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Normative e linee guida per la validazione Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisidei metodi di analisi
Giampaolo TommasiGiampaolo TommasiA.C.R.A.F. S.p.A. Angelini FarmaceuticiA.C.R.A.F. S.p.A. Angelini Farmaceutici
Sviluppo FarmaceuticoSviluppo [email protected]@angelini.it
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
IntroduzioneIntroduzione Aspetti normativi:linee guida ICH, FDA, EmeaAspetti normativi:linee guida ICH, FDA, Emea Finalità studi di validazioneFinalità studi di validazione Come sviluppare un metodo analitico HPLC:caso praticoCome sviluppare un metodo analitico HPLC:caso pratico Risultati di una validazioneRisultati di una validazione Convalida analitica e specifiche di prodottoConvalida analitica e specifiche di prodotto Approfondimenti:Approfondimenti:
Stress test - normativeStress test - normative Finalità studi di degradazioneFinalità studi di degradazione Considerazioni generali sulla degradazioneConsiderazioni generali sulla degradazione Fattori che favoriscono la degradazione di un farmacoFattori che favoriscono la degradazione di un farmaco
ConclusioniConclusioni
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Perché validare un metodo di analisiPerché validare un metodo di analisi
Misurare una caratteristica o proprietà di un prodotto
Titolo principio attivo
Contenuto di impurezze
pH di una soluzione (es. collirio)
Stabilire quanto è attendibile la misura ottenuta
VALIDARE = pesare quanto vale VALIDARE = pesare quanto vale
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Normative sulla validazione: FDANormative sulla validazione: FDA
The FDA is responsible for protecting the public health by assuring the safety, efficacy, and security of human and veterinary drugs, biological products, medical devices, our nation’s food supply, cosmetics, and products that emit radiation. The FDA is also responsible for advancing the public health by helping to speed innovations that make medicines and foods more effective, safer, and more affordable; and helping the public get the accurate, science-based information they need to use medicines and foods to improve their health.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Normative sulla validazione: FDANormative sulla validazione: FDA
Reviewer Guidance - Validation of Chromatographic Methods
Guidance for Industry - Analytical Procedures and Methods Validation - Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation
http://www.fda.gov
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Normative sulla validazione: EmeaNormative sulla validazione: Emea
European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the European Union with headquarters in London. Its main responsibility is the protection and promotion of public and animal health, through the evaluation and supervision of medicines for human and veterinary use. The EMEA coordinates the evaluation and supervision of medicinal products throughout the European Union. The Agency brings together the scientific resources of the 25 EU Member States in a network of 42 national competent authorities. It cooperates closely with international partners, reinforcing the EU contribution to global harmonisation.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
CVMP/VICH/590/98-Topic GL1CVMP/VICH/590/98-Topic GL1 >> >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Definitions and Terminology
CVMP/VICH/590/98-Topic GL2CVMP/VICH/590/98-Topic GL2 >> >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Methodology
Normative sulla validazione: EmeaNormative sulla validazione: Emea
http://www.emea.eu.int
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Normative sulla validazione: ICHNormative sulla validazione: ICH
The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) is a unique project that brings together the regulatory authorities of Europe, Japan and the United States and experts from the pharmaceutical industry in the three regions to discuss scientific and technical aspects of product registration.
The purpose is to make recommendations on ways to achieve greater harmonisation in the interpretation and application of technical guidelines and requirements for product registration in order to reduce or obviate the need to duplicate the testing carried out during the research and development of new medicines.
The objective of such harmonisation is a more economical use of human, animal and material resources, and the elimination of unnecessary delay in the global development and availability of new medicines whilst maintaining safeguards on quality, safety and efficacy, and regulatory obligations to protect public health
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Normative sulla validazione: ICHNormative sulla validazione: ICH
Q2AQ2A >> >> Text on Validation of Analytical Procedures
Q2BQ2B >> >> Validation of Analytical Procedures: Methodology
http://www.ich.org
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Linea guida ICH Q2ALinea guida ICH Q2A
Identificaz.Identificaz.
-
-
+
-
-
-
-
-
-
Test di validazioneTest di validazione
Precisione
Accuratezza
Specificità
Linearità
Intervallo
Limite di detection (LOD)
Limite di quantificazione
Robustezza
Test di efficienza del sistema
QuantitativaQuantitativa
+
+
+
+
+
-
-
+
+
ImpurezzeImpurezze
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
-
+
-
-
-
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
TESTTEST
REPORTREPORT
PIANO DI STUDIOPIANO DI STUDIO
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
AttivitàAttività
Produzione di lotti pilotaProduzione di lotti pilota >> >> secondo quanto indicato nel dossier
Transfert methodTransfert method >> >> test statistico
DocumentiDocumenti >> >> emissione di certificato analitico
PRODOTTOPRODOTTO >> >> Gel a base di Diclofenac sodico
SCOPO DELLO STUDIOSCOPO DELLO STUDIO >> >> Trasferimento sito produttivo
DOCUMENTAZIONEDOCUMENTAZIONE >> >> Dossier farmaceutico
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
VALUTAZIONE METODO DI ANALISIVALUTAZIONE METODO DI ANALISI
Condizioni analiticheCondizioni analitiche ColonnaColonna: LiChrospher RP Select B
M.Ph.M.Ph. >> 50% MeOH - 50% Tampone fosfato
Conc. DiclofenacConc. Diclofenac >> 0.25 mg/ml >> 0.25 mg/ml
Vol. inj.Vol. inj. >> 20 µl (5µg diclofenac)
Flow rateFlow rate >> 1.7 ml/min
pH pH >> 4.3 circa
>> 282 nm
TemperaturaTemperatura >> 40°C
ttRR = 20,447 min = 20,447 min
= 1.51 (= 1.51 ( = a/b) = a/b)N = 3241N = 3241Width = 0,8467 minWidth = 0,8467 min
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
VALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICIVALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICI
Lunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (tLunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (tRR = 20,447 min.) = 20,447 min.)
Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione (Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione ( = 1,5) = 1,5)
Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241)Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241)
CONCLUSIONICONCLUSIONI
Picchi con la pancia >> analisi problematicaPicchi con la pancia >> analisi problematica
DECISIONEDECISIONE
Rivalidazione metodo di analisiRivalidazione metodo di analisi
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
PIANO DI STUDIO PIANO DI STUDIO >> Informazioni>> Informazioni
Cosa misuriamo Cosa misuriamo >> Analisi quantitativa diclofenac >> Analisi quantitativa diclofenac
Come misuriamoCome misuriamo >> Tecnica Cromatografica>> Tecnica Cromatografica
Principi chimico - fisiciPrincipi chimico - fisici >> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer>> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer
Campo di applicazioneCampo di applicazione >> Rilascio lotti (SI)>> Rilascio lotti (SI)>> Studi di stabilità (SI)>> Studi di stabilità (SI)>> Convalida di processo (SI)>> Convalida di processo (SI)>> Cleaning validation (NO)>> Cleaning validation (NO)
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
PIANO DI STUDIO PIANO DI STUDIO >> Informazioni>> Informazioni
Chimica sost.esameChimica sost.esame >> Impurezze e prodotti di degradazione>> Impurezze e prodotti di degradazione
Metodi notiMetodi noti >> Diclofenac in collirio>> Diclofenac in collirio
Forma farmaceuticaForma farmaceutica >> Eccipienti / Gel>> Eccipienti / Gel
Preparazione campionePreparazione campione >> Solubilità sostanza in esame>> Solubilità sostanza in esame
Tempo analisi Tempo analisi >> Obiettivo max 10 minuti>> Obiettivo max 10 minuti
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
CHIMICA DICLOFENAC SODICOCHIMICA DICLOFENAC SODICO fonte Farmacopea Europeafonte Farmacopea Europea
COONa
NH
ClCl
2-[(2,6-diclorofenil)aminofenil]acetato di sodioDICLOFENAC SODICO
N
O
Cl
Cl
1-(2,6-diclorofenil)-1,3-diidro-2H-indol-2-one
CHO
NH
ClCl
2-[(2,6-diclorofenil)amino]benzaldeide
NH
ClCl
OH
2-[(2,6-diclorofenil)amino]fenilmetanolo
COONa
NH
BrCl
NH
O
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
FORMULATO PRODOTTOFORMULATO PRODOTTO fonte Dossier farmaceuticofonte Dossier farmaceutico
FormulatoDiclofenac sodico Diclofenac sodico >> 1 g>> 1 g
Copherol F 1300Copherol F 1300 >> 1 g>> 1 g
Carbopol 980 Carbopol 980 >> 1.50 g>> 1.50 g
Ammoniaca Sol 10%Ammoniaca Sol 10% >> 2.60 g>> 2.60 g
Cetiol VCetiol V >> 0.50 g>> 0.50 g
Phospholipon 80 Phospholipon 80 >> 2.00 g>> 2.00 g
Titriplex III Titriplex III >> 0.04 g>> 0.04 g
Eutanol GEutanol G >> 0.50 g>> 0.50 g
Aroma “Vert de Creme”Aroma “Vert de Creme” >> 0.02 g>> 0.02 g
Alcool Isopropilico g Alcool Isopropilico g >> 20.17g>> 20.17g
Acqua dem.ta Acqua dem.ta >> q.b. a 100 g>> q.b. a 100 g
Analisi
Alto contenuto massa gelificanteAlto contenuto massa gelificante
Alto contenuto massa grassaAlto contenuto massa grassa
Phospholipon 80 >> effetto matricePhospholipon 80 >> effetto matrice
Profumo “Vert de Creme” (mix)Profumo “Vert de Creme” (mix)
Verifiche
Doppia diluizione >> riduzione interf.Doppia diluizione >> riduzione interf.
Intervallo tra 0.2 - 0.6 µg >> no sovracaricoIntervallo tra 0.2 - 0.6 µg >> no sovracarico
Analisi placebo Phospholipon 80 Analisi placebo Phospholipon 80
Analisi spettraleAnalisi spettrale
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
Doppia diluizione: Doppia diluizione: verifiche con vari solventiverifiche con vari solventi
IpotesiIpotesi: solvente che aprisse la matrice gelificante (senza solubilizzarla)
ObiettivoObiettivo: estrarre il P.A. senza modificare la sua ionizzazione
SperimentaleSperimentale: Solventi di estrazione >>
MeOHMeOH - ACN - Fase Mobile - Isopropanolo
Prove rispetto al PhospholiponProve rispetto al Phospholipon
IpotesiIpotesi: possibile “effetto matrice”
ObiettivoObiettivo: Verificare possibile interferenza con il Phospholipon
SperimentaleSperimentale:
Campione con Phospholipon >> 102.4%
Campione senza Phospholipon >> 103.7%
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
VALUTAZIONE METODI ANALOGHIVALUTAZIONE METODI ANALOGHI
Condizioni analiticheCondizioni analitiche
ColonnaColonna: LiChrosorb RP18
M.Ph.M.Ph. >> 60% MeOH - 40% Tampone fos.to (0.5M) + NaOH 1N
Conc. DiclofenacConc. Diclofenac >> 0.20 mg/ml >> 0.20 mg/ml
Vol. inj.Vol. inj. >> 10 µl (2 µg diclofenac)
Flow rateFlow rate >> 1.0 ml/minpHpH = alcalino (magg. 7,0)(magg. 7,0)
>> 278 nmTemp.Temp. >> 25°C
RIFERIMENTORIFERIMENTO
ttRR = 7,141 min = 7,141 min
= 0.86 (= 0.86 ( = a/b) = a/b)
N = 4480N = 4480Widh = 0,2511 minWidh = 0,2511 min
SAMPLESAMPLEttRR = 8.440 min = 8.440 min
= 1.37 (= 1.37 ( = a/b) = a/b)
N = 1621N = 1621Widh = 0,4933 minWidh = 0,4933 min
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISIOTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI
Condizioni analiticheCondizioni analitiche
ColonnaColonna: LiChrospher RP Select B
M.Ph.M.Ph. >> 50% ACN - 50% Tampone ac.to + N(Et)3 0.01M
Conc. DiclofenacConc. Diclofenac >> 0.08 mg/ml >> 0.08 mg/ml Vol. inj.Vol. inj. >> 5 µl (0,4 µg diclofenac)Flow rateFlow rate >> 1.0 ml/minpHpH = ( 6,5 circa)( 6,5 circa)
>> 282/(220) nmTemp.Temp. >> 28°C
SAMPLE in MeOHSAMPLE in MeOH
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Sviluppo di un metodo di analisi HPLCSviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - ValutazioniOTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - Valutazioni
Dati cromatograficiDati cromatografici
Tempo ritenzione (tR)
Simmetria ()
Efficienza (N)
Base picco
Metodo originaleMetodo originale
20,447 min.
= 1,51
N = 3241
0,8467 min.
Metodo ottimizzatoMetodo ottimizzato
4,167 min.
= 0,89
N = 9618
0,1 min.
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
SPECIFICITA’SPECIFICITA’ SCOPO DEL TESTSCOPO DEL TEST: : Misurare la sostanza in esame in presenza di sostanze potenzialmente interferenti
TIPOLOGIE TESTTIPOLOGIE TEST Identificazione Il metodo analitico deve identificare selettivamente l’analitaDosaggio Il metodo analitico deve dosare selettivamente l’analitaPurezza Il metodo analitico deve interagire selettivamente con l’analita
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
RANGE E LINEARITA’RANGE E LINEARITA’
100%100%
Risp
osta
Risp
osta
ConcentrazioneConcentrazione100%100%
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
RANGE E LINEARITA’RANGE E LINEARITA’
Test validazioneTest validazione
Range
Coeff. correlazione
Pendenza
Intercetta
Metodo originaleMetodo originale
4,0 - 6,0 g
0,999
85537
61575
Metodo ottimizzatoMetodo ottimizzato
0,2 - 0,6 g
0,999
22944,37
- 5,13
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
RANGE E LINEARITA’RANGE E LINEARITA’
Confronto intercetteConfronto intercettetabulato 2.14 >> sperim. 1.10
Confronto pendenzeConfronto pendenzetabulato 2.14 >> sperim. 1.08
Confronto intercetta rettaConfronto intercetta rettastandard con lo zerostandard con lo zerotabulato 2.14 >> sperim. 1.15
Confronto intercetta rettaConfronto intercetta rettaricostituito con lo zeroricostituito con lo zerotabulato 2.14 >> sperim. 1.13
Confronto statistico linearità
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14
Conc mg/ml
Area
Standard
Ricostituitointervallo di validazione
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
ACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZAACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZA
ACCURATEZZAACCURATEZZARecupero >> -0.71%Recupero >> -0.71%
PRECISIONEPRECISIONECV% >> 1.01%CV% >> 1.01%
Errore sistematico del metodo di analisi
Errore casuale del metodo di analisi
Test di EfficienzaTest di Efficienza tR >> tra 4.0 e 4.8 min >> tra 0.8 e 1.0 N >> maggiore 8000 Rs >> non indicabile CV% area >> inf. 2.0%
VALIDARE = pesare quanto vale VALIDARE = pesare quanto vale
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
CONCLUSIONICONCLUSIONI
pH fase mobilepH fase mobile
Eluizione pH-dipendente % Modificatore organico% Modificatore organico
ACN sostituisce MeOH
TemperaturaTemperaturaDa 40°C a 28°C
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Validazione di un metodo di analisi HPLCValidazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico: caso pratico
SPECIFICHE: Prodotto vs. ValidazioneSPECIFICHE: Prodotto vs. Validazione
ACCURATEZZAACCURATEZZARecupero >> -0.71%Recupero >> -0.71%
PRECISIONEPRECISIONECV% >> 1.01%CV% >> 1.01%
Specifiche prodottoSpecifiche prodotto
Rilascio lotti >> 95% - 105%
Studi stabilità>> 95% - 105%
95% 100% 105%
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VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Stress Test >> introduzioneStress Test >> introduzione
Aspetti normativiAspetti normativi Finalità studi di degradazioneFinalità studi di degradazione Considerazioni generali sulla degradazioneConsiderazioni generali sulla degradazione Fattori che favoriscono la degradazione di un farmacoFattori che favoriscono la degradazione di un farmaco
Temperatura / UmiditàTemperatura / Umidità LuceLuce pHpH Agenti ossidantiAgenti ossidanti
ConclusioniConclusioni
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Aspetti normativiAspetti normativi
Stress TestStress Test come voce di glossario [rif. ICH Q1A] come voce di glossario [rif. ICH Q1A]
Stress TestStress Test come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R] come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R]
Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B]Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B]
Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A]Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A]
Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02]Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02]
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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Aspetti normativi alcune considerazioni ….Aspetti normativi alcune considerazioni ….
Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1
Non è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezzeNon è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezze
Non è necessario effettuare studi cineticiNon è necessario effettuare studi cinetici
I risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supportoI risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supporto
Ampia libertà nella conduzione dei testAmpia libertà nella conduzione dei test
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
33
Scopo studi di degradazioneScopo studi di degradazione
Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A.Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A.
Verificare le caratteristiche intrinseche di stabilità di un principio attivo
Mettere in evidenza quali fattori provocano la degradazione del principio attivo
Prevedere accorgimenti necessari nello sviluppo formulativo di un prodotto
Valutare le misure necessarie da adottare al fine di proteggere il prodotto
Sviluppo e convalida della più adatta procedura analitica
Anticipare il comportamento del prodotto finito durante gli studi di stabilità
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
34
Cosa occorre?Cosa occorre?
Piano sperimentale corretto:Piano sperimentale corretto:
Personale qualificatoPersonale qualificato
Conoscenza della chimica organica di degradazione Conoscenze analitiche della sostanza in esame Interpretazione dei risultati
Caratteristiche strutturali della molecola in studio
Durata del piano deve avere carattere predittivo
Tipologia dei test per favorirne la degradazione
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
35
Degradazione: considerazione generaliDegradazione: considerazione generali
MOLECOLAMOLECOLA
DURATADURATA
TESTTEST
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
36
Degradazione: la molecolaDegradazione: la molecola
Caratteristiche strutturaliCaratteristiche strutturali
Forma farmaceuticaForma farmaceutica
Gruppi funzionali vs principali reazioni di degradazioneGruppi funzionali vs principali reazioni di degradazione
Ampio ventaglio di principi attiviAmpio ventaglio di principi attivi
EccipientiEccipienti
Impurezze presenti in materie primeImpurezze presenti in materie prime
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
37
Degradazione: durata dei testDegradazione: durata dei test
EsempioEsempio: reazione consecutiva di 1° ordine: reazione consecutiva di 1° ordine
P.A.P.A. BB CCk1 k2
Aspetti generaliAspetti generali
Carattere predittivoCarattere predittivoRaggiungere il 10 - 20% di degradazioneRaggiungere il 10 - 20% di degradazione
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
38
P.A.
B
C
0
20
40
60
80
100
120
Tempo
Modello cinetico per reazioni di degradazione consecutive 1°ordine
Degradazione: durata dei testDegradazione: durata dei test
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
39
Tipologia dei testTipologia dei test
Stato SolidoStato Solido::
Esposizione Temperatura-UmiditàEsposizione Temperatura-Umidità
Esposizione LuceEsposizione Luce
Stato LiquidoStato Liquido::
Esposizione LuceEsposizione Luce
Esposizione pHEsposizione pH
Esposizione agenti ossidantiEsposizione agenti ossidanti
Aspetti generaliAspetti generali
Verificare vari fattori ambientaliVerificare vari fattori ambientali
Replicare i processi degradativiReplicare i processi degradativi
Degradazione: caratteristiche testDegradazione: caratteristiche test
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
40
Test >> Temperatura - UmiditàTest >> Temperatura - Umidità
Aspetti normativiAspetti normativi
It should include the effect of temperatures (… 50°C - 60°C)… and humidity (75%RH or greater) where appropriate …
Campioni analiticiCampioni analitici
Principi attivi - Miscele (p.a. + eccipienti) - Formulati
Direttamente esposti [rif. Q1A_R2]
Principali processi degradativiPrincipali processi degradativi
Idrolisi - Decarbossilazione - Ossidazione - Pirolisi (?!?)
Polimorfismo
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
41
Test >> Temperatura - UmiditàTest >> Temperatura - Umidità
Durata Durata ?? >> piccola considerazione termodinamica?? >> piccola considerazione termodinamica
Ea Ea 22 kcal 22 kcal mol mol-1-1
Eq. Arrhenius k = A eEq. Arrhenius k = A e-Ea/RT-Ea/RT
T = 60°C T = 60°C T = 25°CT = 25°C
kk(60°C)(60°C)/k/k(25°C) (25°C) 30 30
60 gg; (T= 60°C) 60 gg; (T= 60°C) 4,9 aa; (T=25°C) 4,9 aa; (T=25°C)
P.A.P.A. BB CCk1
k2
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
42
Test >> Temperatura - UmiditàTest >> Temperatura - Umidità
Alcune considerazioni sulla degradazione in fase solidaAlcune considerazioni sulla degradazione in fase solida
Formazione interfaccia solido-liquido (soluzioni sovrasature)
Principio attivo o eccipienti a basso punto di fusione
Eccesso di solventi residui da processi di granulazione
Assorbimento di umidità (sostanze igroscopiche)
Acqua di idratazione
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
43
Esposizione Temperatura - UmiditàEsposizione Temperatura - Umidità
CondizioniCondizioni::
temperatura >>temperatura >> 50° - 60°C50° - 60°Cumidità>>umidità>> 75% - 85% RH75% - 85% RH
DurataDurata:: 60 giorni60 giorni
ControlliControlli:: 0 - 15 - 30 - 45 - 60 giorni0 - 15 - 30 - 45 - 60 giorni
Protocollo di studioProtocollo di studio
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
44
Test >> LuceTest >> Luce Aspetti normativiAspetti normativi
Rif. linea guidaQ1A(R)Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of photolysis on : It should include the effects … of photolysis on the active substance.the active substance.
Rif. linea guida Q1BRif. linea guida Q1B: condizioni sperimentali: condizioni sperimentali
DurataDurata ?? ??
Scopo del testScopo del test >> forzare la degradazione >> forzare la degradazione
Tempo almeno doppio delle condizioni del test di confermaTempo almeno doppio delle condizioni del test di conferma
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
45
Test >> LuceTest >> Luce
P.A.P.A. P.A.*P.A.*h
Fosforescenza/FluorescenzaFosforescenza/Fluorescenza
Emissione caloreEmissione calore
DimerizzazioneDimerizzazione
Prodotti di degradazioneProdotti di degradazionefotoliticifotoliticifotossidazionefotossidazione
FotodegradazioneFotodegradazione
EsempioEsempio >> dimerizzazione >> dimerizzazione
N
N
CH3
O
O
H
H
2h N
N
O
O
H
HCH3
N
N
O
O
H
HCH3
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
46
Test >> LuceTest >> Luce
EsempioEsempio >> prodotti di degradazione - fotolisi >> prodotti di degradazione - fotolisi
EsempioEsempio >> prodotti di degradazione - fotossidazione >> prodotti di degradazione - fotossidazione
Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE)Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE)
N
N N
N
NH2
H2N
N
CH3
N
COOH
COOHH
O
N
N N
N
NH2
H2N
CHOhH2N
N
COOH
COOHH
O
hN
N N
N
NH2
H2N
COOH
Metoxarato
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
47
Esposizione luceEsposizione luce
CondizioniCondizioni - - Stato solidoStato solido Stato liquidoStato liquidoSecondo ICH Q1B (forced degradation)Secondo ICH Q1B (forced degradation)
DurataDurata:: 3 - 10 giorni3 - 10 giorni 3 giorni3 giorni
ControlliControlli:: 0 - 1 - 3 - (7 - 10) giorni0 - 1 - 3 - (7 - 10) giorni 0 - 1 - 3 giorni0 - 1 - 3 giorni
Protocollo di studioProtocollo di studio
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
48
Test >> pHTest >> pH
Aspetti normativiAspetti normativi
……should also evaluate the suscettibility of active substance to should also evaluate the suscettibility of active substance to hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or suspension suspension …
Campioni analiticiCampioni analitici
Classico schema a tre punti di pH
Principali processi degradativiPrincipali processi degradativi
Idrolisi - degradazioni pH catalizzate
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
49
Test >> pHTest >> pH Esempio
Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con uno schema a tre punti di pHuno schema a tre punti di pH
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
50
Test >> pHTest >> pH
Esempio: Hydrochlorothiazide
NH
NHSO2
Cl
H2NO2S
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Andamento degradativo che Andamento degradativo che richiede uno schema di studio a richiede uno schema di studio a più di tre valori di pHpiù di tre valori di pH
51
Test >> pHTest >> pH
Esempio: Chlorothiazide
N
NHSO2
Cl
H2NO2S
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Interessante caso di processo di Interessante caso di processo di degradazione multiplo strettamente degradazione multiplo strettamente legato ai valori del pHlegato ai valori del pH
52
Esposizione pHEsposizione pH
CondizioniCondizioniAmbiente Acido >> Ambiente Acido >> Soluzione HCl 0,1 MSoluzione HCl 0,1 M
Ambiente Neutro >>Ambiente Neutro >> Sol.Tampone pH ~ 7Sol.Tampone pH ~ 7
Ambiente Alcalino >>Ambiente Alcalino >> Soluzione NaOH 0,1MSoluzione NaOH 0,1M
Temperatura >>Temperatura >> 50°- 60°C50°- 60°C
Conc. P.A. >>Conc. P.A. >> 0,1 – 1,0%0,1 – 1,0%
DurataDurata:: 7 - 14 giorni7 - 14 giorni
ControlliControlli:: 0 - 1 - 3 - (7 - 10 - 14) giorni0 - 1 - 3 - (7 - 10 - 14) giorni
NoteNote ulteriori test in range più definitoulteriori test in range più definito
Protocollo di studioProtocollo di studio
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
53
OssidazioniOssidazioni
Aspetti normativi
Rif. linea guidaQ1A(R)Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of oxidation ... on : It should include the effects … of oxidation ... on the active substance.the active substance.
Considerazioni generali
Ossigeno molecolareOssigeno molecolare O O22 >> stato fondamentale tripletto >> stato fondamentale tripletto
Reazioni di ossidazioneReazioni di ossidazione >> procedono via radicalica >> procedono via radicalica
RH + O2 ROO
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
54
OssidazioniOssidazioni
Meccanismo di reazione “Autossidazioni”
RH + In R + InH Iniziazione (RIniziazione (Rii))
R• + O2 ROO
ROO + RH ROOH + R Propagazione (KPropagazione (Kpp))
2 ROO Prodotti inerti Terminazione (KTerminazione (Ktt))
d[ROOH]dt
-d[O
dt -
d[RH]dt
= k RH]R2k
2p
i
t
][
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
55
OssidazioniOssidazioni
Uso di iniziatori radicalici
2,2’-azobis( 2-metilpropanonitrile)2,2’-azobis( 2-metilpropanonitrile)[AIBN][AIBN]
N
CH3
CN
H3C N
CH3
CH3
CN
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
56
OssidazioniOssidazioni
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
CH3
CH3
N N
CH3
CH3
CN CN
CH3
CH3
CN
.2 + N2
CH3
CH3
CN
. + O2 CH3
CH3
CN
O O .
CH3
CH3
CN
O O . RH+ CH3
CH3
CN
O O H + R.
CH3
CH3
CN
O O H CH3
CH3
CN
O . + OH.
R R. .+ R R
R . + R O . R O R
CH3
CH3
CN
O . + R . CH3
CH3
CN
O R
CH3
CH3
CN
O . + CH3
CH3
CN
O O H CH3
CH3
CN
O H + CH3
CH3
CN
O O .
TerminazioniPropagazioni
57
OssidazioniOssidazioni
Esempio: Tetrazepam - degradazione
3'
N
NCl
OH3C
N
NCl
O
OOH
H3C
Idroperossido
Epossido
N
NCl
O
O
H3C
Cheton-derivato
N
NCl
O
O
H3C
"Seco"
N
NHCl
O
O
H3C
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
58
OssidazioniOssidazioni
Esempio: Tetrazepam - cromatografia
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
59
OssidazioniOssidazioni
Esempio: Tetrazepam - effetto solvente
SOLVENTESOLVENTE
Acetonitrile
SecoSecoP.A.P.A. ChetoCheto IdropIdrop EpoxEpox
1,9%1,9%65,8%65,8% 11,2%11,2% 8,4%8,4% 2,8%2,8%
Acetonitrile + 20% H2O 1,4%1,4%68,1%68,1% 11,4%11,4% 9,6%9,6% 2,8%2,8%
Metanolo 2,4%2,4%75,2%75,2% 6,6%6,6% 8,3%8,3% 1,8%1,8%
Etanolo 5,2%5,2%84,0%84,0% 1,0%1,0% 6,3%6,3% traccetracce
2-propanolo 4,8%4,8%89,6%89,6% 0,3%0,3% 4,3%4,3% traccetracce
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
60
OssidazioniOssidazioni
Uso di perossido di idrogeno H2O2 >> alcune considerazioni
I risultati devono essere adeguatamente interpretati
Meccanismo di azione ionico
Epossidi e N-ossidi
Esempio: Tetrazepam & Benzidamina HCl
N
NCl
OH3C
N
NCl
OH3C
OH2O2
NN
O
NCH3
CH3
NN
O
NCH3
CH3
OH2O2
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
61
OssidazioniOssidazioni Uso di ioni di metalli Fe3+ ; Cu2+
Possibili iniziatori
Possono essere presenti in tracce (impurezze di materie prime e confezionamenti)
Prodotti sensibili all’ossidazione
Interpretazione dei risultati
azo-derivati più predittivi
H2O2 predittiva per Epossidi e N-ossidi
Attenzione se il prodotto è sensibile a tutti i test
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
62
OssidazioniOssidazioni
CondizioniCondizioniReagenti >>Reagenti >> Substrato + AIBN (1:1 mol)Substrato + AIBN (1:1 mol)
Substrato + tracce ioni metalli (FeSubstrato + tracce ioni metalli (Fe3+3+ o Cu o Cu2+2+))
Substrato + HSubstrato + H22OO22 (sol. 3%) (sol. 3%)
Solvente >>Solvente >> ACN ( + acqua)ACN ( + acqua)Temperatura >> Temperatura >> 40°C (max)40°C (max)
DurataDurata:: 48 ore48 ore
ControlliControlli:: ogni 24 oreogni 24 ore
Protocollo di studioProtocollo di studio
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
63
Conclusioni (1)Conclusioni (1)
Lo stress test è predittivo quando mette in evidenza tutte le impurezze che si possono osservare nella stabilità a lungo termine ed accelerata.
Uno stress test predittivo permette di qualificare un metodo come “stability indicating”.
Un test è predittivo quantitativamente quando permette di anticipare una stabilità critica.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
64
Conclusioni (2)Conclusioni (2)
I saggi di degradazione forzata sono semplici, ma devono essere interpretati da esperti.
L’arricchimento delle impurezze nella degradazione forzata ne facilita l’isolamento e la caratterizzazione.
Non è necessario identificare tutte le impurezze osservate nello stress test.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
65
Conclusioni (3)Conclusioni (3)La convalida di un metodo analitico comprende i test di
specificità, linearità, accuratezza, precisione, robustezza
A meno di non avere informazioni esaurienti dal produttore, va sempre effettuato un test di stress della materia prima. Inoltre va verificato anche il comportamento del prodotto finito alle comuni condizioni di stress (compatibilità con eccipienti).
Occorre prevedere nel metodo una sezione di calcolo per le impurezze incognite (ICH Q3B(R)).
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
66
PrecisionePrecisione
La precisione di un metodo analitico esprime la vicinanza (grado di dispersione) tra una serie di misurazioni ottenute da vari campionamenti di un medesimo campione omogeneo secondo le condizioni prescritte.
La precisione può essere considerata a tre livelli: ripetibilità, precisione intermedia, e riproducibilità.
La precisione dovrebbe essere investigata utilizzando un “prodotto finito” omogeneo. Comunque, se non è possibile ottenere un campione omogeneo, può essere investigata usando un campione preparato artificialmente o un campione in soluzione.
La precisione di un metodo analitico è di solito espressa come la varianza, la deviazione standard o il coefficiente di variazione della serie di misurazioni.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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67
AccuratezzaAccuratezza
L’accuratezza di un metodo analitico esprime la differenza tra il valore convenzionalmente accettato come vero o come valore di riferimento e quello trovato
Può a volte essere definita “esattezza”
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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68
SpecificitàSpecificità La specificità è la capacità di valutare inequivocabilmente l’analita in presenza di componenti di cui può
essere prevista la presenza. Tipicamente questi potrebbero includere impurezze, degradati, matrici, etc.
La mancanza di specificità di una singola procedura analitica può essere compensata da altre procedure di sostegno.
Questa definizione ha le seguenti implicazioni:
1. Identificazione: per accertare l’identità di un analita
2. Prove di purezza: per accertarsi che tutte le procedure analitiche effettuate permettano una dichiarazione esatta del contenuto delle impurità di un analita, i.e. prova delle sostanze correlate, metalli pesanti, contenuto dei solventi residui, etc.
3. Analisi (contenuto o efficacia): per fornire un risultato esatto che permette una dichiarazione esatta sul contenuto o sull’efficacia dell’analita in un campione.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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69
LinearitàLinearità
La linearità di una procedura analitica è la relativa capacità (all’interno di un certo intervallo) di ottenere dei risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita nel campione.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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70
LinearitàLinearità
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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clA Legge Lambert-Beer
Risp
osta
Risp
osta
ConcentrazioneConcentrazione
cbaA L&B
Generica
Generica
100%100% 100%100%
r
c
cba
cba
''
%
Se a=a’=0 e b=b’:r
c
c
c%
71
Intervallo (range)Intervallo (range)
Il range di un metodo analitico è l’intervallo fra la concentrazione superiore e quella inferiore di analita nel campione (queste concentrazioni comprese) per cui è stato dimostrato che la procedura analitica ha un livello adatto di precisione, di accuratezza e di linearità.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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72
Limite di detection (LOD)Limite di detection (LOD)
Il LOD in un metodo analitico è la minima quantità di analita in un campione che può essere rilevata ma non necessariamente essere quantificato come valore esatto.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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73
Limite di quantificazione (LOQ)Limite di quantificazione (LOQ)
Il limite di quantificazione di una procedura analitica è la quantità più bassa di analita che può essere determinato quantitativamente in un campione con adatta precisione ed accuratezza.
Il LOQ è un parametro delle analisi quantitative per i bassi livelli di composti in matrici di campioni, ed è usato particolarmente per la determinazione di impurezze e prodotti di degradazione.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
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74
RobustezzaRobustezza
La robustezza di una procedura analitica è una misura della relativa capacità di rimanere inalterata nonostante piccole intenzionali variazioni dei parametri del metodo e fornisce un’indicazione della relativa affidabilità durante l’uso normale.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ritorna a linea guida ICH Q2A
75
Test di efficienza del sistemaTest di efficienza del sistema
Il test di efficienza del sistema è parte integrante di molte procedure analitiche. Il test si basa sul concetto che l’apparecchiatura, l’elettronica, le operazioni analitiche ed i campioni da analizzare costituiscono un sistema integrale che può essere valutato come tale. I parametri da stabilire nel test di efficienza del sistema dipendono dal tipo di procedura che si sta convalidando. Per informazioni supplementari vedasi le relative farmacopee.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ritorna a linea guida ICH Q2A
76
RipetibilitàRipetibilità
La ripetibilità esprime la precisione nelle stesse condizioni di gestione in un breve intervallo di tempo.
La ripetibilità è anche chiamata precisione di intra-analisi
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ritorna a Precisione
77
Precisione intermediaPrecisione intermedia
La precisione intermedia esprime le variazioni di intra-laboratorio : giorni differenti, analisti differenti, attrezzature differenti, etc.
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ritorna a Precisione
78
RiproducibilitàRiproducibilità
La riproducibilità esprime la precisione fra i laboratori ( studi collaborativi, solitamente applicati alla standardizzazione di metodologie).
VALIDAZIONE METODI DI ANALISIVALIDAZIONE METODI DI ANALISI
Ritorna a Precisione