph 6,0, in 0,4 ml Wasser. Nach der Gleichgewichtseinstellung bei 25 °C wird die Reaktion durch Überkippen des Glutamats eingeleitet und der C02-Ausstoß gemessen.

Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte zweier oder mehrerer Bestimmungen. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ist in Anbetracht der z. T. umständlichen Aufarbeitung gut, doch ist es wichtig, darauf zu achten, daß beim Arbeiten mit Pflanzenmaterial im wäßrigen Medium der pu-Wert nicht unter 7,0 sinkt, da dann unter Umständen beträchtliche Fermentverluste ein-treten. Die Streuung der einzelnen Werte betrug im all-gemeinen unter + 5%, während bei der Aufarbeitung verschiedener Proben desselben Blattmaterials Schwan-

7 J. A . OLSON u. C. B. ANFINSEN , J. biol. Chemistry 197, 67 [1952].

8 J. S. LADUE, F . WROBLEWSKI U. A . KARMEN, Science [Wa-shington] 120, 497 [1954].

9 F . H. FRANKEN, Klin. Wschr. 35,1203 [1957]. 1 0 T H . BÜCHER and G . PFLEIDERER, Methods in Enzymology I,

435, New York 1955. 1 1 A . H. MEHLER, A . KORNBERG, S. GRISOLIA U. S. OCHOA , J. biol.

Chemistry 174, 961 [1948].

kungen um ± 1 0 % auftraten. Bei den manometrisch be-stimmten Enzymen muß allerdings mit einer größeren Streuungsbreite, etwa 10 — 20%, geredinet werden.

Ergebnisse

Über die Fermentausstattung der Chloroplasten existieren nur beschränkte und sich z. T. widerspre-chende Angaben (Sammell i teratur 1 2 - 1 6 ) . Alle Be-funde gründen sich auf die Untersuchung von Chlo-roplasten, die aus wäßrigem Milieu isoliert wurden. Eine Ausnahme macht lediglich die kürzlich erschie-nene Arbeit von STOCKING 17, der nach Isolierungs-Operationen in einem organischen Medium beträcht-liche Mengen Phosphorylase und Aldolase in den Chloroplasten finden konnte. Beide Fermente waren vordem lediglich in der Cytoplasmafraktion fest-gestellt worden.

Um nun den Erhaltungszustand der Chloroplasten zum Zwecke einer Beurteilung der verschiedenen Iso-lierungsverfahren vergleichen zu können, wählten wir einige Fermente des Aminosäure-Stoffwechsels, des Kohlenhydrat-ab- und aufbaues und der End-oxydation zur Untersuchung aus.

Gleichzeitig sollten die Fermentbestimmungen die Möglichkeit geben, die Größe einer Verunreinigung

1 2 T . E . W E I E R U. C . R . STOCKING, B o t . R e v . 1 8 , 1 4 [ 1 9 5 2 ] , 13 D. R. GODDARD U. H. A. STAFFORD, Annu. Rev. Plant. Phy-

siol. 5, 115 [1954]. 14 R. LUMRY , D. J. SPIKES U. H. EYRING , Annu. Rev. Plant Phy-

siol. 5, 271 [1954].

der aus organischem Medium isolierten Chloropla-sten mit Cytoplasmaprotein zu bestimmen. Dazu mußte unter den untersuchten Fermenten wenigstens eines sein, das in vivo nicht in den Chloroplasten vorkommt: Der Gehalt an diesem Ferment ist ein Maß der Verunreinigung mit Cytoplasma. Nun ist leider nichts Sicheres darüber bekannt, welche Fer-mente nicht in den Chloroplasten zu finden sind, da die bisherigen Angaben mit erheblicher Reserve be-trachtet werden müssen. Dies geht aus den Befunden des vorangegangenen Beitrages hervor, nach denen bei der üblichen Isolierung der Chloroplasten in wäß-rigem Milieu mit sehr erheblichen Auswaschungs-verlusten gerechnet werden muß. Es ist jedoch wahr-scheinlich, daß sich wenigstens unter den Fermenten des Kohlenhydratabbaues eines befindet, das in den Chloroplasten nicht vorkommt. Der Kohlenhydrat-abbau ist ja bekanntlich größtenteils in den Chon-driosomen lokalisiert.

In den Tab. 1 bis 8 sind Ergebnisse von Ferment-bestimmungen an Blatthomogenisaten (am Gesamt-protein), an isolierten Chloroplasten und z. T. auch an der „Cytoplasma"-Fraktion zusammengefaßt. Die spez. Aktivität an den einzelnen Enzymen ist dabei in Einheiten pro Gramm Protein ausgedrückt. Aus

1 5 W . VISHNIAC, B . L . HORECKER U. S . OCHOA , Advances in Enzymol. XIX, 1 [1957].

1 6 N . M. SISSAKIAN, Advances in Enzymol. XX, 201 [1958], 1 7 C . R. STOCKING, Plant Physiol. 34, 56 [1959].

Bezeichnung des Materials

des Gesamt-proteins

[E]

Spezifische Aktivität des Chloroplasten-

proteins

[E]

des Cytoplasma-proteins

(errechnet) [E]

Anteil des Chloro-plastenproteins

am Gesamtprotein [ % ]

A. F r i s c h e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o nen im w ä ß r i g e n M i l i e u Vicia faba

I junge Blätter 396000 60000 570000 34 Winterweizen

III Blätter 3 Wochen alt 555000 10000 740000 25,8 B. G e f r i e r g e t r o c k n e t e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n in org . M e d i e n Vicia faba

I junge Blätter 38400 16500 70000 59 Winterweizen

III Blätter 3 Wochen alt 122000 15700 314000 60 IV Blätter 4 Wochen alt 135000 64000 260000 63,8 V Blätter 8 Wochen alt 220000 66500 435000 58

Tab. 1. Die spez. Aktivität der Katalase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein. Die Vorbereitung des zur Analyse kommenden Materials erfolgte hier wie in den folgenden Tabellen

teils lediglich im wäßrigen Milieu, teils nach Gefriertrocknung in Petroläther/Tetrachlorkohlenstoff und anschließend im wäßrigen Milieu.


des Gesamt-proteins

[E]

Spezifische Aktivität des Chloroplasten-

proteins

[E]


(errechnet) [E]

Anteil des Chloro-plastenproteins

am Gesamtprotein [ % ]

A. F r i s c h e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n im w ä ß r i g e n M i l i e u Winterweizen

I I I 3 Wochen alt 860 0 1160 25,8 B. G e f r i e r g e t r o c k n e t e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n in org . M e d i e n Winterweizen

I I I 3 Wochen alt 820 185 1770 60 IV 4 Wochen alt 870 333 1820 63,8 V 8 Wochen alt 665 320 1200 58

Tab. 2. Die spez. Aktivität der Glutaminsäuredecarboxylase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein.

Spezifische Aktivität Anteil des

Bezeichnung des Prot, der Chloroplasten-

Bezeichnung des Gesamt- des Chloro- „Cytoplasma"- des Cytoplasma- proteins am des Materials proteins plastenproteins Fraktion, proteins Gesamtprotein

korrigiert * (errechnet) [E] [E] [E] [E] [%]

A. F r i s c h e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n im w ä ß r i g e n M i l i e u Vicia faba

I junge Blätter 2800 98 — 4200 34 I I a alte Blätter 7600 130 — 11400 34

Winterweizen III 3 Wochen alt 7300 185 — 9800 25,8

B. G e f r i e r g e t r o c k n e t e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n in o r g . M e d i e n Vicia faba

I junge Blätter 1300 1150 — 1510 59 I I a alte Blätter 3080 3100 3000 3050 64,5 I I b alte Blätter 2440

Winterweizen I I I 3 Wochen alt 3050 1850 4000 4900 60

Tab. 3. Die spez. Aktivität der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein.

* Vgl. Text S. 103.

tion erhaltenen und unter Berücksichtigung der Chloro-plasten-Verunreinigung korrigierten Fermentgehalte dienten zur gelegentlichen Kontrolle der aus den Wer-ten des Gesamt- und Chloroplastenproteins errechneten Cytoplasmaaktivitäten.

Die Ermittlung der spez. Aktivität des Cyto-plasmas aus Fermentbestimmungen am Gesamtpro-tein und an der „Cytoplasma"-Fraktion führte im allgemeinen zu befriedigend übereinstimmenden Werten. Wesentliche Abweichungen sind lediglich in je einem Falle bei der Glutaminsäuredehydrogenase (Tab. 5) und der Äpfelsäuredehydrogenase (Tab. 8 ) festzustellen. Speziell bei der Glutaminsäuredehydro-genase sind dafür wahrscheinlich Schwierigkeiten der Bestimmung verantwortlich zu machen, auf die noch eingegangen wird.

diesen Daten ist die spez. Aktivität des Cytoplasma-proteins errechnet worden.

Die Berechnung ging im einzelnen folgendermaßen vor sich: Wenn v die spez. Aktivität des Chloroplasten-proteins und w diejenige des Gesamtproteins sind, so errechnet sich die spez. Aktivität des Cytoplasmapro-teins x bei Kenntnis des prozentualen Chloroplasten-anteils z am Gesamtprotein nach der Gleichung

100 w — v z 1 0 0 - 2 = X '

Ganz analog läßt sich auch die spez. Aktivität des Cytoplasmaproteins aus den bei der Analyse der „Cyto-plasma"-Fraktion erhaltenen Daten unter Berücksichti-gung der Verunreinigung mit Chloroplastenprotein er-halten. Diese läßt sich aus den Chlorophyllgehalten ent-nehmen. Die aus der Analyse der „Cytoplasma"-Frak-

Bezeichnung des Materials des Gesamt-

proteins

[E]

Spezifische

des Chloro-plastenproteins

[E]

Aktivität

des Prot, der „Cytoplasma"-

Fraktion, korrigiert*

[E]


(errechnet) [E]

Anteil des Chloroplasten-

proteins am Gesamtprotein

[ % ]

A. Fr Vicia faba

IIa alte Blätter Winterweizen

I I I 3 Wochen alt B.

Vicia faba IIa alte Blätter

Winterweizen I I I 3 Wochen alt

i s c h e B l ä t t e r , I s

8450

11000 5 e f r i e r g e t r o c k n e

3080

6060

o l i e r u n g s - O p e r a

56

155

te B l ä t t e r , Isol i*

290

1660

t i o n e n im wässr i

j r u n g s - O p e r a t i o

14900

g e n M i l i e u

12780

14750 sen in org . M e d i e

8130

12650

34

25,8 n

64,5

60

Tab. 4. Die spez. Aktivität der Glutamat-Pyruvat-Transaminase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein.

* Vgl. S. 103.


des Gesamt-proteins

[E]

Spezifische


[E]

Aktivität des Prot, der

„Cytoplasma"-Fraktion,

korrigiert* [E]


(errechnet) • [E]



[ % ]

A. Fr Vicia faba

I junge Blätter IIa alte Blätter


B. G e f r Vicia faba

IIa alte Blätter IIb alte Blätter

Winterweizen III 3 Wochen alt

i s c h e B l ä t t e r , I s

256 512

220 i e r g e t r o c k n e t e I

176 274

220

o l i e r u n g s - O p e r a

0

0

0 f l a t t e r , I s o l i e r u r

0 0

0

t i o n e n im wässr i

g s - O p e r a t i o n e n

303

460

g e n M i l i e u

388 775

300 in o rg . M e d i e n

500 775

550

34 34

25,8

64,5 64,5

60,0

Tab. 5. Die spez. Aktivität der Glutaminsäuredehydrogenase ii Cytoplasmaprotein in I

* Vgl. S. 103.

Beim Vergleich der Werte fällt auf, daß nach Ge-friertrocknung meist ein geringerer Fermentgehalt im Gesamtprotein festgestellt wird als bei Bestim-mung an frischem Material. Dies dürfte im wesent-lichen auf drei sich addierenden Effekten beruhen: Durch das Einfrieren allein ergibt sich ein partieller Fermentverlust. Weiter war Schwefelsäure bei der Gefriertrocknung Trockenmittel, so daß auftretende S02 -Spuren ebenfalls eine Beeinträchtigung der Fer-mentaktivität verursachen können. Schließlich wird

Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im iheiten/Gramm Protein.

auch die Behandlung mit organischen Lösungsmit-teln zu Fermentverlusten führen. Die Lagerung der gefriergetrockneten Blätter selbst bewirkt erstaunlich geringe Verluste: Äpfelsäuredehydrogenase und Pyruvatkinase zeigten nach 8-monatigem Aufenthalt der Blätter im Exsikkator bei Zimmertemperatur einen nicht über 4 0 % hinausgehenden Aktivitäts-verlust. In Anbetracht der Instabilität dieser Fer-mente bei Zimmertemperatur in wäßriger Lösung er-scheint dieser Verlust gering.

Tab. 6. Die spez. Aktivität der Aldolase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein.


des Gesamt-proteins

[E]

Spezifischt


[E]


„Cytoplasma"-Fraktion

korrigiert* [E]


(errechnet) [E]



[ % ]

A. F r i s Vicia faba

IIa alte Blätter I Ib alte Blätter


B. g e f r Vicia faba

IIa alte Blätter I Ib alte Blätter


che B l ä t t e r , I s o l

5000 3500

3600 e r g e t r o c k n e t e B

5800 5600

46000

l e r u n g s - O p e r a t i c

40000 28000

24700 l ä t t e r , I s o l i e r u n

60000 54500

87500

>nen im w ä s s r i g e


380?

53000?

n M i l i e u ?

1 ?

n org . M e d i e n

V

V

?

34 34

25,8

64,5 64,5

60


des Gesamt-proteins

[E]

Spezifische


[E]


„Cytoplasma"-Fraktion,

korrigiert* [E]


(errechnet) [E]



[ % ]

A Vicia faba

IIa alte Blätter Winterweizen

I I I 3 Wochen alt B. g e f r

Vicia faba IIa alte Blätter


. f r i s c h e B l ä t t e r

1250

780

e r g e t r o c k n e t e E

560

860

I s o l i e r u n g s - O p

0

0

l ä t t e r , I s o l i e r u n

85

116

s r a t i o n e n i m w ä s


2180

s r i g e n M i l i e u

1890

1050 n org . M e d i e n

1420

1970

34

25,8

64,5

60

Tab. 7. Die spez. Aktivität der Pyruvatkinase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein.

Vergleicht man die spezifische Aktivität des Ge-samtproteins mit der der Chloroplasten, so ergibt sich bei der Aldolase ein überraschender Befund, auf den bereits STOCKING 1 7 aufmerksam gemacht hat (Tab. 6 ) : Im Chloroplastenprotein wird weit mehr Aldolase gefunden als der Bestimmung des Gesamt-proteins zufolge überhaupt darin sein kann. Dieses Ergebnis läßt sich nur so erklären, daß im Cyto-plasma oder in der Vakuole ein Stoff existiert, der das Ferment hemmt. Erst bei Testung der hemm-stoff-freien oder -armen Chloroplasten kann sich die Gesamtaktivität manifestieren. Blätter von Winter-

weizen enthalten offenbar weit weniger Hemmstoff als die der Saubohne. Der Hemmstoff ist niedermole-kular: Die Hemmwirkung verschwindet nicht bei Erhitzung eines hemmstoffhaltigen Eiweißextraktes auf 100 °C , verringert sich jedoch stark bei Dialyse gegen Puffer. Ein Hemmstoff von Eiweißnatur kann also nicht vorliegen. Das Vorliegen eines Hemm-stoffes ist ganz evident sowohl beim Arbeiten in wäß-rigem als auch im organischen Milieu.

Im Gegensatz zu Beobachtungen von TWEFIK und STUMPF 18, die weiterreichende Folgerungen aus ihren 1 8 S . TWEFIK u. P. K. STUMPF, Amer. J. Bot. 36, 567 [1949],

Tab. 8. Die spez. Aktivität der Äpfelsäuredehydrogenase im Gesamtprotein von Blättern, im Chloroplastenprotein und im Cytoplasmaprotein in Einheiten/Gramm Protein.

Spezifische Aktivität Anteil des

Bezeichnung des Prot, der Chloroplasten-

Bezeichnung des Gesamt- des Chloro- „Cytoplasma"- des Cytoplasma- proteins am des Materials proteins plastenproteins Fraktion, proteins Gesamtprotein

korrigiert* (errechnet) [E] [E] [E] [E] [%]

A. f r i sehe B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n im w ä s s r i g e n M i l i e u Vicia faba

I junge Blätter 86000 4450 — 128000 34 IIa alte Blätter 55000 3800 — 81500 34

Winterweizen III 3 Wochen alt 170000 1400 — 230000 25,8

B. g e f r i e r g e t r o c k n e t e B l ä t t e r , I s o l i e r u n g s - O p e r a t i o n e n in o rg . M e d i e n Vicia faba

I junge Blätter 45700 29300 — 69400 59 IIa alte Blätter 83600 47000 135000 150000 64,5 IIb alte Blätter 42000

Winterweizen I I I 3 Wochen alt 104500 21000 410000 230000 60

Befunden ableiten, konnten wir jedoch nicht nur wie STOCKING 17 bei gefriergetrocknetem Material, son-dern auch bei Isolierungs-Operationen im wäßrigen Milieu Aldolase eindeutig und in hoher Aktivität in den Chloroplasten lokalisieren. Sie läßt sich ganz offenbar nicht ohne weiteres aus diesen Zellorganel-len auswaschen.

Beim Vergleich der Tab. 1 bis 8 ist weiter ein wesentlicher Unterschied der spez. Aktivitäten des Chloroplastenproteins bei gefriergetrocknetem und frischem Material auffällig, allerdings nur bei eini-gen Fermenten, nämlich vor allem der Glutamin-säuredecarboxylase, der Glutamat-Oxalacetat-Trans-aminase und der Äpfelsäuredehydrogenase. Diese Unterschiede sind weit größer als die bei Gefrier-trocknung aufgetretenen Verluste, die beim Vergleich der spez. Aktivitäten des Gesamtproteins evident wurden, — und verhalten sich zudem diesen gegen-über gegenläufig! Bevor auf ihre Ursachen eingegan-gen werden kann, ist es notwendig, die Verunreini-gung der nach Gefriertrocknung isolierten Chloro-plasten mit Cytoplasma zu diskutieren.

Besprechung der Ergebnisse

Im vorangegangenen Beitrag wurde bereits die Unmöglichkeit dargelegt, daß bei den aus nicht-wäßrigem Milieu erhaltenen Chloroplasten Aus-waschungsverluste an hochmolekularen hydrophilen

Substanzen wie Proteinen stattgefunden haben, so wie es etwa bei Isolierung aus einem wäßrigen Medium möglich ist. Jedoch läßt das verwandte Ver-fahren der Isolierung aus organischem Lösungsmit-tel eine Fehlermöglichkeit offen: Eine Verunreini-gung der Chloroplasten mit Cytoplasmaprotein ist nicht ausgeschlossen, so daß der gefundene Chloro-plastenanteil am Gesamtprotein von etwa 6 0 % zu hoch gegriffen sein kann. Es ist also nach einer Methode zu suchen, die die Verunreinigung zu be-stimmen gestattet. Oben wurde bereits erwähnt, daß dies über Fermentbestimmungen möglich sein muß: Der Gehalt der isolierten Chloroplasten an einem Ferment, das in vivo nicht in diesen Zellorganellen enthalten ist, ist ein Maß ihrer Verunreinigung. Lei-der ist nichts darüber bekannt, welche Fermente mit Sicherheit nicht in den Chloroplasten vorkommen. Das Verhältnis von spez. Aktivität der untersuchten Fermente im Chloroplastenprotein zur Aktivität im Cytoplasmaprotein erlaubt jedoch eine Entscheidung darüber, welche Fermente nicht oder nur in geringer Menge und dann möglicherweise als Verunreinigung in den Chloroplasten vorhanden sind (Tab. 9 ) . Es ist ersichtlich, daß Glutaminsäuredehydrogenase, Pyruvatkinase, und Glutamat-Pyruvat-Transaminase die niedrigsten Verhältniszahlen aufweisen. Diese Fermente kommen also nicht oder nur in geringer Menge in den Chloroplasten vor.

Daraus, daß in den nach Gefriertrocknung isolier-

Versuchsbezeichnung I I Ia I I b III IV V

Katalase 0,23 0,05 0,246 0,153 Glutaminsäure-

0,05

decarboxylase — — — 0,105 0,183 0,266 Glutamat-Oxalacetat-Transaminase 0,76 1,02 0,82 0,416 — —

Glutamat-Pyruvat-0,82 0,416

Transaminase — 0,036 — 0,12 — —

Glutaminsäure-dehydrogenase 0 0 — 0 — —

Aldolase — ?* ? * 1,64* — —

Pyruvatkinase — 0,06 — 0,056 — —

Äpfelsäuredehydrogenase 0,423 0,313 0,31 0,09 — —

Tab. 9. Das Verhältnis der spez. Aktivität des Chloroplastenp gefriergetrockneten Blättern, Isolierungs-Operationen i

* Vgl. Text S. 105.

ten Chloroplasten im Gegensatz zum Cytoplasma keine Glutaminsäuredehydrogenase gefunden wird, könnte man schließen, daß die isolierten Chloro-plasten frei von cytoplasmatischen Verunreinigungen sind. Dieser Schluß ist aber wahrscheinlich nicht berechtigt: Bei der Bestimmung im optischen Test laufen Nebenreaktionen unter Oxydation von redu-ziertem Pyridinnucleotid ab, und wir glauben, daß diese einen geringen Gehalt an Dehydrogenase in den Chloroplasten maskieren (vgl. auch S. 1 0 3 ) . Des-halb erscheint es uns richtig, als Maß einer cytoplas-matischen Verunreinigung der Chloroplasten den Gehalt an Pyruvatkinase zu betrachten. Wenn wir annehmen wollen, daß Pyruvatkinase in vivo in den Chloroplasten nicht vorkommt, beträgt die Verunrei-nigung in den Chloroplasten nach den Ergebnissen in der Tab. 9 etwa 6 Prozent. Pyruvatkinase ist ein Ferment der Glykolyse, und es besteht begründeter Anlaß zu der Annahme, daß der glykolytische Ab-bau von Kohlenhydraten in den Chloroplasten nicht möglich ist. Abgesehen von diesem Befund haben wir auch einen qualitativen Hinweis, daß unsere Chloroplasten weitgehend frei von Verunreinigungen sind: In den Blättern von Vicia faba kommt neben Dioxyphenylalanin auch Dopa-Oxydase vor. Uber deren Lokalisation ist bisher nichts bekannt, doch konnten wir auch nach Zugabe von Dioxyphenyl-alanin zu unseren Chloroplasten keine Dunkelfär-bung beobachten, während eine solche bei Homo-genisaten auch ohne Dopa-Zugabe sehr schnell ein-trat. Offenbar konnte die Oxydase so weitgehend von den Chloroplasten abgetrennt werden, daß eine merkliche Oxydation von Substrat nicht mehr statt-fand.

Auf der Annahme einer Verunreinigung der Chlo-roplasten mit 6% Cytoplasmaprotein sind alle fol-

oteins zu derjenigen des Cytoplasmaproteins. Verwendung von org. Medien. Versuchsbezeichnungen vgl. die Tab. 1 — 8.

genden Berechnungen aufgebaut. Deswegen erscheint es notwendig, kurz zu diskutieren, inwieweit Abwei-chungen von den erhaltenen Ergebnissen auftreten, wenn sich späterhin etwa herausstellen sollte, daß Pyruvatkinase doch zu einem sehr geringen Anteil in den Chloroplasten auch in vivo lokalisiert ist. Daß eine Verunreinigung der Chloroplasten mit Cyto-plasmaprotein höher als 6 % sein kann, erscheint un-möglich, da Pyruvatkinase leicht und genau zu be-stimmen ist und ihr Gehalt in den isolierten Chloro-plasten der nach oben begrenzende Faktor einer Ver-unreinigung sein muß: Pyruvatkinase kommt in den Chondriosomen 19, Zellkernen 2 0 und wahrscheinlich auch im Grundcytoplasma vor; und in Anbetracht der mechanischen Aufarbeitung der Zellen zur Iso-lierung der Chloroplasten muß sich eine Verunreini-gung ebenso auf Chondriosomen und Zellkerne wie auf Grundcytoplasma erstrecken. Eine sehr gering-fügige Verunreinigung mit Zellkernen läßt sich in der Tat mikroskopisch feststellen 2 1 .

Wenn jedoch Pyruvatkinase auch in vivo tatsäch-lich in den Chloroplasten vorkommen sollte, kann sie nur in außerordentlich geringer Konzentration vor-liegen ; dann beträgt die Verunreinigung der Chloro-plasten sogar weniger als 6 Prozent. Alle Berech-nungen, die im folgenden angestellt werden, ver-schieben sich dann zwar, jedoch in so geringem Aus-maße, daß sich am Grundsätzlichen der daraus ge-zogenen Folgerungen nichts ändert.

Unter Berücksichtigung einer Verunreinigung des Chloroplastenproteins mit 6 % Cytoplasmaprotein er-gibt sich das in Tab. 10 dargestellte Verhältnis des

1 9 W . VON KORFF U. R . M . T W E D T , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 23, 1 2 3 [ 1 9 5 7 ] ,

2 0 H . STERN U. A . F . M I R S K Y , J . gen. Physiol. 3 6 , 1 8 1 [ 1 9 5 2 ] . 2 1 U . HEBER , Ber. dtsch. bot. Ges. 7 0 , 3 7 1 [ 1 9 5 7 ] .

Vicia junge Blätter

faba alte Blätter

Winterweizen junge Blätter

Gehalt an Chloro-plasten-protein im Gesamt-protein [ % ] 55,5 60,5 61,0 56,5

Tab. 10. Der Anteil des Chloroplastenproteins am Gesamt-protein der Zelle. Werte nach Tab. 2 im voraufgegangenen

Bericht unter Berücksichtigung einer Cytoplasma-Verunreinigung von 6% korrigiert.

Chloroplastenproteins zum Gesamtprotein. Es kön-nen also Werte um 55 — 6 0 % als gesichert betrachtet werden. Daraus ergibt sich klar, daß bei der Isolie-rung von Chloroplasten aus wäßrigem Milieu ganz wesentliche Eiweißverluste audi bei schonendem Ar-beiten nicht zu vermeiden sind: Bei der Isolierung von Chloroplasten aus wäßrigem Milieu waren nur 25 — 3 5 % Chloroplastenprotein im Gesamtprotein gefunden worden! Dasselbe geht ganz zweifelsfrei aber auch aus den Fermentbestimmungen hervor. In Tab. 11 ist das Verhältnis der spez. Aktivität des Chloroplastenproteins zu der des Cytoplasmaproteins bei Anwendung der verschiedenen Isolierungsverfah-ren zum Vergleich nebeneinandergestellt. Bei der

Katalase, der Glutaminsäuredecarboxylase, der Glu-tamat-Oxalacetat-Transaminase und der Apfelsäure-dehydrogenase ist das Ferment bei der Isolierungs-operation im wäßrigen Milieu offenbar weitgehend ausgewaschen worden, wie die gegenüber den ge-friergetrockneten Blättern niedrigen Verhältnis-werte der frischen Blätter anzeigen. Die auf S. 106 bereits erwähnten Unterschiede der spez. Aktivitäten des Chloroplastenproteins bei gefriergetrocknetem und frischem Material lassen sich also auf Aus-waschungsverluste bei Isolierung der Chloroplasten aus wäßrigem Milieu zurückführen. So sind z. B. bei der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase mehr als 9 0 % , bei der Apfelsäuredehydrogenase mehr als 7 0 % der in den Chloroplasten enthaltenen Fermentmenge ausgewaschen worden.

Daß die betreffenden Fermente in vivo tatsächlich, z. T. in erheblicher Aktivität, in den Chloroplasten vorkommen, beweisen die bei Anwendung des Ge-friertrocknungs-Verfahrens erhaltenen Werte. CROS-S I N G 2 2 , N E I S H 2 3 u n d B O I C H E N K O 2 4 g e b e n — b e i z . T .

allerdings recht fraglicher Methodik — das Vorkom-men von Katalase in den Chloroplasten an, während sie nach JAGENDORF und WILDMAN25 dort nicht vor-kommen soll. Ein Apfelsäure und Glutaminsäure dehydrierendes System ist von SISSAKIAN und

Versuchsbezeichnung I I I a I I b III IV V

Katalase A 0,105 0,018 B 0,183 — — 0 0,193 0,096

Glutaminsäure- A — — — 0 — —

decarboxylase B — — — 0,047 0,131 0,220 Glutamat- Oxalacetat- A 0,023 0,011 — 0,019 — —

Transaminase B 0,75 1,020 0,80 0,373 — —

Glutamat-Pyruvat- A — 0,005 — 0,01 — —

Transaminase B — 0 — 0,065 — —

Glutaminsäure- A 0 0 — 0 — —

dehydrogenase B 0 0 — 0 — —

Aldolase A — ?* ? * ?* — —

B — ?* ?* 1,70?* — —

Pyruvatkinase A — 0 — 0 — —

B — 0 - 0 — —

Apfelsäure- A 0,035 0,047 0,006 — —

dehydrogenase B 0,386 0,270 0,2(57 0,031 — —

Tab. 11. Das Verhältnis der spez. Aktivität des Chloroplastenproteins zu derjenigen des Cytoplasmaproteins im Vergleich der angewandten Isolierungsverfahren. Die Werte der Tab. 9 für die Gefriertrocknungs-Methode sind hierbei unter Berücksichti-

gung der cytoplasmatischen Verunreinigungen korrigiert. A = frische Blätter, Isolierungs-Operationen im wäßrigen Milieu, B = gefriergetrocknete Blätter, Isolierungs-Operationen in organischem Medium. Versuchsbezeichnungen vgl. die Tab. 1 — 8.

* Vgl. Text S. 105. Berechnung nicht mit Sicherheit möglich.

2 2 G . CROSSING, Biochem. Z . 3 0 5 , 3 5 9 [ 1 9 4 0 ] . u. STOCKING 1 9 5 2 . 2 3 A . C . NEISH , Biochem. J . 3 3 , 3 0 0 [ 1 9 3 9 ] . 2 5 A . T . JAGENDORF U. S . G . WILDMAN , Plant. Physiol. 2 9 , 2 7 0 2 4 E . A . BOICHENKO, Biochimija 1 2 , 1 5 3 [ 1 9 4 7 ] , zit. n. W E I E R [ 1 9 5 4 ] ,

Versuchsbezeichnung I [%]

I I a [%]

I I b [%]

III [%]

IV [%]

V [ % ]

Katalase 19 0 22,5 11 Glutaminsäure-

decarboxylase — — — 6 16,0 21 Glutamat-Oxalacetat-

Transaminase 49 61 56 33 — —

Glutamat-Pyruvat-Transaminase — 0 — 8 — —

Glutaminsäure-dehydrogenase 0 0 — 0 — —

Aldolase — V V 68 — —

Pyruvatkinase — Ö — 0 — —

Äpfelsäuredehydrogenase 33 29 29 4 — —

Tab. 12. Der in den Chloroplasten lokalisierte Anteil des Fermentgehaltes der Zelle. Berechnung nach Werten von Chloroplasten, die im nichtwäßrigen Milieu isoliert wurden. Versuchsbezeichnungen vgl. die Tab. 1 — 8.

C H A M O V A 26 in Chloroplasten-Material gefunden wor-den. Für die anderen Fermente liegen Angaben offen-bar nicht vor.

Wie auf S. 107 bereits eingehender diskutiert und auch aus den Angaben in den Tab. 5, 7, 9 und 11 er-sichtlich ist, dürften Glutaminsäuredehydrogenase und Pyruvatkinase in den Chloroplasten nicht vor-kommen. Wahrscheinlich ist das auch bei der Gluta-mat-Pyruvat-Transaminase der Fall, doch sind hier weitere Analysendaten notwendig, um eine eindeu-tige Entscheidung zu ermöglichen.

Die vorliegenden Befunde enthalten allerdings zwei Unsicherheitsfaktoren: Wie die Untersuchung der Aldolase ergab, existieren zum einen bei gewis-sen Fermenten Hemmstoffe, die ebenso wie die Fer-mente spezifisch in der Zelle lokalisiert sein können. Solche Hemmstoffe können natürlich die Zuverläs-sigkeit der erhaltenen Befunde beeinträchtigen. Zum anderen setzt die von uns vorgenommene Analyse voraus, daß die durch die Gefriertrocknung und an-schließende Aufarbeitung bedingten Fermentverluste in der gesamten Zelle gleichmäßig stattfinden, nicht etwa an besonderen Zellorten bevorzugt. Die experi-mentelle Prüfung ist vorerst nicht möglich, jedoch spricht die Wahrscheinlichkeit dafür, daß die obige Voraussetzung tatsächlich erfüllt ist.

In Tab. 12 seien nun Berechnungen auf der Basis der in den Tab. 10 und 11 angeführten Befunde über den Anteil der untersuchten Fermente angestellt, der in den Chloroplasten lokalisiert ist. Zur Berechnung kommen lediglich die mittels des Gefriertrocknungs-Verfahrens erhaltenen Werte. Aus den Angaben der Tabelle geht hervor, daß etwa 50% der Gesamt-aktivität der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, 30% der Aktivität der Äpfelsäuredehydrogenase und lediglich um 10 bis 20% der Glutaminsäuredecarb-oxylase- und Katalase-Aktivität in den Chloroplasten lokalisiert sind. Der Aldolase-Wert erscheint recht unsicher, da ein Hemmstoff das tatsächliche Vertei-lungsmuster nicht erkennen läßt. Von Glutaminsäure-dehydrogenase und Pyruvatkinase darf angenommen werden, daß sie nicht Bestandteile der Chloroplasten sind. Glutamat-Pyruvat-Transaminase ist, wenn über-haupt, nur in geringer Konzentration vorhanden.

Herrn Prof. Dr. H. ULLRICH danke ich sehr für seine verständnisvolle Förderung der Untersuchungen, Herrn Dr. W. FRANKE für anregende Diskussionen sowie Fräu-lein M. GÖTTE für ihre wertvolle intensive Mitarbeit. Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t ge-bührt Dank für Sachunterstützung.

2 6 N . M . SISSAKIAN u. K . G . CHAMOVA, Dokl. Akad. Nauk S S S R 67, 337 [1949],

vergleichende untersuchungen an chloroplasten, die durch...

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