DEQB
Lição de Biocatálise
Hidrólise da ureia pela urease
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Para cada case do utilização de um enzima para catálise de uma dada reacção é necessário conhecer a estequiometria da reacção
aA + bB → cC
e da sua dependência com:
- Concentração enzima- Concentração do(s) substrato(s)- Presença de inibidores e sua concentração- Presença de activadores e sua concentração- Força iónica do meio reaccional- pH (actividade enzimática e estabilidade)- Temperatura (actividade enzimática e estabilidade)- Indirectamente do tempo de reacção, isto é, acumulação e concentração do(s) produto(s) da reacção.
[ ] [ ] [ ]dt
Bd
bdt
Ad
adt
Cd
cv
111−=−==
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função da concentração de substrato
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função da concentração de substrato
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função da concentração do enzima
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função do pH
v
pH óptimo
pH
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função do pH
v
pH óptimo
pH
O pH óptimo da actividade de um enzima está próximo do pH do ambiente em que o enzima é normalmente encontrado, por exemplo:
(a)Pepsina que hidrolisa certas ligações peptídicas de proteínas durante a sua digestão no estômago tem um pHóptimo de 1,6.
(b) Glucose 6-fosfatase de células do fígado (hapatócitos) com um pHóptimo de ~ 7,8 é responsável pela libertação de glucose na corrente sanguínea. O pH normal no citosol de células de hepatócitos é ~7,2.
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Lição de Biocatálise
Noções Gerais sobre Cinética
v, exprime-se como a velocidade de alteração da quantidade de uma substância interveniente na reacção, presente na mistura reaccional.
De um modo geral, para, aA + bB → cC tem-se;
Com a lei cinética obtêm-se uma expressão matemática que mostre como é que a velocidade medida depende das concentrações dos reagentes (e produtos, se a reacção inversa ocorrer com velocidade apreciável).
[ ] [ ] [ ]dt
Bd
bdt
Ad
adt
Cd
cv
111−=−==
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Lição de Biocatálise
Noções Gerais sobre Cinética
Por exemplo, se a velocidade da reacção
A + B → C variar linearmente com as concentrações de A e B, tem-se:
em que k é a constante cinética para a reacção indicada. De uma forma geral pode escrever-se
em que α e β definem a chamada ordem da reacção em relação a A e B, respectivamente.
[ ] [ ][ ]BAkdt
Cdv ==
[ ] [ ] [ ]βαBAk
dt
Cdv ==
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Lição de Biocatálise
Noções Gerais sobre Cinética
À soma θ = α + β chama-se ordem global da reacção. Para uma reacção de ordem global θ, as unidades da constante cinética são [concentração1-θ x tempo-1].
Tabela– Expressões cinéticas para reacções de ordem global entre zero e dois
Reacção Ordem Lei Cinética tsemi-tranformação
A → B
A → B
A + A → B
0
1ª
2ª
[ ]
− =d A
dtk [ ] [ ]A A kt= −0
[ ][ ]− =
d A
dtk A [ ] [ ]A A e
kt= −0
[ ] [ ]2Ak
dt
Ad
2
1=−
[ ] [ ]1 1
20A A
kt= +
[ ]t =
A1/2
0
2k
tk1 2
2/
ln=
[ ]0
2/1Ak2
1t =
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Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura
Equação de Arrhenius
- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.
A → B[ ]
[ ]− =d A
dtk A
DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura
Equação de Arrhenius
- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.
A → B[ ]
[ ]− =d A
dtk A
Actividade Enzimática: Equação de Base Experimental
PE
k
k
ES
k
k
SE +↔↔+
−− 2
2
1
1
Figura 2-1 – Curva de progressão de uma reacção enzimática
V E2
Vmáx
E1
reacção de ordem zero
1/2 Vmáx
reacção de 1ª ordem
KM
[ S]
[ ][ ]
v k CS
K Scat E
M
=+
Para [S]<< KM
, [ ]SCk
kv E
M
cat=
Para [S]>> KM, máxEcat VCkv ==
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Lição de Biocatálise
PE
k
ES
k
k
SE +→↔+
−
2
1
1
Cinética de Michaelis-Menten
[ ][ ]
d P
dtv k ES= = 2
• Reacção inicial, a concentração de produto édesprezável e, por isso, pode ignorar-se a reacção inversa de formação de ES a partir de E+P
[ ] [ ]ESCE E −=
[ ][ ][ ]ES
ES
k
kK
1
1-
S ==
[ ][ ]
[ ]ES
C S
K S
E
S
=+
[ ][ ]SK
SCkv
S
E2+
=
• A combinação do enzima com o substrato éinstantânea para dar um complexo enzima-substrato, ES. Este passo é considerado, neste esquema, rápido e reversível (equilíbrio)
• A conversão do complexo ES em E+P é muito lenta, não alterando o equilíbrio anterior (k2 << k-1).
Vmáx
= E2Ck
KM = KS,
[ ][ ]SK
SVV
M += máx
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Lição de Biocatálise
[ ] [ ]ESECE +=• Balanço ao enzimas
?
Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten
[ ] máxmáx
M
V
1
S
1
V
K
v
1+=
Pela equação de Lineweaver-Burk
resultante da inversão da Michaelis-Menten
Pela equação de Eadie-Hofstee
multiplicar anterior por Vmax
[ ]v
S
vKV Mmáx +=
[ ]S
vKVv Mmáx −=
coeficiente angular =KM
/Vmáx
abcissa = -1/KM [ ]1/ S
1/Vmáx
1/V
v
ordenada=Vmáxcoeficiente angular = - KM
Vmáx /K M v/[S]
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Lição de Biocatálise
[ ][ ]SK
SVV
M += máx
Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten
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Lição de Biocatálise
KM = 0,161 mM (o-NPG)Vmax = 178 µµµµmole o-NPG/L.min
Cinética de Briggs – Haldane
[ ] [ ]ESkvdt
Pd2==
• Briggs e Haldane examinaram o caso em que, no esquema de Michaelis-Menten, k2 era comparável a k-1,, logo a hipótese da existência de equilíbrio rápido não é válida.
Vmáx
= E2Ck
[ ][ ]SK
SVV
M += máx
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Lição de Biocatálise
• Do balanço ao enzimas
PE
k
ES
k
k
SE +→↔+
−
2
1
1
[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdt
ESd1210 −−−== [ ] [ ][ ] )/( 211 kkSEkES += −
KM =
1
21
k
kk +−
[ ] [ ]ESCE E −= .
• Mas, aplicando a aproximação do estado estacionário à concentração de ES:
[ ] [ ]ESECE +=
• A velocidade de formação do produto.
?
[ ] [ ][ ]Skkk
SCkES E
121
1
)( ++=
−
[ ]
[ ]Sk
kk
SCkv E
++
=−
1
21
2
Actividade Enzimática
sendo n o número de centros activos por molécula de enzima. Como regra, pode-se considerar que kcat é uma constante cinética de 1ª ordem que se refere às propriedades e reacções dos complexos enzima-substrato, enzima-composto intermediário e enzima-produto.
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Lição de Biocatálise
Significado da constante catalítica (k2 = kcat)
No mecanismo de Michaelis Menten kcat = k2 é a constante cinética de 1ªordem para a conversão química de ES em EP. Para casos mais complexos, éuma função de todas as constantes cinéticas de 1ª ordem costume relacionar kcat com o “turnover number”, que representa o número máximo de moléculas de substrato que se podem converter em produtos por centro activo do enzima e por unidade de tempo, e é expresso em s-1.
“turnover number”nC
V
n
k
E
cat máx==
Actividade Enzimática
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Lição de Biocatálise
“turnover number”nC
v
n
k
E
cat ==
onde
aparece como uma constante cinética aparente de segunda ordem. Este quociente relaciona a velocidade da reacção com a concentração do enzima livre. Por exemplo, para baixas concentrações de substrato, o enzima está em grande parte livre e CE ≅ [E]. A constante designa-se por constante de especificidade uma vez que este quociente traduz a especificidade para substratos que estejam em competição para se ligarem ao enzima.
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Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM)
No mecanismo de Michaelis Menten para baixas concentrações de substrato ([S]<<KM):
[ ]SCK
kv E
M
cat=M
cat
K
k
De facto, se tivermos dois substratos A e B competindo para o centro activo do enzima:
[ ]
[ ]BK
k
AK
k
v
v
BM
cat
AM
cat
B
A
=
o poder discriminatório do enzima em relação a dois substratos, é determinadopor kcat/KM.
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Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK
kv E
M
cat=
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Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK
kv E
M
cat=
DEQB
Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK
kv E
M
cat=
Há uma dependência da reacção catalisada pela quimotripsina com o pH e neste caso manifesta-se ao nível dos valores de kcat e KM:
- A velocidade da reacção aumenta para pH > 7,0 devido ao aumento do kcat.
- A velocidade da reacção diminui parapH > 8,5 devido à diminuição do 1/KM.
- Esta dependência é devida à intima relação entre cinética e estrutura do centro activo, em particular ao estado de ionização da His57
envolvida na ligação do substrato.
- No pH óptimo da reacção (pH = 8,0) a His57
deve estar desprotonada (pka ~ 6,0).
Interacções do enzima com activadores e inibidores
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Lição de Biocatálise
Interacções do enzima com activadores e inibidores
DEQB
Lição de Biocatálise
ActivadoresEm enzimas alostéricos o sítio de ligação do substrato (subunidadecatalítica C) e do activador (subunidadereguladora R) são diferentes:
- A ligação do activador (M) ao seu sitio específico na subunidade reguladora écomunicada à subunidade catalítica por uma alteração da sua conformação espacial.
- E é esta alteração conformação espacial que permite à sub-unidadecatalítica reconhecer o substrato com elevada afinidade.
- A dissociação do activador ao sub-unidade reguladora converte o enzima numa forma conformacional não activa ou menos activa.
Interacções do enzima com activadores e inibidores
DEQB
Lição de Biocatálise
Inibidores Irreversíveis
Reacção da quimotripsina com di-isopropil fluoro fosfato (DIFP) inibe irreversivelmente a actividade do enzima e levou àconclusão de que a Ser195 é um resíduo de amino ácido chave no processo catalítico.
Inibição da Actividade Enzimática (Inibidores reversíveis)DEQB
Lição de Biocatálise
Interacções do enzima com activadores e inibidores
Inibição da Actividade Enzimática na cinética Briggs-Haldane
Inibição competitiva
EI
K
I
PE
k
ES
k
k
SE
I b
+
+→↔+
−
2
1
1
[ ][ ][ ]EI
IEKI =
CE=[E]+[ES]+[EI]
[ ][ ]
11
1
1
1
21
2
+
+
+=
−
SK
I
k
kkCkv
I
E
[ ]
+=
I
M´M
K
I1KK
1/ v S + I
S
1/ [S]-1/K`M
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ]
[ ]Sk
kk
SCkv E
++
=−
1
21
2[ ]
[ ][ ]
1
2
1
21
2
+
=
++
=−
S
k
Ck
Sk
kk
SCkv
M
EE
Inibição da Actividade Enzimática
Inibição não competitiva
ESI
k
k
SEI
KK
II
PE
k
ES
k
k
SE
II
1
1
´
2
1
1
−
−
↔+
++
+→↔+
bb
CE=[E]+[ES]+[EI] + [ESI]
[ ][ ]SK
SCkv
M
E
+= 2
1/ vS+I
S
1/ [S ]
1/Vmáx´
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[ ][ ]
[ ]SK
S
K
I1
Ckv
M
I
E2
++
=
[ ]
I
máxmáx
K
I1
V´V
+
=
Inibição anticompetitiva
ESI
K
I
PE
k
ES
k
k
SE
I b
+
+→↔+
−
2
1
1
CE=[E]+[ES]+[ESI],
[ ][ ]
[ ][ ]S
K
I1
K
S
K
I1
Ckv
I
M
I
E2
+
+
+
=
1/ v
S+I
S
1/ [S ]-1/K`M
1/Vmáx´
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ][ ]SK
SCkv
M
E+
= 2
Inibição da Actividade Enzimática
Inibição pelo Substrato
PE
k
ESS
KS
ES
k
k
SE
I
+→+
↔+
−
2
1
1
b [ ][ ][ ]ESS
SESK I =
[ ]
[ ] [ ]2
I
'M
E2
K
SSK
SCkv
++
=
Para baixas concentrações de S
([S]<<KM) a equação é de 1ª
ordem em [S]:
[ ]SK
EC
2k
v'M
=
Para elevadas concentrações
de S ([S]>> KM):
[ ]
[ ] [ ] [ ]
I
E2
I
E2
K
S1
1Ck
K
S1S
SCkv
+
=
+
=
v [ ]
I'M KKS =
k2CE
ESS ES + P
ESS inactivo
[S]
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A equação de Lineweaver-Burk teria o seguinte aspecto:
Inibição pelo Substrato
declive =
máx
'
M
V
K
-1/'
MK
1/[S]
1/v
1/Vmáx
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