Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Olga Maritza Berrio Pérez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Bogotá, Colombia
2018
Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Olga Maritza Berrio Pérez
Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias: Microbiología
Director: Dr. César Augusto Arias MD, MSc, Ph.D
Codirectora: Dra. María Teresa Reguero Reza. Q.F., MSc
Línea de Investigación:
Resistencia antimicrobiana en enterococos y estafilococos
Grupo de Investigación:
Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana (UGRA) – Universidad el Bosque
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias
Bogotá, Colombia
2018
V
Dedicatoria
A Dios que en su infinita misericordia,
siempre me ha sostenido y me tiene aquí
para cumplir sus planes… señor eres mi
estandarte, mi escudo y mi todo.
Dios es amor. El que permanece en amor,
permanece en Dios, y Dios en él. 1 Juan 4,
16
A mis padres:
Luisa y Alfredo, quienes siempre han sido mi
apoyo incondicional, mi madre sigue aquí… y
sé que mi padre desde el cielo me apoya,
Papi… aquí estoy terminando nuestro
sueño…
A todas las personas que han sufrido esta
patología… se puede seguir, luchar día a día
para continuar, a pesar de los altibajos, se
pueden cumplir sueños que murieron en las
crisis.
La mente es una gran bendición, pero puede
ser nuestra peor enemiga si lo permitimos,
está en nosotros hacerla nuestra aliada.
VI
Agradecimientos
Primero que todo a papá Dios, porque es su infinita bondad me permitió terminar este
proceso - sueño y puso en mi camino a tantas personas que con amor y buena
disposición me han ayudado en este proceso, Dios gracias porque siempre cumples tus
promesas y esta es una de ellas; así mismo, porque este escalón me ha llevado al
crecimiento personal, espiritual y académico.
¡A mi familia! por su amoroso e incondicional apoyo: mami, papi, Janneth, Alejo, Juan Da,
Angie y Poliita. Gracias por alegrar mi vida, ¡sin ustedes no hubiera podido superar todo
lo que he afrontado! Y probablemente no estaría aquí todavía. Son los amores de mi
vida y no pude ser más bendecida con una familia tan bonita, con tanto amor, confianza,
y soporte. Papi, sé que en donde estas, estas feliz de que alcance esta meta.
A todos los miembros del equipo de la Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana
(UGRA) de la Universidad del Bosque, que es un grupo sólido y ejemplo de trabajo en
equipo; de todos ustedes he aprendido que con disciplina, constancia, organización,
esfuerzo y amor a la academia, se puede aportar al conocimiento científico de este país y
del mundo: gracias Dr. Cesar Arias, Dra. Jinnethe Reyes, Dra. Lorena Díaz, Dra. Sandra
Rincón, Dra. Diana Panesso, Dra. Paola Carvajal, mi infinito y amoroso agradecimiento
por su apoyo constante durante este largo… proceso. Eduardo, Aura, Paolita, Rafael y
Javier mil gracias por su colaboración y buena disposición, para explicarme y resolver
mis dudas.
A Jinn por ser mi codirectora extraoficial, infinitas gracias por tu tiempo, paciencia,
disposición, confianza y apoyo constante; a Lore, por tu apoyo, tiempo, paciencia,
explicaciones y disposición; no tengo como agradecer a ustedes dos, todo lo que han
hecho por mí en estos años de trabajo, y en los últimos meses aun más; al Dr. Arias por
darme esta nueva oportunidad, y por ser un ejemplo de lo que es un verdadero líder
académico, y excelente ser humano. ¡Gracias a todos! Sin ustedes no hubiera podido
culminar este sueño de tantos años.
A la Dra. Martha Fontanilla, quien me ha demostrado que se puede lograr lo que cada
uno se proponga, que con trabajo y perseverancia se puede aportar para construir país.
A Socorrito mil gracias por tu apoyo durante todos estos años, tu paciencia y tu
Dedicatoria y agradecimientos VII
disposición de ayuda. A ambas, muchas gracias por su apoyo, paciencia y
direccionamiento, sin ustedes no hubiera podido retomar este sueño.
A la profesora María Teresa Reguero, por su apoyo, tiempo, dedicación, y nueva
oportunidad en este largo proceso, profesora a quien admiro y respeto, por ser un
excelente ser humano y un ejemplo de ser una buena maestra. Muchas gracias
¡A Diani, por tu apoyo!, y también el préstamo de las asas de vidrio, cajas de agar sangre
y las fotos. A María Carlina, por su tiempo y generosidad, en los análisis iniciales que
realizamos. A Sandra García por la traducción del resumen y revisión.
A la Universidad Nacional de Colombia, que me ha permitido retomar este sueño y
continuar con mi proceso académico a feliz término, Institución que admiro
profundamente, que apoya a la construcción del país desde la academia y brinda
oportunidades reales a personas que no pueden ni soñar con ellas. Me siento orgullosa y
feliz de haber podido cursar estudios en su claustro. Al Instituto Nacional de Salud, que
como institución pública, me ha enseñado que se aporta desde el conocimiento
epidemiológico a la construcción del país, y que podemos aportar una semilla para
mejorar nuestra nación.
A la Universidad el Bosque que me proporcionó mis primeros trabajos, y en donde pasé
años de aprendizaje académico y personal, así como por la financiación de este trabajo.
Parte de la presente investigación fue financiada mediante la convocatoria interna de
investigación de la Universidad el Bosque, proyecto: “Caracterización de fenotipos de
resistencia a vancomicina (VISA - h-VISA) en aislamientos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina (MRSA) en tres países Latinoamericanos”, código PCI 2009-07.
La secuenciación completa del genoma fue solventada con recursos de proyectos
financiados por Colciencias (códigos 906-2015 y 705-2016), aprobados al Centro
Internacional de Genómica Microbiana (CIGM) y de la Unidad de Genética y Resistencia
Antimicrobiana (UGRA), de la Universidad el Bosque.
Por último, quiero agradecer a todas las personas que Dios ha permitido se cruzaran en
mi vida, de todas he aprendido, en este proceso de crecimiento individual en el que todos
los seres humanos estamos, cada uno ha sido valioso para mí. Finalmente, ¡gracias a
todos y mil bendiciones!
VIII Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Resumen y Abstract IX
Resumen
La vancomicina es el antibiótico utilizado para el tratamiento de infecciones complicadas
por Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA); sin embargo, con el paso del
tiempo han aparecido aislamientos con susceptibilidad reducida a vancomicina. El
mecanismo que causa bajos niveles de resistencia a vancomicina en S. aureus no ha
sido completamente elucidado, no obstante, se han encontrado mutaciones y
acumulación de las mismas, en genes que controlan el metabolismo de este tipo de
aislamientos.
En el presente estudio se realizó perfil de análisis de poblaciones- área bajo la curva
(PAP-AUC), para confirmar el fenotipo de resistencia intermedia heterogénea a la
vancomicina (hVISA), posteriormente se realizó caracterización molecular mediante
electroforesis de campo pulsado (PFGE), secuenciación completa del genoma (MiSeqTM
System, Illumina) y análisis in silico.
De los nueve aislamientos MRSA (originarios de Colombia, Ecuador y Perú), tres fueron
confirmados con el fenotipo hVISA, uno procedía de Ecuador (ST228) y dos de Perú
(ST5); los tres aislamientos pertenecen al complejo clonal 5, son PVL negativos,
SCCmec I y agr II. Los tres hVISA son aislamientos multirresistentes a antibióticos, se
halló correlación entre los genes de resistencia y los resultados de las pruebas de
susceptibilidad a betalactámicos, aminoglicósidos, fluoroquinolonas y macrólidos.
Los alineamientos de las secuencias de aminoácidos permitieron detectar cambios en
residuos de aminoácidos en proteínas que han sido relacionados previamente al fenotipo
hVISA/VISA.
Los resultados de tipificación molecular, sugieren que los aislamientos procedentes de
Perú, tienen características similares con el MRSA-I-ST5, que se denomina clon
chileno/cordobés que ha circulado en la región. Los tres aislamientos adquirieron el
fenotipo de susceptibilidad disminuida a vancomicina, probablemente por acumulación de
mutaciones que alteran la regulación de vías de síntesis de envoltura celular.
Palabras clave: Staphylococcus aureus, vancomicina, resistencia bacteriana, hVISA
X Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Abstract Vancomycin is the antibiotic used for the treatment of Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA) complicated infections; however, isolates with reduced susceptibility to
this antibiotic have appeared over time. The mechanism that causes low resistance levels
to vancomycin in S. aureus has not been fully elucidated, though, mutations and their
accumulations have been found in genes controlling the metabolism of this type of
isolates.
In the present study, a population analysis profile - area under the curve (PAP-AUC) was
performed to confirm heterogeneous intermediate resistance to vancomycin (hVISA).
Afterwards, molecular characterization was performed by pulsed-field gel electrophoresis
(PFGE), whole genome sequencing (MiSeqTM System, Illumina) and in silico analysis.
From the nine MRSA isolates (from Colombia, Ecuador and Peru), three were confirmed
with hVISA phenotype, one from Ecuador (ST228) and two from Peru (ST5). The three
isolates belong to the clonal complex 5, they are PVL negatives, SCCmec I and agr II.
The three hVISA isolates are multi-drug an resistant bacteria; correlation was found
between resistance genes and antibiotic susceptibility tests results to beta-lactams,
aminoglycosides, fluoroquinolones and macrolides.
Alignment of amino acid sequences allowed detecting amino acid residues changes in
proteins that have been previously related to the hVISA / VISA phenotype.
Molecular typing results suggest that isolates from Peru have similar characteristics with
MRSA-I-ST5, called the Cordobes/Chilean clone that has circulated in the region. The
three isolates acquire the reduced susceptibility to vancomycin phenotype, probably due
to the accumulation of changes that alter the regulation of cellular envelope synthesis
pathways.
Key words: Staphylococcus aureus, vancomycin, bacterial resistance, reduced
vancomycin susceptibility S. aureus.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Lista de figuras ............................................................................................................. XIII
Lista de tablas ............................................................................................................. XIV
Lista de anexos ............................................................................................................ XV
Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................... XVI
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Capítulo 1. Marco Teórico ........................................................................................ 5 1.1 Staphyloccocus aureus .................................................................................... 5 1.2 Sistemas reguladores de dos componentes y genes relacionados al fenotipo hVISA/VISA ................................................................................................................ 7
1.2.1 Sistema Accesorio Regulador Agr ......................................................... 8 1.2.2 Sistema de dos componentes WalKR ................................................... 9 1.2.3 Sistema de dos componentes VraSR .................................................. 10 1.2.4 Sistema GraSR ................................................................................... 11 1.2.5 Gen tcaA ............................................................................................. 11 1.2.6 Gen atl ................................................................................................ 12 1.2.7 Gen rpoB ............................................................................................. 12
1.3 Pared Celular ................................................................................................. 13 1.4 Glicopéptidos: generalidades y mecanismo de acción ................................... 15
1.4.1 Vancomicina: generalidades y estructura química ............................... 15 1.5 Resistencia a los glicopéptidos en S. aureus ................................................. 17
1.5.1 Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (SARV o VRSA) ..... 18 1.5.2 S. aureus con bajos niveles de resistencia a vancomicina (VISA o hVISA) 20
1.6 Mecanismos de resistencia a vancomicina en S. aureus ............................... 21 1.6.1 Mecanismo de resistencia con altos niveles resistencia a vancomicina en S. aureus (VRSA) ......................................................................................... 21 1.6.2 Mecanismo de bajos niveles resistencia a vancomicina en S. aureus (VISA y hVISA) .................................................................................................. 22
1.7 Epidemiología de VISA y hVISA .................................................................... 26 1.8 Métodos para la detección de aislamientos con sensibilidad disminuida a vancomicina (hVISA/ VISA) ...................................................................................... 29
2. Capítulo 2. Objetivos .............................................................................................. 33 Objetivo General ...................................................................................................... 33 Objetivos específicos ............................................................................................... 33
3. Capítulo 3. Metodología ......................................................................................... 35 3.1 Esquema Metodológico General .................................................................... 35 3.2 Cepas bacterianas ......................................................................................... 36 3.3 Perfil de análisis de poblaciones (PAP) - área bajo la curva (AUC) ............... 39
XII Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
3.4 Electroforesis en campo pulsado (PFGE) .......................................................40 3.5 Secuenciación ................................................................................................42
Extracción de ADN genómico y verificación de calidad ......................................42 Preparación de las librerías genómicas .............................................................42
3.6 Análisis in sílico ..............................................................................................44 3.6.1 Tipificación de Secuencias de Múltiples Locus (MLST) ........................44 3.6.2 Detección de cambios en residuos de aminoácidos de proteínas previamente relacionados con el fenotipo VISA/hVISA ......................................44 3.6.3 Detección tipo de grupo agr, PVL, SCCmec ........................................45 3.6.4 Tipificación de spa y resistoma ............................................................46 3.6.5 Detección de expresión de delta hemolisina ........................................46
4. Capítulo 4. Resultados ...........................................................................................49 4.1 Resultados objetivo 1. Confirmación de fenotipo hVISA/VISA por perfil de análisis de poblaciones (PAPs) .................................................................................49 4.2 Resultados objetivo 2. Epidemiología molecular de aislamientos hVISA, PFGE, MLST ............................................................................................................51
4.2.1 Resultados de PFGE ...........................................................................51 4.2.2 Resultados de secuenciación, ensamblaje y anotación genómica .......52 4.2.3 Resultados de MLST ...........................................................................53
4.3 Resultados Objetivo 3. Tipo agr en aislamientos confirmados como hVISA y detección fenotípica de hemolisina delta ...................................................................54 4.4 Resultados adicionales: tipo spa, PVL, resistoma y mutaciones de genoma relacionadas con el fenotipo hVISA ..........................................................................57
4.4.1 Resistoma ............................................................................................57 4.4.2 Tipificación de spa ...............................................................................59 4.4.3 Cambios en proteínas asociadas con el fenotipo hVISA/VISA .............59 4.4.4 Resumen de análisis adicionales a los objetivos planteados ...............64
5. Capítulo 5. Discusión ..............................................................................................65
6. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................79 6.1 Conclusiones ......................................................................................................79 6.2 Recomendaciones ..............................................................................................80
Anexos ............................................................................................................................81
7. Bibliografía ..............................................................................................................87
Contenido XIII
Lista de figuras
Pág. Figura 1-1 Regulación del Sistema agr ............................................................................ 9
Figura 1-2 Síntesis de monómero de mureina y ensamblaje del peptidoglicano. ........... 14
Figura 1-3 Estructura química de la vancomicina .......................................................... 16
Figura 1-4 Tipo de resistencia a vancomicina y resultados de MIC en S. aureus (CLSI:
Clinical and laboratory Standars Institute, 2012) ............................................................. 18
Figura 1-5 VanA que confiere resistencia a vancomicina ............................................... 22
Figura 1-7 Generación y pérdida del fenotipo hVISA/VISA/VSSA .................................. 25
Figura 3-1 Metodología establecida para el cumplimiento de los objetivos específicos.
*Análisis adicionales realizados, que no estaban en los objetivos específicos planteados
en el proyecto inicial ....................................................................................................... 36
Figura 3-2 Interpretación de resultados ensayo hemólisis ............................................. 47
Figura 4-1 Perfil de análisis de poblaciones de los aislamientos hVISA ......................... 50
Figura 4-2 Resultados de PFGE .................................................................................... 52
Figura 4-3 Tipificación agr II aislamientos hVISA ........................................................... 56
Figura 4-4 Ensayo de δ hemolisina. ............................................................................... 57
Figura 4-5 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de WalK ............... 61
Figura 4-6 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de Atl ................... 61
Figura 4-7 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de TcaA ............... 62
Figura 4-8 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de de RpoB. ......... 63
XIV Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1-1 Variaciones en los criterios para definición del nivel de sensibilidad a
vancomicina de S. aureus, CLSI, 2012. .......................................................................... 30
Tabla 3-1 Lista de cepas de S. aureus utilizados en este estudio. .................................. 38
Tabla 3-2 Criterios de interpretación del PAP-AUC ........................................................ 39
Tabla 3-3 Secuencias de iniciadores para detección de grupo agr ................................. 45
Tabla 3-4 Iniciadores para detección de tipo de SCCmec .............................................. 46
Tabla 4-1 Resultados de PAP-AUC en los nueve aislamientos evaluados. .................... 49
Tabla 4-2 Porcentaje de aislamientos confirmado como hVISA, discriminado por país. 51
Tabla 4-3 Resultados generales del proceso de secuenciación de los aislamientos ....... 53
Tabla 4-4 Perfil alélico de los aislamientos hVISA .......................................................... 53
Tabla 4-5 Aislamientos hVISA con agr II......................................................................... 54
Tabla 4-6 Resistoma y MIC para los aislamientos hVISA ............................................... 58
Tabla 4-7 Tipificación de spa en los aislamientos hVISA ................................................ 59
Tabla 4-8 Resumen de hallazgos de sustituciones de residuos de aminoácidos en
proteínas previamente relacionadas con hVISA/VISA ..................................................... 63
Tabla 4-9 Principales hallazgos a nivel de análisis de genoma de los aislamientos hVISA
....................................................................................................................................... 64
Contenido XV
Lista de anexos
…………………………………………………………………………….……………….....…Pág. Anexo A. Alineamientos de otras secuencias de aminoácidos conservadas………...…81 Anexo B. Presentaciones en eventos científicos……………………………………….….83
XVI Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas Abreviatura Término
ADN Ácido desoxirribonucleico
Agr Gen accesorio regulador
AIP Péptido Autoinductor
ARN Ácido ribonucleico
AT Ácidos teicoicos
ATP Trifosfato de adenosina
BHIA Agar infusión cerebro corazón (del inglés brain hearth infusion)
CAMP Péptidos antimicrobianos catiónicos
CC Complejo clonal
CDC Centro para el Control y la Prevención de enfermedades (del inglés
Center for Disease Control and Prevention)
CLSI Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (del inglés Clinical and
Laboratory Standard Institute)
CoNS estafilococos coagulasa negativos
Da Daltons
EUCAST Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (del
inglés European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
FDA Administración de Alimentos y Medicamentos (del inglés Food and Drug
Administration)
GISA S. aureus con resistencia intermedia a glicopéptidos
GlcNac N-acetilglucosamina
GRD Detección de Resistencia a Glicopéptidos (del inglés glycopeptide
resistance detection)
HK Histidin Kinasa
hVISA Staphylococcus aureus con resistencia intermedia heterogénea a la
vancomicina (del inglés heterogeneous Vancomycin-intermediate S.
aureus)
MGE Elemento genético móvil
MHA Agar Mueller Hinton
MIC Concentración inhibitoria mínima
MLST Tipificación de secuencias multilocus (del inglés multilocus sequence
typing)
MRSA S. aureus resistente a la meticilina (del inglés Methicillin-resistant S.
aureus)
MRSA-AC S. aureus resistente a la meticilina adquirido en la comunidad (del
inglés Community associatted Methicillin-resistant S. aureus)
Dedicatoria y agradecimientos XVII
MRSA-AH S. aureus resistente a la meticilina adquirido en ambiente hospitalario
(del inglés hospital-adquired Methicillin-resistant S. aureus)
MSCRAMM Componentes de la superficie bacteriana que reconocen las moléculas
de adhesión de la matriz extracelular
MSSA S. aureus sensible a meticilina
MurNac Ácido N-acetilmurámico
PAP-AUC Perfil de análisis de poblaciones-área bajo la curva
PAP Perfil de análisis de poblaciones
PBP Proteína de unión a penicilina (del inglés penicilin binding protein)
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PFGE Electroforesis en campo pulsado (del inglés pulsed field gel
electrophoresis)
PGN Peptidoglicano
PSMs Modulinas fenol solubles
PVL Leucocidina de Panton Valentine (del inglés Panton Valentine
Leukocidin)
SNP Polimorfismos de un solo nucleotido
spa Gen que codifica para la proteína A
ST Secuencia tipo
TCS Sistema de transducción de señales de dos componentes (del inglés
two-component systems)
TEI Teicoplanina
TSST1 Toxina del síndrome de shock tóxico
UFC Unidades formadoras de colonia
VAN Vancomicina
VISA S. aureus con resistencia intermedia a vancomicina (del inglés
Vancomycin-intermediate S. aureus)
VRSA S. aureus con altos niveles de resistencia a vancomicina (del inglés
Vancomycin-resistant S. aureus)
VSSA S. aureus sensible a la vancomicina (del inglés Vancomycin-susceptible
S. aureus-VSSA)
Introducción
El descubrimiento y la comercialización de los antimicrobianos ha revolucionado la
medicina, y se convirtió en una importante herramienta para intervenciones médicas
complicadas, tales como la terapia del cáncer, trasplante de órganos, y manejo de los
pacientes que presentan enfermedades complejas (Munita, Bayer & Arias, 2015); sin
embargo, el extenso uso de antibióticos (que se estimó en alrededor de 100.000-200.000
toneladas por año en el mundo en 2002 y que suman más de 1 millón de toneladas
desde 1940), ha generado un dramático incremento en las estadísticas de patógenos
resistentes a antibióticos, lo que indica sobre la probable pérdida de opciones
terapéuticas para el tratamiento de estos microorganismos (Andersson & Hughes, 2010).
La aparición de aislamientos clínicos resistentes a múltiples antibióticos
(multirresistentes), reduce drásticamente la posibilidad de tratar infecciones con eficacia y
aumenta el riesgo de complicaciones que incluso pueden llevar a la muerte del paciente
(Andersson & Hughes, 2010). Inicialmente, las infecciones producidas por bacterias
resistentes a antibióticos ocurrían en hospitales, donde el uso de antimicrobianos es más
amplio; sin embargo, desde hace algunos años también se han descrito bacterias
resistentes a antimicrobianos relacionadas con la comunidad (Furuya & Lowy, 2006);
desafortunadamente, debido a la transferencia de genes de resistencia a antibióticos,
estas bacterias han logrado sobrevivir y tienen la capacidad de diseminarse a otros
individuos, ya sea por medio del personal de salud o por omisión de las medidas de
asepsia adecuadas.
Algunos estudios muestran que entre los microorganismos Gram positivos más
frecuentemente aislados a nivel de infecciones hospitalarias se encuentran, estafilococos
coagulasa negativos (CoNS), Staphylococcus aureus y enterococos, usualmente
2 Introducción
causando infecciones severas como bacteriemias, endocarditis o infecciones de piel y
tejidos blandos, entre otras (Lowy, 1998).
S. aureus puede hacer parte de la microbiota normal, sin generar ningún daño, pero en
ocasiones puede poner en peligro la vida de los pacientes, debido a su habilidad para
evadir el sistema inmunológico, su fenotipo de resistencia a múltiples antimicrobianos,
hace que sea una de las bacterias patógenas más difíciles de tratar (Hiramatsu et al.,
2014a). S. aureus inicialmente presentó resistencia a penicilina mediante la producción
de betalactamasas, más adelante se describió la resistencia a penicilinas semisintéticas,
generando aislamientos conocidos como S. aureus resistentes a meticilina (MRSA), que
ha sido descrito a nivel hospitalario (MRSA-AH) y también en infecciones asociadas a la
comunidad (MRSA-AC), convirtiéndose en un problema global debido al aumento de sus
prevalencias.
Los MRSA se asocian con aumento en la morbilidad, mortalidad, tiempo de estancia
hospitalaria y costos asociados a tratamientos (Shorr, 2007). Se estima que S. aureus
produce alrededor de 12 millones de visitas ambulatorias y 292.000 hospitalizaciones
anualmente en Estados Unidos, de las cuales 126.000 son producidas por MRSA (Lo,
Lai, Liu, Gallo, & Huang, 2011). Se estima que las infecciones por MRSA causan
alrededor de 19.000 muertes por año en Estados Unidos y adicional a la alta tasa de
mortalidad, las infecciones por este patógeno generan costos adicionales al sistema de
salud de entre 3 a 4 mil millones de dólares por año (Fischbach & Walsh, 2009). De
acuerdo a los datos de incidencias de MRSA en Estados Unidos para 2005, y a las
proyecciones realizadas al respecto, se estima que el número de muertes asociadas a
MRSA excedia el número de muertes atribuidas a la infección con HIV y SIDA en 2005
en dicho país (Rehm & Tice, 2010).
Los glicopéptidos y especialmente la vancomicina, han sido considerados como el
fármaco de elección para el tratamiento de bacteriemias y sepsis causadas por MRSA, la
alta prevalencia de infecciones por este patógeno llevó a un incremento del uso de
vancomicina en pacientes crónicos y seriamente enfermos (Rehm & Tice, 2010). Durante
muchos años no hubo sospechas de problemas de resistencia a vancomicina en S.
aureus (Howden, Davies, Johnson, Stinear, & Grayson, 2010). Por lo tanto, los informes
iniciales de la susceptibilidad reducida a vancomicina en los aislamientos clínicos de S.
Introducción 3
aureus, generaron una preocupación importante en la comunidad médica (Howden et al.,
2010).
Infortunadamente el incremento de las infecciones nosocomiales con MRSA y la
exposición a vancomicina, ha llevado al desarrollo de cepas, con varios grados de
resistencia a este antibiótico (Hu et al., 2013).
En 1997 se realizaron los primeros reportes en Japón, de pacientes con aislamientos de
MRSA con susceptibilidad disminuida a vancomicina (VISA) (Hiramatsu, et al., 1997a) y
luego se reportaron aislamientos con resistencia intermedia heterogénea a la
vancomicina (hVISA) en este mismo país (Hiramatsu et al., 1997b); posteriormente en
2002, se hizo el primer reporte de S. aureus resistente a vancomicina (VRSA), en un
paciente en Michigan, Estados Unidos (Center for Disease Control & Prevention, 2002a).
Desde el primer reporte de los aislamientos con susceptibilidad disminuida a vancomicina
hVISA (Mu3) o VISA (Mu50), se ha documentado su aparición en diferentes países, entre
ellos: Australia (Gosbell, Mitchell, Ziochos, & Ward, 2003; Murray, Sieunarine, Ward, &
Pearman, 2004) Canadá (Adam et al., 2010), China (Hu et al., 2013; Sun et al., 2009),
Estados Unidos (Casapao et al., 2013; Richter et al., 2011; Sader et al., 2009a), Francia
(Garnier et al., 2006), Hungría (Toth et al., 2008), Israel (Maor et al., 2014), Italia
(Campanile et al., 2010), Corea (Song et al., 2004), Reino Unido (Kirby et al., 2010;
Wootton et al., 2001), Singapur (Fong, Low, Koh, & Kurup, 2009).
En Colombia se han realizado estudios epidemiológicos de resistencia a antibióticos, uno
de ellos desarrollado en 14 instituciones de Bogotá, entre 2001 y 2003, en el cual se
analizaron 84.664 aislamientos, hallando que los patógenos más frecuentes fueron
Escherichia coli (20,05%), S. aureus (15,53%), estafilococos coagulasa negativos
(9,77%), Klebsiella pneumoniae (5,71%) y Pseudomonas aeruginosa (5,69%), así mismo,
encontraron entre 41% y 48% de MRSA (Leal, Eslava-Schmalbach, Alvarez, Buitrago, &
Mendez, 2006).
Otras investigaciones buscaban establecer las tasas de resistencia en Gram positivos,
como el estudio multicéntrico realizado por Arias et al. (2003) que se desarrolló en 15
centros hospitalarios, entre 2001 y 2002 (597 muestras de estafilococos y enterococos)
encontrando 29,6% de CoNS, 20,8% de enterococos, 49,6% de S. aureus, y 52% de
4 Introducción
estos fueron MRSA, siendo esta última, una prevalencia de resistencia importante a
dicho antibiótico (Arias et al., 2003).
Entre 2006 y 2008 se realizó una nueva vigilancia que incluía aislamientos de S. aureus y
enterococos de 4 países de Latinoamérica, Perú, Ecuador, Venezuela y Colombia,
obteniendo 1.570 cepas de S. aureus, de los cuales 651 (41%) fueron MRSA. Aquellos
aislamientos de S. aureus que tuvieron MIC ≥1µg/mL, fueron evaluados con 3 tipos agar
suplementado con antibiótico (BHIA con 4 y 6 μg/mL de vancomicina y MHA con 5 μg/mL
de teicoplanina) y se analizaron con 2 tipos de E test, macrométodo y Detección de
Resistencia a Glicopéptidos (GRD), encontrando nueve aislamientos que se podrían
categorizar como probables VISA (6 de Perú, 2 de Colombia, y 1 de Ecuador) (Reyes et
al., 2009).
El objetivo del presente trabajo fue confirmar el fenotipo VISA o hVISA de estos
aislamientos, mediante perfil de análisis de poblaciones-área bajo la curva, luego de lo
cual, se realizó electroforesis en campo pulsado (PFGE) y mediante secuenciación de
genoma completo se realizó caracterización genómica, tipificación de SCCmec, spa, agr,
MLST, y detección de cambios en residuos aminoácidos de proteínas relacionadas
previamente al fenotipo hVISA/VISA.
Tres aislamientos fueron confirmados con hVISA, todos pertenecen a CC5, el procedente
de Ecuador presentó ST228, los dos de Perú ST5, los tres aislamientos fueron SCCmec
I, agr II y en los aislamientos se hallaron diferentes sustituciones en residuos de
aminoácidos de las secuencias de RpoB, TcaA, WalK y Atl. Este es el primer estudio que
referencia aislamientos hVISA confirmados por PAP-AUC con caracterización genómica
de los mismos, en cepas procedentes de estos países.
Capítulo 1 5
1. Capítulo 1. Marco Teórico
1.1 Staphyloccocus aureus
Staphylococcus aureus fue descubierto por Alexander Ogston en 1880, en un paciente que
presentaba un absceso lleno de pus (Larkin, Carman, Krakauer, & Stiles, 2009). Desde su
descripción hasta el dia de hoy, se reconoce por ser un agente infeccioso importante debido
a los mecanismos de patogenicidad y desarrollo de resistencia a varios antibióticos.
El S. aureus es un coco Gram positivo de proximadamente 0,5-1,5 µm de diámetro,
pertenece a la familia Micrococcaceae, usualmente se agrupa en “racimos de uvas”,
aunque también pueden estar solos o en pares; no es móvil, no es formador de esporas y
es anaerobio facultativo, generalmente forma colonias de color amarillo dorado, produce
catalasa, fermenta glucosa, fermenta manitol en condiciones anaerobias y resiste a altas
concentraciones de cloruro de sodio, de hasta 10% (Lowy, 1998).
S. aureus produce coagulasa (causando que el plasma se coagule), la cual sirve para
distinguir S. aureus de otros miembros del género, que se denominan estafilococos
coagulasa negativos (Plata, Rosato, & Wegrzyn, 2009).
El genoma de S. aureus consiste en un cromosoma circular de aproximadamente 2,8 Mpb y
se ha propuesto que está compuesto de un genoma central, componentes accesorios y
genes foráneos. Alrededor de 75% de los genes de S. aureus son compartidos por más de
95% de las cepas y, por tanto, puede ser considerado el “núcleo del genoma” (core) de la
especie (Grumann, Nubel, & Broker, 2014). La organización de los componentes del core
es altamente conservada y la mayoría de estos, están asociados con funciones esenciales
y de metabolismo (Plata, Rosato, & Wegrzyn, 2009).
6 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Los componentes accesorios son usualmente elementos genéticos móviles, que tienen o
tuvieron capacidad de transferencia horizontal entre aislamientos, estos elementos incluyen
islas de patogenicidad, profágos, casetes cromosomales, plásmidos y transposones (Lowy,
1998; Plata, et al., 2009).
La patogénesis de las infecciones por S. aureus depende de la producción de proteínas de
superficie que median la adherencia bacteriana a los tejidos del huésped, la secreción de
una serie de toxinas extracelulares y enzimas que destruyen las células y tejidos del
huésped, previniendo o incapacitando sus defensas, lo que favorece su propagación (Kong,
Neoh & Nathan, 2016) S. aureus en general puede expresar diversos factores de virulencia,
entre ellos:
El peptidoglicano (PGN): componente de la pared celular, que puede tener
actividad de endotoxina al estimular la liberación de citocinas por los macrófagos,
activar el complemento y producir agregación plaquetaria (Lowy, 1998).
El ácido teicóico (AT): otro componente de la pared, puede servir como factor de
anclaje para bacteriófagos y como factor de virulencia, al unirse a la mucosa del
huésped y a estructuras como catéteres (Lowy, 1998).
La proteína A: es característica de S. aureus y es codificada por los genes spa; es
una proteína asociada a la pared celular, que se une a la fracción Fc, de la
inmunoglobulina tipo IgG, facilitando la colonización de los tejidos, esta afinidad le
permite inhibir la opsonización y la fagocitosis (Morell & Balkin, 2010).
Las Moléculas de Unión a Matriz Extracelular: son componentes de la superficie
que reconocen las moléculas de adhesión de la matriz extracelular (MSCRAMM),
facilitando la adhesión del microorganismo al tejido colonizado (Gordon & Lowy,
2008).
Toxinas: una de las características importantes de S. aureus, es su capacidad de
secretar toxinas para lesionar membranas (Plata, et al., 2009). Estas toxinas le
proporcionan características patogénicas desde producir infección in situ hasta
Capítulo 1 7
síndromes tóxicos sistémicos sin necesidad de haber diseminación general de la
bacteria (Lowy, 1998).
Hemolisinas: son toxinas que lisan los glóbulos rojos y su acción es mediada
usualmente por el receptor; hay varias clases de hemolisinas incluyendo las α, β, γ,
δ (Kong, et al., 2016).
Leucocidina de Panton Valentine (PVL): es una toxina citolítica, compuesta por 2
componentes LukF-PV y LukS-PV, estas subunidades son codificadas por un
elemento genético móvil (MGE). Las subunidades de PVL se ensamblan en un
octámero formando poro en la membrana plasmática de las células mieloides. La
exotoxina, forma poro e induce la lisis de leucocitos humanos, principalmente en
neutrófilos; la PVL se ha relacionado con infecciones de piel, forúnculos, abscesos
subcutáneos e incluso neumonías necrotizante (Gordon & Lowy, 2008; Meyer,
Girardot, Piemont, Prevost, & Colin, 2009).
Modulinas fenol solubles (PSMs): son una clase de péptidos que reciben este
nombre de acuerdo a su comportamiento durante la extracción con fenol caliente
(Otto, 2010). Estudios han demostrado que S. aureus secreta péptidos similares a
PSM, cuatro cortos (de alrededor de 20 aminoácidos, definidos como tipo α) y dos
largos (de alrededor de 40 aminoácidos, definidos como tipo β) (Wang et al., 2007).
1.2 Sistemas reguladores de dos componentes y genes
relacionados al fenotipo hVISA/VISA
S. aureus es un microorganismo versátil, lo cual se atribuye en gran parte a su capacidad
para expresar coordinadamente factores de virulencia que varían de acuerdo a los
estímulos ambientales, dichos cambios son controlados principalmente por sistemas
reguladores de dos componentes (TCS de sus siglas en inglés) (Ji et al., 2016).
Un sistema regulador de dos componentes, es un sistema de transducción de señales que
consiste en una proteína sensora que detecta y responde a una señal externa, y que actúa
8 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
sobre una proteína reguladora de respuesta, que transmite la señal a otros componentes de
la célula bacteriana (Hughes, 2003).
Entre los 16 sistemas TCS presentes en S. aureus SaeSR y AgrCA juegan papeles
importantes en el control de la virulencia; genes de evasión del sistema inmune y el sistema
WalKR controla el metabolismo de la pared celular, este último es esencial para la
viabilidad de la célula (Delaune et al., 2012). A continuación se presentan algunos operones
o genes, en los que han sido descritas algunas mutaciones específicas, relacionadas con el
fenotipo hVISA/VISA.
1.2.1 Sistema Accesorio Regulador Agr
El locus agr es parte del núcleo del genoma de S. aureus y es un TCS (Yarwood &
Schlievert, 2003), agr es un regulador global que regula la producción de factores de
virulencia de S. aureus (Kong et al., 2016). La producción de toxinas vitales para S. aureus
tales como α, β, γ hemolisina, toxina del síndrome de shock tóxico (TSST-1), enterotoxinas
B, D y C, exfoliatina A y B y PVL son reguladas positivamente por el sistema agr; en este
sentido se ha demostrado que se requiere de un sistema agr funcional para la expresión
máxima y la secreción de varias enzimas tales como la serina proteasa, proteasa V8,
estafiloquinasa, glicerol éster hidrolasa, nucleasas, lipasas, fosfolipasas y fibrinolisina
(Kong, et al., 2016).
La expresión de proteínas de virulencia está bajo el control del ARN III, un transcrito
regulador del gen accesorio regulador agr; el ARN III se activa por el sistema regulador de 2
componentes (AgrC, AgrA) codificado por agr. El locus agr comprende dos unidades
transcripcionales divergentes, bajo el control de promotores P2 (ARN II) y P3 (ARN III). El
operón P2 regula un sistema de transducción de señales de dos componentes (AgrC es el
receptor transmembranal histidina kinasa y AgrA el regulador citoplasmático), un propéptido
(AgrD) y una proteína integral de membrana (AgrB), que está implicada en el
procesamiento y la secreción del péptido, resultando un péptido autoinducido maduro (AIP)
que se acumula en el ambiente extracelular durante el crecimiento de la bacteria (Gilot,
Lina, Cochard, & Poutrel, 2002; Thoendel & Horswill, 2009); la concentración de este
péptido depende de la densidad celular, y cuando se alcanza una concentración umbral, se
Capítulo 1 9
une a AgrC (quorum sensing), y se activa el TCS por fosforilación. El sensor AgrA
fosforilado, regula positivamente la transcripción del promotor P2, amplificando la
respuesta, e inicia la transcripción del promotor P3, el ARN III, regula positivamente la
secreción de factores de virulencia y regula negativamente la producción de proteínas de
superficie, el proceso se muestra en la figura 1-1 (Gilot et al., 2002; Kong et al., 2016). Se
ha descrito que los AIP producidos por S. aureus activan el locus agr en algunas cepas,
mientras que inhiben su expresión en otras.
Ha sido descrito un polimorfismo en una región variable de agr, que comprende secuencias
de nucleótidos entre AgrD, parte del C-terminal de AgrB y una porción del N-terminal de
AgrC (Ji, Beavis, & Novick, 1997), este polimorfismo en agr, permite clasificarlo en cuatro
tipos I, II, III, IV (Gilot et al., 2002).
Figura 1-1 Regulación del Sistema agr
1.2.2 Sistema de dos componentes WalKR
El TCS WalKR (se conoce también como YycFG, Vick y MicAB), es el único sistema de
transducción de señales esencial para el crecimiento de S. aureus (Haag & Bagnoli, 2016),
se expresa durante la fase exponencial y se apaga cuando entra en fase estacionaria, esto
Hemolisina
delta
10 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
sugiere que este sistema esta activo y es necesario durante el crecimiento exponencial
(Dubrac & Msadek, 2004).
En S. aureus WalK es el sensor histidin kinasa y posee tres dominios funcionales: la kinasa
intracelular, las hélices transmembranales, y el dominio extracelular del receptor (Ji et al.,
2016). WalR es el regulador de respuesta, con un receptor dominio N-terminal y un dominio
de unión a ADN C-terminal (Dubrac & Msadek, 2004; Dubrac & Msadek, 2008; Haag &
Bagnoli, 2016).
El TCS se activa a través de la fosforilación del regulador de respuesta WalR, por la
histidina kinasa de WalK, llevando a un incremento en la expresión de genes importantes
involucrados en la degradación y renovación de la pared celular (Haag & Bagnoli, 2016).
WalKR controla positivamente la actividad autolítica, particularmente de las dos autolisinas
principales de S. aureus, Atl y LytM; así mismo WalKR, regula la transcripción de 13 genes
implicados en el metabolismo y degradación de la pared celular, la reducción de los niveles
de WalKR en la célula bacteriana produce un aumento de la resistencia a Tritón X-100 y la
lisis celular inducida por lisostáfina (Haag & Bagnoli, 2016).
1.2.3 Sistema de dos componentes VraSR
VraSR es un sistema de dos componentes típico, compuesto por VraS y VraR, que puede
sensar y transmitir señales de estrés, que son producidas desde la pared celular; como
factor de trascripción, VraR (regulador de respuesta) activa la expresión de los genes
necesarios para la síntesis de la pared celular, VraS (sensor histidina kinasa) regula la
actividad de unión de VraR al ADN, mediante la fosforilación y polimerización de la misma
(Chen et al., 2016).
Cuando S. aureus es expuesto a una amplia gama de agentes que dañan la pared celular,
el TCS VraSR controla la inducción de un estimulón de estrés de pared celular (CWSS del
inglés: cell wall stress stimulon) (McCallum, Meier, Heusser, & Berger-Bachi, 2011). Es
importante mencionar que en algunos aislamientos con fenotipo hVISA, ha sido descrita
sobre expresión de vraS (McCallum et al., 2011).
Capítulo 1 11
1.2.4 Sistema GraSR
El TCS se ha asociado a la Resistencia a glicopéptidos (graSR), controla la resistencia a los
péptidos catiónicos antimicrobianos (CAMP) en S. aureus; así mismo, se comprobó que
graX, esta implicado en la resisitencia a CAMP y co-transcribe con graRS regulando un co-
factor de regulación de la vía de señalización graSR, formando un sistema de tres
componentes (Falord, Mader, Hiron, Debarbouille, & Msadek, 2011). El dominio sensor
GraS, es más pequeño que los típicos sensores histidina kinasa (Meehl, Herbert, Gotz, &
Cheung, 2007).
Analisis de trasncriptoma de GraSR evidenció que este regulador global controla 248
generes. GraSR tiene un papel intermedio con otros reguladores globales (Agr, MgrA, Rot,
y SarA), puede regular la expresión de adhesinas, exoproteínas, toxinas e inclusive
inclusive se ha planteado que GraSR esté envuelto en el establecimiento de infecciones
persistentes por S. aureus por la regulación de factores de colonización (Herbert et al.,
2007).
El sistema graSR desempeña un papel en la patogénesis de S. aureus y está vinculado con
el péptido AgrCA del sistema de “quórum sensing” controlando la expresión de genes de
virulencia; el TCS GraSR también está implicado con el control de respuesta al estrés y en
vías de transducción de señales para el metabolismo de pared celular, compartiendo un
solapamiento con el regulón WalKR (Falord et al., 2011).
1.2.5 Gen tcaA
El gen tcaA codifica para una proteína transmembranal (predicha) y es uno de los
miembros del core del estimulón del estrés de pared celular en S. aureus. El gen tcaA hace
parte del operón tcaRAB (tcaR-tcaA-tcaB), y este ha sido asociado a teicoplanina, existen
publicaciones que relacionan la deleción completa del operón o que tan sólo la inactivación
de tcaA, puede llevar al incremento de la resistencia a teicoplanina (Brandenberger,
Tschierske, Giachino, Wada, & Berger-Bachi, 2000). La inducción de la expresión de tcaA
es completamente dependiente de VraSR (Chen et al., 2016).
12 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Un estudio reciente que evaluó mutaciones en varios genes relacionados al fenotipo VSSA
y VISA, evidenció presencia de mutaciones en los genes tcaA y tcaB, entre otros (Yoo et
al., 2013).
1.2.6 Gen atl
El gen atl codifica para una de las principales autolisinas de S. aureus, el producto de este
gen es una proteína bi-funcional que tiene un dominio amidasa y un dominio
glucosaminidasa (Oshida, Takano, Sugai, Suginaka, & Matsushita, 1998); las autolisinas
del PGN (hidrolasas) catalizan la degradación o recambio del PGN en la bacteria
(Takahashi et al., 2002). El gen atl se ha relacionado con participar en división celular,
formación de biofilm, recambio de peptidoglicano y autolisis (Cafiso et al., 2012a; Wootton,
Bennett, MacGowan, & Walsh, 2005). La actividad de atl es controlada por el TCS WalKR
(Haag & Bagnoli, 2016). Se ha descrito una disminución de la expresión de atl en
aislamientos hVISA/VISA comparada con la expresión en VSSA (Wootton et al., 2005).
1.2.7 Gen rpoB
La ARN polimerasa es una enzima clave de la transcripción, que en procariotas está
compuesta de cinco subunidades (α I, α II, β, β´, δ) (Borukhov & Nudler, 2003). El gen rpoB,
codifica para la subunidad β de la ARN polimerasa (RpoB) que en S. aureus es una
proteína de 1.182 aminoácidos (Aboshkiwa, Rowland, & Coleman, 1995).
Mutaciones en el gen rpoB, se han asociado a resistencia a rifampicina, inicialmente en
otras especies bacterianas y también en S. aureus (Aubry-Damon, Soussy, & Courvalin,
1998; O'Neill, Huovinen, Fishwick, & Chopra, 2006); por otro lado, mutaciones en rpoB han
sido descritas por jugar un rol importante en aislamientos con reducida susceptibilidad a
vancomicina de S. aureus (Hafer, Lin, Kornblum, Lowy, & Uhlemann, 2012; Katayama,
Sekine, Hishinuma, Aiba, & Hiramatsu, 2016; Matsuo et al., 2011) y resistencia a
daptomicina (Cui et al., 2010).
Capítulo 1 13
1.3 Pared Celular
El principal componente de la pared celular es el peptidoglicano (PGN), esta capa es similar
en todas las bacterias, con algunas diferencias entre Gram positivos y Gram negativos
(Arias, 2000); en Gram positivas es una red compleja, compuesta principalmente de PGN y
ácidos teicoicos (AT), ambos esenciales para el mantenimiento de la integridad y forma de
la célula bacteriana (Atilano et al., 2010).
El ciclo de replicación de S. aureus requiere la síntesis y la remodelación de su capa de
PGN, mientras se mantiene la presión de turgencia, con el fin de conservar su forma cocos
(Haag & Bagnoli, 2016).
El peptidoglicano de S. aureus típicamente tiene un grosor de 20–30 nm, sirve como una
barrera de protección, así como un andamio para la unión de proteínas de superficie y
matriz extracelular, que son necesarias para la morfogénesis, división celular, y patogénesis
(Sharif, Singh, Kim, & Schaefer, 2009).
1.3.1 Síntesis de Pared Celular
El peptidoglicano es un polímero heterogéneo de cadenas de glicano entrecruzado por
péptidos cortos de longitud variable, el PGN está compuesto de subunidades de N-acetil
glucosamina (GlcNac) alternadas por N-acetil murámico (MurNac) (Atilano et al., 2010).
Cada unidad de ácido murámico, inicialmente porta un peptapéptido compuesto por L-
alanina, D-ácido glutámico, L-lisina, D-alanina, D-alanina; la rigidez de la pared celular se
da por el entrecruzamiento que ocurre entre el tercer aminoácido y el penúltimo de la
cadena adyacente, con la pérdida del aminoácido terminal D-alanina (Avison, Bennett,
Howe, & Walsh, 2002).
El proceso de síntesis de pared inicia con la producción del ácido N-acetilmurámico, el cual
se deriva de la N-acetilglucosamina por la adición de un ácido láctico sustituyente derivado
del fosfoenol piruvato. Los primeros 3 aminoácidos de la cadena de pentapéptidos (L Ala, D
Glu- L Lis) son adicionados al ácido murámico secuencialmente (enzimas MurC, MurD y
MurE); las D-alanina, D-alanina terminales, se adiciona como una unidad (DdlA y MurF); en
el citoplasma una racemasa convierte una L-alanina en D-alanina (D-Ala), luego las
14 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
moléculas de D-ala son unidas por una ligasa, formando un dipéptido D-ala D-ala, el cual es
adicionado al uracil difosfato N-acetil muramil tripéptido, para formar uracil difosfato N-
acetilmuramil pentapéptido (L-Ala-D-Gln,-L-Lys-D-Ala-D-Ala), este se une al undecaprenol,
lípido I del transportador de la membrana de peptidoglicano (reacción catalizada por la
enzima MraY), entonces la molécula de N-acetil glucosamina es adicionada, (enzima MurG)
como se muestra en la figura 1-2. (Arias, 2000; Avison et al., 2002; Courvalin, 2006;
Hiramatsu, 2001; Rodriguez & Vesga, 2005).
Figura 1-2 Síntesis de monómero de mureina y ensamblaje del peptidoglicano.
NAG: N-Acetilglucosamina; NAM: N-Acetilmuramico. Circulos grises corresponden a la cadena de pentapetido conformada por L-alanina, D-ácido glutámico, L-lisina, D-alanina, D-alanina. Circulos azules: corresponden a la cadena de penta-glicinas.
La unidad completa es transferida a través de la membrana celular, traslocando el
precursor a la superficie externa de la membrana citoplasmática, el N-acetilmuramil
pentapéptido se incorpora al PGN naciente, por transglicosilación (Hiramatsu, 2001);
posteriormente la transpeptidasa conocida como proteína de unión a la penicilina (PBP de
su nombre en inglés), une la cadena de PGN recién formada, a las cadenas existentes de
PGN; para este paso las PBPs reconocen el extremo D-ala D-ala del monómero de mureina
y cortan entre estos dos péptidos, y ligan la penúltima D-ala con la cadena de penta-glicinas
de la capa de PGN preexistente, cuando se realiza el entrecruzamiento, la D-ala terminal
Capítulo 1 15
del monómero de mureina se elimina del PGN terminado. Cerca de un 20% de los residuos
de D-Ala D-Ala no son entrecruzados (Courvalin, 2006; Hiramatsu, 2001).
1.4 Glicopéptidos: generalidades y mecanismo de acción
Los antibióticos glicopéptidos son esenciales para el control de infecciones causadas por
bacterias patógenas Gram positivas (Yim, Thaker, Koteva, & Wright, 2014), su modo de
acción es mediante la inhibición de la síntesis de peptidoglicano en la pared celular del
microorganismo.
Los glicopéptidos tienen efecto bactericida, se unen con alta afinidad a los extremos D-Ala-
D-Ala del PGN y su precursor el Lípido II; esta unión secuestra el sustrato para dos
enzimas indispensables para la síntesis de la pared celular, generando una inhibición física
en las transglicosilasas que transfieren las subunidades de pentapéptidos GlcNac MurNac
de Lípido II anclado a la pared celular, evitando el crecimiento de la cadena de PGN y las
D, D- transpeptidasas que entrecruzan el peptidoglicano (Yim et al., 2014).
La vancomicina y la teicoplanina, representan la primera generación de este grupo de
antibióticos; la teicoplanina es producida por el Actinoplanes teichomyceticus, fue reportada
por primera vez en 1967 y se introdujo para uso clínico en Europa y Japón en 1988 y 1998
respectivamente (Binda, Marinelli, & Marcone, 2014; Yim et al., 2014).
1.4.1 Vancomicina: generalidades y estructura química
En 1952, de una muestra de Streptomyces orientalis, se derivó el componente 05865,
conocido ahora como vancomicina (de la raíz 'vencer”); este fármaco fue utilizado contra
diferentes microorganismos incluidos estafilococos resistentes a penicilina y algunos
anaerobios incluido Clostridium spp., que resultaron susceptibles a este (Levine, 2006). En
1958 su uso fue aprobado por la Administración Federal de Alimentos y Drogas de Estados
Unidos (FDA) (Castellano & Perozo-Mena, 2010).
16 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Figura 1-3 Estructura química de la vancomicina
Wikimedia Commons contributors, 2015. Dominio público. Imagen tomada de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Vancomycin.svg
La estructura central de la vancomicina es un heptapéptido, que contiene cuatro
aminoácidos C-terminales (3,5-dihidroxifenilglicina, β-hidroxitirosina, ρ-hidroxifenilglicina, y
ρ-hidroxifenilglicina), y se diferencia de la teicoplanina, en los tres aminoácidos N
terminales, que para la vancomicina son: asparagina-β-hidroxitirosina-leucina (figura 1-3)
(Pootoolal, Neu, & Wright, 2002).
La absorción oral de la vancomicina es escasa, razón por la cual es administrada por vía
intravenosa (Rybak, 2006). El problema más común asociado con el uso de vancomicina es
la flebitis en el sitio de infusión; también la fiebre y erupción maculopapular, que ocurren en
aproximadamente 1% a 3% de los pacientes tratados. Se ha reportado también
ototoxicidad, aunque es poco común (Faber, 1984).
Así mismo, la administración de vancomicina se ha relacionado con reacciones de
hipersensibilidad incluyendo anafilaxia y el “síndrome del hombre rojo”, caracterizado por
eritema, prurito e hipotensión, cuya incidencia varía entre 3,7% y 47%, aunque las
Capítulo 1 17
reacciones más severas se presentan en pacientes menores de 40 años (Kollef, 2007;
Rybak, 2006).
Se pensaba que la nefrotoxicidad de la vancomicina se debía en gran medida a impurezas,
pero incluso vancomicina purificada puede ser nefrotóxica especialmente a dosis altas
(Jones, Vasileff, & Hewton, 2012; Kollef, 2007).
1.5 Resistencia a los glicopéptidos en S. aureus
Para la descripción y mención de aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina
se han utilizado diferentes términos, especialmente en los primeros años de su aparición, lo
que pudo haber resultado confuso en algunas oportunidades, por la heterogeneidad de
términos utilizados para referirse a estos aislamientos; sin embargo, desde hace algunos
años esta terminología ha sido un poco más homogénea.
Para indicar un aislamiento de S. aureus, con resistencia intermedia a glicopéptidos (GISA)
y con resistencia intermedia a la vancomicina (VISA) se han utilizado en la literatura las
siglas GISA y VISA, dependiendo del país en que se referencia el aislamiento.
Cabe aclarar, que la susceptibilidad reducida teicoplanina puede estar presente en S.
aureus sin reducción de la susceptibilidad a la vancomicina, mientras que por el contrario
las cepas VISA han demostrado reducida susceptibilidad a la teicoplanina (Hiramatsu et al.,
2001; Howden et al., 2010; Howden, Peleg, & Stinear, 2014).
Se han descrito 2 formas de resistencia a glicopéptidos, que se diferencian por el resultado
de las MIC y por el mecanismo de resistencia a vancomicina: la primera forma la
constituyen los S. aureus con altos niveles de resistencia a vancomicina, usualmente
presentan MIC 16 g/mL (VRSA); la segunda es la denominada S. aureus con bajos
niveles de resistencia a vancomicina, en donde se agrupan S. aureus con dos fenotipos:
aquellos con resistencia intermedia (VISA) que usualmente presentan resultados de MIC
entre 4-8 g/mL o con resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina (hVISA) que
puede tener resultados ≤2 g/mL, pero contener subpoblaciones con fenotipo VISA (figura
1-4) (Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2012).
18 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Figura 1-4 Tipo de resistencia a vancomicina y resultados de MIC en S. aureus (CLSI: Clinical and laboratory Standars Institute, 2012)
1.5.1 Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (SARV o VRSA)
En 2002 en Michigan Estados Unidos, se realizó el primer reporte de un aislamiento VRSA,
que provenía de un paciente diabético con una úlcera crónica tratada con múltiples
antibióticos, incluido vancomicina; de la úlcera infectada se obtuvieron aislamientos de
VRSA, Enterococcus faecalis resistente a vancomicina y Klebsiella oxytoca; el VRSA
presentó MIC para vancomicina >128 µg/mL, y contenía el gen de resistencia a
vancomicina vanA del enterococo y el gen mecA (Centers for Disease Control & Prevention,
2002a). Posteriormente, en Pensilvania se reportó una segunda cepa VRSA (MIC 32
µg/mL) en un paciente de 70 años, que presentaba una úlcera crónica en el tobillo, de la
cual se había aislado previamente MRSA y ERV (Centers for Disease Control & Prevention,
2002b). El tercer caso de una cepa VRSA se reportó en 2004 en un paciente hospitalizado
en Nueva York (MIC > 256 μg/mL) (Centers for Disease Control & Prevention, 2004).
Capítulo 1 19
Hasta mayo de 2015 en Estados Unidos, se habían reportado en total 13 infecciones con
VRSA, ocho de los diez VRSA documentados entre 2002-2009, se produjeron en pacientes
de Michigan y las infecciones con VRSA reportadas a partir de 2010, se produjeron
Delaware (Finks et al., 2009; Sievert et al., 2008; Walters et al., 2015).
En 2013, se reportó el primer caso de VRSA en un paciente de Lisboa Portugal, el
aislamiento presentaba una MIC para vancomicina de 1024 μg/mL y también portaba el gen
vanA (Friaes et al., 2015).
El primer VRSA en América Latina fue reportado por el laboratorio de microbiología del
“Hospital de Clínicas, Universidad de São Paulo Brasil”, este aislamiento correspodió a un
MRSA aislado en un hemocultivo, obtenido de un paciente de 35 años (Panesso et al.,
2015; Rossi et al., 2014).
Se han descrito aproximadamente 35 cepas de VRSA incluyendo cinco en Pakistán, tres en
Irán, 14 en Estados Unidos, 11 en India, una en Portugal y una en Brasil; aunque no todas
los reportes indican haber realizado PCR para confirmar la presencia del gen vanA; sin
embargo, a la fecha no se ha detectado transmisión de VRSA, más allá de los pacientes
relacionados en los casos mencionados (Aligholi et al., 2008; Azimian et al., 2012; Friaes et
al., 2015; Liaqat et al., 2015; Limbago et al., 2014; Panesso et al., 2015; Rossi et al., 2014;
Saha, Singh, Ghosh, & Bal, 2008; Sambandam, Rohinikumar, Gul, & Mounasamy, 2016;
Thati, Shivannavar, & Gaddad, 2011; Tiwari & Sen, 2006; Walters et al., 2015).
Según describe la literatura, las cepas VRSA adquieren resistencia a vancomicina como
resultado de la adquisición del Tn1546 (que le transfierere vanA) de enterococos, durante el
curso de la infección; llama la atención, que la mayor parte de los Tn1546 fueron adquiridos
de Enterococcus faecalis, (dado que es más frecuente en Enterococcus faecium resistente
a vancomicina); los VRSA de EEUU se agrupan dentro del linaje genético de cepas
hospitalarias conocido como complejo clonal 5 (CC5); por el contrario, el aislamiento
MRSA-VRSA reportado en Brasil se clasificó dentro del linaje de cepas comunitarias clon
USA300-ST8 del complejo clonal 8 (CC8) (Kos et al., 2012; Rincón et al., 2014; Rossi et al.,
2014).
20 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
1.5.2 S. aureus con bajos niveles de resistencia a vancomicina (VISA o hVISA)
S. aureus con resistencia intermedia a vancomicina (VISA)
El primer aislamiento VISA fue reportado en 1997 en Japón, en un paciente de 4 meses de
edad, tras desarrollar una infección quirúrgica con un MRSA y recibir tratamiento con
vancomicina por 29 días, la MIC fue de 8 µg/mL, y este aislamiento se denominó Mu50
(Hiramatsu et al., 1997a).
Desde el primer reporte de VISA, se han documentado este tipo de aislamientos en
diferentes países como: Australia, Bélgica, Corea, China, España, Estados Unidos, Francia,
India, Japón, Polonia, Suiza, Tailandia, Taiwán, entre otros (Canton et al., 1999; Chen, Liu,
Sun, Chen, & Wang, 2011; Denis et al., 2002; Gowrishankar, Thenmozhi, Balaji, & Pandian,
2013; Hanaki et al., 2007; Kim, Hwang, Pyo, Mun, & Pai, 2002; Lulitanond et al., 2009;
Mlynarczyk, Mlynarczyk, & Luczak, 2003; Robert, Bismuth, & Jarlier, 2006; Rybak et al.,
2008; Tenover, Biddle, & Lancaster, 2001; Van Hal & Paterson, 2011; Vaudaux et al., 2012;
Wang, Lee, Chiueh, & Lu, 2009; Zhang, Sun, Chang, Dai, & Ma, 2015).
S. aureus con resistencia intermedia heterogénea a la
vancomicina (hVISA)
S. aureus con resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina (hVISA), es un fenotipo
que en pruebas de susceptibilidad a vancomicina realizadas in vitro se comporta como
susceptible; sin embargo, tiene poblaciones minoritarias de S. aureus con resistencia
intermedia a vancomicina (VISA), y dicha población resistente está presente en una
frecuencia de ≤105 a 106 (Chaudhari et al., 2015).
Este fenotipo fue descrito por primera vez en Japón, en un paciente de sexo masculino, de
64 años, que presentaba neumonía por MRSA y quien después de una cirugía por cáncer
de pulmón, fue tratado con vancomicina por 12 días; luego de ello, de una muestra de
esputo del paciente, se aisló un S. aureus con una MIC de 3 µg/mL para vancomicina, que
además contenía subpoblaciones capaces de crecer entre concentraciones de 5-9 µg/mL
de vancomicina, dicho aislamiento se denominó Mu3 (Hiramatsu et al., 1997b).
Capítulo 1 21
Desde entonces aislamientos de fenotipo hVISA han sido descritos en varios países, entre
ellos Argentina, Australia, Canadá, Chile, China, Corea, Estados Unidos, Francia, Hungría,
India, Irlanda, Israel, Italia, Japón, Malasia, México, Reino Unido, Singapur, Taiwán (Adam
et al., 2010; Campanile et al., 2010; Casapao et al., 2013; Chaudhari et al., 2015; Delgado
et al., 2007; Di Gregorio et al., 2015; Fitzgibbon, Rossney, & O'Connell, 2007; Fong et al.,
2009; Garnier et al., 2006; Gosbell et al., 2003; Hu et al., 2013; Kirby et al., 2010; Maor et
al., 2014; Murray et al., 2004; Ramli, Neoh, Aziz, & Hussin, 2012; Richter et al., 2011; Sader
et al., 2009a; Song et al., 2004; Sun et al., 2009; Toth et al., 2008; Vega et al., 2015; Wang
et al., 2009; Wootton et al., 2001).
1.6 Mecanismos de resistencia a vancomicina en S. aureus
1.6.1 Mecanismo de resistencia con altos niveles resistencia a
vancomicina en S. aureus (VRSA)
La resistencia de tipo vanA, se caracteriza por altos niveles de resistencia a vancomicina y
teicoplanina, está mediada por el transposón Tn1546 y elementos estrechamente
relacionados con este. El transposón codifica una deshidrogenasa (VanH), que reduce el
piruvato a D-Lac, y la ligasa VanA, que cataliza la formación de un enlace éster entre D-Ala
y D-Lac. El dipéptido d-Ala-D-Lac resultante reemplaza el dipéptido D-Ala-D-Ala en la
síntesis del peptidoglicano, cuya sustitución disminuye la afinidad de la molécula de
glicopéptidos (Courvalin, 2006).
El operón vanA está compuesto por siete genes, vanRSHAXYZ, cuya expresión es
inducible por los glicopéptidos, vancomicina y teicoplanina. Tres de estos genes (vanHAX)
son necesarios para la producción de la D-Ala-D-Lac de los precursores del peptidoglicano,
que genera la resistencia a glicopéptidos; VanS es un sensor asociado a la membrana que
controla el nivel de fosforilación de VanR. VanR es un activador de la transcripción del
operón codificando VanH, VanA y VanX. VanH es una deshidrogenasa (reduce el piruvato a
D-Lac), y VanA es una ligasa que cataliza la formación de un enlace éster entre D-Ala y D-
Lac, este cambio genera que la vancomicina no se una a D-Ala-D-Lac. VanX es una
22 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
dipeptidasa que hidroliza el componente normal de peptidoglicano D-Ala-D-Ala, lo que
impide que sea sensible a vancomicina. VanY es una D, D-carboxipeptidasa que hidroliza el
residuo terminal D-Ala de los precursores del peptidoglicano, que se producen si la
eliminación de D-Ala-D-Ala por VanX no se produce por completo. Por lo tanto, D-Ala-D-Lac
reemplaza el dipéptido normal D-Ala-D-Ala en la síntesis de peptidoglicano, que lleva a
resistencia a la vancomicina, como se observa en la figura 1-5. VanZ confiere resistencia a
la teicoplanina por un mecanismo desconocido (Hughes, 2003; Qureshi, Yin, & Boyle-
Vavra, 2014).
Figura 1-5 VanA que confiere resistencia a vancomicina
Sistema regulador dos componentes VanR-VanS, que regulan la resistencia a vancomicina en ERV y VRSA
1.6.2 Mecanismo de bajos niveles resistencia a vancomicina en S.
aureus (VISA y hVISA)
Se ha descrito que hVISA puede producir espontáneamente, dentro de su población celular
células VISA con una frecuencia de 106 o mayor (Matsuo, Cui, Kim, & Hiramatsu, 2013).
Aunque el mecanismo que genera bajos niveles resistencia a vancomicina en S. aureus,
(VISA o hVISA), no ha sido comprendido completamente, se han planteado hipótesis de
varios cambios genéticos o bioquímicos responsables de la susceptibilidad disminuida a
vancomicina (Saito et al., 2014).
Capítulo 1 23
A pesar de no comprender los determinantes moleculares de hVISA y VISA, recientemente
se han hecho avances significativos en este campo, debido a la disponibilidad actual de
tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento, que permiten la comparación de
los genomas de pares de cepas de S. aureus isogénicas o series de hVISA obtenidas in
vivo, o inducidas in vitro (Howden, et al., 2014); algunos de estos estudios han encontrado
que la conversión de hVISA a VISA puede ocurrir por una mutación o mutaciones
combinadas en varios genes individuales (Saito et al., 2014).
Una de las primeras hipótesis para explicar el aumento de niveles de resistencia a
vancomicina en estos aislamientos, fue el incremento de residuos D-Ala-D-Ala generados,
debido a la disminución del entrecruzamiento del peptidoglicano, lo que produce que estos
residuos atrapen más eficientemente el antibiótico (Hiramatsu, 2001).
Otro estudio evidenció una difusión anómala de VAN a través de la pared celular de VISA,
generada por la obstrucción de la pared con el antibiótico; así mismo, que el engrosamiento
de la pared celular protege la biosíntesis del PGN en curso (en la membrana
citoplasmática), de la inhibición por VAN, permitiendo que se siga produciendo PGN en la
pared celular naciente, llevando la obstrucción y el engrosamiento la pared celular, que en
conjunto, evitan que la VAN alcance la membrana citoplasmática en el fenotipo VISA (Cui et
al., 2006; Cui et al., 2003).
Otros estudios han asociado mutaciones en el TCS graSR al fenotipo hVISA/VISA; por
ejemplo, una sustitución de seis nucleótidos, que afecta el sensor HK graS, generando la
sustitución T136I (Howden et al., 2008); por otro lado, Neoh et al. (2008) secuenciaron y
compararon el genoma de Mu3, Mu50 y N315 (VSSA), encontrando una mutación en el
regulador de respuesta del TCS graSR en VISA, además encontraron 16 SNP (Neoh et al.,
2008). En ese mismo sentido, en ensayos con microarreglos encontraron que una sola
mutación en vraS o graR, altera la expresión de más de 100 genes, lo que llevó a una
perturbación de la homeostasis en células de Mu3 y Mu50, favoreciendo la generación del
fenotipo VISA (Neoh et al., 2008).
También se ha descrito que una expresión alterada del TCS agr, puede conducir al fenotipo
VISA, un estudio realizado por Moise-Broder mostró mayor porcentaje de polimorfismos del
grupo II en el locus agr, asociados a falla terapéutica en el tratamiento con vancomicina y
con aislamientos VISA (Moise-Broder et al., 2004); en otros aislamientos, se ha vinculado la
24 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
pérdida de función del agr, con la disminución en la eficacia del tratamiento con VAN
(Sakoulas, Moellering, & Eliopoulos, 2006; Tsuji, Rybak, Lau, & Sakoulas, 2007).
Otro de los TCS que han sido asociados al fenotipo hVISA/VISA es walKR (Hafer et al.,
2012; Howden et al., 2011; Howden, et al., 2014; McEvoy et al., 2013; Shoji et al., 2011);
Howden et al. (2014) han descrito que “probablemente no todas las SNPs produzcan
impacto funcional, pero la secuencia de ADN de walKR, es altamente conservada, lo que
puede apoyar el impacto funcional de estos cambios” (Howden, et al., 2014). En algunas de
sus publicaciones tambien muestran gráficamente la presencia de algunas sustituciones de
residuos de aminoácidos en WalKR, asociadas al fenotipo VISA, cinco en WalR (K208R,
A96T, V113A, entre ellas) y 26 en WalK entre ellas G223D, ΔQ371, L14F (Howden et al.,
2011; Howden et al., 2014).
Un estudio realizado por Matsuo et al. (2013), en 45 cepas VISA derivadas de Mu3,
expuestas a vancomicina, encontraron que las 45 cepas portaban entre 1 y 4 mutaciones
probables (que afectaban la expresión de 48 genes) y 32 cepas presentaban una mutación
(en un único gen); los genes afectados más frecuentemente fueron el cmK, (citidilato
kinasa), seguido por rpoB; en este estudio, se encontró que la alteración funcional de genes
en múltiples vías metabólicas, además de los que tienen función reguladora (rpoB, rpoC,
rpoA, rpoD, etc.) puede llevar la conversión fenotípica de hVISA a VISA (Matsuo et al.,
2013).
Otros estudios realizados han evidenciado diferentes genes involucrados; se postuló que la
inactivación del gen tcaA, juega un rol relevante en la resistencia a glicopéptidos (Maki,
McCallum, Bischoff, Wada, & Berger-Bachi, 2004).
En este mismo sentido, se ha descrito asociación entre mutaciones específicas en S.
aureus y el aumento gradual en la MIC para vancomicina, un estudio colectó
secuencialmente aislamientos provenientes de un paciente expuesto a varios días de
tratamiento con VAN, hallando 35 puntos de mutación en estos aislamientos VISA, además
la disminución de 100 veces su sensibilidad a daptomicina, a pesar de no haber sido
tratado con este último antibiótico (Mwangi et al., 2007).
Capítulo 1 25
Estudios sobre los mecanismos genéticos de resistencia intermedia a vancomicina en S.
aureus sugieren que esta se adquiere a través de múltiples pasos de mutaciones de genes
involucrados en la regulación de la fisiología celular (Katayama et al., 2016).
Fenotípicamente las cepas hVISA/VISA exhiben características metabólicas distintas, entre
ellas: “(i) aumento del uso de fructosa, (ii) metabolismo incrementado de ácidos grasos, (iii)
alteración del metabolismo de etilo y ciclo del ácido tricarboxílico, (iv) disminución de la
disponibilidad de glutamato, y (iv) aumento de la expresión de genes de la síntesis de la
pared celular”; estos cambios homeostáticos globales parecen conducir a una reducción de
la actividad autolítica, engrosamiento de la pared celular, aumento de la cantidad de
dipéptidos D-Ala-D-Ala libres y disminución en el entrecruzamiento del PGN (Gardete &
Tomasz, 2014; Howden et al., 2010; Munita & Arias, 2016)
A pesar de las mutaciones asociadas al fenotipo VISA y hVISA, este ha sido descrito como
un fenotipo inestable (Hiramatsu, 2001). Howden, Peleg y Stinear (2014) relacionan que
“algunos estudios han descrito la reversión de las cepas de fenotipo VISA a VSSA después
de largos periodos de almacenamiento de las mismas, durante los cuales no hubo sobre
estas exposición a presión dada por el antibiótico, o luego de pasajes (Howden et al., 2014)
(figura 1-6).
Figura 1-6 Generación y pérdida del fenotipo hVISA/VISA/VSSA
Los mecanismo que llevan al fenotipo hVISA/VISA no se han entendido completamente,
aun ahora; sin embargo, la evidencia científica si ha permitido observar que la evolución al
26 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
fenotipo VISA puede producirse por varias mutaciones únicas, que se van acumulando con
el tiempo y que llevan a adquirir resistencia (Di Gregorio et al., 2017; Howden, et al., 2014;
Mwangi et al., 2007; Shoji et al., 2011), mientras que en otros casos, una única mutación es
suficiente para producir resistencia (Cameron et al., 2012; Howden et al., 2011; Howden et
al., 2014).
1.7 Epidemiología de VISA y hVISA
Los estafilococos, en general tienen una gran capacidad para adaptarse rápidamente a la
presión de selección dada por los antibióticos, con el consiguiente desarrollo de cepas
resistentes (Appelbaum, 2007). Las infecciones producidas por S. aureus, esencialmente
las producidas por MRSA han sido tratadas durante más de medio siglo, principalmente con
glicopéptidos como vancomicina (Hu et al., 2013); sin embargo, debido al dramático
aumento las infecciones por MRSA y el uso generalizado de vancomicina, surgieron cepas
de MRSA con susceptibilidad disminuida a vancomicina (Pitz et al., 2011).
El fenotipo VISA/VISA por lo general se presenta in vivo en pacientes con infecciones
invasivas por estafilococos, que recibieron tratamiento prolongado con vancomicina (Munita
et al., 2015),
La falta de criterios estandarizados para denominar estos aislamientos y el uso de
diferentes metodologías para detectar los hVISA/VISA, dificultan considerablemente la
revisión de la literatura, con el fin de establecer prevalencias que sean comparables, sobre
todo para los primeros años en que fueron reportados; sin embargo, las tasas de
hVISA/VISA varían a nivel mundial (Howden et al., 2010).
Aunque la prevalencia de hVISA/VISA ha aumentado en los últimos años, se cree que ha
sido seriamente subestimada (Zhang et al., 2015), a pesar de que se han presentado casos
en países de todos los continentes; en general la prevalencia de hVISA es superior,
comparada con la de VISA.
Capítulo 1 27
En Estados Unidos, se han desarrollado varios trabajos para establecer presencia de
aislamientos con reducida sensibilidad a VAN; uno de ellos realizado entre 1999 y 2000,
encontró 4 infecciones causadas por VISA y 15 por hVISA (denominados en ese momento
non-VISA SA-RVS) en una muestra de 100 S. aureus (Fridkin et al., 2003). Otro estudio
desarrollado en Nebraska, entre 2000 y 2008, encontró una incidencia de 1,2% de hVISA,
confirmados por PAP-AUC (Pitz et al., 2011). Mientras que otra investigación realizada en
2009 (en 43 centros médicos de ese país), encontró una prevalencia de 0,3% de hVISA
(Richter et al., 2011).
En China entre 2007 y 2011, en 757 aislamientos de S. aureus, se encontró 10% de hVISA
y 0,5% de VISA, en este estudio también se observó un incremento en la incidencia año por
año, pasando de 1,2% en 2007 a 7,2% en 2010, 80% de estos aislamientos presentaban
agr II (Hu et al., 2013).
Un estudio realizado en Taipéi (Taiwán), en 1500 MRSA, halló 43 (2,8%) aislamientos
VISA, todos eran SCCmec III, agr I, PVL negativos y la tipificación molecular por PFGE
reveló que todos los aislamientos pertenecían al pulso tipo A, (con similaridad ≥80%), lo que
indicaba diseminación clonal de los aislamientos de VISA en este caso, lo cual es llamativo,
dado que rara vez se ha informado de diseminación clonal de hVISA/VISA en hospitales
(Hsueh, Lee, Perng, Chang, & Lu, 2010).
Por otro lado, una vigilancia más reciente, realizada entre 2012 y 2013, también en Taiwán,
en 622 asilamientos MRSA que presentaban MIC para vancomicina de 1µg/mL o mayores,
halló una prevalencia de 10% y 2,7% de hVISA y VISA respectivamente; este dato llama la
atención debido al incremento de la prevalencia de cepas con reducida susceptibilidad a
glicopéptidos, cuando se compara con los resultados de un estudio publicado en 2003
(0,7% de hVISA y 0,2% de VISA) (Huang et al., 2015).
Con respecto a estudios realizados en Europa, en Liverpool (Reino Unido), se desarrolló un
estudio entre 2004 y 2006, en un total de 2.550 MRSA, en el que se encontró que 3,4% de
los pacientes colonizados y 2,5% de pacientes con bacteriemia por MRSA presentaban
aislamientos hGISA (Kirby et al., 2010); en Italia se publicó un estudio basado en 128 S.
aureus, de pacientes con endocarditis infecciosa, encontrando 19,5% de hVISA, con una
frecuencia similar en MRSA y SASM (Campanile et al., 2012); otro estudio realizado en
28 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Irlanda, con 3.189 aislamientos MRSA, colectados entre 1999 y 2004, halló 5,6% de
aislamientos hGISA (hVISA) (Fitzgibbon et al., 2007).
Con respecto a datos de América Latina, se han presentado reportes de aislamientos
hVISA en tres países: el primero fue en México, un aislamiento proveniente de una muestra
de esputo, (Delgado et al., 2007); otro caso se reportó en Chile, el aislamiento presentó una
“secuencia tipo (ST) ST267, ST no descrita previamente, que pertenece al complejo clonal
CC5” (Vega et al., 2015). En Argentina se han reportado cuatro aislamientos hVISA,
primero se reportó el caso de un MRSA-AC hVISA en un paciente con una endocarditis
infecciosa, en 2011 (Sola et al., 2011) y posteriormente en 2015 se reportaron 3 (3,3%)
aislamientos hVISA provenientes de pacientes con bacteriemias, al análisis molecular el
primero (ST5, SCCmec I, agr II, luk-PV negativo) fue caracterizado como spa t149-pulsotipo
D, un subtipo del clon cordobés, el segundo (ST100-SCCmec IV, -agr II, luk-PV negativo)
fue spa t002-pulsotipo B, relacionado con el clon pediátrico argentino y el tercero fue un
SASM spa t267 y pertenecía a una secuencia tipo predominante en bovinos con mastitis y
descrita en Argentina por causar osteomielitis (Di Gregorio et al., 2015).
Se han realizado algunas revisiones sistemáticas de prevalencia de VISA y hVISA, una de
ellas realizada por Van Hal y Paterson (2011), con información obtenida de la base de
datos Medline, entre 2006 y 2010, encontró una prevalencia 1,3% de hVISA, en un total de
82.698 MRSA. La segunda revisión fue desarrollada por Zhang et al. (2015), con 91
artículos incluidos (39 de Asia, 28 de Europa, 21 de América y 3 de Australia), en la cual se
halló una prevalencia de 6,05% de hVISA y 3,01% de VISA (con un total de 99.042 y
68.792 MRSA para hVISA y VISA respectivamente), en este estudio se observa igualmente
el incremento en la prevalencia de hVISA que era de 4,68% antes de 2006, 5,38% entre
2006 y 2009 y 7,01 entre 2010 y 2014, con resultados similares en VISA que fueron de
2,05%, 2,63% y 7,93% para los mismos periodos (Zhang et al., 2015).
En algunos de los primeros estudios de VISA/hVISA, se utilizaba electroforesis en campo
pulsado (del inglés Pulsed field gel electrophoresis PFGE) y tipificación de secuencias
multilocus (del inglés Multilocus sequence typing, MLST), para evaluar relación clonal entre
los asilamientos y se demostró que las cepas VISA no eran clonales (Fridkin et al., 2003);
sin embargo existe un reporte de un estudio realizado en Taiwán que indica relación clonal
entre los aislamientos VISA encontrados en su hospital (Hsueh et al., 2010).
Capítulo 1 29
La mayoría de hVISA y VISA se presentan en cepas relacionadas al ambiente hospitalario,
en lugar de asociadas a la comunidad (Howden et al., 2014), sin embargo, existen algunos
estudios que relacionan presencia de aislamientos VISA/hVISA vinculados con la
comunidad: uno fue reportado en San Francisco (EEUU), causado por un MRSA USA 300
asociado a la comunidad (Graber et al., 2007); otro aislamiento reportado en Corea como
un MRSA con SCCmec IV y ST72, que es el genotipo comunitario frecuente de Corea
(Chung et al., 2012); y un tercer caso reportado en Argentina, de un MRSA, SCCmec IV,
PVL negativo, ST5, patrón de PFGE subtipo I2, con relación con el clon MRSA-AC
(pulsotipo I) epidémico en dicho país (Sola et al., 2011).
1.8 Métodos para la detección de aislamientos con
sensibilidad disminuida a vancomicina (hVISA/ VISA)
Se han utilizado varios procedimientos de tamizaje en aislamientos clínicos, para detección
de cepas de S. aureus con reducida sensibilidad a VAN (VISA y hVISA), pero el método
óptimo para realizar su detección no se ha definido claramente (Khatib et al., 2015).
Se reconoce al fenotipo hVISA, por ser aislamientos de S. aureus que presentan resultados
de pruebas de susceptibilidad para VAN en un rango sensible, pero que a su vez poseen
una subpoblación celular con resistencia intermedia a VAN (VISA), que se presenta con
una frecuencia de 105 o 106 (Chaudhari et al., 2015), lo que dificulta considerablemente su
detección con las pruebas de susceptibilidad a antibióticos utilizadas convencionalmente.
En la práctica clínica se utilizan metodologías de análisis microbiológico automatizado o en
algunos casos se realizan análisis manuales, pero estas técnicas no tienen suficiente
sensibilidad para detectar cepas VISA o hVISA (debido a que las plataformas de pruebas
de susceptibilidad comerciales, utilizan inóculos más bajos que los requeridos para su
detección), lo cual puede tener implicaciones en la eficiencia del tratamiento con
vancomicina (Tenover & Moellering, 2007). Adicionalmente, al aplicar pruebas de
susceptibilidad estándar a los aislamientos hVISA, presentan MIC dentro del rango
establecido como sensible.
Sumado a esto, desde hace varios años se empezó a utilizar un término “arrastre de la
MIC” (del inglés MIC creep), que algunos autores definen como “el aumento gradual en la
30 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
tendencia central de la MIC de vancomicina, para la población dominante de tipo salvaje
(del inglés wild-type), causada por el uso prolongado de la vancomicina” (Sader et al.,
2009b), es decir estos aislamientos presentan aumento en la MIC, fenómeno que se ha
observado desde hace varios años.
Como resultado de la “MIC creep”, y debido a reportes de fallas en el tratamiento con
vancomicina en pacientes con infecciones con S. aureus que presentaban MIC ≥4 µg/mL,
en 2006 CLSI redujo los puntos de corte (Diaz et al., 2017) y modificó los criterios de
interpretación para pruebas de resistencia a vancomicina en S. aureus, los VSSA se
categorizan con una MIC ≤2 µg/mL, los VISA entre 4 µg/mL y 8 µg/mL y los VRSA ≥16
µg/mL (tabla 1-1); pero los métodos de tamizaje del CLSI (MIC por dilución en caldo o
difusión en agar), tampoco son útiles para la detección del fenotipo hVISA, debido a la
concentración de inóculo que se utiliza (5x105 o 5x104 UFC, respectivamente) (Chaudhari et
al., 2015; Tenover & Moellering, 2007).
Tabla 1-1 Variaciones en los criterios para definición del nivel de sensibilidad a vancomicina
de S. aureus, CLSI, 2012.
Fenotipo de
sensibilidad a VAN en
S. aureus
CLSI antes de 2006
(µg/mL)
CLSI después de 2006
(µg/mL)
VSSA ≤ 4 ≤ 2
VISA 8-32 4 – 8
VRSA ≥ 32 ≥16
CLSI: Clinical and laboratory standard Institute de EEUU; VAN: vancomicina
Sin embargo, de acuerdo a los criterios de interpretación establecidos por el Comité
Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana -EUCAST (2017) (del inglés
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) solo se tienen dos criterios de
interpretación para la MIC: sensible cuando el punto de corte de la MIC es ≤2 mg/L y
resistente cuando presenta una MIC >2 mg/L, de acuerdo a las tablas de punto de corte de
2017, no se maneja la interpretación de la MIC de resistencia intermedia a vancomicina.
Dada la dificultad que se presenta para la detección de aislamientos con reducida
susceptibilidad a vancomicina, con el paso del tiempo se han descrito algunas técnicas de
Capítulo 1 31
laboratorio para el evaluar la sensibilidad de aislamientos VISA/hVISA a VAN, algunas
pruebas se realizan en platos de agar infusión cerebro corazón (BHIA: brain hearth infusion,
por su sigla en inglés) o agar Müeller Hinton (MHA), con adición de diferentes
concentraciones de antibiótico: 4 µg/mL (BHIA4V) y 6 µg/mL (BHIA6V) de VAN o con 5
µg/mL de TEI (MHA5T), incubados por períodos de 24 y 48 horas; sin embargo, los
resultados obtenidos no fueron tan sensibles, ni específicos y mostraron variaciones de
acuerdo a los diferentes estudios publicados (Fitzgibbon et al., 2007; Hubert et al., 1999;
Wootton, MacGowan, Walsh, & Howe, 2007). De manera semejante, se ha descrito
recientemente, un tamizaje con BHIA suplementado con 3 µg/mL de VAN (BHIAV3), que
reporta una sensibilidad de 100% y especificidad de 65% (Burnham, Weber, & Dunne,
2010); hay que mencionar además que recientemente se planteó un nuevo tamizaje por
duplicado, en BHIA suplementado con 3 µg/mL y 4 µg/mL de VAN para detectar VISA y
hVISA, respectivamente, el crecimiento por duplicado de 2 UFC se consideró como positivo,
los autores plantean resultados de sensibilidad y especificidad superiores a 98% y 93%
respectivamente; sin embargo no existen publicaciones adicionales que relacionen la
utilización de este nuevo método y no se ha difundido su uso (Khatib et al., 2015).
Otra metodología de tamizaje utilizada es el E test, que incluye un gradiente del antibiótico
en diferentes concentraciones, en una tirilla; estos se prueban con un inóculo bacteriano de
concentración específica sobre un medio enriquecido, y se incuban entre 24 y 48 horas;
otros métodos funcionan de forma similar, como el E test macrométodo que utiliza tirillas de
VAN y TEI ubicadas en direcciones opuestas (200µL de inóculo bacteriano a una
concentración 2,0 McFarland) o el GRD (sigla del inglés glycopeptide resistance detection),
que utiliza doble tirilla para evaluar tanto VAN como TEI al mismo tiempo. Estos tres
métodos se han probado obteniendo una mejor sensibilidad y especificidad, comparada con
los métodos de medio enriquecidos con antibiótico, sin embargo, tampoco pueden aplicarse
en la práctica clínica debido a los altos costos (Fitzgibbon et al., 2007; Leonard, Rossi,
Newton, & Rybak, 2009; Riederer et al., 2011; Yusof et al., 2008).
El método más exacto y reproducible para la detección de estos fenotipos, es el perfil de
análisis de poblaciones (PAP) - área bajo la curva (AUC), que se considera como estándar
de oro para la confirmación; consiste en evaluar un aislamiento a concentraciones
crecientes de antibiótico y diferentes diluciones de inóculo bacteriano, realizando conteo de
unidades formadoras de colonias (UFC), posteriormente se grafican los resultados del
32 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
número de UFC viables, frente a la concentración de VAN y se realiza un cálculo de la
proporción del valor obtenido de AUC, entre la cepa evaluada, contra la cepa de referencia
(Mu3), resultados ≥0,9 confirman que el aislamiento es un hVISA; sin embargo, la demanda
técnica de esta metodología hace que sea imposible su implementación en el tamizaje de
rutina de los laboratorios de microbiología clínica, dado que requiere de una fuerte inversión
de tiempo y recursos económicos, además de lo dispendiosa que resulta la aplicación de la
misma (Chaudhari et al., 2015; Van Hal & Paterson, 2011; Wootton et al., 2001).
Capítulo 2 33
2. Capítulo 2. Objetivos
Objetivo General
Caracterizar fenotípica y molecularmente aislamientos MRSA con susceptibilidad reducida a vancomicina en aislamientos clínicos, provenientes de 3 países en Suramérica.
Objetivos específicos
Realizar la confirmación del fenotipo de susceptibilidad reducida a la vancomicina en 9 aislamientos VISA, provenientes de 3 países en Suramérica por medio del perfil de análisis de poblaciones (PAPs).
Establecer la epidemiología molecular de los aislamientos que sean confirmados como VISA/hVISA, por medio de electroforesis en campo pulsado (PFGE) y secuenciación de múltiples locus (MLST).
Determinar el tipo de sistema accesorio regulatorio (Agr) en los aislamientos que sean confirmados como VISA/hVISA, provenientes de tres países en Suramérica y realizar detección fenotípica de hemolisina delta.
34 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Capítulo 3 35
3. Capítulo 3. Metodología
En el presente estudio se realizó confirmación del fenotipo hVISA/VISA en aislamientos
caracterizados previamente como probables VISA, obtenidos en el estudio “Vigilancia de
resistencia a agentes antimicrobianos de Staphylococcus aureus y enterococci
provenientes de hospitales en Colombia, Ecuador, Venezuela y Perú”, desarrollado por la
Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana de la Universidad El Bosque” entre
2006 y 2009; en dicho estudio retrospectivo que incluyó 32 hospitales de 4 países, se
identificaron 651 MRSA que fueron tamizados mediante el uso de tres agares
suplementados con glicopéptidos, posteriormente mediante la aplicación de E test
macrométodo se obtuvieron 49 aislamientos sugestivos del fenotipo VISA (≥ 8 µg/mL
vancomicina) los cuales fueron probados con E test GRD, procedimiento luego del cual
se obtuvieron nueve aislamientos probables VISA (Reyes et al., 2009), que son las cepas
utilizadas para los análisis en el presente estudio.
3.1 Esquema Metodológico General
Se realizaron una serie de procedimientos para dar cumplimiento al objetivo general y los
objetivos específicos figura 3-1. El estudio incluía caracterización de fenotipo y tipificación
molecular.
36 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Figura 3-1 Metodología establecida para el cumplimiento de los objetivos específicos. *Análisis adicionales realizados, que no estaban en los objetivos específicos planteados
en el proyecto inicial
3.2 Cepas bacterianas
Para el desarrollo de este estudio se utilizaron nueve aislamientos MRSA, con probable
susceptibilidad disminuida a vancomicina, obtenidos en un estudio multicéntrico
desarrollado en cuatro países (Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela), en el que se
colectaron 1.570 S. aureus y de ellos 651 eran MRSA (Reyes et al., 2009).
Aquellos aislamientos MRSA que tuvieron MICs ≥1 µg/mL, fueron tamizados por técnicas
para evaluar susceptibilidad a vancomicina, en primer lugar se probaron con tres tipos
agar enriquecido con vancomicina (BHIA con 4 6 μg/mL y 6 μg/mL de VAN y MHA con 5
μg/mL de TEI) y se analizaron con 2 tipos de E test, (macrométodo y Detección de
Resistencia a Glicopéptidos -GRD), luego de lo cual nueve fueron encontrados como
Aislamientos probables
VISA/hVISA
Caracterización fenotipica
Perfil de analisis de poblaciones - área bajo la curva (PAP-
AUC)
Hemolisina Delta
Tipificación molecular
Electroforesis en Campo Pulsado
(PFGE)
*Secuenciación de Genoma Completo
Tipificación: MLST, *spa
, *SCCmec, *PVL
Tipo agr
*Resistoma
*Cambios en proteinas asociadas al fenotipo
VISA/ hVISA
Capítulo 3 37
presuntos aislamientos con susceptibilidad intermedia a vancomicina (6 de Perú, 2 de
Colombia y 1 de Ecuador).
Estos nueve aislamientos, presuntos VISA fueron el objetivo del presente trabajo, que
buscaba realizar la confirmación fenotípica y caracterización genotípica de los mismos.
Las cepas que se utilizaron como control para los ensayos de PAPs (Population Analysis
Profiles) fueron: S. aureus susceptible a meticilina y vancomicina, (ATCC 29213) y el
primer aislamiento reportado como hVISA (Mu3) con resistencia intermedia heterogénea
a la vancomicina (Hiramatsu et al., 1997b; Wootton et al., 2001). Como controles en la
PFGE se utilizaron las cepas USA300, USA600, el clon chileno/cordobés, el aislamiento
con susceptibilidad intermedia a vancomicina VISA (Mu50). El aislamiento RN4220 se
utilizó como control en la detección de producción de delta hemolisina, en la tabla 3-1 se
incluye información relevante de los aislamientos y controles utilizados.
38 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Tabla 3-1 Lista de cepas de S. aureus utilizados en este estudio.
Código o
nombre
de la cepa
Características relevantes / origen de la
muestra
MICa
VAN
µg/mL
Referencia
C329 Aislamiento MRSA proveniente de sangre 1 (Reyes et al., 2009)
C591 Aislamiento MRSA proveniente de sangre 1 (Reyes et al., 2009)
E987 Aislamiento MRSA proveniente de sangre 2 (Reyes et al., 2009)
P1108 Aislamiento MRSA proveniente de herida
quirúrgica
1 (Reyes et al., 2009)
P1112 Aislamiento MRSA proveniente de lavado
bronco alveolar
1 (Reyes et al., 2009)
P1209 Aislamiento MRSA proveniente de aspirado
Bronquial
1 (Reyes et al., 2009)
P1215 Aislamiento MRSA proveniente de líquido
pleural
1 (Reyes et al., 2009)
P1233 Aislamiento MRSA proveniente de líquido
pleural
1 (Reyes et al., 2009)
P1923 Aislamiento MRSA proveniente de líquido
pleural aspirado bronquial
1 (Reyes et al., 2009)
Mu3 Cepa de referencia, MRSA con resistencia
intermedia heterogénea a la vancomicina. PAP-
AUC, ensayos de δ hemolisina, PFGE
NA (Hiramatsu et al.,
1997b; Wootton et al.,
2001)
Mu50 Cepa de referencia, MRSA con resistencia
intermedia a vancomicina. Ensayos de δ
hemolisina, PFGE.
NA (Sakoulas et al., 2002)
ATCC
29213
Cepa de referencia, MSSA sensible a
vancomicina. PAP-AUC, ensayos de δ
hemolisina, PFGE
NA (Yusof et al., 2008)
USA300 Control PFGE NA (McDougal et al., 2003;
Reyes et al., 2009)
USA600 Control PFGE NA (McDougal et al., 2003;
Reyes et al., 2009)
Clon
chileno
Control PFGE NA (Cruz et al., 2005)
RN4220 Aislamiento productor de β hemolisina, ensayos
de δ hemolisina
NA (Cafiso et al., 2012b;
Sakoulas et al., 2002) a
Resultados de la MIC para vancomicina, de los aislamientos de S. aureus utilizados en el presente estudio, tomada de la información de tamizaje realizada a los aislamientos en el estudio previo realizado por Reyes et al. (2009); NA: no aplica resultado de MIC dado que son cepas control.
Capítulo 3 39
3.3 Perfil de análisis de poblaciones (PAP) - área bajo la curva (AUC)
Se realizó como lo describieron previamente Wootton et al. (2001), con algunas
modificaciones. Se descongelaron los aislamientos a evaluar, haciendo un pasaje en
agar infusión cerebro corazón (BHIA), después de 24 horas de incubación a 35°C, se
realizó pase de 1 y/o 2 colonias en 10 mL de caldo tripticasa soya (Biomedics) y se
incubó a 35°C por 24 horas; empleando un inóculo de 108 UFC/mL de los aislamientos y
controles, se realizaron diluciones seriadas en base 10 (4.500 µL de solución salina
estéril y 500 µL del inóculo bacteriano), luego de ello 200 µL de cada una de las
diluciones fueron plaqueadas con asa de Driglasky estéril en cajas de BHIA (Biomedics),
preparado previamente con concentraciones de 0, 0.5, 1, 1,5 2, 3, 4, 6 y 8 µg/mL de
vancomicina. Después de 48 horas de incubación a 35°C, se realizó recuento de
unidades formadoras de colonias. El número de UFC/mL se graficó contra la
concentración de vancomicina. Los PAPs se inspeccionaron visualmente y los datos se
analizaron (Hiramatsu et al., 1997b). Todas las pruebas se realizaron usando como
controles Mu3 (hVISA) y Staphylococcus aureus sensible a meticilina ATCC 29213.
PAP-AUC: Se determinó el radio del área bajo la curva (AUC) como lo describen Wootton
et al. (2001), para los análisis se utilizó el software GraphPad Prims 7 (GraphPad
Software, Inc), con la versión de prueba que tiene el mismo; posteriormente, se
determinó el producto del AUC, para lo cual se dividió el valor obtenido de AUC para
cada aislamiento sobre el valor obtenido de AUC en el control hVISA-Mu3.
La interpretación de resultados, se realizó de acuerdo a los parámetros reportados por
Wootton et al. (2001), como se describe en la tabla 3-2 (Wootton et al., 2001).
Tabla 3-2 Criterios de interpretación del PAP-AUC
Fenotipo de resistencia a
Vancomicina en S. aureus Resultado PAP-AUC
VSSA < 0,9
hVISA 0,9 - 1,3
VISA > 1,3
Criterios de interpretación del PAP- AUC, (Wootton et al., 2001)
De cada experimento se realizaron tres réplicas biológicas, en caso de discrepancias se
tomó el resultado prevalente en dos de los tres ensayos. Se obtuvieron promedios.
40 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
3.4 Electroforesis en campo pulsado (PFGE)
La electroforesis en campo pulsado, es útil para comparar cepas bacterianas, dado que
el ADN es embebido en gel de agarosa, digerido con endonucleasas de restricción de
corte infrecuente (Tenover et al., 1995), luego de lo cual el ADN es sometido a corrido
electroforético, en un equipo que hace que la corriente eléctrica sea pulsada
alternativamente, reorientando la dirección de la misma de acuerdo a los parámetros
establecidos (Schwartz & Cantor, 1984), generando separación de ADN de alto peso
molecular, y a su vez un patrón de bandas que permite comparar el perfil genético entre
aislamientos, para evaluar su relación.
Los nueve aislamientos probables hVISA, fueron sometidos a este procedimiento y se
utilizaron como patrones de comparación los aislamientos VISA (Mu50) y hVISA (Mu3), y
representativos de los clones USA300, USA600 y clon chileno/cordobés, a fin de evaluar
posibles relaciones clonales.
Esta técnica se realizó de acuerdo a las recomendaciones de Murray et al. (1990) con
modificaciones y de acuerdo al protocolo estandarizado en la Unidad de Genética y
Resistencia Antimicrobiana -UGRA (Arias et al., 2003; Murray et al., 1990; Panesso et al.,
2002; Reyes et al., 2009) se inoculó una colonia de cada una de las cepas evaluadas en
15mL de caldo BHIA (oxoid LTD, Hampdhire, England), se incubó a 37°C, durante toda la
noche en agitación constante. El tubo con el inóculo bacteriano fue centrifugado a 4°C
por 5 minutos a 5000 rpm; se descartó el sobrenadante y se recuperó el botón en el
fondo que contenía las células bacterianas, las cuales se resuspendieron en 2 mL de
buffer PIV (tris-HCl pH 7,6 10mM y NaCl 1 M). Se realizó una mezcla de 150µL de la
suspensión bacteriana con el mismo volumen de agarosa de bajo punto de fusión al 1%
(Bio Rad Laboratories Inc. United Satates), posteriormente se dispensó en los moldes y
se dejó solidificar. Los bloques de inóculo embebido en la agarosa se incubaron en buffer
de lisis (Tris-HCl 6 mM -pH 7,6, NacL 1M, EDTA 100mM, Brij-58 0,5%, deoxicolato de
sodio al 0,2%, sarkosyl 0,5% (N-Lauroilsarcosina sódica), RNasa 25 μg/mL y lisostafina
10 μg/mL) a 37°C por 5 horas. Pasado este tiempo se descartó el buffer de lisis y los
Capítulo 3 41
bloques con el inóculo se incubaron en solución ESP (EDTA 0,5 M pH 9.5, sarkosil al 1 %
y proteinasa K 50 μg/mL) a 50°C toda la noche; luego de ello, se realizaron tres lavados
con buffer TE pH 8 (tris-HCl 10 mM pH 7,5 y EDTA 1 mM pH 7,5) a temperatura
ambiente (cada lavado se hizo con incubación de una hora en agitación constante) (
Murray, Singh, Heath, Sharma, & Weinstock, 1990; Reyes, 2014).
El ADN fue digerido con de la enzima de restricción SmaI a una concentración de 20
U/µL (Promega Corporation) a 25°C con buffer J (tris HCL 10mM, MgCl 7mM, KCl 50
mM), BSA 1X y agua destilada des ionizada estéril; para detener la reacción enzimática,
se incubó con buffer TE a 37°C por 30 minutos. Después de realizar digestión, el ADN de
los aislamientos fue separado por electroforesis en gel de agarosa “Seakem gold” al
1,6% (Cambrex Bio Science Rockland INC) con Buffer TBE 0,5 X (Tris borato 44,5 mM,
ácido bórico 44,5 mM y EDTA 1 mM pH 8,0), utilizando el equipo CHEF-DRIII (Bio-Rad
laboratorios Inc Richmond, CA).
Se utilizaron los siguientes parámetros para la corrida electroforética, gradiente de voltaje
6,0 v/cm, pulso inicial 5 segundos, pulso final 40 segundos, con un tiempo de corrida de
24 horas. A continuación, se procedió a colorear el gel con bromuro de etidio a 0,5 µg/mL
(Promega Corporation) por 30 minutos, luego de lo cual se visualizó con luz ultra violeta
(UV).
Para realizar análisis de la información, primero se realizó una revisión manual de las
bandas, de acuerdo a los criterios de Tenover (Tenover et al., 1995) y posteriormente se
realizó análisis del archivo digital en el software Gel Compare II 6.5 (Applied Maths
Software, Biomerieux Company, Bélgica). Se construyó el dendograma con los siguientes
parámetros: se analizaron los patrones de bandas mediante el coeficiente de Dice, se
establecieron los conglomerados (clusters) mediante agrupamiento apareado UPGMA
(del inglés Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages), con una tolerancia
de 1,5% y un valor de corte (threshold cutoff value) de 75%.
Posteriormente los resultados se validaron luego de comparar los resultados obtenidos
en la revisión manual y los obtenidos por el software.
42 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
3.5 Secuenciación
Extracción de ADN genómico y verificación de calidad
A partir de cultivos bacterianos en caldo BHIA se obtuvieron los extractos celulares que
fueron sometidos a un tratamiento de pre-lisis con lisostafina (80 µg/mL), para la
posterior extracción y purificación de ADN genómico, la cual se realizó empleando el kit
comercial DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen Group), de acuerdo a las instrucciones
establecidas por el fabricante. Luego de la purificación en columna, el ADN fue
resuspendido en 50µL de agua ultra pura libre de ARNsas y ADNsas y almacenado a -
20ºC para su uso posterior. Una alícuota de 10µL fue empleada para verificar la calidad
de ADN obtenido.
La verificación de pureza se realizó mediante la determinación del radio de las lecturas
de cada muestra (Nanodrop ratio) a una longitud de onda de 260 nm (cantidad de ADN) y
280nm, (cantidad de proteínas), cuyo resultado debía ser mayor a 1,8. Así mismo, se
comprobó la integridad del ADN mediante visualización de la migración en gel de
agarosa, y se generó el electroferograma, se determinó el tamaño promedio de los
fragmentos y concentración de ADN. La cuantificación de ADN genómico, se realizó por
fluorometría en el Qubit® 2.0 (Invitrogen), utilizando el estuche comercial Qubit dsDNA
BR (Thermo Fisher Scientific Inc).
Preparación de las librerías genómicas
Con el fin de preparar las librerías para el procedimiento de secuenciación completa del
genoma, luego de cuantificar el ADN genómico, las librerías fueron preparadas
empleando el kit Nextera XT DNA sample preparation (Illumina®, San Diego CA), de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante. En resumen, en primera instancia se
realizó tagmentación del ADN (En esta fase se unieron los fragmentos de ADN genómico
a los adaptadores Illumina), a continuación se realizó el proceso de amplificación por
PCR (reacción en cadena de la polimerasa), en este paso se realizó amplificación de los
fragmentos de ADN con los adaptadores específicos de Illumina, los cuales incluyen los
pares de índices específicos (Illumina Inc., 2012). Posteriormente, se realizó el proceso
de limpieza, de los productos (amplicones) obtenidos, para ello se utilizarón perlas
Capítulo 3 43
Ampure XP (Angencourt Bioscience corporation, MA, USA), y las librerías se diluyeron en
el buffer de resuspensión. Las librerías fueron almacenadas a -20°C para su posterior
uso y una alícuota de 5uL fue empleada para la cuantificación y la caracterización de
fragmentos de ADN, como se describe más adelante.
La cuantificación de las librerías se realizó mediante fluorometría en el Qubit® 2.0
(Invitrogen®) utilizando el estuche comercial Qubit HS-DNA (Thermo Fisher Scientific
Inc). Posteriormente se realizó la caracterización de cada librería empleando el
bioanalizador agilent 2100 Bioanalyzer con el High sensitivity DNA chip, con el objetivo
de determinar la distribución de tamaño de los fragmentos. Finalmente, de acuerdo a la
concentración nM teórica, cada librería fue ajustada a una concentración de 4nM y fueron
combinadas para su posterior secuenciación.
El “pool” de librerías fue denaturado mediante el uso de NaOH y diluido con agua esteril
grado PCR, a una concentración de 12pM. Para el proceso de secuenciación se utilizó el
kit V2 500 cycles (Illumina Inc. San Diego CA) compatible con el secuenciador MiSeqTM
System (Illumina Inc. San Diego CA), en donde se llevó a cabo el proceso de
secuenciación para obtener lecturas pareadas de 250 bp (250PE).
Ensamblaje y anotación genómica
A partir de las lecturas pareadas obtenidas en el secuenciador MiSeqTM System (Illumina
Inc. San Diego CA), se realizó la verificación de calidad y la limpieza empleando un
índice de Phred de 20, se eliminaron secuencias contaminantes que correspondieran a la
presencia de adaptadores.
A partir de las secuencias (reads), limpias de adaptadores, se realizaron ensamblajes de
novo (sin usar secuencia de referencia) para la obtención de contings mediante
alineamiento y astringencia media, con tamaños de palabra y de burbuja estimados
automáticamente y una longitud mínima de contig de 400 con un re mapeo, de reads
para corregir errores de ensamblaje, este se realizó empleando el programa CLC
Genomics Workbench 8.5.
A partir de los genomas ensamblados en “contigs” se realizó anotación empleando el
servidor RAST versión 2.0 (Rapid annotation using subsystem Tecnology) (Aziz et al.,
44 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
2008). El proyecto de secuenciación de los genomas de los tres aislamientos se identificó
en la base de datos de Bioproject con el número PRJNA393041. Las secuencias fueron
depositadas en Genbank, bajo los siguientes números de acceso: P1209
(NMOP00000000), P1108 (NMOQ00000000), E987 (NMOR00000000).
3.6 Análisis in sílico
3.6.1 Tipificación de Secuencias de Múltiples Locus (MLST)
La tipificación de secuencias multilocus se basa en el polimorfismo de siete genes
“housekeeping” y sus resultados permiten definir linajes clonales, complejos clonales y
dar información de la evolución del microorganismo (Mehraj et al., 2016). La MLST
identifica secuencias internas de alrededor de 400 a 500 nucleótidos en los genes
“housekeeping”, las secuencias de fragmentos de estos genes permiten la asignación de
siete alelos (identificados por números), que llevan a la asignación de una secuencia tipo
ó ST (del inglés sequence type) (Larsen et al., 2012) De acuerdo a lo descrito en
literatura, los siete genes “housekeeping” utilizados para realizar la MLST de S. aureus,
fueron carbamato kinasa, (arcC), siquimato deshidrogenasa (aroE), glicerín kinasa (glp),
guanilato kinasa (gmk), fosfato acetil tranferasa (pta), trifosfato isomerasa (tpi) y acetil
coenzima A acetiltransferasa (yqiL) (Enright, Day, Davies, Peacock, & Spratt, 2000).
La determinación de secuencia tipo (ST) se realizó empleando el servidor del centro de
epidemiología genómica de Dinamarca, (Center for Genomic Epidemiology)
(http://www.genomicepidemiology.org/), con el MLST 1.8 (MultiLocus Sequence Typing)
(Larsen et al., 2012).
3.6.2 Detección de cambios en residuos de aminoácidos de proteínas previamente relacionados con el fenotipo VISA/hVISA
Con el fin de determinar si los aislamientos que fueron confirmados, presentaban
cambios en residuos de aminoácidos de proteínas previamente relacionados con el
fenotipo de sensibilidad disminuida a vancomicina (hVISA/VISA), se efectuaron
alineamientos de las secuencias predichas de aminoácidos de cada uno de los genomas
de los tres aislamientos hVISA confirmados en este estudio y se compararon con las
Capítulo 3 45
secuencias de los genomas de referencia de Mu3 (GenBank: NC_009782.1), Mu50
(GenBank: NC_002758.2) y N315 (GenBank: BA000018.3).
Para realizar estos alineamientos se tomaron como base proteínas previamente
reportadas en la literatura, con cambios en residuos de aminoácidos: VraR, VraR, GraS,
GraR, WalK, WalR, Atl, TcaA, RpoB. Para realizar el alineamiento se utilizó el software
en la página web http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/ (Corpet, 1988).
3.6.3 Detección tipo de grupo agr, PVL, SCCmec
Mediante PCR in silico, y de acuerdo a secuencias de iniciadores reportados previamente
se realizó detección del tipo de grupo agr, tipo de SCCmec, (del inglés staphylococcal
cassette chromosome mec) y PVL, para lo cual se utilizó el programa blastn® 2.5.0
(Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1997) en el servidor NCBI (National
Center for Biotechnology Information). Para estos análisis in silico se utilizaron
secuencias de iniciadores reportados previamente en literatura (Gilot et al., 2002;
Oliveira, 2002; Strommenger, Cuny, Werner, & Witte, 2004), los cuales se relacionan a
continuación en las tablas 3-3 y 3-4:
Tabla 3-3 Secuencias de iniciadores para detección de grupo agr
Nombre Secuencia de iniciadores Referencia
Pan 5´-ATG CAC ATG GTG CAC ATG C-3´
(Gilot et al. 2002)
agr1 5´-GTC ACA AGT ACT ATA AGC TGC GAT-3´
agr2 5´-TAT TAC TAA TTG AAA AGT GGC CAT AGC-3´
agr3 5´-GTA ATG TAA TAG CTT GTATAA TAA TAC CCA G-3´
agr4 5´-CGA TAA TGC CGT AAT ACC CG-3´
agr1 F: 5´-CAC TTA TCA TCA AAG AGC C-3´ (Strommenger, et
al., 2004)
R: 5´-CCA CTA ATT ATA GCT GG-3´
agr2 F: 5´-GTA GAG CCG TAT TGA TTC-3´
R: 5´-GTA TTT CAT CTC TTT AAG G-3´
agr3 F: 5´-CAA GCT ATT ACA TTA CTA CCA-3´
R: 5´-AAT GCT TCC ACT TAC TATC-3´
agr4 F: 5´-GCT CAA TTC ATG CAA TTA-3´
R: 5´-ATG GTA CTG TAA ACA TTA-3´
F: iniciador forward; R: iniciador reverse
46 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Tabla 3-4 Iniciadores para detección de tipo de SCCmec
Locus Secuencia de iniciadores (5´–3´) Especificidad
tipo de SCCmec Referencia
CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG I
Oliveira, 2002
CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC
KDP F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC II
KDP R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG
MECI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC II, III
MECI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC
DCS F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC I, II, IV
DCS R1 CTAAATCATAGCCATGACCG
MECA P4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG Control interno
MECA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG
Los iniciadores utilizados para este análisis se tomaron de Oliveira, 2002.
Para la detección de la Leucocidina de Panton Valentine (PVL), se utilizó la secuencia de
nucleotidos de PVL reportada para el aislamiento de referencia USA300 (secuencia en
Genbank CP000255), y se comparó con la información contenida en los genomas de los
tres aislamientos hVISA (formato fasta), para lo cual se utilizó la herramienta tblastn 2.5.0
en el servidor NCBI (Altschul et al., 1997).
3.6.4 Tipificación de spa y resistoma
Para la tipificación de spa se usó el programa spaTyper 1.0. (Bartels et al., 2014), para la
detección de genes de resistencia a antibióticos se utilizó ResFinder 2.1 (Zankari et al.,
2012), ambos programas están en el servidor del Centro de Epidemiología Genómica de
Dinamarca, Center for Genomic Epidemiology (http://www.genomicepidemiology.org/).
3.6.5 Detección de expresión de delta hemolisina
La detección de la expresión de δ hemolisina, se realizó teniendo en cuenta lo descrito
por Sakoulas et al. (2002), dado que se ha reportado disminución de la funcionalidad de
agr en aislamientos hVISA y VISA, que ha sido evaluada mediante la disminución de la
producción de δ hemolisina (Sakoulas et al., 2002). Para este ensayo se utilizó una cepa
fuerte productora de β hemolisina, (en nuestro caso utilizamos el S. aureus RN4220), que
Capítulo 3 47
fue sembrado en una línea vertical, los aislamientos a evaluar y controles, se sembraron
en líneas perpendiculares junto a este (líneas horizontales); la hemólisis β generada por
el aislamiento RN4220 produce una zona turbia que rodea la siembra vertical que se
realizó; dado que la hemólisis β y δ actúan sinérgicamente, se produce una hemólisis
clara en la intersección de las dos líneas de siembra cuando la hemolisina δ está
presente (Adhikari, Arvidson, & Novick, 2007; Nielsen et al., 2013). Luego de realizar la
siembra, las cajas de agar se incubaron a 37°C por 24 horas, luego de lo cual se revisó la
producción de hemólisis, como se observa en la figura 3-2.
Figura 3-2 Interpretación de resultados ensayo hemólisis
Figura tomadas de Adhikari, Arvidson, y Novick, 2007. Esquema de la actividad hemolítica en sangre de cordero. Las bacterias a probar (rayas negras horizontales) se siembran en ángulo recto al aislamiento RN4220 (raya negra vertical). La beta hemólisis produce una zona turbia alrededor de RN4220. La δ hemólisis y β hemólisis son sinérgicas y producen una zona clara de hemólisis (Adhikari, et al., 2007).
Capítulo 4 49
4. Capítulo 4. Resultados
Los resultados se presentan de acuerdo a los tres objetivos específicos planteados en el
presente trabajo y posteriormente se relacionan los resultados adicionales.
4.1 Resultados objetivo 1. Confirmación de fenotipo
hVISA/VISA por perfil de análisis de poblaciones
(PAPs)
De los nueve aislamientos que fueron evaluados por la metodología de perfil de análisis
de poblaciones-área bajo la curva, tres fueron confirmados con fenotipo hVISA, los seis
aislamientos restantes fueron confirmados como VSSA, no se halló ningún aislamiento
VISA, como se observa en la tabla 4-1. En caso de discrepancias, los resultados de
caracterización se realizaron basándose en el resultado obtenido en dos de los tres
ensayos.
Tabla 4-1 Resultados de PAP-AUC en los nueve aislamientos evaluados.
Aislamiento
Resultado AUC aislamiento/AUC Mu3 Promedio PAP/AUC
Fenotipo de resistencia
a vancomicina
Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
E987 1,15 1,21 1,10 1,15 h-VISA
P1108 1,52 0,65 1,15 1,11 h-VISA
P1209 1,60 1,00 0,97 1,19 h-VISA
P1112 0,62 0,69 0,74 0,68 VSSA
P1923 1,08 0,87 0,73 0,89 VSSA
P1933 0,86 0,84 0,74 0,81 VSSA
P1215 0,84 0,98 0,80 0,87 VSSA
C591 0,69 1,12 0,65 0,82 VSSA
C329 0,53 0,50 0,62 0,55 VSSA
50 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Tres aislamientos E987, P1108, P1209, fueron confirmados como hVISA, mediante PAP-
AUC; en cada montaje se utilizó un control sensible a vancomicina (ATCC 29213) y el
control Mu3 que corresponde al control positivo utilizado en PAP-AUC, que proviene del
primer aislamiento hVISA reportado (Hiramatsu et al., 1997b; Wootton et al., 2001), como
se observa en la figura 4-1.
A B
C
Figura 4-1 Perfil de análisis de poblaciones de los aislamientos hVISA
Los hallazgos obtenidos en el presente estudio muestran una prevalencia de 0,52% de
hVISA, con respecto al total de MRSA colectados en el estudio previo realizado por la
Unidad de Genetica y Resistencia Antimicrobiana- UGRA (Reyes et al., 2009); el fenotipo
hVISA estaba presente en aislamientos procedentes de dos países, uno (1,15%) de
Ecuador y dos (1,13%) de Perú. Los dos aislamientos colectados en Colombia resultaron
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8
Lo
g10 d
e U
FC
/mL
PAP E987
ATCC 29213
E987
Mu3
Concentración de Vancomicina en ug/mL
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8
Lo
g 1
0 U
FC
/mL
Concentración de Vancomicina en ug/mL
PAP P1108
ATCC 29213
P1108
Mu3
0
2
4
6
8
10
0 0,5 1 1,5 2 3 4 6 8
Lo
g 1
0 U
FC
/mL
Concentración de Vancomicina en ug/mL
PAP P1209
ATCC 29213
P1108
Mu3
Capítulo 4 51
negativos para dicho fenotipo, como se observa en la tabla 4-2. Con respeto al tipo de
muestra de donde fueron recuperados los aislamientos hVISA, E987 fue colectada en
hemocultivo, P1108 de herida quirúrgica y P1209 de aspirado bronquial.
Tabla 4-2 Porcentaje de aislamientos confirmado como hVISA, discriminado por país.
País de procedencia No. Aislamientos
MRSA*
No. Aislamiento
hVISA
% de casos
hVISA
Colombia 318* 0 -
Ecuador 87* 1 1,15
Perú 177* 2 1,13
Total 582** 3 0,52**
*Los datos del número total se MRSA colectados por país que se utilizaron para los cálculos fueron tomados del estudio multicéntrico desarrollado por Reyes y colaboradores, entre 2006 y 2008, en donde se obtuvieron los nueve aislamientos que fueron tamizados como probables VISA, y que en el presente estudio fueron sometidos a prueba confirmatoria mediante PAP-AUC (Reyes et al., 2009).
**Los cálculos se realizaron solamente para los tres países incluidos en el presente estudio, por lo cual se excluyó Venezuela, que tenía 69 MRSA, de los cuales ninguno resultó hVISA, si se incluyera, el porcentaje calculado de hVISA para los cuatro países sería de 0,46%.
4.2 Resultados objetivo 2. Epidemiología molecular de
aislamientos hVISA, PFGE, MLST
4.2.1 Resultados de PFGE
Con respecto a la PFGE, se realizó inspección manual del gel y posteriormente se realizó
el análisis con el programa GelCompar II® (Applied Maths), con una tolerancia de 1,5%,
y un coeficiente de similaridad de 75%; se determinó que ocho de los aislamientos se
relacionan con el clon chileno/cordobés (incluidos los tres aislamientos confirmados como
hVISA), como se observa en el dendograma (figura 4-2).
Por otro lado, el aislamiento C329 (VSSA) no presenta relación clonal con ningún otro
aislamiento o control utilizado en este gel de PFGE.
52 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Figura 4-2 Resultados de PFGE
4.2.2 Resultados de secuenciación, ensamblaje y anotación genómica
Con los reads crudos obtenidos, se realizó un control de calidad inicial para eliminar las
bases de baja calidad (probabilidad de error de 0,01 según el índice de Phred), las
secuencias con menos de 60 bases de longitud fueron removidas para evitar errores. Los
reads que cumplieron con los parámetros de calidad se utilizaron para el ensamblaje de
novo y anotación a través de la página web del National Microbial Pathogen Data
Resourse http://www.nmpdr.org/FIG/wiki/view.cgi; mediante RAST (Aziz et al., 2008),
luego de lo cual se obtuvieron los genomas de los tres aislamientos hVISA ensamblados
en formato fasta, los datos generales obtenidos de este proceso, se resumen en la tabla
4-3.
Capítulo 4 53
Tabla 4-3 Resultados generales del proceso de secuenciación de los aislamientos
Aislamiento Longitud del
ensamblaje
Número de
lecturas
(reads)
Número
de
contigs
%GC Cobertura Número de acceso en Genbank
E987 2.829.559 1.662.996 492 32,8 109X NMOR00000000
P1108 2.914.702 1.647.012 496 32,8 104X NMOQ00000000
P1209 2.977.935 1.733.500 345 32,9 127X NMOP00000000
Estos datos fueron obtenidos del proceso de secuenciación, ensamblaje y anotación.
4.2.3 Resultados de MLST
En cuanto a las secuencias tipo (ST) obtenidas por MLST, los dos aislamientos hVISA
procedentes de Perú presentan una ST5, mientras que el aislamiento hVISA de Ecuador
tiene una ST 228; la identidad fue de 100%, en todos los casos, los detalles se presentan
en la tabla 4-4.
Tabla 4-4 Perfil alélico de los aislamientos hVISA
%Ident: porcentaje de identidad; *ST: Secuencia tipo; long: longitud
Aislamiento E987 P1108 P1209
Locus
%
Iden
t
Long
HSP
Long
alelo Gaps Alelo
%
Ident
long
HSP
Lon
g
alelo
Gaps Alelo %
Ident
Long
HSP
Long
Alelo Gaps Alelo
Arc 100. 456 456 0 arcc_1 100. 456 456 0 arcc_1 100 456 456 0 arcc_1
Aroe 100. 456 456 0 aroe_4 100. 456 456 0 aroe_4 100 456 456 0 aroe_4
Glpf 100. 465 465 0 glpf_1 100. 465 465 0 glpf_1 100 465 465 0 glpf_1
Gmk 100. 417 417 0 gmk_4 100. 417 417 0 gmk_4 100 417 417 0 gmk_4
Pta 100. 474 474 0 pta_12 100. 474 474 0 pta_12 100 474 474 0 pta_12
Tpi 100. 402 402 0 tpi_24 100. 402 402 0 tpi_1 100 402 402 0 tpi_1
Yqil 100. 516 516 0 yqil_29 100. 516 516 0 yqil_10 100 516 516 0 yqil_10
*ST ST 228 ST 5 ST 5
54 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
4.3 Resultados Objetivo 3. Tipo agr en aislamientos
confirmados como hVISA y detección fenotípica de
hemolisina delta
Para la tipificación del agr de los tres aislamientos hVISA, se utilizaron dos juegos de
iniciadores reportados en literatura, que permiten identificar los cuatro tipos de agr (Gilot
et al., 2002; Strommenger et al., 2004), los análisis se realizaron con la herramienta
blastn.
Los resultados obtenidos in silico, evidencian que los tres aislamientos hVISA presentan
agr II; con ambos juegos de iniciadores se obtuvo una identidad de 100%, alineamiento
completo de los iniciadores, no se presentaron mismatch o gaps, y el e-value evidencia
significancia, como se observa en la tabla 4-5 y figura 4-3. Con los iniciadores reportados
por Strommenger et al. (2004), se genera un producto de amplificación de 428 pb,
(Strommenger et al., 2004).
Tabla 4-5 Aislamientos hVISA con agr II
hVISA Contig
Referencia iniciadores probados
agr
% iden
Long
alin
No. Mismatc
h
No. Gap
Inicio en contig
Final en contig
e-value Bitscor
e Referencia
E987
106 agr2 100.0 27 0 0 2664 2690 6,00E-10 51.0 Gilot, 2002
106 agr2
Forward 100.0 18 0 0 2800 2817 6,00E-05 34.4 Strommeng
er et al., 2004 106
agr2 Reverse
100.0 19 0 0 3245 3263 2,00E-05 36.2
P1108
49 agr2 100.0 27 0 0 858 884 2,00E-09 54.0 Gilot, 2002
49 agr2
Forward 100.0 18 0 0 994 1011 2,00E-04 36.2
Strommenger et al., 2004
49 agr2
Reverse 100.0 19 0 0 1439 1457 7,00E-05 38.2
P1209
85 agr2 100.0 27 0 0 28632 28658 2,00E-09 54.0 Gilot, 2002
85 agr2
Forward 100.0 18 0 0 28505 28522 2,00E-04 36.2
Strommenger, 2004 85
agr2
Reverse 100.0 19 0 0 28059 28077 7,00E-05 38.2
% iden: porcentaje de identidad; long alin: Longitud del alineamiento; Finaliz. Contig: finalización en contig
Capítulo 4 55
56 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Figura 4-3 Tipificación agr II aislamientos hVISA
En la figura, se presentan los alineamientos por blastn, de las secuencias del genoma completo
de los aislamientos hVISA en formato fasta, con la secuencia de los iniciadores descritos
previamente para detección del tipo agr; A. aislamiento E987; B. aislamiento P1108; C.
aislamiento P1209
Por otro lado, debido a los reportes de disminución de la funcionalidad de agr en
aislamientos hVISA y VISA, se evaluó la producción de δ en agar sangre de cordero. En
los casos en que se produce delta hemolisina, se genera una zona de hemólisis
mejorada en las zonas donde esta se solapa con la zona de beta hemólisis producida por
el aislamiento de S. aureus RN4220. Para este ensayo se utilizaron cajas de agar sangre
de cordero, en las cuales realizó siembra de una línea vertical del aislamiento RN4220 y
posteriormente los aislamientos evaluados controles (Mu3, Mu50 y ATCC 29213) se
sembraron en líneas perpendiculares.
Como se observa en la figura 4-4, los aislamientos ATCC 29213 (control aislamiento
MSSA) y el aislamiento P1108 (hVISA), presentan incremento de la hemólisis en donde
se solapa con la hemólisis de RN4220 (intersección), evidenciando hemólisis δ; por el
Capítulo 4 57
contrario se observa disminución de la actividad hemolítica en la intersección con los
aislamientos E987 y P1209 (ambos hVISA), lo que demuestra una actividad disminuida
de la hemolisina δ en estos aislamientos y los controles Mu3 y Mu50.
Figura 4-4 Ensayo de δ hemolisina.
Ensayo de δ hemólisis realizado en agar sangre. A. Cepa RN4220 aislamiento productor de β hemolisina; B. Aislamiento ATCC 29213; C. aislamiento E987; D. Aislamiento P1108. E. Mu3 resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina hVISA; F. Mu50 con resistencia intermedia a vancomicina VISA; G. Aislamiento P1209.
4.4 Resultados adicionales: tipo spa, PVL, resistoma y mutaciones de genoma relacionadas con el fenotipo hVISA
4.4.1 Resistoma
De acuerdo a los análisis realizados de resistoma, fue común para los tres
aislamientos la presencia del gen blaZ, que en S. aureus codifica para la producción
de betalactamasas que le confieren resistencia a penicilina (Pereira, Harnett, Hodge,
Cattell, & Speers, 2014).
Si bien en este trabajo no se realizaron perfiles de resistencia a antibióticos a estos
aislamientos, en la Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana-UGRA
(Universidad el Bosque), se les había realizado previamente MIC para diferentes
58 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
antibióticos, en el marco de la vigilancia en que fueron colectados (Reyes et al., 2009)
y dado que se tenía disponible dicha información, se analizaron los resultados de MIC
obtenidos previamente, con los de resistoma obtenidos en el presente estudio.
Se observaron coincidencia en los resultados obtenidos de resistoma (detección de
genes de resistencia a antibióticos), con respecto a los hallazgos previos en las MIC:
los tres aislamientos fueron resistentes a oxacilina, ciprofloxacina y eritromicina y a su
vez, todos los aislamientos presentan los genes mecA, norA y ermA que les confiere
resistencia a betalactámicos, fluoroquinolonas y macrólidos respectivamente; con
respecto a los aminoglicósidos, dos de los aislamientos presentan resistencia a
gentamicina, mientras que P1108 presenta una MIC intermedia, lo cual es coherente,
dado que los tres portan diferentes genes de resistencia a aminoglicósidos (tabla 4-6)
Tabla 4-6 Resistoma y MIC para los aislamientos hVISA
Cepa Antibiótico Genes de resistencia a antibióticos presentes en los aislamientos y resultados de
MIC
Betalactámicos Aminoglicósidos Fluoroquinolonas Macrólidos Fenicol
Gen / MIC Oxacilina BlaZ Gentamicina Ciprofloxacina Eritromicina Cloranfenicol
E987 genes mecA blaZ
aac (6´)
norA ermA ---- aph(2´´)
Spc
ant(6)-la
MIC >64 (R) ___ 32 (R) >32 (R) >64 (R) 8 (S)
P1108 genes mecA blaZ
aph(3´´)
norA ermA cat(pC221) Spc
ant(6)-la
MIC >64 (R) ___ 8 (I) 32 (R) >64 (R) 64 (R)
P1209 genes mecA blaZ
aph(3´III)
norA ermA ---- ant(6)-la
Spc
MIC >64 (R) ___ >64 (R) 16 (R) >64 (R) 8 (S)
Nota: la Información contenida en esta tabla respecto a Concentraciones Mínimas Inhibitorias, fue
suministrada cordialmente por la Unidad de Genética y Resistencia Antimicrobiana UGRA- Dra.
Jinnethe Reyes, de trabajos previos realizados por el grupo. En rosado resultado de MIC:
resistente (R), intermedio (I).
Capítulo 4 59
4.4.2 Tipificación de spa
Durante la última década, la tipificación de spa se basó en los polimorfismos de la X-
región del gen spa (región con un número variable de repeticiones en tándem),
convirtiéndose en una herramienta de tipificación utilizada frecuentemente (Mehraj et al.,
2016); En los aislamientos hVISA, se detectaron tres tipos de spa diferentes, E987 fue
spa t001 y P1108 fue t149, tabla 4-7; sin embargo, el aislamiento P1209 (de Perú), tiene
un tipo de spa que no ha sido reportado en la base de datos de Spa Finder.
Tabla 4-7 Tipificación de spa en los aislamientos hVISA
Aislamiento Tipo spa Repeticiones Contig Posición Orientación
E987 t001 26-30-17-34-17-20-17-12-17-
16 contig_78 1833-2113 Negativa
P1108 t149 14-44-12-17-23-18-17-17-17-
17-17-17-17-17-23-24 contig_93 2165-2493 Positiva
P1209 Desconocido NA NA NA NA
4.4.3 Cambios en proteínas asociadas con el fenotipo hVISA/VISA
Luego de realizar alineamientos de proteínas de genes y operones que en la literatura
habían sido relacionados con el fenotipo hVISA/VISA, se encontraron algunos residuos
de aminoácidos que previamente han sido descritos en cepas con fenotipo VISA. A partir
de alineamiento de las secuencias predichas de proteínas en los genomas ensamblados,
para cada uno de los genomas de los tres aislamientos hVISA (E987, P1108, P1209), y
se compararon con las secuencias de los aislamientos de referencia Mu50 (VISA), Mu3
(hVISA) y N315 (VSSA); en total se hallaron cinco sustituciones en residuos de
aminoácidos, en cuatro de las proteínas evaluadas con asociación a fenotipo
60 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
hVISA/VISA, algunas de ellas están presentes en los tres aislamientos, como se resumen
en la tabla 4-8:
WalK: el alineamiento con la secuencia de WalK de las cepas de referencia, mostró
dos sustituciones en residuos de aminoácidos en la secuencia de WalK (sensor
histidina kinasa del TCS WalKR); la primera en el aislamiento de Perú P1108, en el
que se halló la sustitución L14I (cambio de una leucina por isoleucina). En el
aislamiento E987 se encontró la sustitución G233D (cambio de una glicina por
aspartato) como se observa en la figura 4-5. Estos cambios de residuo en las dos
posiciones mencionadas son cambios frente al aislamiento sensible N315, sin
embargo, la secuencia consenso se mantuvo en las tres cepas de referencia hVISA
Mu3, VISA Mu50 y en la cepa sensible N315.
Capítulo 4 61
Figura 4-5 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de WalK
Atl: se halló también la presencia de sustitución de un residuo de aminoácido de la
proteína Atl, producto del gen atl, (una de las principales autolisinas de S. aureus); el
alineamiento de las secuencias de aminoácidos mostró la sustitución del residuo
Y814H, que produjo cambio de una tirosina por histidina en los dos aislamientos de
Perú P1108 y P1209 (figura 4-6), frente al aminoácido presente en N315 (sensible a
VAN). Sin embargo, la secuencia consenso para este residuo se mantuvo en las
cepas de referencia hVISA Mu3, VISA Mu50 y en la cepa sensible N315 al igual que
para el aislamiento estudiado E987.
Figura 4-6 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de Atl
62 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
TcaA: es una proteína transmembranal codificada por el gen tcaA (que ha sido
asociado cambios en los niveles de resistencia a glicopéptidos). El alineamiento de
las secuencias de aminoácidos de TcaA mostró que los tres aislamientos E987,
P1108 y P1209, presentaban una sustitución en el residuo de aminoácido L218P,
cambio de leucina por prolina (figura 4-7). Este es un cambio de residuo frente a la
cepa sensible N315, sin embargo, la secuencia consenso está presente en N315,
hVISA Mu3, VISA Mu50.
Figura 4-7 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de TcaA
RpoB: la subunidad β de la ARN polimerasa es codificada por el gen rpoB; algunos
reportes de literatura refieren cambios en residuos de aminoácidos en RpoB
asociados a cepas hVISA/VISA, por esta razón se alinearon las secuencias predichas
de proteínas de los aislamientos con las cepas de referencia. En el aislamiento E987
se encontró sustitución en el residuo de aminoácido H481N, (histidina por
asparagina) y el aislamiento Mu50 presenta cambio de un residuo de aminoácido en
la misma posición H481Y, con sustitución de histidina por tirosina (figura 4-8); esta es
una sustitución que llama la atención, dado que es una sustitución frente a la
secuencia de N315 y Mu50 cepa VISA presenta cambio de residuo en la misma
posición, aunque por un aminoácido diferente.
Capítulo 4 63
Figura 4-8 Sustitución de residuos de aminoácidos en la secuencia de de RpoB.
Tabla 4-8 Resumen de hallazgos de sustituciones de residuos de aminoácidos en proteínas previamente relacionadas con hVISA/VISA
Proteína Aislamiento
Sustitución
encontrada en
aminoácidos
Sustitución en
aminoácidos reportada
en literatura / (fenotipo)
Referencia
WalK E987 Gly 233 Asp Gly 223 Asp (VISA)
1
Howden et al., 2011
P1108 Leu 14 Ile Leu 14 Phe (VISA) Howden et al.,
2011
RpoB E987 His 481 Asn His 481 Asn (hVISA/VISA)
His 481 Phe (Mu50)
Hafer et al., 2011; Hiramatsu et al.,
2014b; Howden et al., 2011
TcaA E987, P1108
P1209 Leu 218 Pro Leu 218 Pro (hVISA)
Yoo et al., 2013; Bakthavatchalam
et al., 2017
Atl E987, P1108
P1209 Tyr 814 His -- --
Códigos de aminoácidos de tres letras. Gly: glicina, Asp: aspartato, Leu: leucina, Ile: isoleucina, Phe:
fenilalanina, His: histidina, Asn: asparagina, Pro: prolina, Tyr: tirosina.
Secuencias conservadas en otras proteínas
Por el contrario, los tres aislamientos hVISA presentan las secuencias de aminoácidos
conservadas en VraS, VraR, GraS, GraR, WalR, no presentaron cambios de residuos de
aminoácidos frente a la secuencia de aminoácidos de la cepa sensible N315 o de las
cepas Mu3, Mu50, luego de realizar los alineamientos con proteínas predichas de
genomas de los aislamientos de referencia (anexo A).
64 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
4.4.4 Resumen de análisis adicionales a los objetivos planteados
De acuerdo a los análisis de las secuencias del genoma de los tres aislamientos hVISA,
estos fueron categorizados en el complejo clonal CC5, dado que las dos secuencias tipo
encontradas (ST5 y ST228) pertenecen a este complejo (Monecke et al., 2011). De otro
lado, los tres aislamientos fueron PVL negativos. La siguiente tabla 4-8 resume, los
principales hallazgos moleculares de los tres aislamientos.
Tabla 4-9 Principales hallazgos a nivel de análisis de genoma de los aislamientos hVISA
hVISA País SCCmec PVL Tipo de
spa Tipo agr
MLST
Sustituciones en
secuencia de aminoácidos
Aminoácido cambiado*
E987 Ecuador I Neg. t001 II ST-228 WalK G233D
TcaA L218P
RpoB H481N
P1108 Perú I Neg. t149 II ST-5 WalK L14I
Atl Y814H
TcaA L218P
P1209 Perú I Neg. - II ST-5 Atl Y814H
TcaA L218P
Sustituciones de un residuo de aminoácido, identificados en proteínas relacionadas previamente al fenotipo
hVISA/VISA; Neg.: negativo
Capítulo 5 65
5. Capítulo 5. Discusión
El Staphylococcus aureus es un microorganismo muy exitoso porque puede actuar como
comensal o patógeno, debido a que se adapta fácilmente a las presiones selectivas que
se le imponen (Malachowa & DeLeo, 2010); S. aureus es un comensal, hace parte de la
microbiota normal de piel y mucosas, y puede encontrarse también en las fosas nasales,
piel axilas, perineo y faringe (Lin et al., 2016), es uno de los principales patógenos
nosocomiales y adquiridos en la comunidad (Zhang et al., 2015).
Se estima que entre 20 y 30% de la población general, es portadora sana de S. aureus
(Gosbell & Van Hal, 2013), lo cual se ha asociado a mayor riesgo de infecciones por este
microorganismo; por ejemplo, la colonización nasal se ha relacionado a mayor riesgo de
bacteriemia nosocomial, que aumenta en 3 y 19 veces, en portadores nasales de MSSA
y MRSA respectivamente (Marzec & Bessesen, 2016).
Con el paso del tiempo S. aureus, ha adquirido resistencia a diferentes tipos de
antibióticos, sin embargo, la resistencia a meticilina y a vancomicina (VRSA, VISA,
hVISA) son las más notables (Hiramatsu et al., 2014b). Tanta es su importancia, que la
Organización Mundial de la Salud lo incluye en la primera lista de 12 familias de
patógenos prioritarios para investigación y desarrollo de nuevos antibióticos publicada en
2017, ubicándolo en el nivel “prioridad 2- elevada” (World Health Organization, 2017).
El problema de la resistencia antimicrobiana en los aislamientos de MRSA-HA está
acompañado de alta morbilidad y mortalidad (Ragbetli, Parlak, Bayram, Guducuoglu, &
Ceylan, 2016). El CDC desarrolló una vigilancia entre 2009 y 2010, evaluando patógenos
resistentes a antimicrobianos en infecciones asociadas al cuidado de la salud,
encontrando que S. aureus fue el patógeno más prevalente en neumonías asociadas al
ventilador e infecciones de sitio quirúrgico (24,1% y 30,4% respectivamente) (Sievert et
al., 2013).
66 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Un estudio colaborativo internacional de endocarditis infecciosa (EI), realizado en 58
hospitales de 25 países (América del Norte, América del Sur, Europa y otros países), con
una muestra de 2.781 pacientes, encontró S. aureus en 31% de las infecciones (Murdoch
et al., 2009). Otro estudio, realizado en EEUU, entre 1998 y 2009, halló que S. aureus es
el agente infeccioso más prevalente en EI, pasando de 37,6% a 49,3% entre 1998 y
2009, 53,3% de estas infecciones fueron caudas por MRSA (Bor, Woolhandler, Nardin,
Brusch, & Himmelstein, 2013).
La primera opción para tratar infecciones invasivas con MRSA es la vancomicina (Diaz et
al., 2017) y sigue siendo el antibiótico de elección para tratamiento de pacientes con
bacteriemias por MRSA y endocarditis en aislamientos con MIC ≤2 µg/mL (Choo &
Chambers, 2016); sin embargo, en los últimos 20 años, han aparecido reportes de
aislamientos con reducida susceptibilidad a la vancomicina, e incluso de resistencia a la
misma (Hiramatsu et al., 1997a; Hiramatsu et al., 1997b).
Desde el primer reporte de aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina
hVISA/VISA (en 1996), este tipo de cepas han sido recuperadas de diversas patologías
infecciosas como endocarditis, bacteriemias, neumonías, entre otras (Bae et al., 2009;
Chen et al., 2013; Chung et al., 2012; Da Costa et al., 2016; Howden, Johnson, Ward,
Stinear, & Davies, 2006); estudios recientes no evidencian aumento en la mortalidad en
pacientes infectados con VISA/hVISA; sin embargo, sí se observa que la infección con
este, lleva a fallas en el tratamiento con vancomicina generando tiempos de infección,
tratamiento y hospitalización más largos (Burnham, Burnham, Warren, & Kollef, 2016;
Chong et al., 2015; Howden et al., 2014)
En América Latina también se han reportado investigaciones, en particular el estudio
multicéntrico del área Andina, que detectó nueve aislamientos probables hVISA/VISA
(Reyes et al., 2009), sobre el cual se desarrolló el presente trabajo que efectuó
confirmación de fenotipo hVISA/VISA en los aislamientos mencionados, que procedían
de Colombia, Ecuador y Perú (mediante PAP-AUC) y a su vez se realizó tipificación
molecular de aquellos aislamientos que resultaron confirmados como hVISA.
La prevalencia general de hVISA en el presente estudio fue de 0,52% en aislamientos
MRSA de tres países de la región, 1,15% para Ecuador y 1,13% en Perú; es importante
Capítulo 5 67
mencionar que una investigación realizada en un hospital de Lima Perú en 2008,
relacionaba que no había riesgo de aparición de cepas se S. aureus resistentes a
vancomicina, para ese momento (Alvarado-Gamarra, Alcalá-Marcos, Alvarado-Gamarra,
& Champi Merino, 2011).
Estos hallazgos son similares a los reportados en países de Norteamérica, como México
que reportó un caso (Delgado et al., 2007), y en Sur América en Chile (Vega et al., 2015)
y Argentina en donde se reportaron cuatro aislamientos provenientes de dos estudios,
uno de los cuales relaciona una prevalencia de 3,3% de hVISA (Di Gregorio et al., 2015;
Sola et al., 2011); sin embargo, nuestros hallazgos son inferiores a los reportados en
Brasil, en donde identificaron y confirmaron 12 hVISA que fueron descritos en el sur del
país (Silveira, Cunha, Caierao, Cordova, & d'Azevedo, 2015) y en un estudio más
reciente, realizado en pacientes con bacteriemias, se halló un aislamiento hVISA
confirmado por PAP-AUC y seis aislamientos VISA confirmados mediante microdilución
en caldo con una MIC de 4 µg/mL (Da Costa et al., 2016).
La prevalencia de hVISA a nivel mundial es heterogénea, un estudio realizado en EEUU
muestra el ascenso pasando de 2,2 a 8,3% entre 1986 y 2007 (Rybak et al., 2008); en
Corea se referencia una prevalencia de hasta 38% (Chong et al., 2015; Park et al., 2012),
en Japón varía entre 0 y 6,51% (Hanaki et al., 2014; Ike et al., 2001), en Europa hay
reportes que oscilan entre 0% a 18% (Aucken et al., 2000; Lewis, Chaudhry, Nightingale,
Lambert, & Das, 2011); un estudio realizado entre 1996 y 2008 en Australia, encontró
11,8% de hVISA y otro realizado en 2005 halló 47,9% de hVISA (Horne et al., 2009; Van
Hal, Jones, Gosbell, & Paterson, 2011); estos reportes dan cuenta de lo heterogénea que
es la prevalencia de aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina en
diferentes áreas del mundo y que ha tendido al ascenso en algunos países; la
heterogeneidad en estas cifras podría estar relacionada con la dificultad para la detección
de estos aislamientos con las pruebas de tamizaje utilizadas en la rutina clínica y con las
diferentes técnicas que se han utilizado para su confirmación a lo largo del tiempo, así
como el hecho de que la técnica estándar de oro para confirmación de estos fenotipos
(hVISA/VISA) el PAP-AUC es demasiado dispendiosa, requiere una inversión importante
de tiempo y recursos económicos, lo que hace que no sea aplicable en el quehacer diario
de los laboratorios clínicos. Estos hechos anteriormente mencionados, podrían generar
68 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
en países en desarrollo como el nuestro, pudieran presentarse aislamientos hVISA no
detectados con las pruebas de laboratorio utilizadas convencionalmente, sin embargo,
esto es sólo una hipótesis.
Por otra parte, de los nueve MRSA caracterizados previamente como probables VISA
(Reyes et al., 2009), solamente tres presentaron el fenotipo hVISA, luego de ser
confirmados mediante PAP-AUC en el presente trabajo, dato similar a lo reportado en
otro estudio en donde aproximadamente una tercera parte de los aislamientos
previamente caracterizados por otras técnicas de cribado, fueron confirmados como
hVISA mediante PAP-AUC (Pitz et al., 2011).
Dado que las muestras de los tres aislamientos hVISA, fueron colectadas en un estudio
multicéntrico colaborativo latinoamericano, no tenemos trazabilidad de algunos aspectos
del tratamiento clínico, presencia de infecciones a repetición o tratamiento antibiótico
prolongado que hubiese hecho surgir este fenotipo; sin embargo, sabemos que el
aislamiento de Ecuador procedía de una muestra de sangre y los dos hVISA de Perú
fueron colectados uno de una herida quirúrgica y otro de aspirado bronquial; aunque no
hay muchos estudios que evalúen hVISA de acuerdo a tipo de muestra colectada, una
revisión sistemática halló 9,81% de hVISA recuperados de sangre, cifra
significativamente más alta comparada con los otros tipos de muestras clínicas, de
acuerdo a lo que describen los autores (Zhang et al., 2015).
La ausencia de aislamientos hVISA en Colombia, es coherente con datos de vigilancia
rutinaria publicados por el Grupo para el Control de la Resistencia Antimicrobiana en
Bogotá (GREBO), en donde relacionan que no hay resistencia a vancomicina, a pesar de
que las cifras de MRSA no han descendido con un 23,4% y 23,1% en 2013 y 2014
respectivamente (Leal & Ovalle, 2015); lo cual, pudiera deberse a la implementación de
las recomendaciones dadas a nivel local para la contención de MRSA, como son el
aislamiento de contacto de estos pacientes, lavado de manos y uso restringido de
vancomicina (Leal & Ovalle, 2015)
La detección de cepas con bajos niveles de resistencia a vancomicina hVISA/VISA es
compleja, y esto se extrapola a laboratorios clínicos y de referencia, como se observa en
los resultados del programa Latinoamericano de Control de Calidad en Bacteriología y
Capítulo 5 69
Resistencia a los Antimicrobianos (LA-EQAS), que incluyó la remisión de un aislamiento
VISA (OPS-165) en uno de sus paneles; en este control de calidad participaron 17
Laboratorios Nacionales de Referencia, que obtuvieron una concordancia en la MIC de
66,7% (Corso et al., 2011), lo que ratifica la dificultad de la detección de hVISA, aun para
laboratorios de referencia nacionales, que supervisan los laboratorios clínicos de su país.
En el presente estudio, los tres aislamientos confirmados como hVISA presentan agr II y
aunque las primeras publicaciones mostraban relación entre este tipo agr y los
aislamientos con reducida susceptibilidad a la vancomicina (Sakoulas et al., 2003),
estudios posteriores han evidenciado la presencia de los otros tipos de agr en
aislamientos hVISA/ VISA (Cazares-Dominguez et al., 2015; Hu et al., 2015a; Maor et al.,
2009). Hay que mencionar además que agr controla la virulencia y múltiples vías
metabólicas del estafilococo, algunos estudios relacionan la disfunción en agr con
bacteriemias persistentes, disminución en la actividad bactericida de la vancomicina,
resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina y desarrollo del fenotipo VISA (Hu et
al., 2015a); inclusive se ha sugerido que S. aureus con disfunción en agr pudiera tener
ventajas intrínsecas para sobrevivir bajo presiones selectivas de vancomicina y más aún
si se presentan altas concentraciones de inóculo bacteriano (Tsuji, Harigaya, Lesse,
Sakoulas, & Mylotte, 2009; Tsuji et al., 2007).
La producción δ hemolisina ha sido utilizada para evaluar la expresión o funcionalidad del
operón agr, (dado que el gen estructural que codifica para la δ hemolisina hld, es
regulado por el ARNIII) (Burnside et al., 2010; Traber et al., 2008), para lo cual se han
utilizado diferentes técnicas (Cafiso et al., 2012b; Harigaya, Ngo, Lesse, Huang, & Tsuji,
2011; Sakoulas et al., 2002); en nuestro estudio, dos de los aislamientos hVISA (E987 y
P1209) evidencian una reducción en la producción de δ hemolisina, (lo que pudiera
sugerir una reducida expresión de agr), mientras que el aislamiento P1108 mostró
producción de δ hemolisina, lo que podría indicar una expresión normal de agr, sin
embargo esta es una prueba que ha sido descrita en literatura, pero que es cualitativa y
que por el momento no permite concluir sobre la funcionalidad de expresión de agr, con
estos datos solamente. Sin embargo, actualmente se han desarrollado otro tipo de
técnicas para evaluar la expresión de agr, que no estaban planteadas en el presente
estudio y que a futuro podrían aplicarse a estos aislamientos para poder cuantificar dicha
70 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
expresión, entre ellas la RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) (Dai et al., 2017; Thanert et al.,
2017).
Estos hallazgos son similares a los reportados por Harigaya et al. (2011), quienes
hallaron arg disfuncional en 58% de los aislamientos hVISA, cifra significativa comparada
con los resultados de VSSA evaluados en dicho estudio (Harigaya et al., 2011).
Sin embargo, el mecanismo de reducida expresión de agr en aislamientos VISA es
desconocido, dado que muchas de estas cepas, no tienen mutaciones en agr que
expliquen la disminución en su expresión (Howden et al., 2014). En el presente estudio,
solo se realizó una prueba cualitativa sencilla para evaluar la expresión de δ hemolisina;
sin embargo, no se evaluó molecularmente dicha expresión o con otro tipo de técnica
fenotípica.
Los tres hVISA del presente trabajo pertenecen al complejo clonal 5 (CC5), los dos
aislamientos peruanos (P1108 y P1209) presentan SCCmec I, ST5, agr II, (P1108
presentó spa t149); estos hallazgos son coherentes con lo reportado en otros estudios;
en Perú entre 2008 y 2009, García et al. (2012), hallaron 81% de MRSA que pertenecían
al CC5 y 68,8% tenían SCCmec I y spa t149 (aislamientos de sangre), evidenciando la
circulación del clon chileno/cordobés en este país (Garcia et al., 2012); en este mismo
sentido, este autor realizó un estudio posterior en Lima (entre 2009-2010) en portadores
nasales asociados al cuidado de la salud y pacientes con bacteriemia, obteniendo
resultados similares, los genotipos más frecuentemente detectados fueron cepas multi-
resistentes con SCCmec I, spa t149 y otro grupo con SCCmec que no fue posible
tipificar, ST72, spa148 (García et al., 2016); así mismo, estos hallazgos coinciden con lo
descrito por nuestro grupo, que da cuenta de la circulación de aislamientos MRSA-AH en
Perú (Reyes et al., 2009). Es importante resaltar que la caracterización genómica del
aislamiento P1108 es similar a lo descrito por Di Gregorio et al. (2015) para uno de los
aislamientos hVISA reportados en Argentina (Di Gregorio et al., 2015), lo que da cuenta
de la circulación en la región de aislamientos de este grupo clonal. Por otro lado, el tipo
spa en P1209 no pudo ser determinado debido a que la secuencia de nucleótidos no
contaba con el gen spa.
El aislamiento ecuatoriano E987 presentó una ST228, SCCmec I, agr II, spa t001; el
MRSA-I ST228 se ha denominado clon epidémico del Sur de Alemania o clon italiano, es
Capítulo 5 71
un MRSA nosocomial, descrito como prevalente en países de Europa central (Alemania,
Italia, Hungría, Eslovenia, Austria y Suiza,) e incluso ha sido asociado a brotes (Cafiso et
al., 2012; Campanile et al., 2012; Francois et al., 2008; Layer, Ghebremedhin, Konig, &
Konig, 2006; Mato et al., 2004); La característica nosocomial de dicho aislamiento
contrasta con publicaciones previas: la primera halló que 74% de los MRSA de Ecuador
estaban relacionados con MRSA-AC USA300 (específicamente la variante
Latinoamericana USA300-LV) y 4% con el clon Brasil MRSA-AH, que fueron los clones
predominantes descritos en Ecuador (Planet et al., 2015; Reyes et al., 2009). Sin
embargo, un estudio realizado en Quito entre 2005 y 2013, identificó que los S. aureus
circulantes en dicho país, pertenecían en un 41,6% a la ST8, SCCmec IV (excepto uno
que no tuvo el mismo SCCmec), 7,5% fueron ST239, SCCmec III, (relacionados con el
clon Brasil), y 7,5% fueron ST5 (Zurita, Barba, Ortega-Paredes, Mora, & Rivadeneira,
2016); es importante subrayar que entre las 18 ST reportadas, ninguna corresponde a la
ST228 hallada en nuestro estudio, lo que puede indicar que este es el primer reporte de
esta secuencia tipo en Ecuador.
Las pruebas PFGE y MLST utilizadas inicialmente para evaluar clonalidad de cepas con
reducida susceptibilidad a vancomicina, demuestran que los aislamientos VISA no son
clonales, lo cual es coherente en los resultados del presente trabajo, que evidencian que
los tres aislamientos hVISA no son clonales.
De acuerdo a Howden et al. (2014) “Algunos reportes de hVISA y VISA refieren con más
frecuencia aislamientos de los complejos clonales 5 u 8, en particular ST5 (CC5) y ST239
(CC8), reflejando el éxito de la adaptación de los clones de MRSA hospitalarios” (Hafer et
al., 2012; Howden et al., 2014) y que coincide con lo hallado en nuestros tres hVISA que
pertenecen al CC5.
En el mismo sentido, a pesar de que los dos aislamientos procedentes de Colombia
resultaron VSSA, uno de ellos presentó relación con el clon chileno/cordobés y el otro
C329, no presentó relación clonal con ninguno de los controles utilizados; en este sentido
coincidiría con uno de los clones reportados en los últimos veinte años en Colombia: el
clon chileno/cordobés que fue reportado entre 2001 y 2003, (Cruz et al., 2005),
remplazando al clon pediátrico que circulo inicialmente (entre 1996 y 1998) (Gomes,
72 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
Sanches, Aires de Sousa, Castaneda, & de Lencastre, 2001), y más recientemente se
describió relación entre aislamientos colectados en Colombia con el clon relacionado con
la comunidad USA300 y USA300- LV (Alvarez et al., 2009; Planet et al., 2015; Reyes et
al., 2009), incluso se han reportado aislamientos SASM relacionados con el clon USA300
(Escobar-Perez et al., 2014).
Los análisis de resistoma de los tres aislamientos hVISA muestran la presencia de genes
de resistencia a aminoglicósidos (aac(6´), aph(2´´), aph(3´´), aph(3´III), spc, ant(6)-la),
macrólidos (ermA) y fluoroquinolonas (norA) evidenciando que son multirresistentes a
antibióticos, lo que es coherente con los resultados en las MIC (resistentes a oxacilina,
eritromicina, clindamicina, ciprofloxacina, gentamicina) que se obtuvieron previamente
por nuestro grupo (UGRA); estos perfiles de resistencia a antibióticos, son similares a los
descritos para otros aislamientos ST5, t149 procedentes de Perú, que también resultaron
multirresistentes (García et al., 2016).
Se ha descrito también, por ejemplo que la inhibición de VraSR (un modulador de
síntesis de pared celular, identificado inicialmente como un factor que afecta la
resistencia bacteriana a vancomicina), puede conducir a la disminución de la resistencia
a inhibidores pared celular como betalactámicos, vancomicina, teicoplanina, y fosfomicina
(Gardete, Wu, Gill, & Tomasz, 2006; Yoshida et al., 2011). Gardete et al. (2006)
evidenciaron que la inactivación de vraS bloquea esta respuesta transcripcional y puede
generar reducción en los niveles de resistencia a antibióticos betalactámicos y a
vancomicina.
Inclusive existen reportes en S. aureus que vinculan el fenotipo VISA y la no
susceptibilidad a daptomicina, que es otro antibiótico activo en la superficie, con diferente
mecanismo de acción (Howden et al., 2011).
La secuencia de ADN de los tres aislamientos del presente estudio reveló puntos de
mutaciones correspondientes a cambios de residuos de aminoácidos en walK (E987 y
P1108), rpoB (E987), tcaA (en los tres aislamientos), atl (sólo en P1108, P1209). Cada
aislamiento, presentó por lo menos dos sustituciones de residuos de aminoácidos que
correspondían a proteínas que previamente habían sido relacionados a aislamientos
hVISA/VISA.
Capítulo 5 73
El operón walKR es un sistema importante en el metabolismo de pared celular, en el
aislamiento E987 se halló la sustitución de un residuo de aminoácido G233D en WalK
(codifica para el sensor histidina kinasa), este cambio de residuo de aminoácido es
diferente al encontrado en la cepa de referencia sensible N315, pero todos los
aislamientos incluido N315, E987 y las otras cepas de referencia VISA y hVISA
presentaron la secuencia consenso en ese residuo de aminoácido; una sustitución de los
mismos residuos de aminoácidos, en una posición cercana fue descrita previamente en
WalK (G223D) en un aislamiento de Nueva Zelanda y de la cual se confirmó que puede
generar el paso de fenotipo VSSA a VISA (Howden et al., 2011). Otro estudio en el que
se realizó secuenciación del genoma completo a aislamientos VISA, derivados de
aislamientos VSSA expuestos a concentraciones ascendentes de VAN, postula que el
cambio en el residuo de aminoácido G223D disminuye la autofosforilación de WalK,
reduciendo la fosforilación del regulador de respuesta WalR, lo que genera disminución
en la capacidad de unión de WalR al promotor atlA; esta reducción en la fosforilación
ocasiona disminución en la expresión de genes asociados al metabolismo de pared
celular, disminución de la actividad autolítica, engrosamiento de la pared celular y
reducción de la susceptibilidad a vancomicina (Hu, Zhang, Liu, Chen, & Sun, 2015b).
Si bien la sustitución en el residuo de aminoácido hallada en E987 (G233D) y la
sustitución en G223D, no están exactamente en la misma posición, si están muy cerca, a
10 aminoácidos de diferencia y, ambas están ubicadas en el dominio altamente
conservado HAMP del sensor proteína kinasa WalK, el cual conecta el dominio sensor
extracelular con el dominio de señalización intracelular, por lo cual Hu et al. (2015)
plantean como hipótesis que “la sustitución en G223D causa un cambio funcional en el
dominio HAMP que afecta la actividad kinasa de WalK” (Hu et al., 2015b). Teniendo en
cuenta lo anterior y el hecho de que en ambos aislamientos se produjo la misma
sustitución por el mismo aminoácido, queda la incógnita sobre ¿qué impacto puede tener
la sustitución del residuo de aminoácido hallada en el presente trabajo y si esta tenga un
efecto similar en WalK al que produce la sustitución en G223D?, que ha sido estudiada
con mayor detalle, sin embargo, este tema pudiera estudiarse más a fondo en un estudio
posterior.
74 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
El aislamiento hVISA de Perú (P1108), presenta la sustitución en el residuo de
aminoácido L14I, produciendo el cambio de una leucina por isoleucina, y este es
diferente al aminoácido que tiene en esta posición el aislamiento N315 (sensible); es
importante mencionar que un estudio previo, describió la sustitución del residuo de
aminoácido L14F (sustitución en la misma posición que la hallada en P1108) que genera
el cambio de leucina por fenilalanina y que había sido relacionada a aislamientos con el
fenotipo VISA (Howden et al., 2011).
Por otro lado, McEvoy et al. (2013) demostraron que la inserción de IS256 en walKR,
puede jugar un rol importante en la aparición del fenotipo VISA, mediante la reducción de
la expresión en WalKR. Más recientemente, otros investigadores describieron un papel
importante de las proteínas YycH and YycI en la generación del fenotipo de reducida
susceptibilidad a vancomicina, ya sea por mutaciones en yycH que impactan en la
interacción con walK, y deleción en yycH/yycI, que genera reducción en la expresión de
genes bajo su control, indicando un papel positivo de las proteínas YycHI en la regulación
de WalKR en S. aureus (Cameron, Jiang, Kostoulias, Foxwell, & Peleg, 2016).
Otros estudios han descrito diferentes mutaciones en walK, Shoji et al. (2011) hallaron
61,5% de aislamientos VISA con mutaciones en walK, así mismo Hiramatsu et al.
(2014b) describen 54,5% de mutaciones en walK en 33 aislamientos VISA evaluados.
Teniendo en cuenta los estudios anteriores, se observa la importancia de mutaciones en
el TCS WalKR, que pueden aportar para generar el fenotipo VISA/hVISA y que pudiera
ser uno de los factores que impacto en la producción del fenotipo hVISA en el aislamiento
E987.
Este mismo aislamiento E987, (hVISA de Ecuador), presentó una sustitución en un
residuo de aminoácido en RpoB, generando cambio de una histidina por una asparagina
en la posición 481 (H481N), aminoácido diferente al que se observa en el aislamiento
sensible a VAN N315; hay que mencionar, además que el gen rpoB codifica para la
subunidad β de la ARN polimerasa. Es importante resaltar, que la misma sustitución de
H481N había sido relacionada previamente, por Hafer et al. (2012) en una cepa hVISA
procedente de EEUU, que además presentaba resistencia a rifampicina (Hafer et al.,
2012); así mismo, Hiramatsu et al. (2014b) reportaron esta misma sustitución en
aislamientos VISA de Tailandia (Hiramatsu et al., 2014b); en este mismo sentido, se
Capítulo 5 75
describió una mutación en la misma posición, pero con cambio por otro aminoácido
(polar) H481Y (histidina 481 tirosina) en el aislamiento VISA Mu50 (Katayama et al.,
2016), mutación que ha sido relacionada a la resistencia rifampicina en S. aureus (Aubry-
Damon et al., 1998). Incluso, un estudio reciente da cuenta de un aislamiento de MRSA
que luego de tratamiento con teicoplanina, presentó reducida susceptibilidad a
vancomicina, resistencia a daptomicina, y que también presenta la misma sustitución de
aminoácidos H481Y (Capone et al., 2016). En el gen rpoB se han reportado otras
mutaciones, con sustitución de aminoácidos, asociadas al fenotipo hVISA/VISA (Chen, et
al., 2014), que no fueron halladas en ninguno de los aislamientos hVISA del presente
estudio; dada la importancia que tiene rpoB, Hiramatsu et al. (2014b) plantean que
mutaciones en este, podrían generar cambios drásticos en el perfil transcripcional, y
consideran que esta pudiera considerarse una “mutación reguladora” (Hiramatsu et al.,
2014b).
En los tres aislamientos hVISA (E987, P1108, P1109) se halló la sustitución del residuo
de aminoácido L218P (cambio de leucina por prolina) en TcaA, si bien es diferente al
residuo de aminoácido de la cepa sensible N315; esta misma sustitución fue reportada
en aislamientos VISA de Corea (Yoo et al., 2013) y también fue descrita recientemente
en aislamientos hVISA de la India (Bakthavatchalam et al., 2017). Existen estudios que
identificaron al gen tcaA del operón tcaRAB, como clave para el cambio en los niveles de
resistencia a glicopéptidos (Maki et al., 2004), lo cual coincide con nuestros hallazgos,
dado que los tres aislamientos hVISA presentan la misma sustitución de aminoácidos en
TcaA; también se ha descrito que la deleción o alteración de tcaA en aislamientos in vitro
causa un incremento de dos a cuatro veces en la MIC de teicoplanina (Chen et al., 2016).
En los dos aislamientos de Perú, se halló la sustitución en el residuo de aminoácido
Y814H en Atl (hidrolasa de peptidoglicano) generando cambio de una tirosina por
histidina (en este caso N315, Mu3, Mu50 y E987 presentaron la secuencia consenso); si
bien, no se halló información de esta misma mutación o similares, Wootton et al. (2005)
habían descrito disminución de la expresión de alt, en los aislamientos hVISA y en la
mayoría de los aislamientos VISA, cuando se comparaban con los VSSA evaluados en
dicho estudio; sin embargo, Capone et al. (2016) referencian no haber encontrado
cambios de expresión en alt en dos cepas evaluadas, una hVISA y otra VISA. No
76 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3 países en
Suramérica
obstante, el hecho de que atl sea una de las dos autolisinas más importantes en S.
aureus, y que una de las hipótesis de resistencia en este fenotipo es el engrosamiento de
la pared y disminución de la actividad autolítica de S. aureus (Hiramatsu et al., 2014),
podría generar la hipótesis de que este cambio en el residuo de aminoácido aportó, junto
a las demás sustituciones, para la generación del fenotipo hVISA de estos aislamientos.
Hafer et al. (2012) postulan que dependiendo del origen clonal del aislamiento
hVISA/VISA, los polimorfismos parecen acumularse principalmente en vraR y vraS para
la secuencia tipo 8 (ST8) y en walK y walR para los aislamientos ST5 (Hafer et al., 2012);
en el presente estudio, los tres aislamientos presentaron mutaciones en walK, dos de
ellos pertenecen al ST5 y el otro es ST228. Otras mutaciones en genes o sistemas de
dos o tres componentes vraSR, graRS, yvqF, tcaB, dlt, entre otras han sido asociadas a
hVISA/VISA (Cui et al., 2010; Katayama et al., 2016; Matsuo, Hishinuma, Katayama, &
Hiramatsu, 2015; Shoji et al., 2011), pero no fueron encontradas en los aislamientos del
presente trabajo.
En este sentido, Neoh et al. (2008) compararon los genomas secuenciados de los
aislamientos N315 (aislamiento sensible a vancomicina), Mu3 y Mu50, encontrando 16
SNP en algunos genes. Incluso Hiramastu et al. (2014b) plantean que las mutaciones en
rpoB, walKR y vraUTSR, pudieran considerarse “el primer paso de las mutaciones para
pasar de VSSA hacia el fenotipo VISA”. En contraste Yoo et al. (2013) reportaron 87
aislamientos VISA con 31 patrones de mutación, pero también reporta siete aislamientos
VISA que no evidencian cambios en ninguno de los genes secuenciados (orf1, vraSR,
graSR, yvqF y tcaRAB).
Si bien, a la fecha no se ha sido elucidado completamente el mecanismo de bajos niveles
de resistencia a vancomicina, si se han descrito que múltiples mutaciones están
involucradas en la evolución de este, así como una serie de cambios metabólicos, entre
ellos el engrosamiento de la pared celular, disminución en el entrecruzamiento del PGN,
baja actividad autolítica, crecimiento lento, disminución de la actividad catalítica y
disminución de la virulencia (Howden et al., 2014;Hu, Peng & Rao, 2016; Munita & Arias,
2016).
Capítulo 5 77
En este mismo sentido, las mutaciones encontradas en los tres aislamientos hVISA, con
coherentes con genes o sistemas de dos componentes que se han relacionado en la
literatura con el fenotipo hVISA/VISA y de las cuales se menciona que el acumular
mutaciones (con sustituciones de residuos de aminoácidos), impacta para que los
aislamientos pasen del fenotipo VSSA a VISA.
Los hallazgos del presente estudio sugieren que la presencia de sustituciones de
residuos de aminoácidos en proteínas descritas anteriormente: WalK, RpoB, Atl y TcaA,
que pueden ser uno de los factores involucrados en la adquisición de bajos niveles de
resistencia a vancomicina, hallazgos que han sido descritos previamente; este es el
primer estudio que confirma presencia de aislamientos hVISA en Ecuador y Perú, con la
respectiva tipificación molecular de los mismos.
En este mismo sentido y tenido en cuenta la dificultad que se presenta para confirmar
fenotípicamente los S. aureus con resistencia intermedia heterogénea a la vancomicina
(hVISA), las herramientas de secuenciación completa del genoma son una valiosa
alternativa que aporta datos detallados, a fin de caracterizar microorganismos en
diversos niveles, como comparación de secuencias de genes y de proteínas predichas,
detección de genes que confieren resistencia a antibióticos, y otros análisis
bioinformáticos que pueden desarrollarse a fin de caracterizar aislamientos, que
presentan grandes desafíos para su confirmación fenotípica, como es el caso de los tres
aislamientos estudiados en la presente tesis.
Conclusiones y recomendaciones 79
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
En el presente estudio se confirmó la presencia de tres aislamientos hVISA
mediante la técnica estándar de oro PAP-AUC, uno de Ecuador y dos de
Perú, no se detectaron este tipo de aislamientos en Colombia.
Mediante el uso de PFGE se halló relación de ocho de los aislamientos
(incluidos los tres hVISA) con el clon chileno/cordobés, lo cual concuerda con
lo reportado en la literatura para el clon circulante en Perú; por otro lado, si
bien este clon circuló hace unos años en Colombia, el clon que circula
actualmente en nuestro país es el clon USA300.
Los tres aislamientos hVISA pertenecen al complejo clonal 5, los dos
aislamientos peruanos son ST5 y el aislamiento ecuatoriano presenta ST228,
todos relacionados a MRSA-AH.
La caracterización genómica de los aislamientos hVISA, evidenció la
presencia de sustituciones de un sólo aminoácido, en proteínas, reportadas
en la literatura, relacionadas a aislamientos con reducida susceptibilidad a
vancomicina.
Este es el primer estudio en aislamientos de la región andina, que realizó
confirmación del fenotipo hVISA y caracterización genómica de cepas
procedentes de tres países de la región.
80 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3
países en Suramérica
T de la tesis o trabajo de investigación
6.2 Recomendaciones
Teniendo en cuenta que en la presente investigación no se hallaron
aislamientos hVISA en Colombia, se sugiere un nuevo estudio con
aislamientos procedentes de pacientes con infecciones a repetición por S.
aureus, que incluya aislamientos sensibles y resistentes a meticilina, dado que
este fenotipo también ha sido reportado en aislamientos SASM.
Se sugiere realizar difusión de recomendaciones realizadas en Bogotá,
respecto a la restricción del uso de vancomicina, para evitar la aparición de
aislamientos con reducida susceptibilidad a vancomicina, a nivel nacional.
Sería ideal un procedimiento menos dispendioso a las PAPs, reportadas por
Hiramatsu y Wooton, para realizar la confirmación del fenotipo hVISA/VISA,
que es extremadamente costoso y dispendioso; se recomienda realizar un
estudio para estandarizar una técnica más accesible para realizar dicha
confirmación fenotípica.
Se sugiere a los entes gubernamentales de los tres países la discusión y
aplicación de normativas o políticas de uso y venta de antibióticos con
requisitos más estrictos, con el fin de disminuir la generación de más
aislamientos multi-resistentes, por exposición innecesaria a antimicrobianos.
Dado que otra de las características de hVISA/VISA es la diminución de la
actividad autolítica, se recomendaría realizar una prueba de actividad
autolítica a los tres aislamientos, para evaluar el comportamiento de estos.
Continuar con la vigilancia epidemiológica de resistencia a antibióticos en S.
aureus.
Se recomienda el uso de la secuenciación de genoma completo para
detección de sustituciones de residuos de aminoácidos asociados a este
fenotipo.
Anexos 81
Anexos
Anexo A. Alineamientos de otras secuencias de aminoácidos conservadas
Alineamiento de la secuencia de aminoácidos VraS
Alineamiento de la secuencia de aminoácidos VraR
82 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3
países en Suramérica
T de la tesis o trabajo de investigación
Alineamiento de la secuencia de aminoácidos GraS
Alineamiento de la secuencia de aminoácidos GraR
Alineamiento de la secuencia de aminoácidos WalR
Anexos 83
Anexo B. Presentaciones en eventos
1. Berrio M, Díaz L, Reyes J, Ardila J, Carvajal LP, Porras P, Rincón S, Ríos R,
Munita J, Arias C. Can Whole Genome Sequencing Identify Heterogeneous
Vancomycin-Intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) Isolates? American
Society for Microbiology ASM Microbe 2017, Junio 1-5, de 2017. New Orleans
USA. Poster.
84 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3
países en Suramérica
T de la tesis o trabajo de investigación
2. Berrio M, Ardila J, Porras P, Carvajal LP, Rincon S, Ríos R, Reyes J, Munita JM,
Díaz L. Can Whole Genome Sequencing Identify Heterogeneous Vancomycin-
Intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) Isolates? UT Center for
Antimicrobial Resistance and Microbial Genomics (CARMiG) Antibiotic Resistance
Symposium: Novel Frontiers in Antimicrobial Research. January 19-20, 2017.
Houston, TX USA. Poster
Anexos 85
3. Berrio M, Porras P, Rincón S, Ardila J Carvajal L, Rios R, Reyes J, Díaz L, Arias
C. Caracterización genómica de aislamientos de Staphylococcus aureus con
reducida susceptibilidad a la vancomicina (hVISA), en tres aislamientos de la
Región Andina. X Encuentro Nacional de Investigadores en Enfermedades
Infecciosas, Medellín 2016. Infectio. 2016; 20 (S1). Oral.
86 Caracterización de aislamientos clínicos de Staphylococcus aureus
resistentes a meticilina, con susceptibilidad disminuida a vancomicina, de 3
países en Suramérica
T de la tesis o trabajo de investigación
4. Berrio M, Duarte E, Reyes J, Díaz L, Rincón S, Arias C. Caracterización de
fenotipos de resistencia a vancomicina (VISA - hVISA) en aislamientos de
Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina de hospitales en la Región
Andina. VIII Encuentro Nacional de Investigación en Enfermedades Infecciosas,
Armenia 2012. Infectio. 2012; 16(S1). Poster.
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