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DEQB
Lição de Biocatálise
Hidrólise da ureia pela urease
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Para cada case do utilização de um enzima para catálise de uma dada reacção é necessário conhecer a estequiometria da reacção
aA + bB → cC
e da sua dependência com:
- Concentração enzima- Concentração do(s) substrato(s)- Presença de inibidores e sua concentração- Presença de activadores e sua concentração- Força iónica do meio reaccional- pH (actividade enzimática e estabilidade)- Temperatura (actividade enzimática e estabilidade)- Indirectamente do tempo de reacção, isto é, acumulação e concentração do(s) produto(s) da reacção.
[ ] [ ] [ ]dt
Bd
bdt
Ad
adt
Cd
cv
111−=−==
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função da concentração de substrato
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função da concentração de substrato
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função da concentração do enzima
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função do pH
v
pH óptimo
pH
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimática
Função do pH
v
pH óptimo
pH
O pH óptimo da actividade de um enzima está próximo do pH do ambiente em que o enzima é normalmente encontrado, por exemplo:
(a)Pepsina que hidrolisa certas ligações peptídicas de proteínas durante a sua digestão no estômago tem um pHóptimo de 1,6.
(b) Glucose 6-fosfatase de células do fígado (hapatócitos) com um pHóptimo de ~ 7,8 é responsável pela libertação de glucose na corrente sanguínea. O pH normal no citosol de células de hepatócitos é ~7,2.
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DEQB
Lição de Biocatálise
Noções Gerais sobre Cinética
v, exprime-se como a velocidade de alteração da quantidade de uma substância interveniente na reacção, presente na mistura reaccional.
De um modo geral, para, aA + bB → cC tem-se;
Com a lei cinética obtêm-se uma expressão matemática que mostre como é que a velocidade medida depende das concentrações dos reagentes (e produtos, se a reacção inversa ocorrer com velocidade apreciável).
[ ] [ ] [ ]dt
Bd
bdt
Ad
adt
Cd
cv
111−=−==
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DEQB
Lição de Biocatálise
Noções Gerais sobre Cinética
Por exemplo, se a velocidade da reacção
A + B → C variar linearmente com as concentrações de A e B, tem-se:
em que k é a constante cinética para a reacção indicada. De uma forma geral pode escrever-se
em que α e β definem a chamada ordem da reacção em relação a A e B, respectivamente.
[ ] [ ][ ]BAkdt
Cdv ==
[ ] [ ] [ ]βαBAk
dt
Cdv ==
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DEQB
Lição de Biocatálise
Noções Gerais sobre Cinética
À soma θ = α + β chama-se ordem global da reacção. Para uma reacção de ordem global θ, as unidades da constante cinética são [concentração1-θ x tempo-1].
Tabela– Expressões cinéticas para reacções de ordem global entre zero e dois
Reacção Ordem Lei Cinética tsemi-tranformação
A → B
A → B
A + A → B
0
1ª
2ª
[ ]
− =d A
dtk [ ] [ ]A A kt= −0
[ ][ ]− =
d A
dtk A [ ] [ ]A A e
kt= −0
[ ] [ ]2Ak
dt
Ad
2
1=−
[ ] [ ]1 1
20A A
kt= +
[ ]t =
A1/2
0
2k
tk1 2
2/
ln=
[ ]0
2/1Ak2
1t =
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura
Equação de Arrhenius
- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.
A → B[ ]
[ ]− =d A
dtk A
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DEQB
Lição de Biocatálise
Velocidade de uma reacção enzimáticaFunção da temperatura
Equação de Arrhenius
- k é constante da velocidade, - R é constante da lei dos gases, - A é factor de frequência,- EA à energia de activação da reacção.
A → B[ ]
[ ]− =d A
dtk A
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Actividade Enzimática: Equação de Base Experimental
PE
k
k
ES
k
k
SE +↔↔+
−− 2
2
1
1
Figura 2-1 – Curva de progressão de uma reacção enzimática
V E2
Vmáx
E1
reacção de ordem zero
1/2 Vmáx
reacção de 1ª ordem
KM
[ S]
[ ][ ]
v k CS
K Scat E
M
=+
Para [S]<< KM
, [ ]SCk
kv E
M
cat=
Para [S]>> KM, máxEcat VCkv ==
DEQB
Lição de Biocatálise
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PE
k
ES
k
k
SE +→↔+
−
2
1
1
Cinética de Michaelis-Menten
[ ][ ]
d P
dtv k ES= = 2
• Reacção inicial, a concentração de produto édesprezável e, por isso, pode ignorar-se a reacção inversa de formação de ES a partir de E+P
[ ] [ ]ESCE E −=
[ ][ ][ ]ES
ES
k
kK
1
1-
S ==
[ ][ ]
[ ]ES
C S
K S
E
S
=+
[ ][ ]SK
SCkv
S
E2+
=
• A combinação do enzima com o substrato éinstantânea para dar um complexo enzima-substrato, ES. Este passo é considerado, neste esquema, rápido e reversível (equilíbrio)
• A conversão do complexo ES em E+P é muito lenta, não alterando o equilíbrio anterior (k2 << k-1).
Vmáx
= E2Ck
KM = KS,
[ ][ ]SK
SVV
M += máx
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ] [ ]ESECE +=• Balanço ao enzimas
?
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Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten
[ ] máxmáx
M
V
1
S
1
V
K
v
1+=
Pela equação de Lineweaver-Burk
resultante da inversão da Michaelis-Menten
Pela equação de Eadie-Hofstee
multiplicar anterior por Vmax
[ ]v
S
vKV Mmáx +=
[ ]S
vKVv Mmáx −=
coeficiente angular =KM
/Vmáx
abcissa = -1/KM [ ]1/ S
1/Vmáx
1/V
v
ordenada=Vmáxcoeficiente angular = - KM
Vmáx /K M v/[S]
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ][ ]SK
SVV
M += máx
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Determinação dos parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten
DEQB
Lição de Biocatálise
KM = 0,161 mM (o-NPG)Vmax = 178 µµµµmole o-NPG/L.min
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Cinética de Briggs – Haldane
[ ] [ ]ESkvdt
Pd2==
• Briggs e Haldane examinaram o caso em que, no esquema de Michaelis-Menten, k2 era comparável a k-1,, logo a hipótese da existência de equilíbrio rápido não é válida.
Vmáx
= E2Ck
[ ][ ]SK
SVV
M += máx
DEQB
Lição de Biocatálise
• Do balanço ao enzimas
PE
k
ES
k
k
SE +→↔+
−
2
1
1
[ ] [ ][ ] [ ] [ ]ESkESkSEkdt
ESd1210 −−−== [ ] [ ][ ] )/( 211 kkSEkES += −
KM =
1
21
k
kk +−
[ ] [ ]ESCE E −= .
• Mas, aplicando a aproximação do estado estacionário à concentração de ES:
[ ] [ ]ESECE +=
• A velocidade de formação do produto.
?
[ ] [ ][ ]Skkk
SCkES E
121
1
)( ++=
−
[ ]
[ ]Sk
kk
SCkv E
++
=−
1
21
2
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Actividade Enzimática
sendo n o número de centros activos por molécula de enzima. Como regra, pode-se considerar que kcat é uma constante cinética de 1ª ordem que se refere às propriedades e reacções dos complexos enzima-substrato, enzima-composto intermediário e enzima-produto.
DEQB
Lição de Biocatálise
Significado da constante catalítica (k2 = kcat)
No mecanismo de Michaelis Menten kcat = k2 é a constante cinética de 1ªordem para a conversão química de ES em EP. Para casos mais complexos, éuma função de todas as constantes cinéticas de 1ª ordem costume relacionar kcat com o “turnover number”, que representa o número máximo de moléculas de substrato que se podem converter em produtos por centro activo do enzima e por unidade de tempo, e é expresso em s-1.
“turnover number”nC
V
n
k
E
cat máx==
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Actividade Enzimática
DEQB
Lição de Biocatálise
“turnover number”nC
v
n
k
E
cat ==
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onde
aparece como uma constante cinética aparente de segunda ordem. Este quociente relaciona a velocidade da reacção com a concentração do enzima livre. Por exemplo, para baixas concentrações de substrato, o enzima está em grande parte livre e CE ≅ [E]. A constante designa-se por constante de especificidade uma vez que este quociente traduz a especificidade para substratos que estejam em competição para se ligarem ao enzima.
DEQB
Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM)
No mecanismo de Michaelis Menten para baixas concentrações de substrato ([S]<<KM):
[ ]SCK
kv E
M
cat=M
cat
K
k
De facto, se tivermos dois substratos A e B competindo para o centro activo do enzima:
[ ]
[ ]BK
k
AK
k
v
v
BM
cat
AM
cat
B
A
=
o poder discriminatório do enzima em relação a dois substratos, é determinadopor kcat/KM.
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DEQB
Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK
kv E
M
cat=
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DEQB
Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK
kv E
M
cat=
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DEQB
Lição de Biocatálise
Significado da constante (kcat/KM) [ ]SCK
kv E
M
cat=
Há uma dependência da reacção catalisada pela quimotripsina com o pH e neste caso manifesta-se ao nível dos valores de kcat e KM:
- A velocidade da reacção aumenta para pH > 7,0 devido ao aumento do kcat.
- A velocidade da reacção diminui parapH > 8,5 devido à diminuição do 1/KM.
- Esta dependência é devida à intima relação entre cinética e estrutura do centro activo, em particular ao estado de ionização da His57
envolvida na ligação do substrato.
- No pH óptimo da reacção (pH = 8,0) a His57
deve estar desprotonada (pka ~ 6,0).
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Interacções do enzima com activadores e inibidores
DEQB
Lição de Biocatálise
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Interacções do enzima com activadores e inibidores
DEQB
Lição de Biocatálise
ActivadoresEm enzimas alostéricos o sítio de ligação do substrato (subunidadecatalítica C) e do activador (subunidadereguladora R) são diferentes:
- A ligação do activador (M) ao seu sitio específico na subunidade reguladora écomunicada à subunidade catalítica por uma alteração da sua conformação espacial.
- E é esta alteração conformação espacial que permite à sub-unidadecatalítica reconhecer o substrato com elevada afinidade.
- A dissociação do activador ao sub-unidade reguladora converte o enzima numa forma conformacional não activa ou menos activa.
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Interacções do enzima com activadores e inibidores
DEQB
Lição de Biocatálise
Inibidores Irreversíveis
Reacção da quimotripsina com di-isopropil fluoro fosfato (DIFP) inibe irreversivelmente a actividade do enzima e levou àconclusão de que a Ser195 é um resíduo de amino ácido chave no processo catalítico.
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Inibição da Actividade Enzimática (Inibidores reversíveis)DEQB
Lição de Biocatálise
Interacções do enzima com activadores e inibidores
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Inibição da Actividade Enzimática na cinética Briggs-Haldane
Inibição competitiva
EI
K
I
PE
k
ES
k
k
SE
I b
+
+→↔+
−
2
1
1
[ ][ ][ ]EI
IEKI =
CE=[E]+[ES]+[EI]
[ ][ ]
11
1
1
1
21
2
+
+
+=
−
SK
I
k
kkCkv
I
E
[ ]
+=
I
M´M
K
I1KK
1/ v S + I
S
1/ [S]-1/K`M
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ]
[ ]Sk
kk
SCkv E
++
=−
1
21
2[ ]
[ ][ ]
1
2
1
21
2
+
=
++
=−
S
k
Ck
Sk
kk
SCkv
M
EE
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Inibição da Actividade Enzimática
Inibição não competitiva
ESI
k
k
SEI
KK
II
PE
k
ES
k
k
SE
II
1
1
´
2
1
1
−
−
↔+
++
+→↔+
bb
CE=[E]+[ES]+[EI] + [ESI]
[ ][ ]SK
SCkv
M
E
+= 2
1/ vS+I
S
1/ [S ]
1/Vmáx´
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ][ ]
[ ]SK
S
K
I1
Ckv
M
I
E2
++
=
[ ]
I
máxmáx
K
I1
V´V
+
=
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Inibição anticompetitiva
ESI
K
I
PE
k
ES
k
k
SE
I b
+
+→↔+
−
2
1
1
CE=[E]+[ES]+[ESI],
[ ][ ]
[ ][ ]S
K
I1
K
S
K
I1
Ckv
I
M
I
E2
+
+
+
=
1/ v
S+I
S
1/ [S ]-1/K`M
1/Vmáx´
DEQB
Lição de Biocatálise
[ ][ ]SK
SCkv
M
E+
= 2
Inibição da Actividade Enzimática
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Inibição pelo Substrato
PE
k
ESS
KS
ES
k
k
SE
I
+→+
↔+
−
2
1
1
b [ ][ ][ ]ESS
SESK I =
[ ]
[ ] [ ]2
I
'M
E2
K
SSK
SCkv
++
=
Para baixas concentrações de S
([S]<<KM) a equação é de 1ª
ordem em [S]:
[ ]SK
EC
2k
v'M
=
Para elevadas concentrações
de S ([S]>> KM):
[ ]
[ ] [ ] [ ]
I
E2
I
E2
K
S1
1Ck
K
S1S
SCkv
+
=
+
=
v [ ]
I'M KKS =
k2CE
ESS ES + P
ESS inactivo
[S]
DEQB
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A equação de Lineweaver-Burk teria o seguinte aspecto:
Inibição pelo Substrato
declive =
máx
'
M
V
K
-1/'
MK
1/[S]
1/v
1/Vmáx
DEQB
Lição de Biocatálise