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1. Auflage 2010

© 2010 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gießen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-006-9

Verlag: DVG Service GmbH

Friedrichstraße 17

35392 Gießen

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[email protected]

www.dvg.net

Tierärztliche Hochschule Hannover

Vergleichende Untersuchung der Immunphänotypisierung, Apoptose-Induktion und Bedeutung

regulatorischer T-Zellen bei empfänglichen und resistenten Mausstämmen im

zentralen Nervensystem während der Theilervirus-Enzephalomyelitis

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Stephanie Kristin Klein

Northeim

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung: Jun.-Prof. Dr. Andreas Beineke Institut für Pathologie 1. Gutachter: Jun.-Prof. Dr. Andreas Beineke 2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. Ludwig Haas Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2010

Elise, Edith, Julia und Peter

Vorabveröffentlichungen von Teilergebnissen dieser These in Zeitschriften:

KUMMERFELD, M., KLEIN, S., ULRICH, R., KREUTZER, R., GERHAUSER, I., BAUMGÄRTNER, W., BEINEKE, A. (2010):

Periventricular brain lesion development in a viral murine model for multiple sclerosis (Manuskript eingereicht bei PLOS one)

Teile der vorliegenden These wurden bereits als Kongressbeiträge präsentiert:

Klein, S.; Kummerfeld, M.; Gerhauser, I.; Ulrich, R.; Baumgärtner, W.; Beineke, A.: Comparison of inflammatory responses and apoptosis in the brain of Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infected SJL/J and C57BL/6 mice. In: European Society of Veterinary Pathology (Hrsg.): Proceedings of the 27th meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Olsztyn-Krakow, 09.-12.09.2009; S. 55

Klein, S. K.; Gerhauser, I. ; Ulrich, R.; Elmarabet, S.; Baumgärtner, W.; Beineke, A.: Investigation upon the role of apoptosis in Theiler´s murine encephalitis virus-infected SJL/J and C57BL/6 mice. In: European Society of Veterinary Pathology (Hrsg.): Proceedings of the 26th meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Dubrovnik, 17.-21.09.2008; S. 130

Kummerfeld, M.; Ulrich, R.; Gerhauser, I.; Klein, S.; Baumgärtner, W.; Beineke, A.: Distribution of Theiler´s murine encephalomyelitis virus in acute and chronic brain lesions of SJL/J and C57BL/6 mice. In: European Society of Veterinary Pathology (Hrsg.): Proceedings of the 26th meeting of the European Society of Veterinary Pathology, Dubrovnik, 17.-21.09.2008; S. 135

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht.............................................................................................. 5

2.1 Theilervirus-Enzephalomyelitis als Modell für demyelinisierende Enzephalomyelitiden .................................................................................... 5

2.2 Die Theilervirus induzierte murine Enzephalomyelitis .................................. 9 2.2.1 Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus .......................................... 9 2.2.2 Vergleich empfänglicher SJL-Mäuse und resistenter C57BL/6-Mäuse 12 2.2.3 Die virale Ausbreitung ......................................................................... 14 2.2.4 Die Pathogenese der Theilervirus-Enzephalomyelitis ......................... 14 2.2.5 Die klinische Symptomatik .................................................................. 18

2.3 Apoptose .................................................................................................... 19 2.3.1 Allgemein ............................................................................................ 19 2.3.2 Apoptose bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis................................ 24

2.4 Regulatorische T-Zellen ............................................................................. 27 2.4.1 Allgemein ............................................................................................ 27 2.4.2 Regulatorische T-Zellen bei demyelinisierenden ZNS-Erkrankungen am

Beispiel der Multiplen Sklerose und der Experimentellen Autoimmunen Enzephalitis......................................................................................... 30

3 Material und Methoden ................................................................................... 33 3.1 Virusinfektion von SJL- und C57BL/6- Mäusen.......................................... 33 3.2 Probengewinnung ...................................................................................... 34

3.2.1 Paraffin-eingebettete und Formalin-fixierte Proben............................. 35 3.2.2 OCT-eingebettete Proben (Nativmaterial) ........................................... 35

3.3 Lichtmikroskopische Untersuchung............................................................ 35 3.3.1 Histologie ............................................................................................ 35

3.4 Immunhistologie ......................................................................................... 37 3.4.1 Antikörper und Seren .......................................................................... 39 3.4.2 Protokolle ............................................................................................ 41 3.4.3 TUNEL-Methode ................................................................................. 44

3.5 Auswertung lichtmikroskopischer Untersuchung........................................ 46 3.6 Statistische Auswertung ............................................................................. 47

4 Ergebnisse ....................................................................................................... 49 4.1 Histologische Befunde im zentralen Nervensystem von empfänglichen SJL-

und resistenten C57BL/6-Mäusen.............................................................. 49 4.2 Immunphänotypisierung der Entzündungsreaktion empfänglicher SJL- und

resistenter C57BL/6-Mäusestämme unter spezieller Berücksichtigung regulatorischer T-Zellen ............................................................................. 50

4.2.1 Großhirn.............................................................................................. 50 4.2.2 Klein- und Stammhirn.......................................................................... 74 4.2.3 Rückenmark........................................................................................ 96

4.3 Apoptosenachweis und Fas-Expression in entzündlichen Arealen des ZNS empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäusestämme ...................117

4.3.1 Aktivierte Caspase-3+ Zellen ..............................................................117 4.3.2 TUNEL+, pyknotische Zellen ..............................................................129 4.3.3 Fas+ Zellen .........................................................................................140

II Inhaltsverzeichnis

5 Diskussion ......................................................................................................153 5.1 Immunphänotypisierung der Entzündungsreaktion im zentralen

Nervensystem ...........................................................................................153 5.1.1 Immunphänotypisierung der lymphozytären Infiltrate im Großhirn .....153 5.1.2 Immunphänotypisierung der histiozytären und glialen Zellen im

Großhirn.............................................................................................156 5.1.3 Immunphänotypisierung der lymphozytären Infiltrate im Klein- und

Stammhirn..........................................................................................157 5.1.4 Immunphänotypisierung der histiozytären und glialen Zellen im Klein-

und Stammhirn...................................................................................160 5.1.5 Immunphänotypisierung lymphozytärer Infiltrate im Rückenmark ......162 5.1.6 Immunphänotypisierung der histiozytären und glialen Zellen im ............ Rückenmark.......................................................................................165

5.2 Apoptosenachweis im zentralen Nervensystem........................................167 5.2.1 Großhirn.............................................................................................167 5.2.2 Klein- und Stammhirn.........................................................................168 5.2.3 Rückenmark.......................................................................................168

5.3 Schlussbetrachtung...................................................................................169 6 Zusammenfassung.........................................................................................171 7 Summary .........................................................................................................173 8 Literaturverzeichnis .......................................................................................175 9 Anhang ............................................................................................................197

9.1 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der Immunphänotypisierung entzündlicher Herde im zentralen Nervensystem empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäuse.......................................................................197

9.1.1 Großhirn.............................................................................................197 9.1.2 Klein- und Stammhirn.........................................................................208 9.1.3 Rückenmark.......................................................................................219

9.2 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse des Apoptosenachweis und der Fas-Expression in entzündlichen Herden im zentralen Nervensystem empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäuse................................225

9.2.1 Aktivierte Caspase-3+ Zellen ..............................................................225 9.2.2 TUNEL+, pyknotische Zellen ..............................................................230 9.2.3 Fas+ Zellen.........................................................................................235

9.3 Bezugsquellen für Reagienzen, Chemikalien und Antikörper....................241 9.4 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel .............................................243 9.5 Lösungen und Puffer .................................................................................244

9.5.1 Histologie ...........................................................................................244 9.5.2 Immunhistologie .................................................................................245 9.5.3 TUNEL Methode ................................................................................245

9.6 Abkürzungen .............................................................................................247 10 Danksagung ................................................................................................249

Einleitung 1

1 Einleitung

Die chronische, demyelinisierende Theilervirus-Enzephalomyelitis („Theiler’s murine

encephalomyelitis“, TME) entspricht in ihrem klinischen Verlauf der primär

progressiven Verlaufsform der Multiplen Sklerose (MS) des Menschen und stellt

somit ein anerkanntes Tiermodell zur Untersuchung von Entmarkungsprozessen im

zentralen Nervensystem (ZNS) dar (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; HAFLER

und WEINER, 1995; TSUNODA et al., 1996; HAFLER, 1999). Darüber hinaus

ermöglicht die experimentelle TME die Untersuchung von Pathomechanismen bei

der demyelinisierenden Leukoenzephalitis im Verlauf der Hundestaupe (FRISK et al.,

1999; MARKUS et al., 2002; BEINEKE et al., 2008, 2009; SEEHUSEN und

BAUMGÄRTNER, 2009). Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus (TMEV) ist ein

einzelsträngiges Ribonukleinsäure (RNS)-Virus und gehört zur Familie der

Picornaviridae (RACANIELLO, 2001). Das bei der Maus als Erreger

asymptomatischer Magen-Darminfektionen vorkommende Virus neigt zur spontanen

Manifestation im zentralen Nervensystem (ZNS; THEILER und GARD, 1940;

THOMPSON et al., 1951). Entsprechend ihres zentralnervösen Krankheitsverlaufes

lassen sich hoch- und schwachvirulente TMEV-Stämme unterscheiden (LIPTON,

1980). Die hochvirulenten Virusstämme, GDVII und FA, rufen eine meist letal

endende Polioenzephalitis bei Mäusen hervor. Die intrazerebrale Infektion mit den

schwachvirulenten BeAn- und DA-Virusstämmen in resistenten C57BL/6-Mäusen

resultiert in einer akuten Erkrankung ohne Ausbildung einer demyelinisierenden,

chronischen Phase (OLESZAK et al., 2004). Bei empfänglichen SJL-Mäusen

hingegen kann durch die intrazerebrale Infektion mit diesen Virusstämmen ein

biphasischer Krankheitsverlauf induziert werden. Dieser ist charakterisiert durch eine

akute, milde Polioenzephalomyelitis mit Infiltrationen von Lymphozyten und

Makrophagen und einer späten, chronisch-progredienten Phase mit

demyelinisierender Leukoenzephalomyelitis (LIPTON, 1975; ULRICH et al., 2006 a,

b). Es konnte gezeigt werden, dass der Schluß der Blut-Hirn-Schranke („blood-brain-

barrier“, BBB) des ZNS entscheidenden Einfluss auf den Verlauf der TME bei

empfänglichen SJL-Mäusen hat (NAVARRETE-TALLONI et al., 2010). Im

2 Einleitung

fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung entwickelt sich eine sekundäre

hypersensitive Reaktion vom verzögerten Typ („delayed-type hypersensitivity“, DTH)

(CLATCH et al., 1986; MILLER et al., 2001). Die Immunzellen reagieren hierbei

zunächst auf die Virusepitope. Durch den Vorgang des so genannten „epitope

spreading“ resultieren autoimmune Prozesse mit Nachweis von Immunzellen, welche

gegen körpereigene Myelinepitope agieren (BORROW et al., 1998; DI ROSA und

BARNABA, 1998; LEHMANN et al., 1998; VANDERLUGT et al., 1998).

Autoreaktive T-Zellen werden in der Regel durch die negative Selektion im Thymus

eliminiert (zentrale Toleranz). Weiterhin wird die periphere Toleranz durch Anergie,

Suppression und Apoptose von autoaggressiven Zellen aufrechterhalten (RING und

LAKKIS, 1999). Autoreaktive Zellpopulationen stehen unter der Kontrolle von

regulatorischen CD4+CD25+ T-Zellen (Treg; FONTENOT et al., 2003). Der Prozess

der aktivierungsinduzierten Apoptose („activation-induced cell death“, AICD) von

autoreaktiven Lymphozyten wird durch die Interaktion von Fas (CD95) und

FasLigand (FasL; CD95L) induziert (ZIPP, 2000).

Während der frühen, akuten Phase der TMEV-Infektion kann eine vermehrte

Apoptose-Induktion von infiltrierenden T-Zellen, Makrophagen und infizierten

Neuronen im ZNS beobachtet werden (TSUNODA et al., 1997). Die frühe Apoptose-

Induktion infizierter Neurone vor Einsetzen der humoralen und zellulären

Immunantwort gilt als protektiver Mechanismus gegen die virale Infektion

(TSUNODA, 2008). Im Vergleich hierzu ist die Anzahl apoptotischer Zellen, vor allem

der T-Zellen, während der chronischen Krankheitsphase deutlich vermindert, was zu

einer Akkumulation dieser potentiell autoreaktiven Zellen im ZNS führt (OLESZAK et

al., 2004). Bei MS kann ebenfalls eine erhöhte Apoptose-Resistenz von T-

Effektorzellen im ZNS nachgewiesen werden (JOHNSON und HOWERTH, 2004).

Bislang erfolgten nur wenig detaillierte Immunphänotypisierungen der

Entzündungsantwort im ZNS unter spezieller Berücksichtigung der Treg und der

Apoptose-Induktion in Gehirn und Rückenmark (RM) im Verlauf der TME bei

resistenten und empfänglichen Mäusestämmen.

Ziele der vorliegenden Studie sind I) die Darstellung der Entzündungsantwort in

Groß-, Klein- und Stammhirn sowie des RM in empfänglichen und resistenten

Einleitung 3

Mäusestämmen, II) die Immunphänotypisierung der Entzündungszellen in

meningealen und perivaskulären Infiltraten sowie in parenchymatösen Läsionen in

verschiedenen Regionen des ZNS beider Mäusestämme, III) die Darstellung der

Dynamik regulatorischer T-Zellen unter Berücksichtigung der monophasischen

Entzündung bei resistenten Mäusen und Ausbildung der biphasischen Entzündung

bei empfänglichen Mäusen nach Infektion mit dem schwachvirulenten BeAn-

Virusstamm, IV) die Ermittlung apoptotischer Zellen in verschiedenen ZNS-Regionen

im Verlauf der TMEV sowie V) die Untersuchung des Einflusses der Aktivierungs-

induzierten Apoptose auf die Entzündungsantwort bei empfänglichen und resistenten

Mäusestämmen.

4 Einleitung

Literaturübersicht 5

2 Literaturübersicht

2.1 Theilervirus-Enzephalomyelitis als Modell für demyelinisierende Enzephalomyelitiden

Die chronische, demyelinisierende TME stellt ein bedeutendes Mausmodell für die

Erforschung der Pathogenese und Therapiemöglichkeiten demyelinisierender

Erkrankungen des ZNS, wie z.B. der MS und der Hundestaupe, dar (DAL CANTO

und RABINOWITZ, 1982; FRISK et al., 1999; STOHLMANN und HINTON, 2001;

MARKUS et al., 2002; BEINEKE et al., 2008, 2009; SEEHUSEN und

BAUMGÄRTNER, 2009).

MS ist die am weitesten verbreitete, neurologische Erkrankung junger Erwachsener,

wobei Frauen doppelt so häufig betroffen sind wie Männer (WAKSMAN und

REYNOLDS, 1984; HAAHR und HÖLLSBERG, 2001). Die pathologisch-

histologische Ausprägung der MS des Menschen zeigt sich in entzündlichen Herden

vorwiegend in der weißen Substanz des ZNS, während in der grauen Substanz vor

allem neurodegenerative Prozesse nachweisbar sind. Die Läsionen in der grauen

Substanz des Gehirns werden in kortikalen Arealen und dem Thalamus akzentuiert

aufgefunden (LUMSDEN, 1970; VERCELLINO et al., 2009). Dort zeigen sich in

aktuellen Studien extensiv demyelinisierte Herde im Vorderhirn und zusätzlich im

Kleinhirn, welche in extremen Fällen bis zu 60% der kortikalen Fläche betreffen

können (LASSMANN et al., 2007). Ähnlich wie in den Läsionen der weißen Substanz

finden sich Makrophagen, Lymphozyten und aktivierte Mikroglia, wenn auch die

Quantität weitaus geringer ist als in der weißen Substanz (PETERSON et al., 2001;

VERCELLINO et al., 2009). Die Läsionen innerhalb der weißen Substanz sind diffus

verteilt. Das Corpus callosum im Gehirn ist hierbei besonders stark betroffen

(PRINEAS und MCDONALD, 1997). In den sogenannten Plaques der weißen

Substanz finden sich herdförmige, lymphohistiozytäre, perivaskuläre Infiltrate in

Verbindung mit verschieden stark ausgeprägten intraparenchymatösen

Demyelinisierungen. Hieraus resultiert der Verlust von Axonen und die Bildung von

Glianarben (ADAMS et al., 1989; HAFLER und WEINER; 1995; HUNTER und

RODRIGUEZ; 1995; HICKEY, 1999; TRAPP et al., 1999, LASSMANN et al., 2007;


TRAPP und NAVE, 2008). Die Ausprägung der entzündlichen Areale korreliert mit

dem Grad der Öffnung der BBB (VENKEN et al., 2010). Morphologisch werden die

Plaques in I) aktiv akut, II) chronisch aktiv, III) chronisch inaktiv, IV)

Markschattenherde (“shadow plaques“ = partiell demyelinisierte und/oder weitgehend

remyelinisierte Herde) gruppiert (HICKEY, 1999; TRAPP et al., 1999). Die

Entwicklung und Formation der Plaques sowie die Schädigung der Oligodendrozyten

beruht auf komplexen immunologischen und metabolischen Faktoren. Diese

bestehen vorwiegend aus der Bildung von anti-Myelin-Oligodendrozyten-

Glykoprotein (MOG)-Antikörpern, dem Zell-zerstörenden Effekt der zytotoxischen T-

Zellen („cytotoxic T-cells“, CTL) mittels des CD8+ MHC-I-Komplexes, der Produktion

von pro-inflammatorischen Zytokinen von Makrophagen und Lymphozyten sowie

verschiedenen Oligodendrozyten-toxischen Faktoren, z.B. TNF-α, IL-2 und IFN-γ

(TRAPP et al., 1999; LUCCHINETTI et al., 2000; NEUMANN et al., 2002;

LASSMANN, 2003). Die CTL bilden die vorherrschende Zellpopulation in aktiven und

inaktiven Läsionen, während CD4+ T-Zellen, die hauptsächlich in perivaskulären

Infiltraten vorhanden sind, zahlenmäßig deutlich weniger in Erscheinung treten

(BABBE et al., 2000). NEUMANN et al. (2002) zeigten, dass CTL Antigene auf

Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen erkennen können und diese Zellen

einerseits direkt über die Sezernierung toxischer Substanzen (z.B. Perforin, Granzym

B) lysieren oder aber durch die Aktivierung von „death domain“ (DD)–assoziierten

Molekülen (z.B. Fas, FasLigand) Apoptose in diesen Zellen auslösen (D’SOUZA et

al., 1996; DOWLING et al., 1996; LASSMANN, 2004). CD4+ T-Zellen schädigen die

Myelinschicht direkt über die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine, wie TNF-α,

IL-2 und IFN-γ. Zusätzlich werden weitere Immunzellen, wie B-Zellen, Makrophagen

bzw. Mikroglia und Natürliche Killerzellen (NK) chemotaktisch angelockt (JUNKER et

al., 2007; MARIK et al., 2007). Eine hilfreiche Übersicht der Auswirkung T-Zell-

bedingter, toxischer und viraler Faktoren auf die Demyelinisierung und

Gruppeneinteilung der MS-Herde lieferten LUCCHINETTI et al. (2000). Gruppe I ist

ausschließlich T-Zell- und Makrophagen-bedingt und verursacht zusammen mit

Gruppe II (T-Zellen in Kombination mit Komplement und Antikörpern) eine

autoimmune Demyelinisierung. Gruppe III und IV weisen eine vermutlich Virus- oder


Toxin-vermittelte Dystrophie von Oligodendrozyten auf, mit daraus resultierender

Entmarkung. Die demyelinisierende Enzephalomyelitis eines MS-Patienten wird

immer nur von einer dieser Gruppen verursacht und liefert somit einen wichtigen

Hinweis auf mögliche Ursachen. Topographisch lassen sich die schwersten

entzündlichen, demyelinisierenden ZNS-Veränderungen in den paraventrikulären

Regionen der Großhirnhemisphären, in der weißen Substanz des Stammhirns und

des RM detektieren (Oleszak et al., 2004).

Klinisch werden vier Verlaufsformen der MS definiert. Der weitaus häufigste Verlauf

(85–90% der Fälle) ist die „relapsing-remitting“-Form. Hier werden ca. zweimal

jährlich wiederkehrende Krankheitsschübe beobachtet, während es in der Zeit

zwischen den Schüben zu einer vollständigen Rekonvaleszenz kommen kann

(TRAPP und NAVE, 2008). Bei diesem Verlauf kann es in der Zeitspanne von 10–15

Jahren zu der Entwicklung einer progressiven Form kommen („secondary

progressive“), die möglicherweise letal endet. Selten (ca. 10% der Fälle) wird eine

primär progressive Verlaufsform beobachtet. Diese tritt meist in einem Alter von 30-

50 Jahren auf. Männer und Frauen sind von dieser Form gleichmäßig häufig

betroffen. Es handelt sich hierbei um eine akute Verlaufsform ohne intermittierende

Symptomfreiheit, die im Verlauf von einem Jahr letal enden kann (HUNTER und

RODRIGUEZ, 1995; PRINEAS et al., 2002). Erste auftretende Symptome der MS

sind Muskelschwäche, Koordinationsstörungen und eingeschränkter Visus. Innerhalb

von zehn Jahren sind die motorischen Fähigkeiten so stark begrenzt, dass die

meisten Patienten pflegebedürftig und häufig erwerbsunfähig werden. Die Hälfte aller

Patienten ist nach 25 Jahren bewegungsunfähig, die Lebenserwartung ist gegenüber

der restlichen Bevölkerung um ca. 8 Jahre herabgesetzt (TRAPP und NAVE, 2008).

Basierend auf dem aktuellen Wissensstand ist MS eine organspezifische,

autoimmune Erkrankung, die sowohl von genetischen als auch von

umweltabhängigen Faktoren beeinflusst wird. Ein auslösendes Agens konnte bislang

nicht eindeutig identifiziert werden (HAFLER, 1999; LUCCHINETTI et al., 2000).

Hinweise auf Virusinfektionen, insbesondere Infektionen mit dem Masernvirus,

Epstein-Barr-Virus (EBV), Herpes simplex virus, Varizella-Zoster-Virus,

Zytomegalievirus, humanen Herpesvirus 6, humanen Coronavirus, kaninen


Staupevirus, humanen T-Zell-Leukämie-Virus und dem MS-assoziierten Retrovirus

(MSRV; PERRON et al., 1997; BERTI und JACOBSON, 1999; MEINL, 1999; HAAHR

und HÖLLSBERG, 2001) müssen genauso in Betracht gezogen werden, wie eine

polygene Veranlagung unter Einbeziehung der humanen Leukozyten-Antigene

(HLA)-DR und -DQ (BERTI und JACOBSON, 1999). Eine kürzlich veröffentlichte

Studie proklamiert das EBV als wahrscheinlichsten Auslöser der MS. In dieser Arbeit

wurde eine signifikant erhöhte Inzidenz des Virus in Kombination mit einem

bestimmten HLA Haplotyp bei MS-Patienten nachgewiesen (DE JAGER et al., 2008).

Verschiedene demyelinisierende Tiermodelle existieren, deren Ursprung zum Teil auf

natürlichen Infektionen beruht, wie beispielsweise die demyelinisierende Visna-

Erkrankung des Schafes oder die demyelinisierende Staupeenzephalitis des Hundes

(DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005;

SEEHUSEN et al., 2007; BEINEKE et al., 2009). Experimentell induzierte,

demyelinisierende Krankheiten sind genetischer, toxischer, allergischer oder viraler

Natur. Bei dem genetischen Tiermodell werden „knock out“ Mäuse generiert, bei

denen entweder das Gen für das Myelin basische Protein (MBP)- (sogenannte

„shiverer“) oder das Gen für den Myelinbestandteil Proteolipid Protein (PLP)-

(sogenannte „rumpshaker“) verändert ist. Dies ermöglicht einen genauen Vergleich

der Auswirkung induzierter Schäden (EDGAR et al., 2004). Toxische Modelle sind

das oral verabreichte Cuprizione oder per Injektion lokal in das ZNS verabreichtes

Ethidiumbromid, Lysolecithin und Lipopolysaccharid. Diese Studien ermöglichen die

Beschreibung einer einsetzenden Demyelinisierung sowie nach Absetzen der

toxisch-wirkenden Substanzen von Remyelinisierungsvorgängen (WOODRUF und

FRANKLIN, 1999; MATSUSHIMA und MORELL, 2001; FELTS et al., 2005). Die

experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) und die chronische,

demyelinisierende TME werden genutzt, um pathologisch-genetische Aspekte der

MS als ein primäres autoimmunes Geschehen oder als eine primäre Virus-induzierte

und sekundär immunpathologische Erkrankung zu untersuchen (DAL CANTO und

RABINOWITZ, 1982; DAL CANTO et al., 1995; TSUNODA und FUJINAMI, 1996;

STOHLMANN und HINTON, 2001; ULRICH et al., 2006b). Bei der EAE, welche in

Abhängigkeit vom Studiendesign der remittierenden Form der MS entspricht, werden


in Labornagern und Affen durch Immunisierung mit Myelinbestandteilen in

Verbindung mit einem Adjuvans eine akute Enzephalomyelitis mit autoimmun-

vermitteltem Markscheidenabbau ausgelöst (TSUNODA und FUJINAMI, 1996;

LEHMANN et al., 1998; HAFLER, 1999).

Bei der demyelinisierenden TME, welche klinisch dem primär progressiven Verlauf

der MS entspricht, bedingt eine persistente Virusinfektion direkte Erreger-vermittelte

sowie indirekte immunpathologische Schädigungen des ZNS. In der chronischen

Spätphase findet sich bei dieser experimentell induzierten Krankheit zudem eine

sekundäre Autoimmunität. Die sekundäre Autoimmunität resultiert aus einer DTH-

Reaktion gegen Virusepitope und einem sich anschließenden „epitope spreading“,

welches sich gegen Myelinepitope richtet (CLATCH et al., 1986; MILLER et al.,

2001).

2.2 Die Theilervirus-induzierte murine Enzephalomyelitis Das von Theiler im Jahre 1934 isolierte TMEV ist ein Erreger von asymptomatischen

Magen-Darmtrakt-Infektionen bei der Maus. Die natürliche faekale/orale Infektion

erfolgt bei noch nicht immunkompetenten, juvenilen Mäusen oder

immunsupprimierten, adulten Tieren und resultiert in einer erhöhten Ausscheidung

des Virus bis zum 53. Tag nach der Infektion (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941;

THEILER und GARD, 1940). Die faekale/orale Übertragung manifestiert sich nur

selten in Form einer spontanen ZNS-Symptomatik mit schlaffer Lähmung der

Hintergliedmaßen (THEILER und GARD, 1940; THOMPSON et al., 1951). In den

meisten wild-lebenden Mäusen sowie bei Labormäusen, die unter nicht-spezifisch

pathogenfreien Bedingungen gehalten werden, konnten mittels serologischer Studien

verschiedene Stämme des TMEV nachgewiesen werden (LIPTON et al., 2001;

DESCOTEAUX et al., 1977).

2.2.1 Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus

Zur Familie der Picornaviridae gehörend, wird das TMEV dem Genus Cardiovirus

zugeordnet (PEVEAR et al., 1987). Die Picornaviren sind ca. 30 µm im Durchmesser

große, unbehüllte, ikosaedrische, RNS-enthaltende Viren (RACANIELLO, 2001). Die


TMEV-Stämme werden in eine hochvirulente Gruppe (GDVII- und FA-Stamm) und

eine schwachvirulente Gruppe (DA- und BeAn-Stamm) unterteilt (THEILER und

GARD, 1940; PEVEAR et al., 1987; MONTEYNE et al., 1997). Die von Max Theiler

isolierten hochvirulenten Stämme GDVII und FA führen in den meisten Fällen nach

intrazerebraler Infektion zu einer nach ca. ein bis zwei Tagen letal verlaufenden

Polioenzephalitis (THEILER, 1937; THEILER und GARD, 1940; LIPTON, 1980;

MONTEYNE et al., 1997). Die schwachvirulenten DA- und BeAn-Stämme induzieren

hingegen nach intrazerebraler Infektion empfänglicher Mäusestämme einen

biphasischen Krankheitsverlauf, charakterisiert durch eine ca. 14 Tage andauernde

Polioenzephalomyelitis und eine anschließende demyelinisierende

Leukoenzephalomyelitis, deren stärkste Ausprägung nach ca. zwei bis drei Monaten

post infectionem (pi) erreicht ist (DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975 und 1980;

LIPTON und DAL CANTO, 1979; ULRICH et al., 2006b).

Das TMEV ist ein typischer Vertreter der Picornaviren. Das virale Genom mit einer

Länge von 8100 Nukleotiden ist hierbei dem des Poliovirus ähnlich (RACANIELLO,

2001). Abweichend von dem Genom des Poliovirus sind zwei zusätzliche Gene, das

L und L* am nicht-kodogenen 5’ Ende des Genoms identifiziert worden, welche die

Neurovirulenz des Erregers massiv erhöhen (JAROUSSE et al., 1999). Das bei den

TMEV-Stämmen vorhandene L-Protein erschwert die Produktion des Typ-I

Interferons (CHEN et al., 1995). Das L*-Protein, welches ausschließlich von den

persistierenden, schwachvirulenten Stämmen (DA und BeAn) gebildet wird, hemmt

die Apoptose während der Infektion und vereinfacht die Infektion von Makrophagen,

die am stärksten betroffene Zellpopulation während der chronischen TME

(MICHIELS et al., 1995; GHADGE et al., 1998; BRAHIC et al., 2005). Das

Abschwächen der Apoptose infizierter Zellen erhöht das virale Reservoir und

begünstigt die Persistenz der schwachvirulenten Stämme (BRAHIC et al., 2005). Bei

den verschiedenen TMEV-Stämmen zeigt die äußere Proteinschicht, das Kapsid,

welches das virale Genom umhüllt, geringe Abweichungen seiner Struktur (FU et al.,

1990; MCALLISTER et al., 1990). Es zeigt sich, dass die hochvirulenten

Erregerstämme einen ausgeprägten neuronalen Zelltropismus aufweisen, während

die schwachvirulenten Stämme eher mit Makrophagen interagieren. Darüber hinaus


verhindert das Kapsid der schwachvirulenten BeAn- und DA-Stämme eine

interneuronale Ausbreitung des Agens und begünstigt somit das Überleben des Wirts

bzw. die Viruspersistenz (REDDI und LIPTON, 2002; SHAH und LIPTON, 2002).

Die Infektionsroute der hochvirulenten TMEV-Stämme ist entscheidend für die

Ausbildung einer akuten Polioenzephalitis. Die intrazerebrale, intranasale und unter

bestimmten Bedingungen die intraperitoneale Infektion mit den hochvirulenten

GDVII- und FA-Stämmen können eine ZNS-Erkrankung auslösen (THEILER und

GARD, 1940). Die demyelinisierende Enzephalomyelitis, ausgelöst durch die

schwachvirulenten DA- und BeAn-Stämme gelingt im immunkompetenten

Organismus nur durch die direkte intrazerebrale Infektion (THEILER und GARD,

1940; TSUNODA et al., 1996). Demyelinisierung im RM und in peripheren Nerven bei

„severe combined immunodeficiency“ (SCID)-Mäusen konnte nach Injektion des DA–

Stammes in den Nervus ischiadicus ausgelöst werden (DRESCHER und TRACY,

2007). Obwohl die schwachvirulenten Stämme eine 93%ige Homologie ihrer

Aminosäuresequenzen aufweisen, bestehen große Unterschiede bezüglich der

induzierten Demyelinisierung. Die vom DA-Stamm ausgelöste frühe

Polioenzephalomyelitis ist im Verhältnis zu der des BeAn-Stammes deutlich stärker

ausgeprägt. Im weiteren Verlauf der Erkrankung weisen aber BeAn-infizierte,

empfängliche Mäuse viel früher Entmarkungsprozesse und resultierende klinische

Symptome auf (OLESZAK et al., 2004). In Abhängigkeit vom verwendeten

schwachvirulenten TMEV-Stamm findet sich eine dominierende virusbedingte

Schädigung der Oligodendrozyten oder aber eine autoreaktive Zerstörung der

Myelinscheiden (ZOECKLEIN et al., 2003). Der DA-Stamm infiziert neben

phagozytierenden Monozyten des ZNS verstärkt Oligodendrozyten. Diese gehen

durch eine virusinduzierte Nekrose oder infolge einer Apoptose-Induktion, ausgelöst

durch CTL, zu Grunde (RODRIGUEZ et al., 1983; ZOECKLEIN et al., 2003). Der

BeAn-Stamm hingegen besitzt einen ausgeprägten Tropismus für Makrophagen.

Durch die lang anhaltende Infektion und persistente Antigenpräsentation wird eine

deutliche DTH-Reaktion ausgelöst, welche sich im weiteren Verlauf auch auf die

Myelinepitope ausweitet (CLATCH et al., 1986; DRESCHER et al., 1997; MILLER et

al., 2001; TSUNODA und FUJINAMI, 2002; ZOECKLEIN et al., 2003; LIPTON et al.,


2005). Der BeAn-akzentuierte, schwachvirulente Phänotyp resultiert aus einer

Veränderung der Aminosäure 101 des VP1-Peptids. Das VP1-Peptid ist

entscheidend für die zelluläre Rezeptorbindung und Demyelinisierung in der weißen

Substanz (ZOECKLEIN et al., 2003).

2.2.2 Vergleich empfänglicher SJL-Mäuse und resistenter C57BL/6-Mäuse (s. Tab. 1)

Der Genotyp der unterschiedlichen Mäusestämme bestimmt, ob nach intrazerebraler

Infektion mit schwachvirulenten TMEV-Stämmen die Infektion nach einer akuten

Polioenzephalomyelitis eliminiert wird oder es zu einer chronisch progredienten,

demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis kommt. Zu den hochempfänglichen

Mäusestämmen, welche zur Ausbildung der chronischen Krankheitsphase neigen,

zählen die SJL-, FVB/N- und DBA/2-Populationen, während CBA-, C3H- und AKR-

Mäuse als wenig empfängliche Mäusestämme angesehen werden. Resistente

Mäusestämme stellen C57BL/6- und Balb/c-Populationen dar, welche das TMEV

nach der akuten Phase eliminieren und eine stabile Immunität ausbilden (LIPTON

und DAL CANTO, 1979; MONTENYE et al., 1997; BRAHIC et al., 2005).

Die Resistenz gegen die Viruspersistenz wird von verschiedenen Genen gesteuert.

Die stärkste Auswirkung hat das H-2D Gen, des Haupthistokompatibilitätskomplex

(„major histocompability complex“ [MHC])-Klasse I auf dem 17. Chromosom (LIPTON

und MELVOLD, 1984; BRAHIC et al., 2005). Mäusestämme mit dem Haplotyp H-

2f,p,q,r,s,v sind demnach empfänglich. Die Viruspersistenz wird bei Mäusen mit dem H-

2d,b,k-Haplotyp, welcher dominant vererbt wird, unterbunden. Bei diesen Mäusen

kommt es zu einer frühen MHC-Klasse-I abhängigen CTL-Antwort gegen ein

spezifisches, immundominantes Virusepitop (VP3159-166; RODRIGUEZ et al., 1986;

BORROW et al., 1992; MONTEYNE et al., 1997). Die in frühen Läsionen

nachweisbaren virusspezifischen CTL lysieren über die Sezernierung von Perforin

und/oder Granzymen infizierte Oligodendrozyten und sorgen auf diese Weise für

eine deutliche Reduktion des Virusgehaltes im ZNS bei empfänglichen

Mäusestämmen bzw. für die vollständige Eliminierung des Virus in resistenten

Mäusestämmen. Diese T-Zellen erkennen hauptsächlich die drei TMEV-Peptide


VP1233-250, VP274-86 und VP324-37 (GERETY et al., 1994; YAUCH und KIM, 1994). Bei

resistenten C57BL/6-Mäusen ist drei Tage pi eine deutliche, gegen das VP2-Protein

gerichtete CTL-Antwort messbar. Im Vergleich hierzu zeigt sich bei empfänglichen

SJL-Mäusen nur eine schwache CTL-Antwort (LINDSLEY et al., 1991). Die

Bedeutung des genetischen Hintergrundes der Mäuse und der virusspezifischen CTL

für die Ausbildung der chronischen Entmarkung im Verlauf der TME wurde ebenfalls

von BEGOLKA et al. (2001) gezeigt. Die Arbeitsgruppe konnte bei β2-Mikroglobulin-

„knockout“ Mäusen, welchen CTL fehlen, eine frühere Entwicklung der

Polioenzephalomyelitis mit verstärkter Demyelinisierung nachweisen. ZOECKLEIN et

al. (2003) zeigten bei TMEV infizierten SJL-Mäusen eine deutlich höhere Anzahl

CD4+ Th1-Zellen am siebten Tag pi im Vergleich zu infizierten C57BL/6-Mäusen.

Tab. 1: Vergleich empfänglicher SJL-Mäuse und resistenter B6-Mäuse

Mäusestamm Kriterien der Differenzierung

SJL C57BL/6 Referenz

Viruspersistenz ja nein LIPTON und DAL CANTO, 1979

Akute Polioenzephalomyelitis ja ja LIPTON und DAL CANTO, 1979

Demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis ja nein LIPTON, 1975

H-2-Haplotyp H-2f,p,q,r,s,v H-2 d,b,k RODRIGUEZ et al., 1986

Effektorzellen CD4+ CD8+ RODRIGUEZ et al., 1991

Anzahl zytotoxischer T-Zellen wenige sehr viele LINDSLEY et al., 1991

Autoreaktive CD4+ T-Zellen vorhanden nicht vorhanden KATZ-LEVY et al., 2000

Apoptotische Zellen in Frühphase viele sehr viele JELACHICH und LIPTON, 1996; TSUNODA et al., 1997

Apoptotische Zellen in Spätphase wenige keine JELACHICH und LIPTON, 1996; TSUNODA et al., 1997

Typ-IV Hypersensitivität ja nein CLATCH et al., 1986

„epitope spreading“ ja nein MILLER et al., 1997

Zytokinexpression in Frühphase (TGF-ß, TNF-α) sehr hoch schwach BEGOLKA et al., 1998;

CHANG et al., 2000 Zytokinexpression in Spätphase

(TGF-ß, TNF-α, IFN-γ, IL-1, -4, -6, -10, -12)

sehr hoch schwach BEGOLKA et al., 1998; CHANG et al., 2000


2.2.3 Die virale Ausbreitung

Beginnend am vierten Tag pi bis zum 30. Versuchstag kann das virale Agens mit

Hilfe von spezifischen Antikörpern in Neuronen immunhistologisch nachgewiesen

werden (LIPTON, 1975; TSUNODA et al., 1996, KUMMERFELD et al., 2009). Die

virale Ausbreitung erfolgt bei den empfänglichen Mäusestämmen entlang der Axone

der infizierten Nervenzellen. Durch die infektionsbedingte Zerstörung der Neurone

wird das Virus freigesetzt und kann so auf Myelin-bildende Oligodendrozyten der

weißen Substanz des Stammhirns und RM übertragen werden (DAL CANTO und

LIPTON, 1982; LIPTON et al., 1995; TROTTIER et al., 2001; ZHENG et al., 2001;

TSUNODA und FUJINAMI, 2002; TSUNODA et al., 2003). Nach dem 30.

Infektionstag sind in der Regel nur noch geringe Mengen des Virus im RM

darstellbar. DAL CANTO und LIPTON (1982) zeigten mittels immunhistologischer

Methoden, dass Makrophagen bzw. Mikroglia die größten Virusmengen während der

chronischen Phase aufweisen. Allerdings finden sich in der Literatur unterschiedliche

Angaben zur Viruspersistenz im Verlauf der TMEV-Infektion. So konnten AUBERT et

al. (1987) mittels in situ Hybridisierung den größten Virusanteil in Oligodendrozyten

nachweisen, während ZHENG et al. (2001) Astrozyten als die dominierende

Zellpopulation für die Virusreplikation in der späten Phase identifizierten. Die

persistente Infektion kann bis zu zwei Jahre pi nachgewiesen werden (LINDSLEY et

al., 1991).

2.2.4 Die Pathogenese der Theilervirus-Enzephalomyelitis

Nach intrazerebraler Infektion mit den schwachvirulenten DA- oder BeAn-Stämmen

erfolgt die Virusausbreitung durch die Infektion von Neuronen und einigen Gliazellen

hauptsächlich im Hippocampus, Kortex und den Ventralhörnern des RM (STROOP,

1981; DAL CANTO und LIPTON, 1982; TSUNODA et a., 2003). Hierbei werden

neuronale Apoptosen und Nekrosen mit Wallerscher Degeneration der Nervenfasern

sowie eine lymphohistiozytäre Meningoenzephalitis beobachtet (OLITSKY und

SCHLESINGER, 1941; STROOP et al., 1981; LIPTON et al., 1994; TSUNODA und

FUJINAMI, 2002; TSUNODA et al., 2003; ZOECKLEIN et al., 2003).


Eine Woche nach der Infektion finden sich in der grauen und weißen Substanz des

Gehirnes und RM erste entzündliche, vorwiegend perivaskulär und meningeal

gelegene Infiltrate. Hierbei handelt es sich um CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten sowie

um Makrophagen, wenige B-Lymphozyten und Plasmazellen. Außerdem finden sich

reaktive Astrozyten in den Läsionen (LIPTON, 1975; DAL CANTO und LIPTON,

1982; OLESZAK et al., 1995; DRESCHER et al., 1997; MURRAY et al., 1998; POPE

et al., 1996; ULRICH et al., 2006b).

Die erste frühe Phase der Demyelinisierung ist auf den direkten Einfluss der Infektion

von Oligodendrozyten und deren Absterben zurück zu führen (BRAHIC et al., 2005).

Im Weiteren kann zusätzlich eine verminderte Transkription von Myelin-assoziierten

Genen in den infizierten Oligodendrozyten beobachtet werden (OZDEN et al., 1993).

Die entzündliche Ausweitung auf das Neuroparenchym erfolgt nach Migration der

Entzündungszellen und resultiert in hyperzellulären Arealen bestehend aus

Makrophagen/Mikroglia und Lymphozyten (LIPTON, 1975; DAL CANTO und

LIPTON, 1982; ULRICH et al., 2006b). Makrophagen und Mikroglia, aber auch

Astrozyten infizieren sich mit dem TMEV durch die Phagozytose untergegangener

virushaltiger Zellen. Zusätzlich wird der freigesetzte Erreger auf Zellen übertragen,

die in unmittelbarer Nähe zu untergegangenen TMEV-infizierten Oligodendrozyten

lokalisiert sind (BRAHIC et al., 1981; DAL CANTO und LIPTON, 1982; CLATCH et

al., 1986; LIPTON et al., 1995). Drei Wochen nach Infektion mit schwachvirulenten

TMEV-Stämmen finden sich im Gehirn empfänglicher SJL-Mäuse schwerwiegende

neuropathologische Veränderungen vorwiegend im Hippocampus und Corpus

striatum sowie prominente, meningeale Infiltrate. Nach 45 Tagen pi zeigen sich

demyelinisierte Herde im Klein- und Stammhirn (ZOECKLEIN et al. 2003).

In vitro-Untersuchungen wiesen eine Expression von pro-inflammatorischen

Zytokinen, wie IL-1, IL-6, TNF-α und IFN-β bereits eine Stunde pi in TMEV-infizierten

Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia nach. Hierbei war die Expression bei

den Mikrogliazellen deutlich geringer ausgeprägt als die der Astrozyten und

Oligodendrozyten (PALMA et al., 2003). Astrozyten, die nach Stimulierung durch

IFN-γ und Viruspartikel als Antigen-präsentierende Zellen („antigen-presenting cells“,

APC) bei viralen und autoimmunen Erkrankungen, wie MS wirken können,


exprimieren Fas und sind zusätzlich Produzenten pro-inflammatorischer Zytokine

(MASSA et al., 1986, ZEINSTRA et al., 2000). Hierdurch sind sie entscheidend an

der Kompromittierung der BBB und der Induktion von entzündlichen Reaktionen im

ZNS beteiligt (DONG und BENVENISTE, 2001).

Bei viralen Infektionen, wie mit dem murinen lymphozytären Choriomeningitis Virus

(LCMV), dem murinen Zytomegalievirus (MCMV), dem humanen Influenzavirus oder

Herpes simplex Virus (HSV) bewirken die pro-inflammatorischen Zytokine die

Reifung von dendritischen Zellen, die Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen und

die Verstärkung der B-Zellantwort (TOUGH et al., 1996; BIRON, 2001).

Aktivierte Makrophagen (infizierte und nicht-infizierte) exprimieren MHC-II Moleküle

und kostimulierende Faktoren (z.B. B7-1, B7-2, CD40 und ICAM-1). Sie präsentieren

neben viralen Antigenen auch körpereigene Antigene, wie beispielsweise PLP an

Th1-Zellen und tragen damit zur Entstehung einer autoimmun-bedingten

Demyelinisierung in der chronischen Phase der TME bei (BORROW et al., 1992;

DRESCHER et al., 1997; POPE et al., 1998; KATZ-LEVY et al., 2000).

Die CD4+ Th1-Zellen führen innerhalb von zwei bis drei Tagen durch die Sekretion

von Zytokinen, wie beispielsweise von IFN-γ, zur verstärkten Migration von

Makrophagen und Aktivierung von Mikrogliazellen, welche ihrerseits über die

Produktion von MBP-toxischen Substanzen (z.B. TNF-α) und freien Radikalen über

den Prozess der „bystander demyelination“ zu einem weiteren Verlust von

Myelinscheiden führen (TSUNODA und FUJINAMI, 2002; KIM et al., 2005, ULRICH

et al., 2006b). Zusätzlich sind Th1-Zellen entscheidend an der späteren Entwicklung

der sogenannten DTH-Reaktion beteiligt (CLATCH et al., 1986; MILLER et al., 2001;

LIPTON et al., 2005).

Erste Vakuolenbildungen in der weißen Substanz zeigen sich bereits zwei Wochen

nach der Infektion vorwiegend in den ventralen und lateralen Strängen des RM

(MCGAVERN et al., 1999; TSUNODA et al., 2003; ULRICH, 2006). Die Entwicklung

der Autoimmunität wird entscheidend durch die DTH-Reaktion bestimmt (DAL

CANTO et al., 2000). Hierbei werden durch TMEV-spezifische CD4+ Th1-Zellen im

Rahmen der antiviralen Immunantwort neben Virus-infizierten Zellen zusätzlich über

die vorher geschilderten Mechanismen Myelinscheiden zerstört. Interessanterweise


zeigen Makrophagen bzw. Mikroglia von resistenten C57BL/6-Mäusen keine

Produktion von proteolytischen, MBP-zerstörenden Faktoren, wie beispielsweise

TNF-α und freie Radikale (LIUZZI et al., 1995).

Zwei bis drei Monate nach der Infektion empfänglicher SJL-Mäuse finden sich dann

autoreaktive, Myelin-spezifische CD4+ T-Zellen in den Läsionen, welche über DTH-

Reaktionen den Prozess des sogenannten „epitope spreading“ einleiten (MILLER et

al., 1997; CROXFORD et al., 2002). Bei diesem Phänomen wird die Autoreaktivität

verstärkt, nachdem ein erregerunabhängiges, körpereigenes Epitop eine chronische

Entzündungsreaktion induziert. Im Falle der TMEV ist dies ein Epitop des PLP.

Anschließend greift die Reaktivität auf weitere Epitope des PLP über. Im weiteren

Verlauf werden zusätzlich Moleküle des MBP und MOG von Immunzellen erkannt

(CROXFORD et al., 2002).

„Molecular mimicry“ wird als eine weitere Ursache für die Myelin-spezifische

Autoimmunität und Demyelinisierung diskutiert (OLSON et al., 2001; CROXFORD et

al., 2002). Hierbei erkennen CTL Epitope, die sowohl auf den körpereigenen

Proteinen des infizierten Wirtes vorkommen als auch von Mikroorganismen

exprimiert werden. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten werden immunologische

Kreuzreaktionen zwischen Virus und Wirtszellen hervorgerufen. Die Immunantwort,

die zunächst gegen das virale Agens gerichtet war, kreuzreagiert daher auch gegen

körpereigene Epitope, sodass sich die Entzündungsreaktion selbst unterhält. Dieser

Prozess wird fortgesetzt, auch wenn das ursprünglich auslösende Agens nicht mehr

vorhanden ist (OLSON et al., 2001; OLESZAK et al., 2004; TSUNODA et al., 2006).

Bislang konnte mit Hilfe eines apathogenen Wild-Stammes des TMEV, welcher

murines PLP(139-151) exprimiert, „molecular mimicry“ nachgewiesen und eine sich

langsam entwickelnde Form der demyelinisierenden ZNS-Erkrankung induziert

werden (OLSON et al., 2001; CROXFORD et al., 2002).

Über einen Zeitraum von zwei bis drei Monaten entwickelt sich die Demyelinisierung

bei der TME progressiv. Nach dem Untergang der vorwiegend mittelgroßen und sehr

großen myelinisierten Axone findet sich eine fortschreitende Atrophie des RM

(MCGAVERN et al., 1999; MCGAVERN et al., 2000). Unklar ist hierbei, ob nicht-

myelinisierte, nackte Axone dem weiteren entzündlichen Angriff ausgesetzt sind und


dadurch zu Grunde gehen oder ob eine verspätete Wallersche Degeneration diese

Nervenfasern zerstört (MCGAVERN et al., 2000). TSUNODA und FUJINAMI (2002)

entwickelten die Theorie des „inside out vs. outside in“ Modells. Hierbei wird

diskutiert, in wieweit der axonale Untergang bedingt durch die Wallersche

Degeneration der Demyelinisierung voraus eilt („inside out“) oder aber das Myelin

Primärziel der autoimmunen Erkrankungen ist und nackte Axone sekundär

untergehen („outside in“). Sie konnten darüber hinaus nachweisen, dass der axonale

Untergang die virale Ausbreitung limitiert (TSUNODA et al., 2007). SEEHUSEN und

BAUMGÄRTNER (2009) wiesen bei der demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis

der Hundestaupe ebenfalls einen frühen axonalen Schaden vor der eigentlichen

Entmarkung nach.

Drei Monate nach der Infektion mit dem DA-Stamm finden sich im Großhirn

empfänglicher und resistenter Mäuse keine weiteren entzündlichen Alterationen

(LIPTON et al., 1994). Im vierten Monat nach der Infektion zeigt sich im RM eine

beginnende Remyelinisierung, welche durch dünnere Myelinscheiden charakterisiert

ist. Hiermit vergesellschaftet kann ein Rückgang der Entzündungszellen sowohl im

Neuroparenchym als auch in den perivaskulären Infiltraten nachgewiesen werden

(LIPTON et al., 1994; ULRICH et al., 2006a). MCGAVERN et al. (1999) zeigten den

Grad der Remyelinisierung in Abhängigkeit von dem verwendeten empfänglichen

Mäusestamm bei der Infektion mit dem DA-Stamm. Nach Infektion von SJL-Mäusen

waren sechs Monate nach der Infektion 8% der Axone remyelinisiert, während bei

infizierten PL/J-Mäusen zum gleichen Zeitpunkt bei 30% der Axone eine

Remyelinisierung nachgewiesen werden konnte (MURRAY et al., 2001).

2.2.5 Die klinische Symptomatik

Klinisch zeigen sich nach intrazerebraler Infektion der Mäuse mit den hochvirulenten

GDVII- oder FA-Stämmen Symptome einer perakuten Polioenzephalitis mit schlaffer

Lähmung beginnend in den Hintergliedmaßen, Exzitationen und reduziertem

Allgemeinbefinden. Die Infektion endet zumeist nach ca. zwei Tagen letal (THEILER,

1937; THEILER und GARD, 1940; LIPTON, 1980).


In resistenten Mäusestämmen, wie dem C57BL/6-Stamm, verursachen die schwach

virulenten Viren eine frühe akute Polioenzephalomyelitis. Das Virus wird ca. drei

Wochen nach Infektion aus dem ZNS eliminiert und die Ausbildung der chronisch

demyelinisierenden Erkrankung bleibt aus (LIPTON, 1975). Nur die empfänglichen

Mäusestämme zeigen eine Persistenz des Virus in Monozyten bzw. Makrophagen,

Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten. In Abhängigkeit des verwendeten

schwachvirulenten Virusstammes zeigen sich bei empfänglichen Mäusestämmen

nach intrazerebraler Infektion mit dem BeAn-Stamm die ersten klinischen Symptome

30 – 40 Tagen pi, wohingegen nach Infektion mit dem DA-Stamm die ersten

Bewegungsstörungen erst 140 – 180 Tagen pi auftreten und schwerwiegender als

die durch das BeAn-TMEV verursachten Symptome sind (CLATCH et al., 1990;

JELACHICH et al., 1995; QI und DAL CANTO, 1996; STROOP et al., 1981;

TSUNODA und FUJINAMI, 1996; ZOECKLEIN et al., 2003; OLESZAK et al., 2004).

Nach drei bis sechs Monaten pi ist die schwerste klinische Symptomatik zu

beobachten. Die Ataxien können sich bei schwer erkrankten DA-infizierten Tieren bis

hin zu spastischen Lähmungen entwickeln. Die Tiere werden inkontinent, zeigen ein

deutlich reduziertes Allgemeinbefinden und Gewichtsabnahme (LIPTON et al., 1994).

2.3 Apoptose

2.3.1 Allgemein

Der Mechanismus der Apoptose ist essentiell für die Regulation Virus-induzierter T-

Zellantworten, zur Verhinderung überschießender Reaktionen des Immunsystems

sowie für die Eliminierung pathogener, autoreaktiver Lymphozyten, die zu

Gewebezerstörungen führen können (VAN PARIJS und ABBAS, 1998; ZIPP et al.,

1999). Während der Prozess der Nekrose ein passiver Vorgang des Zellunterganges

ist, bezeichnet die Apoptose die aktive Form des Zelltodes. Morphologische

Charakteristika der Apoptose sind pyknotische Zellschrumpfung, die Formation

apoptotischer Körper und die Kondensation des nukleären Chromatins mit

Fragmentation der Desoxyribonukleinsäure („deoxyribonucleic acid“, DNA; HONIG

und ROSENBERG, 2000). Die Fragmentation des intranukleären Chromatins ist ein


wichtiges Merkmal der Apoptose und kann als diagnostisches Kriterium unter

Zuhilfenahme der TUNEL-(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end

labeling)-Methode nachgewiesen werden.

Grundsätzlich können zwei unterschiedliche Initiationsphasen der zellulären

Apoptose-Induktion unterschieden werden. Diese sind abhängig von der Beteiligung

der Mitochondrien (intrinsischer Signalweg) oder der Todesrezeptoren an der

äußeren Zellmembran (extrinsischer Signalweg; s. Abb. 1).

Der intrinsische Signalweg wird durch verschiedene zytotoxische Stimuli initiiert,

wie oxidativer Stress, Imbalance der Kalzium-Homeostase und mitochondrialer

Dysfunktion (MATTSON, 2000; TURNER und SCHAPIRA, 2001). Die Abgabe von

mitochondrialem Cytochrom c in das Zytosol aktiviert die Initiator-Caspasen-8 und -9.

Hier setzt die Effektor-Phase der Apoptose ein, welche durch die Aktivierung der

Effektor-Caspasen-3, -6 und -7 charakterisiert ist. Die Effektorcaspasen sind selbst

aktiv am Abbau von Lamin (in der Zellkernmembran) und Aktin (Teil des Zytoskeletts)

beteiligt. Anderseits aktivieren sie sekundäre Zielproteine (z.B. Caspase-aktivierte

DNase (CAD) oder andere Caspasen) durch limitierte Proteolyse (HONIG und

ROSENBERG, 2000).

Der extrinsische Signalweg der Apoptose wird hauptsächlich durch die Bindung

von FasL an mehrere Fas-Domänen der äußeren Zellmembran ausgelöst. Das „Fas-

associated protein with death domain“ (FADD) interagiert mit dem

zusammengefügten Fas–FasL-Komplex und induziert durch die Formation des

„death initiating signaling complex“ (DISC) die Apoptose durch Oligomerisation der

Initiator-Caspase-8. An dieser Stelle resultiert ein gemeinsamer Verlauf

(Effektorphase) des extrinsischen und des intrinsischen Signalwegs der Apoptose-

Induktion. Die Initiator-Caspase-8 und -9 aktivieren hierbei die Effektorcaspase-3,

welche die nachgeschaltete Effektor-Caspase-Kaskade und damit die Spaltung

unterschiedlichster zellulärer Proteine bewirkt (HIRATA et al., 1998). FasL

(Synonyme: CD95L, APO-1L, CD178) gehört zu der TNF-Superfamilie und wird als

ein TypII Transmembran-Protein synthetisiert, das direkt an den Fas-Rezeptor

binden kann. Es kann als membrangebundene (45 KD) oder lösliche Form (26 KD)

vorkommen. Die lösliche Form entsteht nach Abspaltung durch eine


Metalloproteinase. Die Bindung der löslichen Form von FasL an Fas führt zur

Oligomerisierung des Rezeptors und letztlich zur Weiterleitung von apoptotischen

Signalen. Aktivierte T-Lymphozyten und NK exprimieren vorwiegend FasL (OSHIMI

et al., 1996; SUDA et al., 1993). Fas (Synonyme: CD95, APO-1), der Rezeptor für

FasL, ist ein TypI Transmembran-Protein und gehört zur TNF-Rezeptor Superfamilie.

Es wird hauptsächlich von Zellen des Immunsystems exprimiert (z.B. aktivierte T-

und B-Zellen; LEE et al., 2000). Fas verfügt über eine intrazelluläre DD, die der

Bindung von FasL dient und so über eine Konformationsänderung die Apoptose

einleitet (WEBER und VINCENZ, 2001).

Die Interaktion von Fas und FasL ist verantwortlich für den Prozess der Aktivierungs-

induzierten Apoptose (AICD) von autoreaktiven Lymphozyten (ZIPP, 2000). Die

AICD wird durch verschiedene anti-apoptotisch wirkende Faktoren, wie

beispielsweise die Bcl-2-Familie und die Inhibitoren der Apoptose („inhibitors of

apoptosis protein“, IAP) beeinflusst. Zu der Bcl-2 Familie gehören die anti-

apoptotisch wirkenden Moleküle Bcl-2, Bcl-w und Bcl-xL sowie deren Antagonisten

Bax, Bak und Bid, welche an der mitochondrialen Membran wirken. Während Bcl-2,

das an der Außenmembran der Mitochondrien exprimiert wird, die mitochondriale

Abgabe von Cytochrom c in das Zytoplasma herabsetzt, blockieren die IAP die

Effektor-Caspasen-3 and -7 und die Initiator-Caspase-9 (DEVERAUX und REED,

1999).


Bei den IAP handelt es sich um eine neuentdeckte Familie regulatorisch wirkender

Proteine, deren strukturelle Gemeinsamkeit eine „baculoviral IAP repeat“ (BIR)-

Domäne und ein RING („really interesting new gene“)-Finger (Zink-bindende

Domäne) darstellen. Die BIR-Domäne kann sowohl die Initiator-Caspase-9, als auch

die Effektor-Caspasen-3, -6 und -7 binden und damit inhibieren, was die Caspase-

Kaskade unterbricht und die Apoptose der Zelle verhindert. Zu den IAP gehören das

multifunktionelle Survivin bzw. dessen murines Homolog TIAP. Beide Moleküle

aktivieren das X-chromosomale IAP (XIAP) und c-IAP1 und c-IAP2 (DEVERAUX und

REED, 1999; REED, 2001). Das „neuronal apoptosis inhibitor protein” NAIP, das

erstmals bei infantiler spinaler Muskelatrophie (SMA) beschrieben wurde, zählt

ebenfalls zu den IAP (SHIN et al., 2003). Die Inhibierung der Apoptose durch

Aufregulation anti-apoptotischer Faktoren (speziell Survivin) wird bei Tumorzellen

FADD: „Fas-associated death-domain“ DISC: „death inducing signaling complex“ IAP: “inhibitors of apoptosis protein”

Abb. 1: Schematische Darstellung des extrinsischen und intrinsischen Signalwegs der Apoptose. Durch die Bindung von Fas Ligand (FasL) an Fas kommt es zur Bildung des DISC und der Aktivierung der Caspase-8 (extrinsischer Weg). Die Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom c wird durch das Molekül Bax gefördert, wodurch Caspase-9 aktiviert wird (intrinscher Weg). Dieser Prozess wird durch Bcl-2 gehemmt. Beide Signalwege resultieren gemeinsam in der Aktivierung der Effektor-Caspasen (Caspase-3, -6, -7). Der Prozess der Caspaseaktiverung kann durch verschiedene IAP unterbunden werden.


beobachtet und stellt einen Schwerpunkt aktueller Forschung dar (LACASSE et al.,

1998).

2.3.1.1 Apoptose bei demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems am Beispiel der Multiplen Sklerose und der Experimentellen Autoimmunen Enzephalitis

Das Immunprivileg des ZNS wird durch die Fas-induzierte AICD aufrecht erhalten.

Die AICD dient im gesunden Organ der Erhaltung der Immunabwehr und im

entzündlich veränderten Organ der Induktion der Apoptose potentiell autoreaktiver

Zellen sowie der Beendigung der T-Zellantwort zur Verhinderung überschießender

entzündlicher Reaktionen (ZIPP et al., 1999; ZIPP, 2000).

Interessanterweise sind Astrozyten und Endothelzellen trotz hoher Exprimierung von

Fas und FasL resistent gegenüber der vermittelten Apoptose. Vielmehr wird bei

diesen Zellen über die Bindung von Fas und FasL die Bildung von pro-

inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen angeregt (SAAS et al., 1999; LEE et

al., 2000). Die Fas-Expression der Mikroglia wird durch die Aufregulation von pro-

inflammatorischen IFN-γ und TNF-α erhöht. Im Gegensatz zu Astrozyten erleiden

Mikroglia zu 60% eine Fas-vermittelte Apoptose (LEE et al., 2000). Somit induziert

Fas zwei unterschiedliche Signale im entzündeten ZNS: ein zytotoxisches Signal an

die Mikroglia und ein pro-inflammatorisches Signal an Astrozyten (LEE et al., 2000).

Die AICD wird von autoreaktiven T-Lymphozyten durch die Interaktion von Fas und

FasL induziert. Eine erhöhte Expression der Moleküle kann bei MS beobachtet

werden (ZIPP, 2000). Im peripheren Blut von MS-Patienten finden sich Myelin-

reaktive T-Zellen, welche in vitro auf eine FasL-bedingte Apoptose ansprechen, in

vivo aus ungeklärten Gründen aber nicht eliminiert werden können (ZANG et al.,

1999). Die Imbalance der Apoptose aktivierter Lymphozyten bei Patienten mit

klinisch aktiver MS ist möglicherweise durch eine massive Erhöhung der „FLICE

inhibitory proteins“ (FLIP)-Expression bedingt. FLIP ist ein potenter Inhibitor des

extrinsischen Signalwegs der AICD (SEMRA et al., 2001). Weiterhin konnte in

betroffenen Individuen eine Aufregulation von Bcl-2 und Survivin in Immunzellen

sowie eine Erhöhung der IAP-Expression im peripheren Blut bestätigt werden. Die


Inhibition der Apoptose aktivierter Lymphozyten erfolgt somit auch durch den

intrinsischen Signalweg (SHARIEF und SEMRA, 2001; SHARIEF et al, 2002;

JOHNSON und HOWERTH, 2004).

Bei der schubweise voranschreitenden Form der MS-Erkrankung zeigt sich eine

geringe Präsenz Bcl-2 positiver T-Zellen (ZETTL et al., 1998). Im Gegensatz hierzu

findet sich bei dem primär progressiven Verlauf eine deutliche Erhöhung der

Expression von Bcl-2, welche den konstant fortschreitenden Krankheitsverlauf

erklären könnte. Hier zeigt sich eine interessante Parallele zu der chronisch

demyelinisierenden Phase der TME, bei der es auf Grund des Mangels an Apoptose

ebenfalls zu einer Akkumulation potentiell autoreaktiver T-Zellen im ZNS kommt

(OLESZAK et al., 2004).

Ein Missverhältnis der Apoptose-Regulation von autoreaktiven Lymphozyten konnte

bereits bei der EAE nachgewiesen werden (TSUNODA et al., 2005). LEE et al.

(2000) zeigten bereits im Vorfeld, dass durch Fas-Expression von aktivierten

Gliazellen pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine induziert werden.

Mäusestämme, die Fas (lpr) oder FasL (gld) Mutationen aufweisen, zeigen eine

mildere Ausprägung der EAE mit früher einsetzender Rekonvaleszenz (WALDNER et

al., 1997; SABELKO et al., 1997).

2.3.2 Apoptose bei der Theilervirus-Enzephalomyelitis

Die Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus bei der TMEV-Infektion, da hierdurch

einerseits virusinfizierte Zellen eliminiert werden, andererseits aber die Ausbreitung

des Virus durch Phagozytose infizierter, apoptotischer Zellen begünstigt wird

(OLESZAK et al., 2003; OLESZAK et al., 2004). Die Apoptose kann in der frühen

Phase der Erkrankung durch die virale Replikation in nicht aktivierten Makrophagen

induziert werden. Zusätzlich kann die Bindung von „tumor necrosis factor-related

apoptosis-inducing-ligand“ (TRAIL) an Rezeptoren der aktivierten Makrophagen die

Apoptose einleiten (LIPTON et al., 2005). Bei den empfänglichen SJL-Mäusen zeigt

sich am zehnten Tag pi eine deutliche Reduzierung der Virusmenge, jedoch kann zu

keinem Zeitpunkt während der TMEV-Infektion eine Eliminierung des Virus erzielt

werden (OLESZAK et al 2004).


Die Apoptose aktivierter T-Lymphozyten ist essentiell für die Aufrechterhaltung der

Homeostase im ZNS während der TMEV-Infektion, da diese Zellpopulation

gewebeschädigende Moleküle wie TNF-α, IL-1 und freie Radikale produziert (AKBAR

und SALMON; 1997, MATLOUBIAN et al., 1999). T-Zellen, die das ZNS infizierter

Mäuse infiltrieren, exprimieren hohe Mengen Fas und FasL, aber nur geringe

Mengen Bcl-2. Somit resultiert eine wichtige Funktion der AICD bei der

Entzündungselimination der resistenten C57BL/6-Mäuse (OLESZAK et al., 2003).

Bislang erfolgte eine Quantifizierung apoptotischer Zellen in SJL-Mäusen mit dem

BeAn-Stamm im RM in der chronischen Phase (31 Tage pi; SCHLITT et al. 2003). Zu

diesem Zeitpunkt sind die meisten apoptotischen Zellen in den ventralen und

lateralen Bereichen der weißen Substanz des RM lokalisiert. Bis zum 60. Tag pi

findet sich ein leichter Anstieg TUNEL+ Zellen, gefolgt von einem leichten Abfall bis

zum 90 Tag pi. 74% der apoptotischen Zellen sind T-Zellen, ein Drittel hiervon CD8+

T-Zellen, ca. 8% sind Makrophagen und 0,6% Astrozyten. 17% der apoptotischen

Zellen können nicht eindeutig klassifiziert werden. In nur 1% der TUNEL+ Zellen kann

virale RNA detektiert werden. Die Ergebnisse sprechen für das Vorliegen einer AICD

von T-Zellen im Verlauf der TME (SCHLITT et al. 2003).

PALMA et al. (1999) zeigen eine erhöhte Expression von Fas und FasL von TUNEL+

Astrozyten vier Monate nach BeAn-Infektion von SJL-Mäusen. Eine vergleichende

Untersuchung empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäuse nach Infektion mit

dem DA-Stamm wurde von OLESZAK et al. (2003) durchgeführt. Der Vergleich

erfolgte am achten und zehnten Tag pi im Gehirn sowie nach sechs Monaten pi im

RM. Mittels Durchflusszytometrie kann in der frühen Phase bei beiden

Mäusestämmen festgestellt werden, dass 20-30% der CD3+ T-Zellen apoptotisch

sind, während in der chronischen Phase bei den infizierten SJL-Mäusen nur noch 2-

3% der CD3+ T-Zellen Apoptose aufweisen. Zusätzlich findet sich eine große Anzahl

TUNEL+ Makrophagen und Neuronen im Gehirn bei beiden Mäusestämmen. Die

infiltrierenden Entzündungszellen des ZNS zeigen über den gesamten Verlauf eine

konstant hohe Expression von Fas und FasL. Die Apoptose-Resistenz in der

chronischen Phase wird über den Anstieg der Bcl-2 Expression von CD3+ T-Zellen

erklärt (OLESZAK et al., 2003).


Bei dem Vergleich eines hochvirulenten (GDVII) und eines schwachvirulenten (DA)

TMEV-Stammes im ZNS empfänglicher SJL-Mäuse fanden TSUNODA et al. (1997)

eine signifikant erhöhte Anzahl TUNEL+ Neuronen im zerebralen Cortex und

Hippocampus sieben Tage nach Infektion mit dem GDVII-Stamm. Wenige

monozytäre, apoptotische Zellen fanden sich bei beiden Stämmen in perivaskulären

Infiltraten. In der chronischen Phase der TMEV-Infektion (1 Monat pi) ist die

Polioenzephalomyelitis nicht mehr vorhanden und es findet sich eine akzentuierte

Leukomyelitis und Meningitis. TUNEL+ Zellen waren nur noch im Neuroparenchym

nachweisbar, wobei keine apoptotischen Astrozyten und nur wenige TUNEL+

Mikroglia auftraten. 5% der Oligodendrozyten sind TUNEL+ Zellen und somit

hinweisend auf die Ursache der Demyelinisierung in der chronischen Phase

(TSUNODA et al., 1997).

Zur Charakterisierung des Einflusses schwachvirulenter TMEV-Stämme (DA und

BeAn) auf einzelne Zellpopulationen wurden diverse Zelllinien von Mikroglia,

Neurone und Makrophagen untersucht. Der Zellzyklus BeAn-infizierter Makrophagen

ist entscheidend für die Induktion der Apoptose. Undifferenzierte myeloische

Vorläuferzellen, die Charakteristika von Gewebemakrophagen aufweisen, zeigen

weder eine virale Replikation noch apoptotische Zelluntergänge. Differenzierte Zellen

hingegen weisen eine limitierte Virusinfektion auf, mit Produktion der pro-

inflammatorischen Zytokine IFN-α und -β und der pro-apoptotischen Moleküle Bax

und Bak sowie assoziierter Apoptose (JELACHICH und LIPTON, 1999). Zwei Tage

nach Infektion einer murinen Mikroglia-Zelllinie und eines myelinisierten Explantat

des Kleinhirns mit dem DA-Stamm können in Mikroglia deutliche Virusmengen ohne

apoptotische Zelluntergängen nachgewiesen werden. Im Kontrast hierzu findet sich

eine hohe Anzahl apoptotischer Neuronen in der frühen Phase und,

elektronenmikroskopisch detektiert, schwerwiegend geschädigte Axone ohne

Demyelinisierung. Das Virus persistiert anschließend in den Mikrogliazellen während

der chronischen TMEV-Infektion und provoziert erst dann die Demyelinisierung als

Resultat der Aktivierung des Immunsystems (ANDERSON et al. 2000; OHARA et al.

2002).


2.4 Regulatorische T-Zellen

2.4.1 Allgemein

Treg sind entscheidend an der Erhaltung der immunologischen Toleranz gegenüber

Autoantigenen beteiligt und können so autoimmune Erkrankungen verhindern (KIM,

2007). Sie entsprechen einer kleinen Population von T-Zellen, die trotz der

Präsentation von körpereigenem Antigen nicht durch die negative Selektion im

Thymus eliminiert werden. Ihre Funktion ist die Erkennung von Autoantigen und die

anschließende Induktion von immunsuppressiven Mechanismen. Treg stellen

natürlich vorkommende immunmodulatorische T-Zellen dar und exprimieren häufig

CD4 und CD25 (die α-Kette des IL-2-Rezeptors; O’GARRA und VIEIRA, 2004).

Unter physiologischen Bedingungen finden sich bei adulten Menschen und Mäuse

ca. 10% Treg in der gesamten CD4+ T-Zellpopulation. Bei der Identifizierung von

Treg ist zu beachten, dass auch aktivierte Effektor-T-Zellen das Oberflächenantigen

CD25 exprimieren, sodass häufig weitere Marker zur Diskriminierung verwendet

werden müssen (SAKAGUCHI et al., 2001). Der „forkhead/winged helix“

Transkriptionsfaktor Foxp3 wird selektiv von immunregulatorisch wirkenden

Lymphozyten gebildet und ist daher als zuverlässiger Marker für murine Treg

etabliert. Es wird angenommen, dass dieser Transkriptionsfaktor für die Entwicklung

und Funktion der natürlich vorkommenden Treg verantwortlich ist (HORI et al., 2003;

FONTENOT et al., 2003; RAMSDELL, 2003). Das murine Gen FOXP3 sowie das

humane Gen FOXP3 sind nahezu unverändert konserviert und scheinen eine

ähnliche Funktion zu besitzen. Mutationen dieses Gens bewirken schwerwiegende

autoimmune Erkrankungen, wie IPEX des Menschen. Diese Krankheit ist

charakterisiert durch Immun Dysregulation, Polyendokrinopathie, Enteropathie und

zeigt einen X-chromosomalen Erbgang. Bei Mäusen wird durch die Mutation des

Foxp3 der sogenannte scurfy-Phänotyp hervorgerufen. Dies beinhaltet eine nach ca.

4 Wochen post partum letal endende Erkrankung. Bei den betroffenen männlichen

Tiere (X-chromosomal gebunden) tritt Diarrhoe mit gastrointestinalen Blutungen,

Thrombozytopenie, Leukozytose, Lymphadenopathie, Kachexie, Hypogonadismus


und schuppige Haut auf (CHATILA et al., 2000; BENNETT et al., 2001; WILDIN et

al., 2001).

Die Höhe der Foxp3-Expression in murinen Treg ist eng mit deren suppressiver

Funktion korreliert. Konventionelle anergische CD4+CD25+ T-Zellen aus dem Thymus

werden nach Stimulation durch ihren T-Zellrezepetor (TCR) in Anwesenheit von

TGF-β in aktive CD4+CD25+ Treg konvertiert. Ihre Proliferation wird hiernach durch

IL-2 angeregt (HORI et al., 2003; TRAN et al., 2007). Im entzündlichen Milieu

verhindert das akute Phase Protein IL-6 die Konversion von Foxp3- T-Zellen in

Foxp3+ Treg und bewirkt die Induktion von pathogenen Th17-Zellen (BETTELLI et

al., 2006, VELDHOEN et al., 2006, KORN et al., 2007; s. Abb. 2 und 3). Ein Teil der

CD4+CD25- T-Zellen besitzen ebenfalls eine immunregulatorische Aktivität, jedoch ist

diese weniger suppressiv als die der Treg (ANNACKER et al., 2000). Die Population

der Treg bleibt zeitlebens stabil. Unklar ist, wie der immunsuppressive Phänotyp

nach Involution des Thymus erhalten bleibt. Verschiedene Studien bei „knock out“

Mäusen zeigen, dass eine kontinuierliche periphere Stimulation durch IL-2 sowie

eine TCR-Aktivierung und kostimulierende Moleküle wie CD28 und B7 essentiell an

der Erhaltung und Proliferation von CD25+ Treg beteiligt sind (PAPIERNIK et al.,

1998; SALOMON et al., 2000; KUMANOGOH et al., 2001).

Treg hemmen die Reifung und Funktion von APC, supprimieren die Zytokin-

Produktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen, hemmen die Immunglobulinproduktion und

die Proliferation von B-Zellen sowie die zytotoxische Funktion von CTL (MALOY et

al., 2003; SHEVACH, 2009). Die immunsuppressive Wirkung erfordert einerseits den

Zell-Zellkontakt über die Bindung des TCR (THORNTON und SHEVACH, 1998;

SHEVACH, 2002), andererseits kann über lösliche Faktoren wie beispielsweise IL-

10, -35 und TGF-ß ebenfalls eine immunsuppressive Wirkung erzielt werden

(SAKAGUCHI et al., 2009). Im Anschluss an den Zell-Zellkontakt induzieren Treg

den apoptotischen Zelluntergang von Effektor-T- und B-Zellen sowie von APC durch

einen Granzym- und/oder Perforin-abhängigen Weg (GONDEK et al., 2005; ZHAO et

al., 2006; CAO et al., 2007). Speziell die Effektor-T-Zellen unterlaufen die Treg-

vermittelte Apoptose durch Bindung des TRAIL-DR5-Rezeptors der Treg (REN et al.,

2007). Die Treg vermitteln zudem einen negativ metabolischen Einfluss auf die T-


Zellproliferation, indem sie das intrazytoplasmatische, zyklische

Adenosinmonophosphat der gebundenen Effektor-T-Zelle aufregulieren und auf

diesem Weg die weitere Proliferation inhibieren (BOPP et al., 2007). Durch die

Expression des zytolytischen T-Lymphozyten assoziierten Antigen 4 (CTLA-4) erfolgt

die Interaktion mit dem kostimulierenden Molekül B7 (CD80/CD86; ODERUP et al.,

2006). Dies resultiert in der Inhibition der Proliferation aktivierter T-Zellen durch die

Behinderung der Aufregulation von CD80/CD86 an APC (PAUST et al., 2004). Die

Stimulation dendritischer Zellen (DC) durch Treg führt zur Expression des Enzyms

Indoleamin-2,3-dioxygenase (IDO), welches toxisch auf benachbarte T-Zellen der DC

wirkt (FALLARINO et al., 2003; s. Abb. 2 und 3). Von besonderer Bedeutung

hinsichtlich der suppressiven Funktion der Treg ist die Produktion anti-

inflammatorischer Zytokine, wie IL-10, IL-35 und membrangebundenes TGF-β

(MALOY und POWRIE, 2001). Zusätzlich erfolgt die Hemmung der Produktion von

pro-inflammatorischen IL-12, welches der Entwicklung von CD4+ Th1-Zellen dient

sowie der Inhibition pro-inflammatorischen IFN-γ der T-Effektor-Zellen (MOORE et

al., 2001; KORN et al., 2007; O’CONNOR et al., 2007). IL-10 exprimierende Treg

induzieren eine dominante Suppression der Proliferation von CD4+ und CD8+ T-

Zellen. Treg unterdrücken weiterhin die Produktion von IL-2 der CD4+ und CD8+ T-

Zellen sowie die Effektor-Aktivität von CTL. Die IFN-γ Sekretion von autoreaktiven

CD4+ Th1-Zellen und die Funktion von APC werden ebenfalls gehemmt (O’GARRA

und VIEIRA, 2004; s. Abb. 2 und 3).

IL-35 ist ein neues Mitglied der IL-12 Familie und induziert regulatorische Aktivität bei

naiven T-Zellen in vivo und inhibiert die Proliferation von T-Zellen in vitro (COLLISON

et al., 2007). TGF-β erhöht die Sensitivität der T-Zellen gegenüber der Suppression,

es fördert zudem die Expression von Foxp3 und wirkt stimulierend auf die

Differenzierung von naiven T-Zellen in einen regulatorischen T-Zellphänotyp (CHEN

et al., 2003; MARIE et al., 2005).


2.4.2 Regulatorische T-Zellen bei demyelinisierenden ZNS-Erkrankungen am Beispiel der Multiplen Sklerose und der Experimentellen Autoimmunen Enzephalitis

Humane regulatorische T-Zellen besitzen eine weitaus größere Heterogenität als

murine Treg. Unter pathologischen Umständen enthalten humane, periphere

Blutleukozyten ca. 30% Treg von denen ca. 4% eine extrem hohe CD25+ Expression

zeigen (CD4+CD25“high“ T-Zellen). Diese CD4+CD25“high“ T-Zellen können durch die

Expression von CD62L+ von „normalen“ Treg unterschieden werden. Eine

Besonderheit dieser CD4+CD25“high“ T-Zellen ist die Bildung diverser

immunregulatorischer Moleküle, wie MHC Klasse II, CD95 (Fas) und CTLA-4.

Abb. 2: Schematische Darstellung der Entwicklung (I-II) und der Pathomechanismen (III-IV) regulatorischer T-Zellen (Treg)


Humanes Foxp3 stellt, wie auch bei murinen Treg, den wichtigsten Marker zur

Identifizierung regulatorisch aktiver T-Zellen dar. Beim Menschen finden sich darüber

hinaus regulatorisch aktive T-Zellen ohne Foxp3-Expression. Diese Zellen zeigen

einen CD45RO+, CD45RA- und/oder CD45RB“low“ Phänotyp (COSTANTINO et al.,

2008).

Die klinische Symptomatik bei der MS wird auf Myelin-reaktive T-Effektorzellen

zurückgeführt, die nach Passage der Blut-Hirnschranke in das ZNS gelangen und

dort aktiviert werden. Die Anzahl autoreaktiver T-Zellen und Treg im Blut sind bei

gesunden und an der schubweisen Form der MS erkrankten Menschen identisch

(COSTANTINO et al., 2008). Die Treg im peripheren Blut der MS Patienten scheinen

aber eine geringere Expression des suppressiv wirkenden Foxp3 zu zeigen (HUAN

Abb. 3: Schematische Darstellung der Wirkung regulatorischer T-Zellen (Treg) durch Zell-Zellkontakt (I-IV)


et al., 2005). Bei der schubweise auftretenden Form der MS, nicht aber bei der

sekundär progressiven Verlaufsform, konnte dies bereits verifiziert werden

(COSTANTINO et al., 2008).

Darüber hinaus findet sich eine funktionelle Störung der immunsuppressiven Wirkung

der Treg bei den betroffenen Individuen. Dies zeigt sich in der Unfähigkeit der Zellen,

die Proliferation sowie die IFN-γ Produktion potenziell autoreaktiver T-Zellen zu

inhibieren (VENKEN et al., 2006; COSTANTINO et al., 2008). Die

immunhistologische Aufarbeitung von aktiven MS-Plaques im ZNS demonstrierte

eine reduzierte Anzahl Foxp3+ Zellen im ZNS im Vergleich zum peripheren Blut der

Patienten (TZARTOS et al., 2008).

Bei der EAE resultiert die in vivo Depletion von CD25+ Treg in einer Zunahme der

klinischen Symptomatik, einer erhöhten Mortalität und verhindert im Verlauf der EAE

die Rekonvaleszenz (STEPHENS et al., 2005, GÄRTNER et al., 2006). Im

Gegensatz hierzu führt der adoptive Transfer von CD25+ Treg zu einer signifikanten

Protektion vor der Entwicklung der EAE und einer Reduktion klinischer Symptome.

Die Treg zeigen eine deutliche Akkumulation im ZNS während der Genesung der

EAE (MCGEACHY et al., 2005). KORN et al. (2007) wiesen im ZNS während der

Rekonvaleszenzphase der EAE im Vergleich zur akuten Erkrankung nicht nur

erhöhte Werte von Treg nach, sondern zeigten, dass deren IL-10 Produktion deutlich

gestiegen war. Im Verlauf der EAE kann zwar eine konstant hohe Anzahl

autoreaktiver CD4+ Th1-Zellen im ZNS detektiert werden, jedoch ist die Infiltration

von CD4+ T-Zellen und Makrophagen in das ZNS herabgesetzt und es findet sich

zudem eine erhöhte Anzahl von CD4+ Th2-Zellen, die die Th1-bedingte DTH im ZNS

herabsetzen und der Aktivierung von Makrophagen entgegenwirken kann (KOHM et

al., 2002). O’GARRA und VIEIRA (2004) fanden eine dominante Suppression der

Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Zellen und der IFN-γ Sekretion von autoreaktiven

CD4+ Th1-Zellen nach Transfer von IL-10 exprimierenden Treg.

Das Auftreten sowie die Funktion der Treg und deren Bedeutung während der

Initiation und Progression der ZNS-Läsionen bei der TME wurden bislang nicht

untersucht.

Material und Methoden 33

3 Material und Methoden

3.1 Virusinfektion von SJL- und C57BL/6- Mäusen In der fünften Lebenswoche wurden nach 12-tägiger Qurantänezeit beide aus einer

spezifisch pathogen freien (SPF)-Zucht stammenden Mäusestämme (weibliche SJL

und C57BL/6, Harlan/Winkelmann) in tiefer Allgemeinanästhesie intrazerebral

infiziert. Die Genehmigung der tierexperimentellen Studien erteilte das

Regierungspräsidium Hannover (Aktenzeichen: 509c-42502-02/589 und 509.6-

42502-04/860). Die für die Plazebo-Gruppe vorgesehenen Tiere wurden mit 20 µl

eines virusfreien Zellkulturmediums inokuliert (ULRICH et al., 2006b). Die restlichen

Tiere wurden mit 20 µl des BeAn-Stammes infiziert. Die intrazerebrale Infektion

erfolgte in die rechte Großhirnhemisphäre und entsprach einer Virusdosis von 1,63 x

106 PFU pro Maus. Die Einteilung der Gruppen sowie die Sektionszeitpunkte finden

sich in Tab. 2.

Tab. 2: Alter, Sektionszeitpunkte, Gruppengröße von Plazebo- und TMEV-infizierten

SJL- und C57BL/6-Mäusen

SJL-Mäuse C57BL/6-Mäuse Alter in

Wochen Versuchstag

(Tage pi). Durchgeführte

Maßnahme Plazebo (Tierzahl und Tiernummer)

TMEV-Infizierte(Tierzahl und Tiernummer)

Plazebo (Tierzahl und Tiernummer)

TMEV-Infizierte(Tierzahl und Tiernummer)

5 0 Infektion 30 Mäuse 30 Mäuse 30 Mäuse 30 Mäuse

6 7 Sektion 6 Mäuse (TAP 073-078)

6 Mäuse (TAI 151-156)

6 Mäuse (TCP 019-024)

6 Mäuse (TCI 073-078)


6 Mäuse (TAI 157-162)

6 Mäuse (TCP 025-030)

6 Mäuse (TCI 079-084)


6 Mäuse (TAI 175-180)

6 Mäuse (TCP 037-042)

6 Mäuse (TCI 091-096)


6 Mäuse (TAI 187+192)

6 Mäuse (TCP 043-048)

6 Mäuse (TCI 097-102)


6 Mäuse (TAI 199-204)

6 Mäuse (TCP 049-054)

6 Mäuse (TCI 103-108)


3.2 Probengewinnung Für die Untersuchungen lagen Gewebeproben von experimentiell infizierten SJL-

Mäusen vor (ULRICH, 2006). Die Probengewinnung der experimentiell infizierten

C57BL/6-Mäusen erfolgte analog zu der der SJL-Mäuse. Zu den angegebenen

Sektionszeitpunkten wurden die Mäuse beider Stämme in tiefer Allgemeinanästhesie

euthanasiert und nach Entnahme das Groß- und Kleinhirn voneinander abgesetzt

(ULRICH, 2006). Das Großhirn wurde in Höhe der Hippocampus-Formation, das

Kleinhirn an der breitesten Ausprägung des 4. Ventrikels quer halbiert, und der

jeweilig kraniale Anteil gefrierfixiert. Die kaudalen Abschnitte wurden wie auch die

ersten beiden Halswirbel, sowie der dritte und vierte Brustwirbel und die ersten

beiden Schwanzwirbel für die Formalinfixierung vorgesehen. Nach 24stündiger

Fixierung in 10% Formalin erfolgte für die Wirbelkörper eine 48stündige Entkalkung

in einer 10%igen EDTA-Lösung. Nach Dehydrierung in einer aufsteigenden

Alkoholreihe und Xylol als Intermedium wurden die zentralnervösen Gewebe

maschinell bei 58°C eingebettet (Pathcenter, Shandon). Hierbei fanden die drei

Wirbelkörpersegmente in einem Paraffinblock Platz, während die Transversalschnitte

von Groß- und Kleinhirn in einem weiteren Paraffinblock untergebracht wurden. Die

gewonnenen Paraffinblöcke wurden trocken und bei Raumtemperatur gelagert. Zur

Herstellung des gefrierfixierten Nativmaterials wurden die drei verbliebenen

Abschnitte der Wirbelsäule einer dorsalen Laminektomie unterzogen und nach

Entnahme der Rückenmarksegmente zusammen mit den kaudalen Anteile von Groß-

und Kleinhirn in vorgeformte Aluminiumbehältnisse verbracht. Hierbei wurden für den

Abschnitt von Groß- bzw. Kleinhirn je ein Hütchen verwendet, die drei

Rückenmarkssegmente hingegen in paralleler Anordnung in ein Hütchen

angeordnet. Die Proben wurden mit Tissue-Tec ® O.C.T TM compound (Sakura)

gleichmäßig bedeckt und in eine Metalldose verbracht, deren Boden mit Isopentan

bedeckt war. Nach Überführung dieser Dose in einen Behälter mit flüssigem

Stickstoff wurde der Gefrierprozess umgehend eingeleitet. Das gefrierfixierte

Nativmaterial wurde bei -80°C gelagert.


3.2.1 Paraffin-eingebettete und Formalin-fixierte Proben

Für die histologischen und immunhistologischen Untersuchungen der Mäuse wurden

von den Paraffinblöcken mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms 2 µm dicke Serienschnitte

angefertigt, die auf Superfrost/Plus-Objektträgern (Menzel-Gläser) aufgezogen

wurden. Von jedem Block wurde an den Serienschnittennummer 1, 30 und 60

routinemäßig in einem Färbeautomaten (Shandon 24-3 Varistain ®, Fa. Thermo

Electron GmbH) eine Hämatoxylin-Eosin Färbung (ROMEIS, 1989) durchgeführt.

Weitere acht Serienschnitte dienten der immunhistologischen Untersuchung (s. Tab.

3).

3.2.2 OCT-eingebettete Proben (Nativmaterial)

Von dem OCT-eingebetteten Gefriermaterial beider Mäusestämme wurden 4-6 µm

starke Gefrierserienschnitte mittels Kryostaten (HM 500 OM, Microtom-Kryostat, Fa.

MICROM) angefertigt. Nach 60 minütiger Trockenzeit bei Raumtemperatur, erfolgte

eine Azetonfixierung für 10 Minuten. Die Lagerung der Nativserienschnitte wurde bis

zu Ihrem Gebrauch bei -20°C durchgeführt. Der Schnitt Nr. 1 einer jeden Serie wurde

mittels Färbeautomat (Shandon 24-3 Varistain ®, Fa. Thermo Electron GmbH)

Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt (ROMEIS, 1989). Drei weitere Serienschnitte wurden

umgehend immunhistologisch gefärbt (s. Tab. 3).

3.3 Lichtmikroskopische Untersuchung

3.3.1 Histologie

Die histologische Untersuchung der Mäusestämme wurde lichtmikroskopisch an

Hämatoxylin-Eosin (HE)- und Luxol fast blue-Kresylechtviolet (LFB-KV)-gefärbten

Transversalschnitten der Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten

Rückenmarksegmente sowie der Querschnitte von Groß-, Klein- und Stammhirn

durchgeführt. Die anatomischen Lokalisationen der perivaskulären Infiltrate sowie die

Bereiche der Hyperzellularität in Gehirn und Rückenmark wurden skizziert, um

innerhalb der Serienschnitte die entzündlichen Veränderungen vergleichend


auswerten zu können (s. Abb 4 und 5). Anhand dieser Übersichtsdarstellung erfolgte

die immunhistologische Charakterisierung der entzündlichen Regionen. Bei den

Plazebo-Mäusen beider Stämme wurde die Charakterisierung vorhandener Zellen

anhand zehn zufällig ermittelter Lokalisationen in Groß,- Klein- und Stammhirn sowie

des Rückenmarks durchgeführt. Die Intensität der Hyperzellularität und

perivaskulären Entzündungszellinfiltrate wurden in den verschiedenen Lokalisationen

semiquantitativ am HE-gefärbten Schnitt und die Entmarkung am LFB-KV-gefärbten

Schnitt ermittelt (GERHAUSER et al., 2007).

1 = Meninx 2 = Cortex cerebri 3 = Corpus callosum 4 = Hippocampus 5 = paraventrikuläre Substanz mit Caudoputamen 6 = Thalamus und Hypothalamus

Abb. 4: Einteilung in Lokalisationen nach anatomischen Regionen im Großhirn von SJL- und C57BL/6-Mäusen


3.4 Immunhistologie

Die immunhistologische Charakterisierung der Entzündungsantwort im ZNS sowie

der Nachweis pro- und anti-apoptotischer Faktoren wurden durch verschiedene

Antikörper auf Kreuzreaktivität mit murinen Geweben getestet.

Der immunhistologische Nachweis von Differenzierungsantigen für T-Zellen (CD3)

und B-Zellen (CD45R/B220), saurem Gliafaserprotein von Astrozyten (GFAP), sowie

transmembranen Glykoprotein in lysosomalen Membranen von mononukleären

Phagozyten Mac-3 (CD107b) und die „forkhead/wingled-helix“ Familie P3 von

Transkriptionsregulatoren in immunsuppressiven regulatorischen T-Zellen (Foxp3)

erfolgte an Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Schnitten von Gehirn und

Rückenmark von SJL- und C57BL/6-Mäusen.

1 = Meninx, Klein- und Stammhirn 2 = graue Substanz, Kleinhirn 3 = weiße Substanz, Kleinhirn 4 = paraventrikuläre Substanz des vierten Ventrikels 5 = graue Substanz, Stammhirn 6 = weiße Substanz, Stammhirn

Abb. 5: Einteilung in Lokalisationen nach anatomischen Regionen im Klein- und Stammhirn von SJL- und C57BL/6-Mäusen


Das OCT-eingebettete ZNS-Nativmaterial beider Mäusestämme wurde

immunhistologisch für den Nachweis des Interleukin-2Rα Rezeptors auf aktivierten

T- und B-Zellen/T-Effektorzellen sowie regulatorischen T-Zellen (CD25) genutzt.

Zur Darstellung pro-apoptotischer Faktoren des extrinsischen Signalweges wurden

die Zelloberflächenglykoproteine Fas (CD95) und Fas-Ligand (CD95L) der

Rezeptorseite des „death inducing signaling complex“ (DISC) in lymphatischen

Zellen gewählt, sowie die Familie der anti-apoptotischen Proteine Bcl-2 und pro-

apoptotischen Proteine Bax, die mitochondrial freigesetzt, zum intrinsischen

Signalweg der Apoptose gerechnet werden. Zur Detektion apoptotischer Zellen in der

Apoptosekaskade wurde die aktivierte Effektor-Caspase-3 („cysteine-aspartic acid

protease“), ausgewählt. Im Weiteren wurden die inhibitorischen Proteine der

Apoptose Survivin, c-IAP1, c-IAP2, XIAP, NAIP, TIAP, ML-IAP (Livin) gewählt,

welche durch Komplexbildung mit den Effektor Caspasen-3, -7 und -9 deren

proteolytische Aktivität inhibieren.

Für die oben genannten Marker wurde die Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC-

Methode) nach ALLDINGER et al. (1996) durchgeführt, die farbliche Markierung

erfolgte mittels 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB). Tabellarisch (s. Tab.

3) sind die kreuzreagierenden Primärantikörper, deren angewandte Verdünnung,

Hersteller, Spezifität, Demaskierungsverfahren, verwendete Blocksera und

zugehörige Sekundärantikörper dargestellt. Im Anhang (s. Anhang, Tab. 55) findet

sich eine komplette Auflistung der untersuchten Antikörper und deren

Kreuzreaktivitäten mit murinen Gewebe.


Tab. 3: Liste der etablierten Primärantikörper mit Herkunft, Demaskierungsverfahren, Blockserum, Verdünnung und Sekundärantikörper.

Spezifität Hersteller mAk/pAk Spezies

Klon/ Antiserum

De-maskierung

Block-serum

Ver-dünnung

Sekundär-antikörper Nachweis

CD3 Dako pAk

Kaninchen

IgG Fraktion

Kaninchenserum

Citratpuffer/Mikrowelle - 1:300 GaR-b

1:200 T-Zellen

CD25 BD

Biosciences mAk Ratte

7D4 - KNS 1:5 1:200 -

regulatorischeT-Zellen/ Effektor- Zellen

CD45R/ B220

BD Biosciences

mAk Ratte

RA3-6B2 Citratpuffer/Mikrowelle

KNS 1:5 1:2000 - B-Zellen

CD95 Santa Cruz

pAk Kaninchen

IgG Fraktion

Kaninchenserum

Citratpuffer/Mikrowelle

ZNS 1:5 1:4000 GaR-b

1:200 Fas Rezeptor

CD107b (Mac-3)

AbD Serotec mAk Ratte

M3/84 Citratpuffer/Mikrowelle - 1:200 - Makrophagen

Mikroglia

GFAP Dako pAk

Kaninchen

IgG Fraktion

Kaninchenserum

- ZNS 1:5 1:2000 GaR-b

1:200 Astrozyten

Aktivierte Caspase-3

Cell Signaling

pAk Kaninchen

IgG Fraktion

Kaninchenserum

Citratpuffer/Mikrowelle

ZNS 1:5 1: 200 GaR-b

1:200

aktivierte Effektor-Caspase

Foxp3 Natu Tec

mAk Ratte

FJK-16s Citratpuffer/Mikrowelle

KNS 1:5 1:50 RaR-b

1:200 regulatorische

T-Zellen

mAk = monoklonaler Antikörper; pAk = polyklonaler Antikörper;

KNS = Kaninchennormalserum; ZNS = Ziegennormalserum;

GaR-b = „goat-anti-rabbit-biotinylated“; RaR-b = „rat-anti-rabbit-biotinylated“;

3.4.1 Antikörper und Seren

Zur immunhistochemischen Etablierung der Primärantikörper wurde an

Paraffinschnitten ohne Demaskierungsverfahren und unter Zuhilfenahme von

Demaskierungen wie Citratpuffer + Mikrowelle, Triton-X und Pronase sowie an


Gefrierschnitten gearbeitet. Verwendete Gewebe zur Etablierung waren Gehirn,

Rückenmark, Thymus, Lunge, Leber, Milz, Nieren, Magen und Lymphknoten

infizierter (50. und 100. Tag pi), adulter sowie neonataler SJL-Mäuse, ein kolorektaler

Polyp einer adulten SJL-Maus und ein HeLa-Zellpellet.

Zur Demaskierung der Antigene wurden die auf SuperFrostObjektträger

aufgezogenen Paraffinschnitte 15 min in Citratpuffer (pH-Wert: 6; s. Anhang) in der

Mikrowelle gekocht (800 Watt).

Zum Blockieren unspezifischer Antikörper-Bindungsstellen wurden Blocksera von

Ziegen- und Kaninchenserum 1:5 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)

verdünnt.

Die verwendeten Primärantikörper wurden in PBS mit Zusatz von 1% bovinem

Serumalbumin (BSA) verdünnt. Sekundärantikörper und Detektionssystem (ABC-Kit)

wurden in PBS ohne Zusatz verdünnt. Für jeden Antikörper wurden

Verdünnungsreihen von 1:10 bis 1:12.800 angelegt.

Als Sekundärantikörper wurden biotinilierte Antikörper verwendet. Dies war einerseits

ein Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Vector Laboratories, BA 1000), andererseits ein

Kaninchen-anti-Ratte-Antikörper (Vector Laboratories, BA-4001), jeweils in der

Verdünnung 1:200 in PBS.

Bei den biotynilierten Primärantikörpern CD25, CD45R/B220 und CD107b (Mac-3) entfiel die Inkubation mit Sekundärantikörpern.

Das verwendete Detektionssystem war das Avidin-Biotin-Komplex (ABC)

(„Vectastatin Elite ABC Kit“, Vector Laboratories, PK 6100; Ansatz: 1ml PBS

vorlegen, 15 µl der Reagenz A zufügen, nach guter Durchmischung 15 µl des

Reagenz B zugeben und nochmals durchmischen).


3.4.2 Protokolle

3.4.2.1 Protokoll für die Immunhistologie (ABC-Methode) an Paraffinschnitten

1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost® plus-Objektträger und

anschließendes Trocknen im Wärmschrank bei 57°C für mindestens 30

Minuten;

2. Entparaffinierung der Schnitte in Roticlear® zweimal für jeweils 5 Minuten,

in Isopropanol und 96%igem Ethanol für jeweils 3 Minuten;

3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml Methanol (reinst) + 3

ml frisch zugesetztem 30%igem H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung

0,5%igem H2O2) unter langsamen Rühren für 30 Minuten;

4. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS (s. Anhang) für jeweils 5 Minuten;

5. Demaskierung der Antigene in Zitratpuffer (s. Anhang) bei pH-Wert 6 für 15

Minuten in der Mikrowelle kochen (800 Watt), danach Abkühlung für 10

Minuten bei Raumtemperatur; zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für

jeweils 5 Minuten;

6. Einsetzen der Schnitte in Coverplates TM (Fa. Shandon Sequenza);

7. Spülen der Schnitte mit PBS für 5 Minuten;

8. Überschichten der Schnitte mit 100 µl Blockserum je nach Antikörper (siehe

Tabelle 2) mit Kaninchennormalserum oder Ziegennormalserum 1:5 in PBS

verdünnt für 20 Minuten;

9. Auftragen von 100 µl Primärantikörper in PBS mit 1%igem bovinen

Serumalbumin bzw. entsprechend verdünnten Kontrollserum, Inkubation

über Nacht bei 4°C;

10. Bei Raumtemperatur Erwärmen der Schnitte für mindestens 30 Minuten;

11. Ansetzten des ABC-Komplex (Ansatz: 1ml PBS vorlegen, 15 µl der

Reagenz A zufügen, nach guter Durchmischung 15 µl des Reagenz B

zugeben und nochmals durchmischen).

12. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten;


13. Überschichten mit je 100 µl Sekundärantikörper (s. Tab. 2) 1:200 verdünnt

in PBS, Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur;


15. Auftragen von je 100 µl ABC-Reagenz und Inkubation für 30 Minuten bei

Raumtemperatur;

16. Zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten, danach

Verbringen der Schnitte in eine mit PBS gefüllte Küvette;

17. Inkubation der Schnitte in DAB (s. Anhang) mit 0,03% H2O2 unter

langsamen Rühren bei Raumtemperatur für 5 Minuten;

18. Zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten;

19. Spülen der Schnitte in fließendem, kaltem Leitungswasser für 5 Minuten;

20. Gegenfärbung der Schnitte mit Hämalaun nach Mayer (ROMEIS, 1989) für

15 Sekunden;

21. Bläuen der Schnitte in fließendem, kaltem Leitungswasser für 10 Minuten;

22. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe für jeweils 2-3

Minuten, in 50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol, danach für 5

Minuten in Isopropanol und zweimal für jeweils 5 Minuten in

Essigsäurebutylester (EBE);

23. Eindecken der Schnitte mit Hilfe eines Objektträger-Eindeckautomaten

RCM200 (Fa. Medite Gesellschaft für Medizintechnik mbH);

Für den Nachweis von CD45R/B220 und CD107b (Mac-3) entfielen die Schritte 13

und 14, da hier die Primärantikörper bereits in biotinilierter Form vorlagen.

3.4.2.2 Protokoll für die Immunhistologie (ABC-Methode) an Gefrierschnitten

1. Aufziehen der Gefrierschnitte auf Superfrost® plus-Objektträger und

anschließendes Trocknen bei Raumtemperatur für mindestens 60 Minuten;

Fixierung der Schnitte in Azeton für 10 Minuten, anschließendes Trocknen

für weitere 10 Minuten;

2. Rehydrierung der Schnitte in PBS (s. Anhang) für 5 Minuten;


3. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 197 ml PBS + 3 ml frisch

zugesetztem 30%igem H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung 0,5%igem

H2O2) unter langsamen Rühren für 30 Minuten;


5. Einsetzen der Schnitte in feuchte Kammern;

6. Überschichten der Schnitte mit 1:5 in PBS verdünnten Kaninchenserum

(Blockserum) für 20 Minuten bei Raumtemperatur;

7. Abkippen des Kaninchenserums;

8. Auftragen von 100 µl Primärantikörper in PBS mit 1%igem bovinen

Serumalabumin bzw. entsprechend verdünnten Kontrollserum, Inkubation

über Nacht bei 4°C;

9. Bei Raumtemperatur Erwärmen der Schnitte für mindestens 30 Minuten;

10. Ansetzten des ABC-Komplexes (Ansatz: 1ml PBS vorlegen, 15 µl der

Reagenz A zufügen, nach guter Durchmischung 15 µl des Reagenz B

zugeben und nochmals durchmischen).


12. Überschichten mit je 100 µl Sekundärantikörper RaR-b (Kaninchen-anti-

Ratte-Antikörper-biotiniliert) 1:200 verdünnt in PBS, Inkubation für 30

Minuten bei Raumtemperatur;


14. Auftragen von je 100 µl ABC-Reagenz und Inkubation für 30 Minuten bei

Raumtemperatur;

15. Zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten, danach

Verbringen der Schnitte in eine mit PBS gefüllte Küvette;

16. Inkubation der Schnitte in DAB (s. Anhang) mit 0,03% H2O2 unter langsamen

Rühren bei Raumtemperatur für 5 Minuten;

17. Zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten

18. Spülen der Schnitte in fließendem, kaltem Leitungswasser für 5 Minuten;

19. Gegenfärbung der Schnitte mit Hämalaun nach Mayer (ROMEIS, 1989) für

15 Sekunden;




Minuten, in 50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol, danach für 5 Minuten

in Isopropanol und zweimal für jeweils 5 Minuten in EBE;



Für den Nachweis von CD25 entfielen die Schritte 12 und 13, da hier der

Primärantikörper bereits in biotinilierter Form vorlag.

3.4.3 TUNEL-Methode

3.4.3.1 Protokoll der Apoptosedetektion mittels ApopTag® Plus (In Situ Apoptosis Detection Kit) an Paraffinschnitten

1. Aufziehen der Paraffinschnitte auf Superfrost® plus-Objektträger und

anschließendes Trocknen im Wärmschrank bei 57°C für mindestens 30

Minuten;

2. Entparaffinierung der Schnitte in Roticlear® zweimal für jeweils 5 Minuten,

in Isopropanol und 96%igem Ethanol für jeweils 3 Minuten;

3. Einmaliges Spülen der Schnitte in PBS (s. Anhang) für 5 Minuten;

4. Ansetzen der Endverdünnung von Proteinase K (20 µg/ml, s. Anhang) für 2

ml Proteinase K-Lösung (ausreichend für 20 Schnitte) 4 µl Stammlösung

in1996 µl Verdaupuffer (s. Anhang);

5. Objektträger abtrocknen und Schnitte mit Fettstift umranden;

6. Mit Proteinase K-Lösung bedecken und Andauen für 10 Minuten bei

Raumtemperatur in einer feuchten Kammer;

7. „Working-Strength-TdT-Solution“ (s. Anhang) ansetzen und bis zum

Gebrauch auf Eis lagern;

8. „Stop-Wash“-Puffer (s. Anhang) in einer Küvette ansetzen;

9. Schnitte von feuchter Kammer in Küvette überführen, und viermal mit Aqua

dest. unter ständigem Rühren für jeweils 2 Minuten spülen;


10. Hemmung der endogenen Peroxidase mittels 56 ml PBS + 4 ml frisch

zugesetztem 30%igem H2O2 (entspricht in endgültiger Lösung 2%igem

H2O2) unter langsamen Rühren für 5 Minuten;

11. Zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten unter

ständigem Rühren;

12. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen der Schnitte in eine feuchte

Kammer;

13. Auftragen von 75 µl Equilibrationspuffer pro Schnitt und Inkubation für 10

Minuten;

14. Überschuß an Equilibrationspuffer abschütten und Objektträger abtrocknen;

15. Bedecken der Schnitte mit 54 µl Working Strength TdT Solution und mit

Cover Slip bedecken, Inkubation im Brutschrank (37°C) für 60 Minuten;

16. Küvette mit Stop-Wash-Puffer ins Wasserbad (37°C) setzen;

17. Entfernen der Cover Slips und in Aqua dest. überführen;

18. Schnitte in vorgewärmte Küvette mit Stop-Wash-Puffer überführen, im

Wasserbad bei 37°C und ständiger Bewegung für 30 Minuten inkubieren;


20. Reinigung und Trocknen der Cover Slips;

21. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen der Schnitte in eine feuchte

Kammer;

22. Auftragen von 55 µl Anti-Digoxigenin-Peroxidase pro Schnitt mit einem

Cover Slip abdecken und für 30 Minuten inkubieren;

23. Überführen der Schnitte in Küvette;

24. Viermaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 2 Minuten;

25. Inkubation der Schnitte in DAB (s. Anhang) mit 0,03% H2O2 unter

langsamen Rühren bei Raumtemperatur für 5 Minuten;

26. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für jeweils 5 Minuten

27. Kurzes Eintauchen der Schnitte in Aqua dest.;

28. Gegenfärbung mit Hämalaun nach Mayer (ROMEIS, 1989) für 10

Sekunden;




Minuten, in 50%igem, 70%igem und 96%igem Alkohol, danach für 5

Minuten in Isopropanol und zweimal für jeweils 5 Minuten in EBE;



3.4.3.2 Kontrollen

Als Positivkontrollen dienten Gehirn, Rückenmark, Thymus, Lunge, Leber, Milz,

Nieren, Magen und Lymphknoten infizierter (50. und 100. Tag pi), adulter sowie nicht

infizierter, neonataler SJL-Mäuse, ein kolorektaler Polyp einer adulten SJL-Maus und

ein HeLa-Zellpellet. Positivkontrolle für den immunhistologischen Nachweis von

Entzündungszellen (CD3, CD25, CD45R/B220, CD107b) war die Milz einer Maus.

Für GFAP wurde ein Gehirnschnitt einer gesunden Maus gefärbt. Für TUNEL, aktivierte Caspase-3 und CD95 (Fas) stand ein Fibroadenom der Mamma einer

Ratte zur Verfügung. Die Positivkontrolle für Foxp3 war Thymus einer juvenilen

Maus. Als Negativkontrollen dienten je nach Herkunftspezies des Primärantikörpers

Normalseren, die auf die identische Proteinkonzentration des Primärantikörpers

verdünnt wurden. Dies waren für CD3, CD95 (Fas), aktivierte Caspase-3 und GFAP

Kaninchennormalserum (Dako), für CD45R/B220 und Foxp3 Ratten-IgG2a-Isotyp-

Kontrolle (R&D Systems), sowie für CD107b (Mac-3) Ratten-IgG1-Isotyp-Kontrolle

(R&D Systems) und für CD25 Ratten-IgM-Isotyp-Kontrolle (R&D Systems). Für die

Negativkontrolle des ApopTag® Plus TUNEL Kits wurde das Enzym TdT in der

„Working-Strength-TdT-Solution“ ausgespart und lediglich Reaktionspuffer

aufgetragen.

3.5 Auswertung lichtmikroskopischer Untersuchung Die immunhistologische Auswertung des Gehirns erfolgte nach getrennten

anatomischen Lokalisationen (s. Abb. 4 und 5).

Zur Immunphänotypisierung der Hyperzellularität wurden mittels einer in das Okular

des Mikroskops eingelassenen Netzmikrometerplatte (U-OCMSQ10/10, OLYMPUS


Deutschland GmbH) bis zu zehn Lokalisationen pro Region ausgezählt. Bei

Verwendung des 10-fach Okulars und des 40er Objektives wurde ein Zählfeld von

0,0625 mm2 (0,25 mm x 0,25 mm), welches aus 100 Quadraten besteht (0,025 mm x

0,025 mm), erfasst. Nach Ermittlung der immunhistologisch positiven Zellen

innerhalb eines Zählfeldes wurden diese Zahlenwerte pro mm2 errechnet. Für die

Auswertung der perivaskulären und meningealen Infiltrate wurden pro Region bis zu

10 entzündliche Infiltrate ausgezählt. Hierbei wurden die immunhistologisch positiven

Zellen sowie die mit Hämalaun-gegengefärbten, immunhistologisch negativen Zellen

erfasst. Rechnerisch konnte so ein prozentualer Wert der immunhistologisch

positiven Zellen innerhalb eines entzündlichen Infiltrats ermittelt werden.

3.6 Statistische Auswertung Die statistische und graphische Auswertung der histologischen und

immunhistologischen Untersuchung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS

für Windows (Superior Performing Software Sytems, Version 18.0, SPSS Inc.) auf

einem Personalcomputer. Die Annahme auf Normal- bzw. Lognormalverteilung der

gemessenen Parameter mit dem Shapiro-Wilks-Test sowie durch visuelle Beurteilung

der Q-Q-Plots mußte abgelehnt werden. Daraus folgend wurden für die Deskription

der Stichprobenumfang, Mediane, Minima, Maxima erhoben. Für Vergleichstest

wurden nichtparametrischen Verfahren genutzt, zum einen als nichtparametrische

Ein-Weg-Varianzanalyse (Kruskal-Wallis-H-Test) zwischen den vier

Versuchsgruppen sowie über den zeitlichen Verlauf jeder einzelnen Gruppe. Im Falle

von signifikanten Gruppenunterschieden wurden mit einem nichtparametrischen

paarweisen Vergleich (Mann-Whitney-U-Test) die infizierten Gruppen miteinander

sowie die infizierten Tiere mit den Plazebo Tieren des gleichen Stammes verglichen.

Die graphische Darstellung wurde mittels „box-and-whisker-plots“ erzeugt, wobei

Werte als Ausreißer bzw. Extremwerte gekennzeichnet wurden, wenn sie mehr als

der 1,5 bzw. 3,0-fache Wert der Länge des Intervalls vom 25%- oder vom 75%-

Quartil aufwiesen. Bei allen Berechnungen wurde ein Signifikanzniveau von 0,05

ohne α-Adjustierung angenommen, Ergebnisse mit p < 0,05 galten als statistisch

signifikant.

Ergebnisse 49

4 Ergebnisse

4.1 Histologische Befunde im zentralen Nervensystem von empfänglichen SJL- und resistenten C57BL/6-Mäusen

Hyperzellularität (Gliosen) und/oder perivaskuläre Entzündungszellinfiltrate fanden

sich in der Frühphase der Infektion (7. Tag post infectionem, pi) hauptsächlich im

Großhirn beider Mäusestämme. Die Entzündungsreaktionen waren hierbei

besonders stark am 7. und 14. Tag pi im Hippocampus, um den dritten und die

lateralen Ventrikel sowie im Thalamus und Hypothalamus ausgeprägt. Außerdem

fanden sich prominente entzündliche Reaktionen im Kortex am 7. Versuchstag. Im

weiteren Infektionsverlauf (nach dem 14. Versuchstag) folgte in diesen Arealen eine

deutliche Reduktion der Entzündung. Im Vergleich hierzu fand sich eine Gliose im

Corpus callosum auch an späteren Zeitpunkten (7. bis 56. Tag pi). Mit der Stärke der

entzündlichen Reaktionen des zerebralen Ventrikelsystems vergleichbar, fanden sich

bereits am 7. Versuchstag Gliosen und perivaskuläre Infiltrate um den vierten

Ventrikel bei beiden Mäusestämmen. Diese paraventrikuläre Entzündung war

besonders intensiv am 7. bis 56. Tag pi bei SJL-Mäusen und vom 7. bis 14. Tag bei

C57BL/6-Mäusen ausgeprägt. Während die Entzündung hiernach bei C57BL/6-

Mäusen verschwand, konnten paraventrikuläre Reaktionen um den vierten Ventrikel

bis zum 196. Versuchstag bei SJL-Mäusen nachgewiesen werden. Eine deutliche

Gliose und perivaskuläre Infiltrate lagen im Stammhirn, beginnend am 7. Tag pi und

im Rückenmark, beginnend am 14. Tag pi von infizierten SJL-Mäusen bis zum 196.

Tag pi vor.

Abgesehen von geringgradigen Gliosen im Bereich des Stichkanals (Infektionsstelle)

im Thalamus und Hypothalamus am 7. Versuchstag konnten keine

Entzündungsreaktionen bei den Plazebo-Tieren nachgewiesen werden.

Mittels LFB-KV-Färbung fand sich bei infizierten SJL-Mäusen eine ausgeprägte

Demyelinisierung um den vierten Ventrikel am 56. Versuchstag. Während der Grad

der Entmarkung in dieser Region im weiteren zeitlichen Verlauf abnahm, kam es zu

einem zunehmenden Myelinverlust in der weißen Substanz des Stammhirns und

Rückenmarks, welcher bis zum Versuchsende (196. Tag pi) nachweisbar war.

50 Ergebnisse

Bei TMEV-infizierten C57BL/6-Mäusen und Plazebo-Tieren konnten keine

Demyelinisierungen nachgewiesen werden.

4.2 Immunphänotypisierung der Entzündungsreaktion empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäusestämme unter spezieller Berücksichtigung regulatorischer T-Zellen

4.2.1 Großhirn

4.2.1.1 CD3+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

Die immunhistochemische Untersuchung des Großhirns wies die CD3+ T-Zellen als

den dominierenden Entzündungszelltyp beider infizierter Mäusestämme aus.

Zudem fand sich eine vergleichbare Anzahl CD3+ T-Zellen in den entzündlichen

Infiltraten infizierter SJL- und C57BL/6-Mäuse. Mittels Kruskal-Wallis-Test über den

zeitlichen Verlauf zeigten die Plazebo SJL- und C57BL/6-Mäuse in keiner

untersuchten Lokalisation signifikante Unterschiede. In allen Lokalisationen mit

Ausnahme der meningealen Infiltrate der infizierten C57BL/6-Mäuse fanden sich

signifikante Unterschiede über den zeitlichen Verlauf bei den TMEV-infizierten

Mäusen. Auf Grund der hohen Anzahl CD3+ T-Zellen in der akuten Phase (7. -

14.Tag pi) waren in nahezu allen untersuchten Lokalisationen signifikante

Unterschiede bei dem Kruskal-Wallis-Test über die vier Gruppen (SJLinfiziert,

C57BL/6infiziert, SJLPlazebo, C57BL/6Plazebo) ermittelbar. In der chronischen Phase (56. –

196.Tag pi) waren nur noch wenige CD3+ T-Zellen nachweisbar, somit konnten keine

weiteren signifikanten Unterschiede an den einzelnen Untersuchungszeitpunkten

nach Anwendung des Kruskal-Wallis-Test detektiert werden.

In der akuten Phase der Infektion (7. – 14. Tag pi) zeigten beide infizierte

Mäusestämme in den meningealen Infiltraten deutlich erhöhte prozentuale Werte

CD3+ T-Zellen, die im paarweisen Vergleich mittels Mann-Whitney-U-Test zu den

Plazebo-Tieren signifikant erhöht waren. Am 56. Tag pi sanken diese Zahlen deutlich

Ergebnisse 51

ab, am 98. und 196. Versuchstag waren kaum noch CD3+ T-Zellen detektierbar (s.

Anhang, Tab. 4).

Innerhalb der perivaskulären Infiltrate des Cortex cerebri und des Corpus callosum

konnte für beide Mäusestämme eine identisch hohe Anzahl CD3+ T-Zellen am 7. Tag

pi nachgewiesen werden. Der paarweise Vergleich mittels Mann-Whitney-U-Test

zeigte, dass die Werte der TMEV-infizierten Mäuse zu diesem Zeitpunkt signifikant

gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht waren. Hiernach fiel die Anzahl der

CD3+ T-Zellen in den perivaskulären Infiltraten deutlich ab. Am 56. Tag pi waren

keine entzündlichen Infiltrate darstellbar (s. Anhang, Tab. 4).

Auch in den perivaskulären Infiltraten innerhalb der Hippocampusformation fand sich

bei dem paarweisen Vergleich in der frühen, akuten Phase (7. – 14. Tag pi) eine

signifikante Erhöhung CD3+ T-Zellen bei infizierten SJL- und C57BL/6-Mäusen im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Am 56. Tag pi konnte bei keinem der

Mäusestämme perivaskuläre Infiltrate innerhalb des Hippocampus nachgewiesen

werden (s. Abb. 6, Anhang, Tab. 4).

In der paraventrikulären Substanz des Großhirns konnte eine konstante Prozentzahl

an CD3+ T-Zellen in den perivaskulären Infiltraten am 7. und 14. Versuchstag für

beide Mäusestämme verzeichnet werden. Der Mann-Whitney-U-Test zeigte am 7.

Versuchstag signifikant erhöhte Werte CD3+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen

im Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen konnten

signifikant erhöhte Prozentzahlen nur am 14. Tag pi nachgewiesen werden. Am 56.

Versuchstag fielen die Werte CD3+ T-Zellen bei beiden TMEV-infizierten

Mäusestämmen deutlich ab. Es fand sich sowohl am 98. als auch am 196.

Versuchstag einzelne CD3+ T-Zellen in den entzündlichen Infiltraten (s. Anhang, Tab.

4).

Die Anzahl CD3+ T-Zellen in den perivaskulären Infiltraten von Thalamus und

Hypothalamus war an den Zeitpunkten 7., 14. und 56. Tag pi für beide

Mäusestämme gleichmäßig stark ausgeprägt. Am 7. und 14. Versuchstag war die

Anzahl der T-Zellen bei den infizierten Mäusestämmen signifikant gegenüber den

Plazebo-Tieren erhöht. Nur in dieser Lokalisation des Großhirns fanden sich bei

52 Ergebnisse

beiden infizierten Mäusepopulationen perivaskuläre Infiltrate bis zum 56. Tag pi (s.

Anhang, Tab. 4).

4.2.1.2 CD3+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

Mittels Kruskal-Wallis-Test über den zeitlichen Verlauf zeigten sich keine

signifikanten Unterschiede bei den Plazebo Mäusen. Bei den infizierten

Mäusestämmen waren in allen Regionen des Großhirns signifikante Unterschiede

über den zeitlichen Verlauf ermittelbar. Der Kruskal-Wallis-Test über alle Grupen an

den einzelnen Untersuchungszeitpunkten ermittelte signifikante Unterschiede in der

Frühphase in allen untersuchten Regionen des Großhirns. Zusätzlich fand sich ein

signifikanter Unterschied am 56. Versuchstag im Corpus callosum.

Nach dem 7. Versuchstag sanken die Werte CD3+ T-Zellen in den parenchymatösen

Läsionen im Cortex cerebri bei beiden Mäusestämmen deutlich ab. Am 7. und 14.

Tag pi zeigten sich mittels paarweisen Vergleichs signifikant erhöhte Werte bei

TMEV-infizierten Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Ab dem 56. Tag pi

konnte in den parenchymatösen Läsionen dieser Lokalisation keine weiteren T-

Zellen ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 5).

Bei infizierten SJL-Mäusen waren vom 7. bis zum 56. Tag pi deutlich erhöhte

Anzahlen CD3+ T-Zellen in den parenchymatösen Läsionen des Corpus callosum zu

verzeichnen. Der paarweise Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass die Werte an diesen

drei Zeitpunkten signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere erhöht waren. Bei

den infizierten C57BL/6-Mäusen zeigten sich im Vergleich zu den Plazebo-Tieren

signifikant erhöhte Werte erst am 14. Versuchstag. Hiernach sanken die Zahlen

deutlich und waren im paarweisen Test somit am 56. Tag pi signifikant erniedrigt im

Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen. In der Spätphase der TMEV-Infektion (98.

und 196. Tag pi) waren keine CD3+ T-Zellen im Corpus callosum detektierbar (s.

Abb. 6 und 7, Anhang, Tab. 5).

Am 56. Versuchstag waren sowohl die infizierten SJL- als auch die infizierten

C57BL/6-Mäuse frei von parenchymatösen Läsionen innerhalb der

Hippocampusformation. Am 7. und 14. Tag pi konnten mittels Mann-Whitney-U-Test

Ergebnisse 53

bei beiden infizierten Mäusestämmen signifikant erhöhte Werte CD3+ T-Zellen im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren ermittelt werden. Zusätzlich fand sich im

paarweisen Test am 7. Versuchstag eine signifikante Erhöhung der T-Zellen bei den

infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 6,

Anhang, Tab. 5).

In den hyperzellulären Bereichen der paraventrikulären Substanz konnte die höchste

Anzahl CD3+ T-Zellen am 7. Tag pi nachgewiesen werden. Bei beiden

Mäusestämmen sanken die Werte hiernach deutlich ab, wobei die Werte der

infizierten Mäuse signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere erhöht waren. Im

weiteren zeitlichen Verlauf konnten in dieser Lokalisation nur noch vereinzelte CD3+

T-Zellen detektiert werden (s. Anhang, Tab. 5).

Innerhalb der parenchymatösen Läsionen von Thalamus und Hypothalamus war die

Anzahl CD3+ T-Zellen für die infizierten Mäusestämme am 7., 14. und 56.

Versuchstag identisch hoch. Während die Anzahl der T-Zellen bei infizierten SJL-

Mäusen am 7. und 14. Versuchstag im paarweisen Test signifikant gegenüber denen

der Plazebo-Mäuse erhöht waren, fand sich bei infizierten C57BL/6-Mäusen nur am

7. Tag pi signifikant erhöhte Werte. Am 14. Versuchstag zeigte sich eine

gleichbleibend große Menge an CD3+ T-Zellen in den hyperzellulären Bereichen der

Plazebo-Mäuse des C57BL/6-Stammes. In der chronischen Phase (98. und 196. Tag

pi) fanden sich lediglich bei den infizierten C57BL/6-Mäusen geringe Mengen an

CD3+ T-Zellen in den Läsionen von Thalamus und Hypothalamus (s. Anhang, Tab.

5).

54 Ergebnisse

Abb. 6: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 161), 14.Tag pi, CD3-Immunhistologie (DAB). CD3+ T-Zellen in perivaskulären Infiltraten (Pfeile) und in parenchymatösen Läsionen (Dreieck) des Hippocampus und Corpus callosum (Pfeilspitzen). Balken: 250 µm.

Abb. 7: CD3+ T-Zellen innerhalb des Corpus callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

6a

Ergebnisse 55

4.2.1.3 CD45R/B220+ B-Zellen in perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

Die mittels immunhistologischen Färbeverfahren nachgewiesenen B-Zellen stellten

zusammen mit den regulatorischen T-Zellen die zweithöchste Zellpopulation

innerhalb der entzündlichen Alterationen des Großhirns nach den CD3+ T-Zellen dar.

Es fand sich ein ähnliches Verteilungsbild wie bei den CD3+ T-Zellen.

Über den zeitlichen Verlauf zeigten sich mittels Kruskal-Wallis-Test bei den Plazebo

Tieren keine signifikanten Unterschiede in den meningealen und perivaskulären

Infiltraten. Die Darstellung der infizierten Mäuse wies über den zeitlichen Verlauf

signifikante Unterschiede in allen Kompartimenten des Großhirns auf, mit Ausnahme

der perivaskulären Infiltrate in der paraventrikulären Substanz. Hier fanden sich bei

beiden infizierten Mäusestämme nur sehr wenige B-Zellen. In den perivaskulären

Infiltraten des Thalamus und Hypothalamus konnten über den zeitlichen Verlauf

signifikante Unterschiede bei den C57BL/6-Mäusen dargstellt werden. Der Kruskal-

Wallis-Test aller vier Gruppen zu den einzelnen Untersuchungszeitpunkten wies

signifikante Unterschiede in allen meningealen und perivaskulären Infiltraten am 7.

Tag pi nach. Am 14. Versuchstag waren nur noch in meningealen Infiltraten sowie in

den perivaskulären Infiltraten des Hippocampus signifikante Unterschiede zwischen

den vier Gruppen nachweisbar.

Innerhalb der meningealen Infiltrate wurden am 7. und 14. Versuchstag identisch

hohe Werte von B-Zellen ermittelt, die im paarweisen Mann-Whitney-U-Test im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren signifikant erhöht waren. Bei beiden

Mäusestämmen fielen diese Werte am 56. Versuchstag deutlich ab, sie waren bis in

die chronische Spätphase (196. Tag pi) hinein detektierbar, jedoch nur noch in sehr

geringer Ausprägung (s. Anhang, Tab. 6).

Innerhalb der perivaskulären Infiltrate von Cortex cerebri und Corpus callosum

zeigten sich vergleichbar hohe Anzahlen an B-Zellen am 7. Versuchstag bei beiden

infizierten Mäusestämmen, diese waren bei infizierten SJL-Mäusen im paarweisen

Vergleich signifikant gegenüber den Plazebo-Tieren erhöht. Hiernach sanken die

56 Ergebnisse

Zahlen bei beiden infizierten Mäusestämmen deutlich ab. Am 56. Versuchstag waren

keine perivaskulären Infiltrate in diesen Lokalisationen mehr nachweisbar (s.

Anhang, Tab. 6).

Die perivaskulären Infiltrate des Hippocampus zeigten am 7. und 14. Tag pi identisch

hohe Werte CD45R/B220+ B-Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen. An beiden

Untersuchungszeitpunkten fanden sich im paarweisen Vergleich signifikant erhöhte

Werte der infizierten Mäusestämme gegenüber den Plazebo-Tieren. Am 56. Tag pi

konnten keine perivaskulären Infiltrate in der Hippocampusformation detektiert

werden (s. Anhang, Tab. 6).

Die Anzahl der B-Zellen war bei beiden infizierten Mäusestämmen in den

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz am 7. Versuchstag erhöht,

jedoch konnten nur bei infizierten SJL-Mäusen mittels Mann-Whitney-U-Test

signifikante Unterschiede im Vergleich zu den Plazebo-Tieren ermittelt werden. Die

Werte der infizierten Mäuse blieben am 14. Tag pi auf einem vergleichbar erhöhten

Niveau. Am 56. Versuchstag fanden sich keine CD45R/B220+ B-Zellen. Bis in die

chronische Spätphase (98. und 196. Versuchstag) hinein waren vereinzelte B-Zellen

bei beiden infizierten Mäusestämmen nachweisbar (s. Anhang, Tab. 6).

Die perivaskulären Infiltrate von Thalamus und Hypothalamus zeigten vom 7. bis

zum 56. Tag pi identisch hohe Werte CD45R/B220+ B-Zellen bei beiden

Mäusestämmen. Jedoch waren die Werte im paarweisen Vergleich nur am 7. Tag pi

signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere erhöht. Nach dem 56. Versuchstag

konnten keine B-Zellen in den perivaskulären Infiltraten nachgewiesen werden (s.

Anhang, Tab. 6).

4.2.1.4 CD45R/B220+ B-Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

Im Corpus callosum wiesen die infizierten SJL-Mäuse eine deutliche Infiltration

CD45R/B220+ B-Zellen auf, wohingegen bei infizierten C57BL/6-Mäusen nur wenige

B-Zellen ermittelt werden konnten.

In allen untersuchten Regionen des Großhirns fanden sich über den zeitlichen

Verlauf mittels Kruskal-Wallis-Test signifikante Unterschiede in hyperzellulären

Ergebnisse 57

Arealen beider infizierter Mäusestämme. Auf Grund der geringen Zellzahl bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen konnte kein signifikanter Unterschied über den zeitlichen

Verlauf im Corpus callosum ermittelt werden. Bei den Plazebo Tieren fanden sich

ebenfalls keine signifikanten Unterschiede über den zeitlichen Verlauf. Der Kruskal-

Wallis-Test aller vier Gruppen an den einzelnen Untersuchungszeitpunkten wies

signifikante Unterschiede in allen untersuchten Lokalisationen in der Frühphase (7. -

14. Tag pi) auf. Lediglich in hyperzellulären Arealen des Corpus callosum waren im

Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich noch signifikante Unterschiede am 56. Tag pi

ermittelbar.

Während die Menge CD45R/B220+ B-Zellen in den parenchymatösen Läsionen des

Cortex cerebri noch am 7. Tag pi bei beiden Mäusestämmen gleich hoch und hier im

paarweisen Vergleich signifikant im Vergleich zu den Plazebo-Tieren erhöht waren,

sanken die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen am 14. Tag pi deutlich ab. Sie

waren an diesem Versuchstag im Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen signifikant

erniedrigt. Die Werte der infizierten SJL-Mäuse waren zu diesem Zeitpunkt signifikant

gegenüber den Plazebo-Tieren erhöht. Ab dem 56. Tag pi fanden sich keine weiteren

immunhistologisch positiven B-Zellen bei beiden Mäusestämmen (s. Anhang, Tab.

7).

Mittels Mann-Whitney-U-Test zeigte sich innerhalb der intraparenchymatösen

Läsionen des Corpus callosum am 7., 14. und 56. Versuchstag signifikant erhöhte

Werte von B-Zellen bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den infizierten

C57BL/6-Mäusen und den Plazebo SJL-Mäusen. Bei infizierten C57BL/6-Mäusen

waren in der akuten Phase der TMEV-Infektion (7. und 14. Tag pi) nur geringgradig

erhöhte Werte CD45R/B220+ B-Zellen ermittelbar. Ab dem 56. Tag pi konnten bei

den infizierten C57BL/6-Mäusen keine immunhistologisch positiven Zellen detektiert

werden. Bei infizierten SJL-Mäusen war dies ab dem 98. Tag pi feststellbar (s. Abb. 8

und 9, Anhang, Tab. 7).

In der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) fanden sich signifikant erhöhte Werte von B-

Zellen in den intraparenchymatösen Läsionen des Hippocampus der infizierten SJL-

Mäuse im Vergleich zu den C57BL/6-Mäusen und auch im Vergleich zu den

Plazebo-Mäusen des SJL-Stammes. Bei infizierten C57BL/6-Mäusen konnten

58 Ergebnisse

signifikant erhöhte Mengen von B-Zellen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren am 7.

und 14. Versuchstag detektiert werden. Nach dem 14. Tag pi waren nur noch bei

infizierten SJL-Mäusen geringe Mengen CD45R/B220+ B-Zellen ermittelbar (s. Abb.

8 und 10, Anhang, Tab. 7).

In den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz sowie von

Thalamus und Hypothalamus konnten am 7. und 14. Versuchstag mittels paarweisen

Mann-Whitney-U-Tests signifikant erhöhte Werte bei infizierten SJL-Mäusen im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren des gleichen Stammes ermittelt werden. Am 7. Tag

pi fand sich zusätzlich im paarweisen Test eine signifikante Erhöhung der infizierten

SJL-Mäuse im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen. Beide Mäusestämme

zeigten zudem deutlich erhöhte Werte immunhistologisch positiver B-Zellen in der

frühen Phase der TMEV-Infektion (7. und 14. Tag pi). Ab dem 56. Tag pi fanden sich

CD45R/B220+ B-Zellen nur noch bei einzelnen Tieren. Bei infizierten, resistenten

C57BL/6-Mäusen konnte mittels Mann-Whitney-U-Test nur am 7. Tag pi ein

signifikanter Unterschied zu den Plazebo-Tieren nachgewiesen werden (s. Anhang,

Tab. 7).

Abb. 8: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 156), 7. Tag pi, CD45R/B220-Immunhistologie (DAB). 8a: CD45R/B220+ B-Zellen in parenchymatösen Läsionen (Stern) und Corpus callosum (Pfeil), Balken: 250 µm. 8b: Nachweis CD45R/B220+ B-Zellen in parenchymatösen Läsionen (Dreiecke) der paraventrikulären Substanz. Balken: 100 µm.

8a 8b

Ergebnisse 59

Abb. 10: CD45R/B220+ B-Zellen im Hippocampus.

Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 9: CD45R/B220+ B-Zellen im Corpus callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

60 Ergebnisse

4.2.1.5 CD25+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

In den untersuchten Lokalisationen des Großhirns konnte nur in der akuten Phase

(7. – 14. Tag pi) wenige CD25+ T-Zellen detektiert werden.

In den meningealen und perivaskulären Infiltraten fanden sich nur wenige CD25+ T-

Zellen bei beiden Mäusestämmen. Mittels Kruskal-Wallis-Test konnten über den

zeitlichen Verlauf signifikante Unterschiede in den meningealen Infiltraten bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen ermittelt werden. Ebenso fanden sich signifikante

Unterschiede in den perivaskulären Infiltraten des Cortex cerebri und des Thalamus

und Hypothalamus beider infizierter Mäusestämme, sowie in den perivaskulären

Infiltraten des Hippocampus bei den infizierten SJL-Mäusen. Bei dem auf

Untersuchungszeitpunkte bezogenen Kruskal-Wallis-Test fand sich in allen

Lokalisationen mit Ausnahme der perivaskulären Infiltrate der paraventrikulären

Substanz in der akuten Frühphase (7. Tag pi) signifikante Unterschiede zwischen

den Gruppen.

Bis zum 14. Tag pi wiesen beide Mäusestämme identische Anzahlen CD25+ T-Zellen

in den meningealen Infiltraten auf. Diese waren im paarweisen Vergleich zu den

Plazebo-Tieren bei beiden Mäusestämmen signifikant erhöht. Ab dem 56. Tag bis

zum 98. Tag pi waren nur noch bei empfänglichen SJL-Mäusen erhöhte Werte der

CD25+ T-Zellen feststellbar (s. Anhang, Tab. 8).

In den perivaskulären Infiltraten des Cortex cerebri, des Corpus callosum und des

Hippocampus konnten nur in der frühen akuten Krankheitsphase wenige CD25+ T-

Zellen bei den TMEV-infizierten, empfänglichen SJL-Mäusen nachgewiesen werden

(s. Anhang, Tab. 8). Am 7., 14 und 56. Versuchstag fanden sich in den

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz nur bei den infizierten,

resistenten C57BL/6-Mäusen wenige CD25+ T-Zellen (s. Anhang, Tab. 8). Die

perivaskulären Infiltrate von Thalamus und Hypothalamus wiesen am 7. Tag pi

wenige CD25+ T-Zellen bei beiden Mäusestämmen auf. Am 14. Versuchstag konnte

Ergebnisse 61

nur noch bei infizierten C57BL/6-Mäusen wenige immunhistologisch positive Zellen

ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 8).

4.2.1.6 CD25+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

Mittels Kruskal-Wallis-Test über den zeitlichen Verlauf fanden sich lediglich im

Corpus callosum signifikante Unterschiede bei den infizierten SJL-Mäusen über den

zeitlichen Verlauf. Der Gruppenvergleich mittels Kruskal-Wallis-Test konnte nur im

Corpus callosum am 7. Versuchstag signifikante Unterschiede ermitteln.

In den parenchymatösen Läsionen des Cortex cerebri, des Corpus callosum, des

Hippocampus, der paraventrikulären Substanz und des Thalamus und Hypothalamus

konnten nur wenige CD25+ T-Zellen am 7. Tag pi bei infizierten SJL-Mäusen

detektiert werden. Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen und den Plazebo-Tieren

konnten keine CD25+ T-Zellen in den oben genannten Lokalisationen nachgewiesen


4.2.1.7 Foxp3+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

Während sich in den entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten in der

Frühphase (7. Tag pi) der TMEV-Infektion vergleichbar hohe Werte regulatorischer T-

Zellen (Treg) bei den infizierten Mäusestämmen fanden, wiesen die hyperzellulären

Bereiche der infizierten SJL-Mäuse im Großhirn in der frühen Phase (7. und 14. Tag

pi) eine überwiegende Dominanz der immunhistologisch positiven Zellen auf.

Während in den meningealen Infiltraten und den perivaskulären Infiltraten der

übrigen Regionen mittels Kruskal-Wallis-Test über den zeitlichen Verlauf signifikante

Unterschiede bei beiden infizierten Mäusestämmen ermittelt werden konnten, wiesen

die perivaskulären Infiltrate des Corpus callosum und des Thalamus und

Hypothalamus über den zeitlichen Verlauf eine konstante Ansammlung

regulatorischer T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen auf. Es konnte daher in

diesen Regionen keine signifikanten Unterschiede bei diesem Mäusestamm ermittelt

62 Ergebnisse

werden. Der Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich detektierte signifikante Unterschiede

am 7. Versuchstag in allen Lokalisationen. In perivaskulären Infiltraten des Cortex

cerebri und Corpus callosum sank hiernach die Anzahl regulatorischer T-Zellen,

weshalb nur in diesen Lokalisationen keine signifikanten Unterschiede am 14.

Versuchtag nachgewiesen werden konnte.

In den meningealen Infiltraten fanden sich identisch hohe Werte von Treg beider

Mäusestämme am 7. Versuchstag. Im paarweisen Vergleich waren die Werte der

infizierten Mäuse signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht. Während

beide infizierte Mäusestämme am 14. Tag pi signifikant erhöhte Werte im Vergleich

zu den Plazebo-Mäusen zeigten, fanden sich zusätzlich signifikant erhöhte Werte der

infizierten C57BL/6-Mäuse im Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen. Bis in die

chronische Spätphase (196. Tag pi) konnten geringe Mengen von Treg bei beiden

infizierten Mäusepopulationen ermittelt werden (s. Abb. 11 und 12, Anhang, Tab. 10).

Die infizierten SJL-Mäuse zeigten in den perivaskulären Infiltraten des Cortex cerebri

mittels Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung der Treg am 7. Tag pi im

Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen. Die Werte beider infizierter

Mäusestämme waren zu diesem Zeitpunkt signifikant gegenüber denen der Plazebo-

Mäuse erhöht. Nur am 14. Tag pi fanden sich noch geringe Mengen regulativ aktiver

T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen (s. Anhang, Tab. 10).

In perivaskulären Infiltraten des Corpus callosum war die Anzahl an Treg am 7 Tag pi

bei den infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere

und denen der infizierten SJL-Mäuse erhöht. Im weiteren zeitlichen Verlauf (14. –

196. Tag pi) konnten keine immunhistologisch positiven Zellen detektiert werden (s.

Anhang, Tab. 10).

Die perivaskulären Infiltrate innerhalb der Hippocampusformation wiesen am 7. und

14. Versuchstag eine vergleichbar hohe Zahl an Treg bei beiden infizierten

Mäusepopulationen auf. Es zeigte sich im Mann-Whitney-U-Test eine signifikante

Erhöhung der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren an beiden Zeitpunkten, während die Werte der infizierten C57BL/6-Mäuse nur

am 7. Tag pi signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht waren. Bis zum

Ergebnisse 63

Ende der Messungen (196. Tag pi) konnten keine weiteren Treg detektiert werden (s.

Anhang, Tab. 10).

Am 7. Tag pi fand sich bei beiden infizierten Mäusestämmen vergleichbar hohe

Werte von Treg in den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz. Am

14. Versuchstag war die Anzahl immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen im paarweisen Vergleich signifikant gegenüber denen der Plazebo-

Mäuse und denen der infizierten SJL-Mäuse erhöht (s. Anhang, Tab. 10).

In den perivaskulären Infiltraten von Thalamus und Hypothalamus zeigte sich eine

vergleichbar hohe Anzahl an Treg am 7. und 14. Versuchstag bei beiden infizierten

Mäusestämmen. Die Werte der infizierten C57BL/6-Mäuse waren im paarweisen

Vergleich an beiden Untersuchungszeitpunkten signifikant gegenüber denen der

Plazebo-Mäuse erhöht. Die Werte der infizierten SJL-Mäuse zeigten eine signifikante

Erhöhung im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen am 7. Tag pi. Bis zum 98.

Versuchstag waren einzelne positive Zellen in den entzündlichen Infiltraten der

infizierten SJL-Mäuse ermittelbar (s. Anhang, Tab. 10).

4.2.1.8 Foxp3+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

Es zeigten sich mittels Kruskal-Wallis-Test über den zeitlichen Verlauf in den

intraparenchymatösen Läsionen aller Regionen signifikante Unterschiede bei den

infizierten Mäusen beider Stämme. Weiterhin konnten in der akuten Phase (7. – 14.

Tag pi) signifikante Unterschiede mittels Kruskal-Wallis-Test zwischen den Gruppen

ermittelt werden.

In den parenchymatösen Läsionen von Cortex cerebri und Corpus callosum zeigte

sich im paarweisen Vergleich am 7. Versuchstag eine signifikante Erhöhung der Treg

bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen. Die

Werte der infizierten SJL-Mäuse waren am 14. Tag pi deutlich gesunken. Die Anzahl

von Treg bei den infizierten Mäusen war an beiden Versuchstagen signifikant

gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht. Zu keinem weiteren Zeitpunkt fanden

sich immunhistologisch positive Zellen in den Läsionen dieser Gehirnregion (s. Abb.

11, Anhang, Tab. 11).

64 Ergebnisse

In den parenchymatösen Läsionen der Hippocampusformation waren in der akuten

Phase der TMEV-Infektion (7. und 14. Tag pi) keine Abweichung der Anzahl an Treg

bei den infizierten SJL- und C57BL/6-Mäusen feststellbar. An beiden Tagen waren

die Werte der infizierten Mäuse im paarweisen Test signifikant erhöht im Vergleich zu

den Plazebo-Mäusen (s. Anhang, Tab. 11).

Während sich am 7. Tag pi mittels Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Mengen

von Treg bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen in

den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz fanden, waren die

Werte bei beiden Mäusestämmen am 14. Versuchstag vergleichbar hoch. An beiden

Tagen war die Anzahl der Treg signifikant gegenüber der der Plazebo-Mäuse erhöht.

Am 56. Tag pi waren noch einzelne immunhistologisch positive Zellen bei den

infizierten SJL-Mäusen detektierbar (s. Anhang, Tab. 11).

In den parenchymatösen Läsionen von Thalamus und Hypothalamus waren am 7.

und 14. Tag pi identisch hohe Werte von Treg bei beiden infizierten Mäusestämmen

zu finden. Mittels paarweisen Vergleich des Mann-Whitney-U-Tests konnte

festgestellt werden, dass die Werte der infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den

Plazebo-Mäusen an beiden Untersuchungszeitpunkten signifikant erhöht waren. Bei

den infizierten C57BL/6-Mäusen fanden sich signifikant erhöhte Werte nur am 7. Tag

pi. Bis zum 98. Tag pi fanden sich bei den infizierten Mäusen geringe Mengen von

Treg (s. Anhang, Tab. 11).

Abb. 11: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 156), 7. Tag pi, Foxp3-Immunhistologie (DAB). 11a: Nachweis Foxp3+ Zellen in meningealen Infiltraten (Stern). Balken: 20 µm. 11b: Foxp3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen des Corpus callosum (Pfeile). Balken: 50 µm.

11a 11b

Ergebnisse 65

4.2.1.9 CD107b+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

In den meningealen und perivaskulären Infiltraten der untersuchten Lokalisationen

des Großhirns fanden sich bei beiden Mäusestämmen deutlich weniger CD107b+

Zellen im Vergleich zu den intraparenchymatösen Läsionen.

Mittels Kruskal-Wallis-Test über den zeitlichen Verlauf und im Gruppenvergleich an

einzelnen Untersuchungszeitpunkten konnten nur wenige signifikante Unterschiede

in den entzündlichen Infiltraten des Großhirns detektiert werden. Dies konnte auf die

geringe Anzahl CD107b+ Zellen in den meningealen und perivaskulären Infiltraten in

der Frühphase (7. - 14. Tag pi) zurückgeführt werden (s. Anhang, Tab. 12).

Während nur bis zum 56. Versuchstag einzelne CD107b+ Zellen in den meningealen

Infiltraten des Großhirns bei den infizierten SJL-Mäusen detektiert werden konnten,

wiesen die infizierten C57BL/6-Mäuse am 7. Tag pi eine deutlich erhöhte Anzahl an

Abb. 12: Foxp3+ Zellen in entzündlichen meningealen Infiltraten des Großhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

66 Ergebnisse

Makrophagen auf. Der paarweise Mann-Whitney-U-Test ergab, dass diese zu dem

untersuchten Zeitpunkt sowohl signifikant gegenüber den Plazebo-Tieren des

gleichen Stammes als auch gegenüber den infizierten SJL-Mäusen erhöht waren.

Hiernach wiesen die infizierten C57BL/6-Mäuse lediglich am 196. Tag pi geringe

Mengen CD107b+ Zellen auf (s. Anhang, Tab. 12).

Die perivaskulären Infiltrate innerhalb des Cortex cerebri zeigten bei beiden

Stämmen nur in der frühen, akuten Phase (7. Tag pi) eine geringgradig erhöhte

Anzahl der CD107b+ Zellen (s. Anhang, Tab. 12).

In den perivaskulären Infiltraten des Corpus callosum zeigten die infizierten SJL-

Mäuse nur am 7. Tag pi eine deutlich erhöhte Zahl CD107b+ Zellen, die im

paarweisen Vergleich gegenüber den Plazebo-Tieren signifikant erhöht waren. Die

infizierten, resistenten C57BL/6-Mäuse wiesen in der akuten Frühphase (7. Tag pi)

lediglich einzelne Makrophagen auf. Im weiteren Verlauf der TMEV-Infektion waren

bei beiden Mäusestämmen keiner Makrophagen in den entzündlichen Infiltraten

messbar (s. Anhang, Tab. 12).

Bis zum 14. Tag pi konnte für die infizierten, empfänglichen SJL-Mäuse und für die

infizierten, resistenten C57BL/6-Mäuse eine gleichwertige Anzahl CD107b+ Zellen in

den perivaskulären Infiltraten der Hippocampusformation dargestellt werden. Am 14.

Versuchstag zeigte sich im paarweisen Test eine signifikante Erhöhung der Menge

CD107b+ Zellen bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Am

56. Versuchstag war die Hippocampusformation frei von perivaskulären Infiltraten (s.

Anhang, Tab. 12).

In den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz fanden sich bei

infizierten C57BL/6-Mäusen am 7. und 14. Tag pi einzelne CD107b+ Zellen, bei

infizierten SJL-Mäusen hingegen nur am 7. Versuchstag.

Die infizierten C57BL/6-Mäuse zeigten bis zum 56. Versuchstag geringe Mengen von

Makrophagen in den perivaskulären Infiltraten von Thalamus und Hypothalamus, am

7. Tag pi war die Anzahl im paarweisen Vergleich signifikant gegenüber denen der

Plazebo-Tieren erhöht. Bei infizierten SJL-Mäusen waren bis zum 98. Tag pi

vereinzelte CD107b+ Zellen detektierbar.

Ergebnisse 67

4.2.1.10 CD107b+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

Über den zeitlichen Verlauf fanden sich mittels Kruskal-Wallis-Test in nahezu allen

hyperzellulären Arealen des Großhirns signifikante Unterscheide bei beiden

infizierten Mäusestämmen. Einzige Ausnahmen hiervon waren wenige CD107b+

Zellen im Corpus callosum infizierter C57BL/6-Mäuse und in der paraventrikulären

Region bei infizierten SJL-Mäusen. Der Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich an

einzelnen Untersuchungszeitpunkten erbrachte wiederum das Ergebnis signifikanter

Unterschiede in der akuten Frühphase (7. – 14. Tag pi) in nahezu allen untersuchten

Lokalisationen. Auch hier wies nur das Corpus callosum signifikante Unterschiede

bis in die frühe chronische Phase auf (56. Versuchstag).

Am 7. Versuchstag waren, mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test ermittelt,

signifikant erhöhte Anzahlen CD107b+ Zellen in den parenchymatösen Läsionen des

Cortex cerebri bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren

nachweisbar. Wenige CD107b+ Zellen konnten anschließend noch bei infizierten

SJL-Mäusen am 14. Versuchstag und am 56. Versuchstag bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen detektiert werden (s. Anhang, Tab. 13).

In den parenchymatösen Läsionen des Corpus callosum fanden sich am 7., 14. und

56. Tag pi signifikant erhöhte Werte CD107b+ Zellen in infizierten SJL-Mäusen

sowohl im Vergleich zu Plazebo-Tieren, als auch zu infizierten C57BL/6-Mäusen.

Nach dem 56. Versuchstag konnten bei beiden Mäusestämme keine

Makrophagen/Mikroglia angefärbt werden. Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen fand

sich nur in der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) einzelne CD107b+ Zellen (s. Abb. 13


Die infizierten SJL-Mäuse wiesen im paarweisen Test am 7. und 14. Tag pi

signifikant erhöhte Werte CD107b+ Zellen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und

den infizierten C57BL/6-Mäusen in den intraparenchymatösen Läsionen des

Hippocampus auf. Am 56. Versuchstag waren noch vereinzelte CD107b+ Zellen bei

dem infizierten SJL-Stamm messbar. Am 7. Tag pi wiesen auch die infizierten

C57BL/6-Mäuse signifikant erhöhte Werte CD107b+ Zellen im Vergleich zu den

68 Ergebnisse

Plazebo-Tieren des gleichen Stammes auf. Hiernach fanden sich nur noch einzelne

Makrophagen/Mikroglia am 56. Versuchstag (s. Anhang, Tab. 13).

In den hyperzellulären Bereichen der paraventrikulären Substanz wiesen im

paarweisen Test nur die infizierten C57BL/6-Mäuse am 7. Tag pi signifikant erhöhte

Werte CD107b+ Zellen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren auf. Die infizierten SJL-

Mäusen zeigten in der akuten Phase der TMEV-Infektion (7. und 14. Tag pi) einzelne

CD107b+ Zellen (s. Anhang, Tab. 13).

In den parenchymatösen Läsionen von Thalamus und Hypothalamus zeigte sich

noch am 7. Versuchstag eine vergleichbar hohe Anzahl CD107b+ Zellen in beiden

infizierten Mäusestämmen. Mittels Mann-Whitney-U-Test detektiert, war am 14. Tag

pi die Menge der CD107b+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant

gegenüber denen der infizierten SJL-Mäuse erhöht. Am 56. Tag pi war das

Verhältnis der immunhistologisch nachgewiesenen Zellen wiederum gleichmäßig

hoch und bis in die chronische Spätphase (196. Tag pi) hinein in geringer Menge

nachweisbar.

Abb. 13: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 180), 56.Tag pi, CD107b-Immunhistologie (DAB). 13a: Akkumulation von CD107b+ Zellen in parenchymatösen Läsionen des Corpus callosum (Pfeilspitzen). Balken: 100 µm. 13b: Vergrößerung von 13a, Gitterzellmorpholgie (Pfeile) der CD107b+ Zellen. Balken: 20 µm.

13b 13a

Ergebnisse 69

4.2.1.11 GFAP+ Astrozyten in den hyperzellulären Arealen des Großhirns

Der immunhistologische Nachweis von GFAP+ Zellen erbrachte ein gleichwertiges

Verhältnis der immunhistologisch markierten Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämmen in den parenchymatösen Läsionen der meisten Lokalisationen

(Cortex cerebri, Hippocampus und paraventrikuläre Substanz). Nach Abklingen der

lymphohistiozytären Entzündung im Großhirn konnte zudem eine deutlich basale

Expression sowohl bei den Plazebo-Tieren als auch bei den infizierten Mäusen

beider Stämme ermittelt werden.

Über den zeitlichen Verlauf fanden sich mittels Kruskal-Wallis-Test nachgewiesen, in

unterschiedlichen Regionen des Großhirns signifikante Unterschiede sowohl bei den

infizierten als auch bei den Plazebo-Tieren (s. Anhang, Tab. 14). Besonders im

Thalamus und Hypothalamus konnte eine nahezu konstant deutlich ausgeprägte

Astrogliose in allen vier Gruppen über den zeitlichen Verlauf dargestellt werden. Der

Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich an den einzelnen Untersuchungszeitpunkten zeigte

Abb. 14: CD107b+ Zellen im Corpus Callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

70 Ergebnisse

in allen Lokalisationen signifikante Unterschiede in der Frühphase (7. – 14. Tag pi).

In der chronischen Phase waren nur noch signifikante Unterschiede im Corpus

callosum (56. Tag pi) und Hippocampusformation (56. und 196. Tag pi) ermittelbar.

Mittels Mann-Whitney-U-Test konnte innerhalb des Cortex cerebri für die infizierten

SJL-Mäuse an dem 7. und 14 Versuchstag, und für die infizierten C57BL/6-Mäuse

am 7. Versuchstag signifikante Unterschiede der Anzahl GFAP+ Zellen im Vergleich

zu den Plazebo-Tieren des gleichen Stammes ermittelt werden. Nach dem 14.

Versuchstag zeigte sich ein deutlicher Abfall der Astrogliose sowohl bei den

infizierten Mäusen als auch bei den Plazebo-Tieren. Bis zum Ende der Messungen

fand sich eine geringe basale Expression GFAP+ Astrozyten in den vier Gruppen (s.

Anhang, Tab. 14).

Während bei den infizierten C57BL/6-Mäusen und den Plazebo C57BL/6-Mäusen

eine konstante Anzahl Astrozyten im Corpus callosum nachweisbar war, zeigten die

infizierten SJL-Mäusen im paarweisen Mann-Whitney-U-Test bis zum 56. Tag pi

signifikant erhöhte Werte GFAP+ Zellen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Die

Werte der infizierten SJL-Mäuse waren auch am 7. und 56. Versuchstag signifikant

gegenüber den infizierten C57BL/6-Mäusen erhöht. Nach dem 56. Versuchstag

schwächte die Astrogliose bei den infizierten SJL-Mäusen deutlich ab und zeigte das

Niveau der C57BL/6-Mäuse (s. Abb, 15 und 16, Anhang, Tab. 14).

Am 7. und 14. Versuchstag fanden sich nach paarweisen Test in der

Hippocampusformation der infizierten SJL-Mäuse signifikant erhöhte Werte im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Interessanterweise wies diese Region die stärkste

Astrogliose in der chronischen Phase (98. und 196. Versuchstag) bei den infizierten

SJL-Mäusen auf. Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen fanden sich im Mann-Whitney-

U-Test signifikant erhöhte Werte am 14. Tag pi im Vergleich zu den Plazebo

Mäusen. Am 56. Versuchstag waren die Werte gesunken und blieben bis zum Ende

der Messungen auf einem konstant hohen Niveau (s. Abb. 15, Anhang, Tab. 14).

In der paraventrikulären Substanz fanden sich am 7. und 14. Tag pi signifikant

erhöhte Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo

Mäusen. Bei den infizierten SJL-Mäusen war dies nur am 7. Versuchstag

Ergebnisse 71

nachweisbar. Die Astrogliose war in der gesamten chronischen Phase (56. – 196.

Tag pi) auf einem konstant niedrigen Niveau (s. Anhang, Tab. 14).

Nur im Thalamus und Hypothalamus fand sich im paarweisen Test eine signifikante

Dominanz GFAP+ Zellen am 14. Tag pi bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im

Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen und den Plazebo-Tieren des gleichen

Stammes. Obwohl die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen zum 56.

Versuchstag deutlich absanken, war eine ausgeprägte Astrogliose, auch bei den

Plazebo-Tieren und den infizierten SJL-Mäusen bis in die späte chronische Phase

(196. Tag pi) detektierbar (s. Abb. 17, Anhang, Tab. 14).

72 Ergebnisse

Abb. 15: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 180), 56.Tag pi, GFAP-Immunhistologie (DAB). 15a: Astrogliose im Corpus callosum (Pfeile), Hippocampus (Sterne) und Thalamus/Hypothalamus (Pfeilspitzen). Balken: 2000 µm. 15b: Vergrößerung von 15a. Astrogliose im Corpus callosum (Pfeile) und Hippocampus (Sterne). Balken: 250 µm. 15c: Vergrößerung von 15b. Astrogliose im Corpus callosum (Pfeil) und Hippocampus (Stern). Balken: 20 µm.

15b 15c

15a

Ergebnisse 73

Abb. 16: GFAP+ Zellen im Corpus callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 17: GFAP+ Zellen im Thalamus und Hypothalamus. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.1

74 Ergebnisse

4.2.2 Klein- und Stammhirn

4.2.2.1 CD3+ T-Zellen in den entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn

In allen untersuchten Lokalisationen des Stammhirns und der paraventrikulären

Substanz um den vierten Ventrikel zeigte sich ab dem 56. Versuchstag bis hin in die

späte, chronische Phase (196. Tag pi). eine deutliche Dominanz CD3+ T-Zellen bei

den empfänglichen SJL-Mäusen. In der grauen Substanz des Kleinhirns waren keine

Entzündungszellinfiltrate nachweisbar, in der weißen Substanz des Kleinhirns fanden

sich vereinzelte Infiltrate CD3+ T-Zellen.

Mittels Kruskal-Wallis-Test ergaben sich signifikante Unterschiede über den

zeitlichen Verlauf bei den infizierten C57BL/6-Mäusen in den meningealen Infiltraten

und den perivaskulären Infitraten rund um den vierten Ventrikel sowie in den

perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns. Auf Grund der

konstant hohen Zahl CD3+ T-Zellen in den meningealen Infiltraten von Klein- und

Stammhirn und in den perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz

des Stammhirns konnte bei den infizierten SJL-Mäusen in diesen Lokalisationen

keine signifikanten Unterschiede über den zeitlichen Verlauf ermittelt werden (s.

Anhang Tab. 15). Der Gruppenvergleich wies keine signifikanten Unterschiede in

perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz des Kleinhirns auf. In

meningealen Infiltraten und perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz

waren schon am 7. Tag pi bis zum 98 Tag pi signifikante Unterschiede zwischen den

Gruppen ermittelbar. In der grauen Substanz war die stärkste Infiltration CD3+ T-

Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen am 56. Versuchstag, somit ergab sich nur an

diesem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. In der weißen

Substanz begann die Infiltration von T-Zellen am 14. Versuchstag, es fanden sich im

Gruppenvergleich signifikante Unterschiede beginnend am 14. - 196. Tag pi (s.

Anhang, Tab. 15).

Ergebnisse 75

In den meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns fand sich noch am 7. und

14. Versuchstag ähnlich hohe Prozentzahlen von CD3+ T-Zellen bei beiden

infizierten Mäusestämmen, wobei sich am 7. Tag pi für beide infizierte Stämme im

paarweisen Test signifikante Unterschiede zu ihren Plazebo-Tieren zeigten.

Während die Werte der CD3+ T-Zellen bei infizierten C57BL/6-Mäusen nach dem 14.

Versuchstag kontinuierlich sanken und die Tiere schon ab dem 56. Tag pi frei von

meningealen Infiltraten waren, blieben die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen bis

zum Ende der Messungen (196. Tag pi) auf einem gleichbleibend hohem Niveau. Es

zeigte sich am 56. und 98. Versuchstag mittels Mann-Whitney-U-Test ein

signifikanter Unterschied zwischen den infizierten SJL-Mäusen und Plazebo-Tieren,

wie auch zwischen den infizierten Tieren beider Mäusestämme (s. Anhang, Tab. 15).

In den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels waren am 7. Tag pi vergleichbar hohe Werte CD3+ T-Zellen bei beiden

infizierten Mäusestämmen nachweisbar, es fand sich zu diesem

Untersuchungszeitpunkt, wie auch am 14. Versuchstag ein signifikanter Unterschied

zwischen infizierten Tieren und Plazebo-Mäusen. Nach der akuten Frühphase der

Infektion (7. Tag pi) sanken die Werte CD3+ T-Zellen bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen, so dass am 14., 56. und 98. Tag pi die Werte bei den infizierten SJL-

Mäusen im paarweisen Test signifikant im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-

Mäusen und den Plazebo-Tieren des gleichen Stammes erhöht waren. Am 196.

Versuchstag wies keine der infizierten Mäuse perivaskuläre Infiltrate in der

untersuchten Lokalisation auf (s. Abb. 18, Anhang, Tab. 15).

Nur bei infizierten C57BL/6-Mäusen fanden sich am 7. und 14. Tag pi einzelne CD3+

T-Zellen in den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns. Am

56. Versuchstag erfolgte eine Umkehr der Verhältnisse. Hier war die Anzahl der

CD3+ T-Zellen bei infizierten C57BL/6-Mäusen deutlich abgefallen, während die

Anzahl bei infizierten SJL-Mäusen erheblich angestiegen war. Die Werte der

infizierten SJL-Mäuse waren zu diesem Zeitpunkt signifikant gegenüber derer der

infizierten C57BL/6-Mäuse, sowie der der Plazebo-Mäusen erhöht. Bis in die späte,

chronische Phase der TMEV-Infektion (196. Tag pi) waren erhöhte Werte CD3+ T-

76 Ergebnisse

Zellen bei den infizierten, empfänglichen Mäusen ermittelbar (s. Abb. 18, Anhang,

Tab. 15).

Während des gesamten Verlaufs der TMEV-Infektion konnte in den perivaskulären

Infiltraten der weißen Substanz des Stammhirns nur bei den infizierten SJL-Mäusen

CD3+ T-Zellen detektiert werden. Es zeigte sich eine kontinuierlich hohe Anzahl

CD3+ T-Zellen beginnend am 14. Tag pi bis in die späte, chronische Phase hinein

(196. Tag pi). An den Untersuchungstagen 14., 56. und 98. fanden sich mittels

Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Werte CD3+ T-Zellen bei den infizierten

SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen und den infizierten C57BL/6-

Mäusen (s. Anhang, Tab. 15).

4.2.2.2 CD3+ T-Zellen in den hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

In den hyperzellulären Bereichen der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels beider infizierter Mäusestämme, sowie in der grauen Substanz des

Stammhirns bei den infizierten C57BL/6-Mäusen fand sich in der Frühphase (7. – 14.

Versuchstag) eine hohe Infiltration CD3+ T-Zellen. Diese Werte sanken im weiteren

zeitlichen Verlauf deutlich ab, woraus sich mittels Kruskal-Wallis-Test über den

zeitlichen Verlauf signifikante Unterschiede ergaben (s. Anhang, Tab. 16). In der

Frühphase der Infektion (7. – 14- Tag pi) fanden sich mittels Kruskal-Wallis-

Gruppenvergleich signifikante Unterschiede in hyperzellulären Arealen der

paraventrikulären Substanz und der grauen Substanz des Stammhirns. In der grauen

und weißen Substanz des Stammhirns waren signifikante Unterschiede zwischen

den Gruppen bis zum Ende der Messungen (196. Versuchstag) nachvollziehbar,

wohingegen die Anzahl CD3+ T-Zellen in meningealen Infiltraten nur bis zum 98. Tag

pi signifikant unterschiedlich war.

In den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz rund um den

vierten Ventrikel waren noch am 7. Tag pi vergleichbar hohe Werte CD3+ T-Zellen

bei beiden infizierten Mäusestämmen ermittelbar. Am 14. Versuchstag zeigten die

infizierten C57BL/6-Mäuse einen deutlichen Abfall der Menge CD3+ T-Zellen,

Ergebnisse 77

wohingegen die T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen angestiegen waren, und

nach diesem Untersuchungszeitpunkt (56.- 196. Tag pi) kontinuierlich sanken. Beide

infizierte Mäusestämme wiesen im paarweisen Test einen signifikant erhöhten Wert

CD3+ T-Zellen im Vergleich zu Plazebo-Tieren in der akuten Phase (7. und 14. Tag

pi) der TMEV-Infektion auf. Es zeigte sich, dass am 14., 56. und 98. Tag pi die

Anzahl der T-Zellen in den hyperzellulären Bereichen bei infizierten SJL-Mäusen

signifikant gegenüber den infizierten C57BL/6-Mäusen und den Plazebo-Tieren

erhöht war. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) waren lediglich bei

empfänglichen SJL-Mäusen wenige CD3+ T-Zellen detektierbar (s. Abb. 18, Anhang,

Tab. 16).

Am 7. und 14. Versuchstag war die Menge CD3+ T-Zellen in den parenchymatösen

Läsionen der grauen Substanz des Stammhirns bei beiden infizierten

Mäusestämmen vergleichbar hoch, es fanden sich mittels Mann-Whitney-U-Test

signifikante Unterschiede zu den Plazebo-Mäusen des jeweiligen Stammes. Am 56.

Tag pi waren die CD3+ T-Zellen bei infizierten C57BL/6-Mäusen deutlich gesunken.

Es zeigte sich bis zum 196. Tag pi eine konstant hohe Menge T-Zellen bei infizierten

SJL-Mäusen. So konnten signifikante Unterschiede zwischen den infizierten

Mäusestämmen und den infizierten SJL-Mäusen sowie zwischen den infizierten

Mäusestämmen und den Plazebo-Tieren am 56. und am 196. Versuchstag ermittelt


In den parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz des Stammhirns waren

noch am 7. Versuchstag wenige T-Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen

ermittelbar. Während konstant wenige CD3+ T-Zellen bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen bis zum 196. Tag pi nachgewiesen werden konnten, stieg die Anzahl der T-

Zellen bei den SJL-Mäusen am 14. Versuchstag an, fiel am 98. Tag pi ab und blieb

am 196. Versuchstag auf einem konstanten Wert. Am 56. und 196. Tag pi war die

Menge der CD3+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant gegenüber

derer der infizierten C57BL/6-Mäuse und den Plazebo-Tieren erhöht (s. Abb. 18 und


78 Ergebnisse

18a

18b 18c

Abb. 18: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 179), 56.Tag pi, CD3-Immunhistologie (DAB). 18a: CD3+ T-Zellen in parenchymatösen Läsionen (Sterne) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeile) um den vierten Ventrikel. Balken: 1000 µm. 18b: Vergrößerung von 18a. CD3+ T-Zellen in parenchymatösen Läsionen (Stern) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeil) um den vierten Ventrikel. Balken: 250 µm. 18c: Vergrößerung von 18a. CD3+ T-Zellen in parenchymatösen Läsionen (Stern) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeil) des Stammhirns. Balken: 100 µm.

Ergebnisse 79

4.2.2.3 CD45R/B220+ B-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns

In der frühen Phase (7. und 14. Tag pi) der TMEV-Infektion fanden sich in den

untersuchten Lokalisationen, mit Ausnahme der grauen und weißen Substanz des

Kleinhirns, vergleichbare Werte CD45R/B220+ B-Zellen bei den infizierten

Mäusestämmen. Im weiteren Verlauf der TMEV-Infektion zeigte sich eine deutliche

Dominanz dieser Zellen bei den infizierten, empfänglichen SJL-Mäusen.

Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen fanden sich in den meningealen Infiltraten sowie

in den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz rund um den vierten

Ventrikel eine deutliche Infiltration CD45R/B220+ B-Zellen in der Frühphase (7. – 14.

Tag pi). Hiernach sanken die Werte und es resultierte im Kruskal-Wallis-Test ein

signifikanter Unterschied über den zeitlichen Verlauf. Bei den infizierten SJL-Mäusen

fand sich ebenfalls ein signifikanter Unterschied in den perivaskulären Infiltraten der

paraventrikulären Substanz über den zeitlichen Verlauf, welcher sich aus dem

Abb. 19: CD3+ Zellen in der weißen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

80 Ergebnisse

deutlichen Anstieg der Zellen am 14. Versuchstag erklärt (s. Anhang Tab. 17). Die

deutlichste Infiltration von B-Zellen fand sich in perivaskulären Infiltraten der

paraventrikulären Substanz, somit konnten mittels Kruskal-Wallis-Test signifikante

Unterschiede zwischen den Gruppen vom 7. – 98. Tag pi ermittelt werden. In den

übrigen Lokalisationen fanden sich nur vereinzelte signifikante Unterschiede.

In den meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn zeigte sich eine

vergleichbare Anzahl von B-Zellen bis zum 56. Versuchstag bei beiden infizierten

Mäusestämmen, wobei nur am 7. Tag pi signifikante Unterschiede im paarweisen

Test zu den Plazebo-Tieren ermittelt werden konnte. Während nach diesem

Zeitpunkt bei infizierten C57BL/6-Mäusen keine CD45R/B220+ B-Zellen

nachgewiesen werden konnten, fand sich ab dem 98. Tag pi ein Anstieg bei

infizierten SJL-Mäusen. Es konnte in der chronischen Spätphase der TMEV-Infektion

(196. Tag pi) mittels Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung der Anzahl

immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu

den Plazebo-Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen nachgewiesen werden (s.

Anhang, Tab. 17).


Ventrikels konnte mittels Mann-Whitney-U-Test am 7. Tag pi eine signifikant erhöhte

Anzahl CD45R/B220+ B-Zellen bei infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den

Plazebo-Tieren und infizierten SJL-Mäusen nachgewiesen werden. Im weiteren

zeitlichen Verlauf stiegen die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen an, so dass am

14. Tag pi bei beiden infizierten Mäusestämmen eine signifikante Erhöhung im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren ermittelt werden konnte. Am 56. Versuchstag waren

die Werte der infizierten SJL-Mäuse signifikant über die der infizierten C57BL/6-

Mäuse erhöht. In der chronischen Phase (98. und 196. Tag pi) fanden sich nur noch

einzelne immunhistologisch positive Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen (s. Abb.


In den perivaskulären Infiltraten der grauen und der weißen Substanz des

Stammhirns fanden sich erst am 14. Tag pi wenige CD45R/B220+ B-Zellen bei den

infizierten Mäusestämmen. Am 56. Versuchstag zeigte sich im paarweisen Test eine

signifikante Erhöhung der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den

Ergebnisse 81

Plazebo-Mäusen und den infizierten C57BL/6-Mäusen. Bis in die chronische

Spätphase (196. Tag pi) waren nur wenige B-Zellen in den entzündlichen Infiltraten

nachweisbar (s. Abb. 21, Anhang, Tab. 17).

4.2.2.4 CD45R/B220+ B-Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

Auf Grund der hohen Anzahl CD45R/B220+ B-Zellen am 7. und 14. Versuchstag in

der paraventrikulären Substanz von Klein- und Stammhirn beider infizierter

Mäusestämme konnte in dieser Lokalisation mittels Kruskal-Wallis-Test ein

signifikanter Unterschied über den zeitlichen Verlauf ermittelt werden. In allen

weiteren Regionen fanden sich geringe Unterschiede über den zeitlichen Verlauf (s.

Anhang Tab. 18). Im zeitpunktbezogenen Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich konnte

auf Grund deutlicher Infiltration von B-Zellen bei den infizierten Mäusestämmen

signifikante Unterschiede beginnend am 7. bis 56. Versuchstag ermittelt werden. In

hyperzellulären Arealen der grauen und weißen Substanz des Stammhirns fanden

sich deutliche Infiltrate nur am 56. Versuchstag, so dass auch nur zu diesem

Zeitpunkt in den Lokalisationen ein signifikanter Unterschied zwischen den vier

Gruppen detektierbar war (s. Anhang Tab. 18).

In den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels konnte am 7. und 14. Versuchstag mittels paarweisen Mann-Whitney-U-

Test signifikant erhöhte Werte der infizierten Mäusestämme im Vergleich zu den

Plazebo-Tieren ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 18). Zusätzlich stieg die Menge der

CD45R/B220+ B-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen deutlich an, so dass am 14.

Versuchstag die Anzahl an B-Zellen signifikant gegenüber der der infizierten

C57BL/6-Mäusen erhöht war. Am 56. Tag pi waren die Werte bei den infizierten SJL-

Mäusen immer noch signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere erhöht. In der

chronischen Phase (98. und 196. Versuchstag) konnten nur noch einzelne

CD45R/B220+ B-Zellen detektiert werden.

82 Ergebnisse

Die hyperzellulären Bereiche der grauen und weißen Substanz des Stammhirns

wiesen bis zum 14. Versuchstag nur wenige B-Zellen bei den infizierten

Mäusestämmen auf. Am 56. Tag pi stiegen die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen

deutlich an und waren hier gegenüber denen der Plazebo-Tiere im paarweisen

Vergleich signifikant erhöht. In den intraparenchymatösen Läsionen der grauen

Substanz fand sich zu diesem Zeitpunkt auch eine signifikante Erhöhung der Anzahl

CD45R/B220+ B-Zellen der infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den infizierten

C57BL/6-Mäusen. In der chronischen Phase der TMEV-Infektion (98. und 196. Tag

pi) konnten nur noch vereinzelte B-Zellen in den hyperzellulären Bereichen ermittelt


Abb 20: CD45R/B220+ Zellen in perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 83

4.2.2.5 CD25+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns

Während in der akuten Frühphase der TMEV-Infektion einige CD25+ T-Zellen in den

entzündlichen Infiltraten der untersuchten Lokalisationen, mit Ausnahme der grauen

und weißen Substanz des Kleinhirns, akzentuiert bei den infizierten SJL-Mäusen

detektiert werden konnten, fielen die Zahlen hiernach deutlich ab. Sie waren erst in

der chronischen Phase (98. und 196. Tag pi) bei den infizierten SJL-Mäusen in

geringer Anzahl erneut nachweisbar.

Es zeigten sich mittels Kruskal-Wallis-Test signifikante Unterschiede über den

zeitlichen Verlauf in den meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns beider

infizierter Mäusestämme, sowie in den perivaskulären Infiltraten der

paraventrikulären Substanz infizierter SJL-Mäuse. Nur in diesen Lokalisationen

waren erhöhte Werte CD25+ T-Zellen nachweisbar. In allen weiteren

Kompartimenten konnten nur wenige CD25+ T-Zellen immunhistologisch ermittelt

werden. Die Akkumulation dieser Zellen in der Frühphase der Infektion führte zu

Abb. 21: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 179), 56.Tag pi, CD45R/B220-Immunhistologie (DAB). 21a: CD45R/B220+ B-Zellen in perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns (Pfeile). Balken: 25 µm. 21b: CD45R/B220+ B-Zellen in parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz des Stammhirns (Pfeile). Balken: 25 µm.

21a

21b

84 Ergebnisse

signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen in den meningealen Infiltraten

und den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz. Eine erneute

Erhöhung der Werte CD25+ T-Zellen in meningealen Infiltraten am 98. und 196.

Versuchstag führte mittels zeitpunktbezogenen Kruskal-Wallis-Test erneut zu

signifikanten Unterschieden (s. Anhang, Tab. 19).

Die Anzahl CD25+ T-Zellen war am 7. Versuchstag in den meningealen Infiltraten

des Klein- und Stammhirns bei den infizierten Mäusen vergleichbar hoch und zeigte

mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung gegenüber den

Plazebo-Tieren. Am 14. und 56. Tag pi waren bei beiden infizierten Mäusestämmen

kaum noch immunhistologisch positive Zellen detektierbar. Erst in der chronischen

TMEV-Infektionsphase (98. und 196. Versuchstag) stiegen die Werte bei den

infizierten SJL-Mäusen an und waren zu diesen Untersuchungszeitpunkten

signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere und den infizierten C57BL/6-Mäusen

erhöht (s. Abb.22, Anhang, Tab. 19).

In den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz von Klein- und

Stammhirn fand sich, mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test ermittelt, am 7. Tag

Abb. 22: CD25+ T-Zellen in meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 85

pi signifikant erhöhte Werte CD25+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Am 14. Versuchstag fanden sich nur noch wenige

CD25+ T-Zellen bei infizierten C57BL/6-Mäusen, am 98. Tag pi waren noch einzelne

immunhistologisch positive Zellen bei infizierten SJL-Mäusen ermittelbar (s. Anhang,

Tab. 19).

In den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns wurden nur

am 98. Versuchstag einzelne CD25+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen

markiert (s. Anhang, Tab. 19).

In der akuten Frühphase (7. Tag pi) und der chronischen Phase (98. und 196. Tag pi)

fanden sich vereinzelte CD25+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen in den

perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz des Stammhirns (s. Anhang, Tab. 19).

4.2.2.6 CD25+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

Der Kruskal-Wallis-Test ermittelte nur in der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels einen signifikanten Unterschied der infizierten C57BL/6-Mäuse über den

zeitlichen Verlauf. Der zeitpunktbezogene Kruskal-Wallis-Test wies keine

signifikanten Unterschiede in allen untersuchten Lokalisationen nach.

In den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz sowie der grauen

und der weißen Substanz des Stammhirns konnten nur am 7. Versuchstag bei

beiden infizierten Mäusestämmen wenige CD25+ T-Zellen ermittelt werden (s.

Anhang, Tab. 20).

4.2.2.7 Foxp3+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns

In der akuten Frühphase (7. Tag pi) der TMEV-Infektion wiesen einzelne

Lokalisationen (meningeale Infiltrate und paraventrikuläre Substanz) deutlich erhöhte

Werte von Treg bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den SJL-

Mäusen auf. Ab dem 56. Versuchstag zeigte sich in dem überwiegenden Teil der

untersuchten Lokalisationen eine signifikante Erhöhung der Anzahl von Treg bei den

86 Ergebnisse

infizierten SJL-Mäusen. Dies war bis in die chronische Spätphase hinein (196. Tag

pi) ersichtlich.

Der Kruskal-Wallis-Test wies über den zeitlichen Verlauf auf Grund des deutlichen

Anstiegs regulatorischer T-Zellen in der chronischen Phase signifikante Unterschiede

bei den infizierten Mäusestämmen in allen untersuchten Lokalisationen, mit

Ausnahme der grauen und weißen Substanz des Kleinhirns und der weißen

Substanz des Stammhirns auf. In den meningealen Infiltraten und den perivaskulären

Infiltraten der weißen Substanz des Stammhirns fanden sich bei den infizierten SJL-

Mäuse eine nahezu konstant hohe Zahl Foxp3+ T-Zellen, wohingegen in den

perivaskulären Infiltrate der weißen Substanz infizierter C57BL/6-Mäuse keine

regulatorischen T-Zellen detektiert werden konnten. Mit wenigen Ausnahmen

konnten zu jedem Zeitpunkt in allen untersuchten Lokalisationen signifikante

Unterschiede mittels Kruskal-Wallis-Test zwischen den Gruppen detektiert werden (s.

Anhang, Tab. 21).

In den meningealen Infiltraten war noch am 7. Tag pi die Anzahl der Treg bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere und

gegenüber denen der infizierten SJL-Mäuse erhöht. Am 14. Tag pi fanden sich

vergleichbar hohe Werte bei beiden infizierten Mäusepopulationen. Zu Beginn der

chronischen Phase (56. Tag pi) zeigte sich im paarweisen Mann-Whitney-U-Test ein

signifikant erhöhter Wert der immunhistologisch positiven Zellen bei den infizierten

SJL-Mäusen verglichen mit den Plazebo-Mäusen und den infizierten C57BL/6-

Mäusen. Am 98. Versuchstag fand sich ein deutlicher Rückgang der Anzahl Foxp3+

T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi)

konnten wiederum signifikant erhöhte Werte der infizierten SJL-Mäuse im Vergleich

zu den Plazebo und infizierten C57BL/6-Mäusen ermittelt werden (s. Abb. 23 und 24,

Anhang, Tab. 21).

Während in der akuten Phase der Infektion (7. und 14. Tag pi) im paarweisen Test

signifikant erhöhte Werte von Treg in den perivaskulären Infiltraten der

paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels bei den infizierten Mäusestämmen

im Vergleich zu den Plazebo-Tieren nachweisbar waren, zeigte sich am 56. Tag pi

Ergebnisse 87

ein signifikanter Anstieg der Werte an Treg bei den infizierten SJL-Mäusen im

Vergleich zu Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen. In der chronischen

Phase (98. Tag pi) sanken dann die Anzahl der Treg bei den infizierten SJL-Mäusen

und waren am 196. Tag pi nicht mehr nachweisbar (s. Abb. 23, Anhang, Tab. 21).

In den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns konnte am 7.

und 14. Tag pi nur vereinzelte Treg bei den infizierten Mäusen detektiert werden. Am

56. Versuchstag fand sich bei den infizierten SJL-Mäusen, mittels Mann-Whitney-U-

Test ermittelt, ein signifikanter Anstieg der Werte Foxp3+ T-Zellen im Vergleich zu

Plazebo-Mäusen und C57BL/6-Mäusen. Nach einem deutlichen Abfall der

immunhistologisch positiven Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen am 98.

Versuchstag fanden sich noch geringe Mengen Foxp3+ T-Zellen in der chronischen

Spätphase (196. Tag pi) der TMEV-Infektion (s. Abb. 23, Anhang, Tab. 21).

Nur bei den infizierten SJL-Mäusen konnten Treg in den perivaskulären Infiltraten der

weißen Substanz des Stammhirns detektiert werden. Es zeigte sich anfangs (7. und

14. Tag pi) eine geringe Anzahl an Treg. Am 56., 98. und 196. Versuchstag konnten

dann im paarweisen Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Werte im Vergleich

der infizierten Mäusestämme und der Plazebo-Mäuse ermittelt werden (s. Anhang,

Tab. 21).

4.2.2.8 Foxp3+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

Erwartungsgemäß fanden sich mittels Kruskal-Wallis-Test in hyperzellulären Arealen

der paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels, sowie in der grauen und

weißen Substanz des Stammhirns signifikante Unterschiede über den zeitlichen

Verlauf bei den infizierten Mäusen. Lediglich in der weißen Substanz des

Stammhirns konnten nur wenige regulatorische T-Zellen bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen nachgewiesen werden. In der paraventrikulären Substanz wies der

zeitpunktbezogene Kruskal-Wallis-Test signifikante Unterschiede beginnend am 7.

bis zum 56. Versuchstag auf. In der grauen Substanz des Stammhirns fanden sich

während der gesamten TMEV-Infektion Treg bei den infizierten SJL-Mäusen, somit

ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppe über den gesamten

88 Ergebnisse

Messzeitraum. In der weißen Substanz des Stammhirns konnten erste Infiltrate bei

den infizierten Mäusestämmen erst ab dem 56. Versuchstag nachgewiesen werden,

weshalb der Gruppenvergleich ausschließlich in der chronischen Phase (56. – 196.

Tag pi) signifikante Differenzen aufwies (s. Anhang, Tab. 22).

In den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels konnten in der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) der TMEV-Infektion

identisch hohe Werte an Treg bei den untersuchten infizierten Mäusestämmen

nachgewiesen werden. Die Werte der infizierten Mäuse waren im paarweisen

Vergleich signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht. Es erfolgte ein

deutlicher Anstieg der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen am 56. Versuchstag,

somit auch eine signifikante Erhöhung im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen und den

infizierten C57BL/6-Mäusen. Nur am 98. Versuchstag konnten noch wenige Treg bei

den infizierten SJL-Mäusen ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 22).

Am 7. Versuchstag fand sich mittels Mann-Whitney-U-Test in den hyperzellulären

Bereichen der grauen Substanz des Stammhirns eine signifikante Erhöhung der

Anzahl immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im

Vergleich zu Plazebo-Tieren und infizierten SJL-Mäusen. Die Werte der infizierten

C57BL/6-Mäuse blieben auch am 14. Tag pi signifikant gegenüber denen der

Plazebo-Mäuse erhöht. Die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen waren allerdings

deutlich gestiegen. Im Verlauf der chronischen Phase (56. – 196. Tag pi) war die

Anzahl immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant

gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht. Mit Ausnahme des 98. Tages pi, an

dem die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen gering gesunken waren, ergaben sich

auch hier im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant erhöht Werte

an den Tagen 56. und 196. pi (s. Anhang, Tab. 22).

In den parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz des Stammhirns wiesen die

infizierten Mäuse nur wenige Treg am 7. und 14. Versuchstag auf. Am 56. Tag pi war

die höchste Anzahl immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen nachweisbar. Zu diesem Zeitpunkt fand sich mittels paarweisen Mann-

Whitney-U-Tests eine signifikante Erhöhung gegenüber den infizierten C57BL/6-

Mäuse und der Werte der Plazebo-Mäuse. Nach einem deutlichen Abfall der Treg

Ergebnisse 89

konnte am 98. Versuchstag trotzdem ein signifikanter Unterschied zu den Plazebo-

Mäusen nachgewiesen werden. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) fanden

sich nur noch geringe Mengen von Treg bei dem infizierten SJL-Mäusestamm (s.

Abb. 25, Anhang, Tab. 22).

Abb. 23: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 179), 56.Tag pi, Foxp3-Immunhistologie (DAB). 23a: Foxp3+ Zellen in einem meningealen Infiltrat (Pfeile) des Stammhirns. Balken: 50 µm. 23b: Foxp3+ Zellen in perivaskulären Infiltraten (Pfeile) um den vierten Ventrikel (Stern) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeilspitzen) des Stammhirns. Balken: 100 µm.

Abb. 24: Foxp3+ Zellen in meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

23a

23b

90 Ergebnisse

4.2.2.9 CD107b+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns

In den entzündlichen Infiltraten der untersuchten Lokalisationen zeigte sich im

Vergleich zu den hyperzellulären Arealen nur wenige CD107b+ Zellen bei den

infizierten SJL-Mäusen.

Akzentuiert in der paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels fanden sich über

den zeitlichen Verlauf eine erhöhte Anzahl CD107b+ Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämmen. Dies bestätigte sich auch bei Anwendung des zeitpunktbezogenen

Kruskal-Wallis-Gruppentests. Zusätzlich fanden sich signifikante Unterschiede am 7.

und 98. Versuchstag in meningealen Infiltraten sowie am 56. Tag pi in perivaskulären

Infiltraten der weißen Substanz des Stammhirns (s. Anhang, Tab. 23).

Während in den meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn bei infizierten

C57BL/6-Mäusen nahezu keine CD107b+ Zellen immunhistologisch detektiert

Abb. 25: Foxp3+ Zellen in der weißen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 91

werden konnten, fand sich vom 7. bis 196. Versuchstag eine konstante, wenn auch

nur geringe Anzahl immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen. Es ergaben sich mittels Mann-Whitney-U-Test signifikante Unterschiede

zwischen den infizierten Mäusestämmen sowie zwischen den infizierten SJL-Mäusen

im Vergleich zu den Plazebo-Tieren am 7. und am 98. Versuchstag (s. Anhang, Tab.

23).


Ventrikels fanden sich noch am 7. und 14. Versuchstag vergleichbare Werte

CD107b+ Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen. In der akuten Frühphase (7.

Tag pi) war die Anzahl der perivaskulär gelegenen Makrophagen bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tieren erhöht. Am 56.

und 98. Versuchstag war die Anzahl der immunhistologisch positiven Zellen bei den

infizierten SJL-Mäusen signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tieren des gleichen

Stammes, sowie der infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht. In der chronischen

Spätphase (196. Tag pi) waren keine CD107b+ Zellen bei den infizierten

Mäusestämmen nachweisbar (s. Anhang, Tab. 23).

In den entzündlichen Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns wiesen die

infizierten Mäusestämme nur am 14., 56. und 98. Versuchstag geringe Werte an

CD107b+ Zellen auf (s. Anhang, Tab. 23).

Die perivaskulären Infiltrate in der weißen Substanz des Stammhirns zeigten von

Beginn der TMEV-Infektion (7. Tag pi) bis in die chronische Spätphase (196. Tag pi)

bei infizierten SJL-Mäusen erhöhte CD107b+ Zellen, wobei am 56. Tag pi mittels

Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung der Werte im Vergleich zu den

Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen ermittelt werden konnte (s. Anhang,

Tab. 23).

4.2.2.10 CD107b+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

In der grauen und weißen Substanz des Stammhirns infizierter C57BL/6-Mäuse

waren nur vereinzelte CD107b+ Zellen detektierbar. In den hyperzellulären Bereichen

aller untersuchten Lokalisationen, mit Ausnahme der grauen und weißen Substanz

92 Ergebnisse

des Kleinhirns, fanden sich mittels Kruskal-Wallis-Test signifikante Unterschiede über

den zeitlichen Verlauf bei den infizierten SJL-Mäusen. Auf Grund der deutlichen

Infiltration von CD107b+ Zellen in der chronischen Phase bei infizierten SJL-Mäusen,

wies der zeitpunktbezogene Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich signifikante

Unterschiede am 56. und 98. Versuchstag in der paraventrikulären Substanz und der

grauen Substanz des Kleinhirns auf. Zusätzlich fanden sich in der weißen Substanz

des Stammhirns beginnend am 14. bis 196. Tag pi signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen (s. Anhang, Tab. 24).

In den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz rund um den

vierten Ventrikel und der grauen Substanz des Stammhirns konnten am 7. und 14.

Tag pi identisch hohe Werte CD107b+ Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen

detektiert werden. Am 56. und 98. Versuchstag fanden sich, mittels paarweisen

Mann-Whitney-U-Test detektiert, signifikante Erhöhungen der Werte bei dem

Vergleich der infizierten SJL-Mäusen und der Plazebo-Tiere sowie zwischen den

infizierten Mäusestämmen. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) konnten

keine weiteren immunhistologisch positiven Zellen nachgewiesen werden (s. Abb.


In den hyperzellulären Bereichen der weißen Substanz des Stammhirns konnten nur

bei infizierten SJL-Mäusen CD107b+ Zellen ermittelt werden. Die höchsten Werte

zeigten sich am 56. Tag pi, die Anzahl sank im weiteren Verlauf kontinuierlich ab,

trotzdem fanden sich im paarweisen Vergleich signifikante Unterschiede zwischen

den infizierten Mäusestämmen und den infizierten SJL-Mäusen und den Plazebo-

Tieren am 56., 98. und 196. Versuchstag (s. Abb. 26 und 27, Anhang, Tab. 24).

Ergebnisse 93

Abb. 27: CD107b+ Zellen in der weißen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 26: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56.Tag pi, CD107b-Immunhistologie (DAB). 26a: CD107b+ Zellen in parenchymatösen Läsionen der grauen (Sterne) und weißen Substanz (Dreieck) des Stammhirns. Balken: 500 µm. 26b: CD107b+ Zellen mit Gitterzellmorphologie in parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz (Pfeile) des Stammhirns. Balken: 20 µm.

26b 26a

94 Ergebnisse

4.2.2.11 GFAP+ Astrozyten in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

In allen untersuchten Lokalisationen des Klein- und Stammhirns beider infizierter

Mäusestämme zeigten sich gleichwertig hohe Zahlen GFAP+ Zellen in der akuten

Phase (7.-14. Tag pi) in der paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels sowie

in der grauen und weißen Substanz des Stammhirns. Ab dem 56. Versuchstag bis in

die chronische Spätphase (196. Tag pi) fand sich eine ausgeprägte Dominanz der

Zellen bei den infizierten empfänglichen SJL-Mäusen. In allen Regionen von Klein-

und Stammhirn fand sich eine konstante basale Expression GFAP+ Astrozyten bei

den Plazebo-Tieren beider Mäusestämme (s. Anhang, Tab. 25).

Mittels Kruskal-Wallis-Test fanden sich über den zeitlichen Verlauf signifikante

Unterschiede bei den infizierten Mäusestämmen in der paraventrikulären Substanz,

sowie bei infizierten Mäusestämmen und den SJL-Plazebomäusen in der grauen

Substanz des Stammhirns. Auf Grund des geringen, basalen Nachweis GFAP+

Astrozyten bei den infizierten C57BL/6-Mäusen waren bei diesen Tieren keine

signifikanten Unterschiede in der weißen Substanz des Stammhirns messbar. Die

TMEV-infizierten und SJL-Plazebomäuse wiesen hier hingegen signifikante

Unterschiede über den zeitlichen Verlauf auf. Der zeitpunktbezogene Kruskal-Wallis-

Gruppenvergleich detektierte über den gesamten Zeitraum signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen in der paraventrikulären Substanz und der grauen Substanz

des Stammhirns. In der weißen Substanz fand sich eine deutliche Astrogliose erst in

der chronischen Phase, somit wies der Kruskal-Wallis-Test signifikante Unterschiede

beginnend am 56. bis zum 196. Versuchtag nach (s. Anhang, Tab. 25).

In der paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels fand sich noch am 7. und

14. Tag pi eine identisch hohe Anzahl GFAP+ Zellen in den parenchymatösen

Läsionen beider infizierter Mäusestämme, es zeigten sich hier signifikante

Unterschiede im Vergleich der infizierten Mäuse mit den Plazebo-Tieren. Am 56.

Versuchstag waren die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen deutlich

gesunken, es ergab sich somit im paarweisen Mann-Whitney-U-Test eine signifikante

Ergebnisse 95

Erhöhung der Werte bei dem Vergleich der infizierten SJL-Mäuse und den infizierten

C57BL/6-Mäusen. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) fanden sich nur noch

vereinzelte GFAP+ Zellen in den hyperzellulären Bereichen der infizierten SJL-Mäuse

(s. Abb. 28, Anhang, Tab. 25).

In den parenchymatösen Läsionen der grauen Substanz des Stammhirns konnten

noch in der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) deutlich erhöhte Werte GFAP+ Zellen

bei infizierten C57BL/6-Mäusen nachgewiesen werden. Es fand sich zu diesen

Zeitpunkten ein signifikanter Unterschied zwischen infizierten C57BL/6-Mäusen und

Plazebo-Tieren. Am 56. Versuchstag erfolgte eine Umkehr der Verhältnisse.

Während die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen sanken, stiegen die der

infizierten SJL-Mäuse deutlich an und waren von jetzt an bis zum Ende der

Messungen (196. Tag pi) signifikant gegenüber denen der infizierten C57BL/6-

Mäusen und denen der Plazebo-Mäuse erhöht (s. Abb. 28, Anhang, Tab. 25).

In den hyperzellulären Bereichen der weißen Substanz des Stammhirns zeigte sich

im paarweisen Mann-Whitney-U-Test ebenfalls eine signifikante Erhöhung im

Vergleich der infizierten Mäusestämme sowie der infizierten Mäusestämme mit den

Plazebo-Tieren ab dem 56. bis zum 196. Versuchstag. In der akuten Phase der

Infektion (7. und 14. Tag pi) fanden sich bei beiden infizierten Mäusestämmen nur

wenige GFAP+ Zellen (s. Abb. 28 und 29, Anhang, Tab. 25).

Abb. 28: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 180), 56. Tag pi, GFAP-Immunhistologie (DAB). 28a: GFAP+ Zellen (Astrogliose) um den vierten Ventrikel (Dreiecke) sowie in der grauen (Sterne) und weißen Substanz (Pfeil) des Stammhirns. Balken: 1000 µm. 28b: Vergrößerung von 28a. Akkumulation von GFAP+ Astrozyten in der weißen Substanz (Pfeile) des Stammhirns. Balken: 20 µm.

28a 28b

96 Ergebnisse

4.2.3 Rückenmark

4.2.3.1 CD3+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

In allen untersuchten Lokalisationen des Rückenmarks fand sich eine starke

Dominanz an CD3+ T-Zellen im Vergleich zu allen anderen untersuchten

Zellpopulationen.

In den meningealen Infiltraten beider infizierter Mäusestämme, sowie in den

perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz infizierter C57BL/6-Mäuse

zeigten sich konstante Werte CD3+ T-Zellen, weshalb in diesen Lokalisationen

mittels Kruskal-Wallis-Test keine signifikanten Unterschiede über den zeitlichen

Verlauf ermittelt werden konnten. In perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen

Substanz des Rückenmarks infizierter SJL-Mäuse war ab dem 56. Versuchstag eine

deutliche Infiltration der CD3+ T-Zellen zu verzeichnen, es ergaben sich somit

signifikante Unterschiede über den zeitlichen Verlauf. Bei den infizierten SJL-Mäusen

Abb 29: GFAP+ Zellen in der weißen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 97

waren über den gesamten Messzeitraum deutliche Mengen CD3+ T-Zellen in den

meningealen Infiltraten zu verzeichnen, es ergab sich somit in dieser Lokalisation im

Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich signifikante Unterschiede an allen

Messzeitpunkten. In perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz war nur am 56.

Versuchstag vermehrt CD3+ T-Zellen bei infizierten SJL-Mäusen detektierbar, nur an

diesem Versuchstag fand sich ein signifikanter Unterschied des Vergleichs aller vier

Gruppen. In der gesamten chronischen Phase (56. – 196. Tag pi) waren erhöhte

Zahlen von T-Zellen in den perivaskulären Infiltrate der weißen Substanz infizierter

SJL-Mäuses ermittelbar, es fanden sich in dieser Phase signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen (s. Anhang Tab. 26).

Der Mann-Whitney-U-Test zeigte, dass sich über den gesamten Erkrankungsverlauf

eine signifikante Erhöhung der Anzahl CD3+ T-Zellen innerhalb der meningealen

Infiltrate bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu Plazebo-Tieren und infizierten

C57BL/6-Mäusen messbar war (s. Abb. 30 und 31, Anhang, Tab. 26).

In den vereinzelt vorgelegenen perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des

Rückenmarks fand sich nur am 56. Versuchstag bei einigen infizierten SJL-Mäusen

geringe Werte CD3+ T-Zellen in den Infiltraten. An allen anderen Versuchstagen

konnte nur für einzelne Tiere stark schwankende CD3+ T-Zellen ermittelt werden (s.


Mit deutlich geringeren Mengen CD3+ T-Zellen in den perivaskulären Infiltraten der

weißen Substanz des infizierten SJL-Mäusestammes, zeichnete sich eine ähnliche

Tendenz, vergleichbar der in den meningealen Infiltraten ab. Erste positive Zellen in

den Infiltraten der infizierten SJL-Mäuse fanden sich am 7. und 14. Versuchstag. Es

erfolgte ein deutlicher Anstieg am 56. und am 98. Tag pi, gefolgt von einem Abfall in

der späten Phase (196. Tag pi). Beginnend am 56. Versuchstag bis zum Ende der

zeitlichen Messungen (196. Tag pi) waren die Werte der infizierten SJL-Mäuse

signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse und der infizierten C57BL/6-Mäuse

erhöht (s. Abb. 30 und 32, Anhang, Tab. 26).

98 Ergebnisse

4.2.3.2 CD3+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

In hyperzellulären Arealen der grauen Substanz fand sich eine frühe hohe Infiltration

(7. Tag pi) CD3+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen, womit sich mittels Kruskal-

Wallis-Test ein signifikanter Unterschied über den zeitlichen Verlauf und über den

Vergleich aller vier Gruppen zu diesem Zeitpunkt ermitteln ließ. Die Infiltration CD3+

T-Zellen in der weißen Substanz zeigte sich bei beiden infizierten Mäusestämmen

erst am 14. Versuchstag, woraus sich signifikante Unterschiede über den zeitlichen

Verlauf bei den infizierten Mäusen ergaben. Auf Grund der konstant hohen Infiltration

CD3+ T-Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks infizierter SJL-Mäusen

ergab der Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich beginnende am 14. Versuchstag bis zum

Ende der Messungen (196. Versuchstag) signifikante Unterschiede (s. Anhang, Tab.

27).

In den hyperzellulären Bereichen der grauen Substanz fand sich in der akuten

Frühphase (7. Tag pi) mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test eine signifikante

Erhöhung der CD3+ T-Zellen bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu Plazebo-

Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen. Im weiteren zeitlichen Verlauf fanden sich

einzelne Tiere, die wenige CD3+ T-Zellen aufwiesen (s. Anhang, Tab. 27).

In den parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz fand sich am 14. Tag pi

eine identisch hohe Menge CD3+ T-Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen. Es

zeigte sich hier ein signifikanter Unterschied im Vergleich zu den Plazebo-Tieren.

Nachdem am 56. Versuchstag die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen

deutlich gesunken waren, zeigte sich ein deutlicher Anstieg der Zellen gefolgt von

einem kontinuierlichen Abfall bei den infizierten SJL-Mäusen. Am 56., 98. und 196.

Tag pi konnte somit eine signifikante Erhöhung der Werte der infizierten SJL-Mäuse

im paarweisen Vergleich zu Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen

nachgewiesen werden (s. Abb. 30 und 33, Anhang, Tab. 27).

Ergebnisse 99

30a

30b 30c

Abb. 30: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56.Tag pi, CD3-Immunhistologie (DAB). 30a: CD3+ T-Zellen in meningealen Infiltraten (Sterne) sowie in perivaskulären Infiltraten (Pfeilspitzen) und in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 250 µm. 30b: Vergrößerung von 30a. Akkumulation von CD3+ T-Zellen in meningealen Infiltraten (Stern) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeilspitze) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 20 µm. 30c: Vergrößerung von 30a. Akkumulation von CD3+ T-Zellen in perivaskulären Infiltraten (Pfeilspitze) und in parenchymatösen Läsionen (Pfeil) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 20 µm.

100 Ergebnisse

Abb. 32: CD3+ Zellen in perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 31: CD3+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 101

4.2.3.3 CD45R/B220+ B-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

Die Anzahl der B-Zellen zeigte in den überwiegenden Lokalisationen eine deutliche

Dominanz bei den infizierten SJL-Mäusen.

Auf Grund der konstanten Zellzahlen CD45R/B220+ B-Zellen in den meningealen

Infiltraten und den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz konnte mittels

Kruskal-Wallis-Test in diesen Lokalisationen kein signifikanter Unterschied über den

zeitlichen Verlauf ermittelt werden. In den perivaskulären Infiltraten der weißen

Substanz zeigten sich nur wenige B-Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen. Bei

den infizierten SJL-Mäusen fand sich beginnend am 14. Tag pi eine deutliche

Infiltration CD45R/B220+ B-Zellen, woraus sich ein zeitlich abhängiger, signifikanter

Unterschied ermitteln ließ. Über den gesamten Verlauf zeigte sich eine hohe Anzahl

B-Zellen in den meningealen Infiltraten, der Kruskal-Wallis-Test wies an jedem

Untersuchungszeitpunkt signifikante Unterschiede bei dem Vergleich der vier

Abb. 33: CD3+ Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

102 Ergebnisse

Gruppen miteinander nach. In perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz konnte

nur wenige immunhistologisch positive Zellen ermittelt werden, es ergaben sich somit

keine signifikanten Unterschiede. Bei infizierten SJL-Mäusen zeigte sich beginnend

am 14. Versuchstag bis in die späte chronische Phase (196. Versuchstag) erhöhte

Werte CD45R/B220+ B-Zellen in den perivaskulären Infiltraten. Der Vergleich aller

vier Gruppen zeigte somit signifikante Unterschiede vom 14. bis zum 196.

Versuchstag. (s. Anhang, Tab. 28).

Bis in die Spätphase (98. Tag pi) der TMEV-Infektion fanden sich im paarweisen

Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Zahlen von CD45R/B220+ B-Zellen in den

meningealen Infiltraten von infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu Plazebo-Tieren

und infizierten C57BL/6-Mäusen. Die B-Zellzahlen blieben im gesamten zeitlichen

Verlauf auf einem konstant hohen Niveau (s. Abb. 34 und 35, Anhang, Tab. 28).

In den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz waren nur am 56. und 98. Tag

pi geringe Mengen CD45R/B220+ B-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen

nachweisbar (s. Anhang, Tab. 28).

In perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz zeigten sich erste CD45R/B220+ B-

Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen schon am 7. Versuchstag. Ab dem 14.

Tag pi waren ausschließlich immunhistologisch positive Zellen bei den infizierten

SJL-Mäusen nachweisbar. Es fand sich am 98. Versuchstag eine signifikante

Erhöhung der Werte CD45R/B220+ B-Zellen bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich

zu Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 34, Anhang, Tab. 28).

4.2.3.4 CD45R/B220+ B-Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Der durch den Kruskal-Wallis-Test ermittelte signifikante Unterschied über den

zeitlichen Verlauf in hyperzellulären Bereichen der grauen Substanz infizierter SJL-

Mäuse ergab sich aus der Infiltration CD45R/B220+ B-Zellen am 7. Tag pi. In der

weißen Substanz infizierter C57BL/6-Mäuse fanden sich am 14. Versuchstag wenige

B-Zellen. Bei den infizierten SJL-Mäusen hingegen fand sich beginnend am 14. Tag

pi eine dominante Akkumulation der Zellen in den hyperzellulären Arealen dieser

Lokalisation, die bis zum Ende der Untersuchung nachweisbar war, hieraus

Ergebnisse 103

resultierte ein signifikanter Unterschied bei beiden infizierten Mäusestämmen über

den zeitlichen Verlauf in den hyperzellulären Arealen der weißen Substanz. Die

deutliche Infiltration von B-Zellen bei infizierten SJL-Mäusen am 7. Versuchstag

resultierte in einem signifikanten Unterschied im Vergleich aller vier Gruppen zu

diesem Zeitpunkt. Erhöhte B-Zellzahlen in der weißen Substanz von beiden

infizierten Mäusestämmen am 14. Tag pi, sowie bei den infizierten SJL-Mäusen

zusätzlich bis zum 196. Versuchstag führten zu signifikanten Unterschieden bei dem

Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich beginnend am 14. bis zum 196. Versuchstag (s.

Anhang, Tab. 29).

Innerhalb der intraparenchymatösen Läsionen der grauen Substanz fanden sich

signifikant erhöhte Werte bereits am 7. Versuchstag bei infizierten SJL-Mäusen im

Vergleich zu Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen. Hiernach erfolgte ein

deutlicher Abfall der Werte immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen am 14. Versuchstag. Der 56. Tag pi war der späteste Zeitpunkt, an dem

CD45R/B220+ B-Zellen in den hyperzellulären Bereichen der grauen Substanz der

infizierten SJL-Mäuse nachgewiesen werden konnten. Bei den resistenten C57BL/6-

Mäusen konnten noch am 98. Tag pi geringe Mengen positiver Zellen detektiert


In den hyperzellulären Bereiche der weißen Substanz fanden sich am 14.

Versuchstag bei beiden infizierten Mäusestämmen im paarweisen Mann-Whitney-U-

Test signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen. Nachdem in

den intraparenchymatösen Läsionen des infizierten C57BL/6-Mäusestamms im

weiteren, zeitlichen Verlauf keine immunhistologisch positiven Zellen detektiert

werden konnte, waren die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen bis zum 196.

Versuchstag im paarweisen Vergleich signifikant gegenüber denen des infizierten

C57BL/6-Mäusestamms und den Plazebo-Tieren erhöht (s. Abb. 34 und 36, Anhang,

Tab. 29).

104 Ergebnisse

Abb. 34: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56.Tag pi, CD45R/B220-Immunhistologie (DAB). 34a: CD45R/B220+ B-Zellen in einem meningealen Infiltrat (Pfeilspitze) sowie in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 500 µm. 34b: Vergrößerung von 34a. Akkumulation von CD45R/B220+ B-Zellen in einem meningealen Infiltrat (Stern) und in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 50 µm. 34c: Nachweis von CD45R/B220+ B-Zellen in einem perivaskulären Infiltrat (Dreieck) und in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 30 µm. 34d: CD45R/B220+ B-Zellen in parenchymatöser Läsion (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 30 µm.

34b 34a

34d 34c

Ergebnisse 105

Abb. 35: CD45R/B220+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test

Abb. 36: CD45R/B220+ Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

106 Ergebnisse

4.2.3.5 CD25+ T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

In den entzündlichen Alterationen des Rückenmarks konnten nur wenige CD25+ T-

Zellen ab dem 56. Versuchstag hauptsächlich bei den infizierten SJL-Mäusen

nachgewiesen werden.

Der Kruskal-Wallis-Test zeigte signifikante Unterschiede über den zeitlichen Verlauf

in den meningealen Infiltraten und den perivaskulären Infiltraten der weißen

Substanz bei den infizierten SJL-Mäusen. Auf Grund des Anstiegs CD25+ T-Zellen in

den meningealen Infiltraten fanden sich in der chronischen Phase (56. – 196. Tag pi)

signifikante Unterschiede beim Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich. Ein deutlicher

Anstieg in den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz infizierter SJL-Mäuse

fand sich auch am 98. Versuchstag woraus auch an diesem Untersuchungszeitpunkt

ein signifikanter Unterschied mittels angewandten Kruskal-Wallis-Test ermittelt

werden konnte (s. Anhang Tab. 30).

Ab dem 14. Versuchstag bis zum Versuchsende (196. Tag pi) ließen sich nur bei den

infizierten SJL-Mäusen CD25+ T-Zellen in den meningealen Infiltraten nachweisen.

Am 56. und 196. Tag pi zeigte sich im paarweisen Mann-Whitney-U-Test eine

signifikante Erhöhung der Werte bei infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu Plazebo-

Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 37, s. Anhang, Tab. 30).

Abb. 37: CD25+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 107

In perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz waren bei beiden infizierten

Mäusestämmen keine CD25+ T-Zellen vorhanden.

In den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz fanden sich nur bei den

infizierten SJL-Mäusen wenige CD25+ T-Zellen. Erstmals in geringer Zahl am 56.

Versuchstag vertreten, stiegen sie in der Spätphase (98. Tag pi) deutlich an, waren

hier gegenüber den Plazebo-Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen im

paarweisen Vergleich signifikant erhöht und, bis auf ein einzelnes Tier des SJL-

Stammes (TAI 204) am 196. Tag pi, nicht mehr messbar (s. Anhang, Tab. 30).

4.2.3.6 CD25+ T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Der Kruskal-Wallis-Test konnte über den zeitlichen Verlauf keine signifikanten

Unterschiede ermitteln. Lediglich in der weißen Substanz der infizierten SJL-Mäuse

fand sich in der chronischen Phase (56. – 196. Versuchstag) eine deutliche

Infiltration von CD25+ T-Zellen, weshalb im zeitpunktbezogenen Vergleich der vier

Gruppen mittels Kruskal-Wallis-Test signifikante Unterschiede an den drei

Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen werden konnte (s. Anhang Tab. 31).

In hyperzellulären Bereichen der grauen Substanz waren weder bei infizierten SJL-

Mäusen noch bei infizierten C57BL/6-Mäusen CD25+ T-Zellen nachweisbar.

Bereits am 14. Versuchstag zeigten sich erste wenige CD25+ T-Zellen in den

hyperzellulären Bereichen der weißen Substanz von den infizierten SJL-Mäusen.

Während über den gesamten Zeitraum keine immunhistologisch positiven Zellen bei

den infizierten C57BL/6-Mäusen ermittelt werden konnten, stiegen die Werte der

CD25+ T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen über den zeitlichen Verlauf

kontinuierlich an. Sie erreichten am 98. Versuchstag einen Höchstwert und sanken

hiernach in der chronischen Spätphase (196. Tag pi) auf geringe Werte ab. Am 98.

Tag pi zeigte sich im paarweisen Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung

der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und

den infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Anhang, Tab. 31).

108 Ergebnisse

4.2.3.7 Foxp3+ regulatorische T-Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

In den entzündlichen Alterationen der Meningen und der weißen Substanz fand sich

beginnend am 14. Versuchstag eine deutliche Dominanz der Treg bei den infizierten

SJL-Mäusen.


in den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz bei den infizierten SJL-

Mäusen. Auf Grund des deutlichen Anstiegs regulatorischer T-Zellen beginnend am

14. Versuchstag in den meningealen und den perivaskulären Infiltraten der weißen

Substanz erschienen signifikante Unterschiede im Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich

an den Untersuchungszeitpunkten 14, 56, 98 und 196 Tage pi (s. Anhang, Tab. 32).

In meningealen Infiltraten fanden sich Treg bei beiden infizierten Mäusestämmen in

der frühen, akuten Phase (7. Tag pi). Ab dem 14. Tag pi waren bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen nur wenige regulatorische T-Zellen ermittelbar. Hingegen fanden

sich, mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test ermittelt, beginnend am 14. Tag pi bis

zum 196. Untersuchungstag signifikant erhöhte Werte bei den infizierten SJL-

Mäusen verglichen mit Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 38


In perivaskulären Infiltraten der grauen Rückenmarkssubstanz konnten nur in der

akuten Frühphase (7. Tag pi) geringe prozentuale Werte an Treg bei den infizierten

SJL-Mäusen ermittelt werden. In der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) fanden sich in

Vergleich zu Plazebo-Mäusen und infizierten C57BL/6-Mäusen erhöht (s. Anhang,

Tab. 32).

In der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) fanden sich in den perivaskulären Infiltraten

der weißen Substanz vergleichbar hohe Werte an Treg bei beiden infizierten

Mäusestämmen. In der chronischen Phase (56. – 196. Tag pi) war die Anzahl Foxp3+

T-Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant im Vergleich zu Plazebo-Mäusen

und infizierten C57BL/6-Mäusen erhöht (s. Abb. 40, Anhang, Tab. 32).

Ergebnisse 109

4.2.3.8 Foxp3+ regulatorische T-Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Der Kruskal-Wallis-Test zeigte einen signifikanten Unterschied über den zeitlichen

Verlauf in der weißen Substanz der infizierten SJL-Mäuse. In dieser Lokalisation fand

sich bei infizierten SJL-Mäusen ein deutlicher Anstieg regulatorischer T-Zellen in der

chronischen Phase, woraus mittels Kruskal-Wallis-Test an den

Untersuchungszeitpunkten 56, 98 und 196 Tage pi signifikante Unterschiede

zwischen den Gruppen ermittelt werden konnte (s. Anhang, Tab. 33).

Innerhalb der intraparenchymatösen Läsionen der grauen Rückenmarkssubstanz

konnten nur in der akuten TMEV-Phase (7. und 14. Tag pi) bei den infizierten SJL-

Mäusen wenige Treg nachgewiesen werden (s. Anhang, Tab. 33).

Die hyperzellulären Bereiche innerhalb der weißen Substanz von infizierten SJL-

Mäusen zeigten im paarweisen Mann-Whitney-U-Test beginnend am 14. Tag pi

signifikant erhöhte Zellzahlen im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen und

Plazebo-Tieren. Dies war bei konstant hoher Zellzahl der infizierten SJL-Mäuse bis in

die chronische Spätphase (196. Versuchstag) nachweisbar. In den hyperzellulären

Bereichen der weißen Substanz der infizierten C57BL/6-Mäuse fanden sich wenige

Treg am 14. bis 98. Tag pi (s. Abb. 38 und 41, Anhang, Tab. 33).

110 Ergebnisse

Abb. 38: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 179), 56.Tag pi, Foxp3-Immunhistologie (DAB). 38a: Foxp3+ Zellen in einem meningealen Infiltrat (Pfeile) des Rückenmarks. Balken: 50 µm. 38b: Nachweis von Foxp3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 20 µm.

Abb. 39: Foxp3+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

38a 38b

Ergebnisse 111

Abb. 40: Foxp3+ Zellen in perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 41: Foxp3+ Zellen in hyperzellulären Arealen der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

112 Ergebnisse

4.2.3.9 CD107b+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

Die nachgewiesenen CD107b+ Zellen in den entzündlichen Alterationen des

Rückenmarks fanden sich vorwiegend bei den infizierten SJL-Mäusen ab dem 56.

Versuchstag.

Mittels Kruskal-Wallis-Test ergaben sich signifikante Unterschiede über den

zeitlichen Verlauf in den meningealen Infiltraten und den perivaskulären Infiltraten

der weißen Substanz bei den infizierten SJL-Mäusen. Auf Grund der deutlichen

meningealen Infiltration bei den infizierten SJL-Mäusen über den gesamten Verlauf

konnte mittels Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich signifikante Unterscheide an allen

Untersuchungszeitpunkten ermittelt werden. In perivaskulären Infiltraten der grauen

Substanz waren nur vereinzelte CD107b+ Zellen detektierbar. In perivaskulären

Infiltraten der weißen Substanz infizierter SJL-Mäuse zeigten sich beginnend am 14.

Versuchstag steigende Zahlen der Makrophagen, somit ergab sich ab dem 14.

Versuchstag bis zum 196. Tag pi signifikante Unterschiede im Gruppenvergleich (s.

Anhang Tab. 34).

Eine erhöhte Anzahl CD107b+ Zellen in meningealen Infiltraten waren schon am 7.

Versuchstag bei infizierten SJL-Mäusen ersichtlich. Während die resistenten

C57BL/6-Mäuse ausschließlich wenige CD107b+ Zellen in den meningealen

Infiltraten am 7. Tag pi zeigten, blieben die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen

konstant hoch. Es fanden sich im paarweisen Mann-Whitney-U-Test signifikante

Unterschiede der infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Tieren am 7.

Tag pi, sowie in der gesamten chronischen Phase (56. – 196. Versuchstag), wo sie

auch im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant erhöht waren (s.

Abb. 42 und 43, Anhang, Tab. 34).

In den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz zeigte nur jeweils ein Einzeltier

des infizierten SJL-Stammes am 56. und 98. Tag pi (TAI 179, TAI 189) positive

Werte.

Ergebnisse 113

Am 14. Tag pi fanden sich wenige CD107b+ Zellen in den perivaskulären Infiltraten

der weißen Substanz der infizierten SJL-Mäuse. Am 56. Versuchstag stiegen die

Werte bei den infizierten SJL-Mäusen an und waren dann am 98. Tag pi im

paarweisen Vergleich signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere und den

infizierten C57BL/6-Mäusen erhöht. Nach einem geringen Abfall der Zellzahlen

zeigte sich in der chronischen Spätphase noch ein signifikanter Unterschied der

infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Tieren (s. Anhang, Tab. 34).

4.2.3.10 CD107b+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Der Kruskal-Wallis-Test zeigte über den zeitlichen Verlauf in den hyperzellulären

Bereichen der grauen Substanz bei den infizierten C57BL/6-Mäusen und in der

weißen Substanz bei den infizierten SJL-Mäusen signifikante Unterschiede. Der

Gruppenvergleich an den einzelnen Untersuchungszeitpunkten wies signifikante

Unterschiede am 7. und am 98. Versuchstag in hyperzellulären Arealen der grauen

Substanz nach. Zu diesen Zeitpunkten zeigten die infizierten SJL-Mäuse die stärkste

Infiltration von Makrophagen/Mikroglia. In hyperzellulären Arealen der weißen

Substanz konnte ab dem 56. Tag pi bis in die chronische Spätphase eine Infiltration

von CD107b+ Zellen bei infizierten SJL-Mäusen nachgewiesen werden. Hieraus

resultierten signifikante Unterschiede an den genannten Untersuchungszeitpunkten

mittels Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich (s. Anhang, Tab. 35).

In den parenchymatösen Läsionen der grauen Substanz fand sich die deutlichste

Infiltration von Makrophagen/Mikroglia bei den infizierten SJL-Mäusen am 7. Tag pi.

Hier wies der paarweise Mann-Whitney-U-Test einen signifikanten Unterschied zu

den Plazebo-Tieren des gleichen Stammes nach (s. Anhang, Tab. 35).

Die infizierten SJL-Mäuse zeigten in den hyperzellulären Bereichen der weißen

Substanz geringfügig erhöhte CD107b+ Zellen am 14. Versuchstag. Am 56. Tag pi

wiesen diese einen deutlichen Anstieg auf und waren gegenüber den Werten der

Plazebo-Tiere bis zum Ende der Messungen (196. Versuchstag) signifikant erhöht. In

der chronischen Spätphase erbrachte der paarweise Vergleich signifikant erhöhte

114 Ergebnisse

Werte im Vergleich zu den infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 42, Anhang, Tab.

35).

Abb. 42: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 189), 98. Tag pi, CD107b-Immunhistologie (DAB). 42a: Nachweis von CD107b+ Makrophagen in meningealen Infiltraten (Stern) sowie ein parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 20 µm. 42b: Akkumulation von CD107b+ Makrophagen/Mikroglia in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 20 µm.

Abb. 43: CD107b+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

42a 42b

Ergebnisse 115

4.2.3.11 GFAP+ Astrozyten in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Während in der grauen Substanz eine konstant erhöhte Expression GFAP+ Zellen

bei den infizierten SJL-Mäusen ermittelt werden konnte, fanden sich kontinuierlich

ansteigende Werte in der weißen Substanz des Rückenmarks bei beiden infizierten

Mäusestämmen.

Der Kruskal-Wallis-Test wies in der grauen Substanz beider infizierte Mäusestämme

keine signifikanten Unterschiede über den zeitlichen Verlauf auf, es bestanden in

dieser Lokalisation konstante Werte bei beiden Mäusestämmen. In der weißen

Substanz zeigte sich ein konstanter Anstieg der Werte, nur bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen fielen diesen zum Ende der chronischen Phase (196. Versuchstag)

deutlich ab. Hieraus resultierten signifikante Unterschiede bei beiden infizierten

Mäusestämmen über den zeitlichen Verlauf. Auf Grund deutlicher Astrogliosen bei

den infizierten Mäusestämmen sowohl in der grauen als auch in der weißen

Substanz zeigte der Gruppenvergleich mittels Kruskal-Wallis-Test an allen

Untersuchungszeitpunkten signifikante Unterschiede (s. Anhang, Tab. 36).

In der grauen Substanz fanden sich bei beiden infizierten Gruppen eine deutliche

Expression GFAP+ Zellen, die bei den C57BL/6-Mäusen stets geringer, ab dem 14.

Versuchstag dann signifikant (paarweiser Mann-Whitney-U-Test) unter der der

infizierten SJL-Mäuse lag (s. Anhang, Tab. 36).

In der weißen Substanz wiesen beide infizierten Mäusestämme ansteigende Werte

GFAP+ Zellen auf. Ab dem 56. Versuchstag resultierte dieser Anstieg in einem

signifikanten Unterschied beider infizierter Mäusestämme im Vergleich zu ihren

Plazebo-Tieren. Bei den infizierten SJL-Mäusen zeigte sich im paarweisen Vergleich

am 196. Tag pi eine signifikante Erhöhung der Werte, welche einerseits durch den

konstanten Anstieg bei diesem Stamm, andererseits durch den Abfall der Werte bei

den infizierten C57BL/6-Mäusen zum Ende der Messungen begründet war (s. Abb,

44 und 45, Anhang, Tab. 36).

116 Ergebnisse

Abb 45: GFAP+ Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 44: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 188), 98.Tag pi, GFAP-Immunhistologie (DAB). 44a: Nachweis von GFAP+ Astrozyten in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 250 µm. 44b: Vergrößerung von 44a. Astrogliose in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 50 µm.

44a 44b

Ergebnisse 117

4.3 Apoptosenachweis und Fas-Expression in entzündlichen Arealen des ZNS empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäusestämme

4.3.1 Aktivierte Caspase-3+ Zellen

4.3.1.1 Aktivierte Caspase-3+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

In den parenchymatösen Läsionen von Thalamus und Hypothalamus fanden sich

neben einer deutlichen Dominanz der Anzahl aktivierte Caspase-3+ Zellen bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen auch die

höchsten Werte immunhistologisch positiver Zellen. In allen anderen Lokalisationen

konnten nur geringe Werte bis zum 56. Versuchstag bei beiden infizierten

Mäusestämmen detektiert werden.

Mittels Kruskal-Wallis-Test fanden sich signifikante Unterschiede bei beiden

infizierten Mäusestämmen über den zeitlichen Verlauf in den meningealen Infiltraten

und den perivaskulären Infiltraten des Hippocampus und des Thalamus und

Hypothalamus. In diesen Lokalisationen zeigten sich bei beiden Mäusestämmen in

der frühen Phase (7. – 14. Versuchstag) Caspase-3+ Zellen. Im Weiteren konnten

signifikante Unterschiede in perivaskulären Infiltraten des Cortex cerebri und Corpus

callosum der infizierten SJL-Mäuse ermittelt werden. Hier zeigte sich in der akuten

Frühphase der Infektion (7. Tag pi) ein deutlicher Anstieg Caspase-3+ Zellen. In

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz konnten nur sehr wenige

immunhistologisch positive Zellen ermittelt werden. Auf Grund der erhöhten Anzahl

Caspase-3+ Zellen in der akuten Frühphase (7. Versuchstag) bei den infizierten

Mäusen, konnten mittels Gruppenvergleich des Kruskal-Wallis-Test signifikante

Unterschiede am 7. Versuchstag in den perivaskulären Infiltraten aller untersuchten

Lokalisationen nachgewiesen werden. In den meningealen Infiltraten ergaben sich

signifikante Unterschiede am 7. und 14. Versuchstag (s. Anhang, Tab. 37).

In den meningealen Infiltraten waren die Werte der aktivierte Caspase-3+ Zellen am

7. Versuchstag mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test bei den infizierten

118 Ergebnisse

C57BL/6-Mäusen signifikant gegenüber den Plazebo-Tieren und den infizierten SJL-

Mäusen erhöht. Im weiteren zeitlichen Verlauf zeigten sich vergleichbar hohe Werte

der beiden infizierten Gruppen, es konnte am 14. Tag pi eine signifikante Erhöhung

der Werte bei infizierten Mäusestämmen im Vergleich zu Plazebo-Tieren ermittelt

werden. Am 56. Tag pi konnte nur noch bei den infizierten C57BL/6-Mäusen geringe

Werte immunhistologisch positiver Zellen nachgewiesen werden (s. Anhang, Tab.

37).

In den perivaskulären Infiltraten von Cortex cerebri und Corpus callosum wies der

paarweise Vergleich am 7. Versuchstag signifikant erhöhte Werte des

Apoptosemarkers bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu Plazebo-Tieren

des gleichen Stammes nach. Schon am 14. Tag pi waren in beiden Lokalisationen

keine aktivierte Caspase-3+ Zellen mehr nachweisbar (s. Anhang, Tab. 37).

In der akuten Frühphase der TMEV-Infektion (7. Tag pi) konnten in den

perivaskulären Infiltraten des Hippocampus signifikant erhöhte Werte aktivierte

Caspase-3+ Zellen bei den infizierten Mäusestämme im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren ermittelt werden. Am 14. Tag pi waren nur noch vereinzelt immunhistologisch

positive Zellen in der untersuchten Lokalisation detektierbar (s. Anhang, Tab. 37).

Am 7. und 14. Versuchstag fanden sich wenige aktivierte Caspase-3+ Zellen in den

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz beider infizierter

Mäusestämme.

In den perivaskulären Infiltraten von Thalamus und Hypothalamus konnte am 7. Tag

pi gleichartig hohe Zahlen aktivierte Caspase-3+ Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämme markiert werden. Es fand sich nach Anwendung des Mann-Whitney-

U-Tests zu diesem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zu den Plazebo-Tieren.

Die infizierten C57BL/6-Mäuse zeigten bis zum 56. Versuchstag einzelne

immunhistologisch positive Zellen, die infizierten SJL-Mäuse nur bis zum 14.

Versuchstag (s. Anhang, Tab. 37).

Ergebnisse 119

4.3.1.2 Aktivierte Caspase-3+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

Lediglich in hyperzellulären Arealen des Corpus callosum konnte bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen wenige Caspase-3+ Zellen ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 38).

Somit ergab sich über den zeitlichen Verlauf in dieser Lokalisation kein signifikanter

Unterschied bei den infizierten, resistenten Mäusen. In allen anderen hyperzellulären

Arealen fanden sich über den zeitlichen Verlauf signifikante Unterschiede bei beiden

infizierten Mäusestämme. Die deutlich erhöhten Werte des Apoptosemarkers in der

Frühphase (7. – 14. Versuchstag) resultierten in signifikanten Unterschieden an

diesen Untersuchungszeitpunkten zwischen den vier Gruppen.

In den parenchymatösen Läsionen des Cortex cerebri fanden sich am 7. Tag pi

gleichwertig große Mengen aktivierte Caspase-3+ Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämmen. Es zeigte sich im paarweisen Vergleich an diesem

Untersuchungszeitpunkt ein signifikanter Unterschied zu den Plazebo-Mäusen. Bei

den infizierten SJL-Mäusen konnte auch am 14. Versuchstag noch eine signifikante

Erhöhung der Anzahl immunhistologisch positiver Zellen im Vergleich zu den

Plazebo-Mäusen detektiert werden (s. Anhang, Tab. 38).

Innerhalb der parenchymatösen Läsionen des Corpus callosum fanden sich am 7.

und 14. Tag pi nach Anwendung des Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Werte

der infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen des gleichen

Stammes und der infizierten C57BL/6-Mäusen. Es konnte zu keinem späteren

Zeitpunkt in dieser Lokalisation immunhistologisch positive Zellen nachgewiesen

werden (s. Abb. 46 und 47, Anhang, Tab. 38).

Am 7. und 14. Versuchstag wiesen beide infizierten Mäusestämme in den

hyperzellulären Bereichen der Hippocampusformation einen signifikant erhöhten

Wert der aktivierte Caspase-3+ Zellen im Vergleich zu ihren Plazebo-Tieren auf.

Während die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen am 14. Tag pi deutlich sanken,

blieben die der infizierten C57BL/6-Mäuse auf einem geringgradig gesunkenen

Niveau und waren somit gegenüber denen der SJL-Mäuse signifikant erhöht. Am 56.

120 Ergebnisse

Tag pi wiesen nur noch die C57BL/6-Mäuse geringe Werte des Apoptosemarkers auf


Am 7. Tag pi zeigte sich mittels Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung der

Anzahl aktivierte Caspase-3+ Zellen in den parenchymatösen Läsionen der

paraventrikulären Substanz bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den

infizierten SJL-Mäusen. Die Werte beider infizierter Mäusestämme waren zudem

signifikant gegenüber den Plazebo-Mäusen erhöht. Im weiteren zeitlichen Verlauf

zeigte sich am 14. Versuchstag deutlich gesunkene Werte bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen, jedoch fand sich weiterhin eine signifikante Erhöhung gegenüber

den Plazebo-Mäusen (s. Abb. 46, Anhang, Tab. 38).

In der akuten Phase der TMEV-Infektion (7. und 14. Tag pi) zeigten beide infizierten

Mäusestämme in den hyperzellulären Bereichen von Thalamus und Hypothalamus

im paarweisen Vergleich eine signifikante Erhöhung der Werte aktivierter Caspase-3+

Zellen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren. Die Anzahl der Apoptosen am 7. Tag pi

war bei den infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant gegenüber denen der infizierten

SJL-Mäuse erhöht. Bis in die chronische Spätphase (196. Tag pi) fanden sich bei

beiden infizierten Mäusestämmen wenige aktivierte Caspase-3+ Zellen (s. Anhang,

Tab. 38).

Abb. 46: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 156), 7.Tag pi, aktivierte Caspase-3-Immunhistologie (DAB). 46a: Nachweis einzelner aktivierter Caspase-3+ Zellen im Corpus callosum (Pfeile) des Großhirns. Balken: 20 µm. 46b: Aktivierte Caspase-3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen (Sterne) der paraventrikulären Substanz des Großhirns. Balken: 50 µm.

46a 46b

Ergebnisse 121

4.3.1.3 Aktivierte Caspase-3+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn

Während in der überwiegenden Zahl der untersuchten Lokalisationen die Menge

Caspase-3+ Zellen in der akuten Frühphase (7. und 14. Tag pi) bei beiden infizierten

Mäusestämmen vergleichbar hoch war, zeigte sich beginnend ab dem 56.

Versuchstag eine erhöhte Zahl apoptotischer Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen.

Mittels Kruskal-Wallis-Test fanden sich signifikante Unterschiede über den zeitlichen

Verlauf in den meningealen Infiltraten bei infizierten C57BL/6-Mäusen, sowie in den

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz beider infizierter

Mäusestämme. Nur in diesen Lokalisationen fanden sich erhöhte Werte Caspase-3+

Zellen. Der zeitpunktbezogene Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich wies auf Grund

erhöhter apoptotischer Zellen in den meningealen Infiltraten infizierter C57BL/6-

Mäuse einen signifikanten Unterschied am 7. Versuchstag in dieser Lokalisation

Abb. 47: Aktivierte Caspase-3+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Corpus callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

122 Ergebnisse

nach. Beginnend am 7. bis zum 98. Versuchstag fanden sich geringgradige Mengen

Caspase-3+ positiver Zellen in den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären

Substanz, so dass an den genannten Zeitpunkten signifikante Unterschiede ermittelt

werden konnten. In perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz des

Stammhirns fanden sich immunhistologisch positive Zellen beginnend in der

chronischen Phase. Der durchgeführte Gruppenvergleich lieferte signifikante

Unterschiede am 56. Versuchstag in beiden Lokalisationen und zusätzlich am 98.

Versuchstag in perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz (s. Anhang Tab. 39).

In den meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn fand sich im paarweisen

Vergleich in der akuten Frühphase (7. Tag pi) eine signifikante Erhöhung aktivierte

Caspase-3+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren. Nachdem nur wenige positive Werte nach dem 14. Versuchstag bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen nachweisbar waren, konnte der Mann-Whitney-U-Test

am 98. Versuchstag eine signifikante Erhöhung immunhistologisch positiver Werte

bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den

infizierten C57BL/6-Mäusen ermitteln. Am 196. Tag pi wiesen die infizierten SJL-

Mäuse vereinzelt aktivierte Caspase-3+ Zellen auf (s. Anhang, Tab. 39).


Ventrikels waren die Werte aktivierte Caspase-3+ Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren bis zum 98. Versuchstag signifikant

erhöht. Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren

waren die Werte aktivierter Caspase-3+ Zellen bis zum 14. Versuchstag signifikant

erhöht. Die Anzahl immunhistologisch positiver Zellen sank bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen nach dem 14. Versuchstag deutlich ab, so dass am 56. und auch

am 98. Tag pi die Anzahl bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant gegenüber

denen der infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht war. In der chronischen Spätphase

fanden sich keine weiteren immunhistologisch positiven Zellen bei beiden Gruppen


In den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz des Stammhirns wiesen beide

infizierten Mäusestämme während des zeitlichen Verlauf der TMEV-Infektion nur

Ergebnisse 123

wenige aktivierte Caspase-3+ Zellen auf. Es konnten keine signifikanten

Unterschiede ermittelt werden (s. Abb. 48, Anhang, Tab. 39).

In den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz des Stammhirns konnten keine

aktivierte Caspase-3+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen nachgewiesen

werden. Die Werte stiegen aber bei den infizierten SJL-Mäusen kontinuierlich an,

und erreichten am 56. und 98. Versuchstag Höchstwerte. Somit war am 56. Tag pi

die Anzahl immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen

signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere und der infizierten C57BL/6-Mäuse

erhöht. Am 196. Versuchstag waren die Zahlen geringfügig gesunken (s. Abb. 48,

Anhang, Tab. 39).

4.3.1.4 Aktivierte Caspase-3+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

In den hyperzellulären Arealen der paraventrikulären Substanz beider infizierter

Mäusestämme und in den hyperzellulären Bereichen der grauen Substanz der

infizierten C57BL/6-Mäuse fanden sich mittels Kruskal-Wallis-Test signifikante

Unterschiede über den zeitlichen Verlauf. In diesen Lokalisationen erfolgte ein früher

Nachweis Caspase-3+ Zellen, die in der chronischen Phase nicht mehr vorhanden

waren (s. Anhang, Tab. 40). Der frühe Nachweis apoptotischer Zellen in

hyperzellulären Arealen der paraventrikulären Substanz und in der grauen Substanz

des Stammhirns erbrachte signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen

beginnend am 7. bis zum 98. Versuchstag. In der weißen Substanz des Stammhirns

ließen sich ab dem 56. Tag pi erste Caspase-3+ Zellen ermitteln (s. Anhang, Tab.

40). Der Kruskal-Wallis-Test wies somit signifikante Unterschiede im

Gruppenvergleich in der chronischen Phase der Infektion nach (56. – 196.

Versuchstag).

Noch am 7. und 14. Tag pi wiesen beide infizierte Mäusestämme identisch hohe

Mengen aktivierte Caspase-3+ Zellen in den parenchymatösen Läsionen der

paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels auf. Es zeigte sich zu diesen

Zeitpunkten, im paarweisen Mann-Whitney-U-Test, eine signifikante Erhöhung der

124 Ergebnisse

infizierten Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen. Am 56. Versuchstag waren

die Zahlen immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen

deutlich gesunken, während die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen nach wie vor

signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse und somit auch gegenüber denen

der infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht waren. Im weiteren zeitlichen Verlauf fanden

sich bei den infizierten SJL-Mäusen am 98. Tag pi nur noch wenige aktivierte

Caspase-3+ Zellen (s. Abb. 48, Anhang, Tab. 40).

In den parenchymatösen Läsionen der grauen Substanz des Stammhirns fanden

sich in der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) signifikant erhöhte Werte aktivierte

Caspase-3+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im paarweisen Vergleich zu

den Plazebo-Tieren. Bei den infizierten SJL-Mäusen konnten nur wenige

immunhistologisch positive Zellen in dieser Phase der TMEV-Infektion detektiert

werden. Nachdem die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen am 56. Tag pi

deutlich gesunken und somit nur noch vereinzelt nachweisbar waren, zeigte sich hier

eine signifikante Erhöhung der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu

der resistenten Mäusepopulation. Bis in die chronische Spätphase hinein (196. Tag

pi) war lediglich bei dem empfänglichen Mäusestamm einzelne aktivierte Caspase-3+

Zellen ermittelbar (s. Abb. 48, Anhang, Tab. 40).

In den parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz des Stammhirns fanden

sich am 7. und 14. Tag pi bei beiden infizierten Mäusestämmen einzelne aktivierte

Caspase-3+ Zellen. In der chronischen Phase (56. und 98. Tag pi) zeigten sich,

mittels Mann-Whitney-U-Test ermittelt, signifikant erhöhte Werte der infizierten SJL-

Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen. Am

196. Versuchstag fanden sich nur noch einzelne aktivierte Caspase-3+ Zellen bei

dem infizierten, empfänglichen SJL-Mäusestamm (s. Abb. 48 und 49, Anhang, Tab.

40).

Ergebnisse 125

Abb. 48: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56. Tag pi, aktivierte Caspase-3-Immunhistologie (DAB). 48a: Nachweis aktivierte Caspase-3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) um den vierten Ventrikel. Balken: 50 µm. 48b: Aktivierte Caspase-3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeil) im Stammhirn. Balken: 50 µm.

Abb. 49: Aktivierte Caspase-3+ Zellen in der weißen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

48a 48b

126 Ergebnisse

4.3.1.5 Aktivierte Caspase-3+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

Über den zeitlichen Verlauf der TMEV-Infektion fand sich eine schwache Dominanz

der aktivierte Caspase-3+ Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen. In den

hyperzellulären Arealen der grauen und weißen Substanz waren wenige

apoptotische Zellen auch bei den infizierten C57BL/6-Mäusen nachweisbar.

Auf Grund des geringen aber konstanten Nachweis Caspase-3+ Zellen in den

meningealen und perivaskulären Infiltraten des Rückenmarks beider infizierter

Mäusestämme konnte mittels Kruskal-Wallis-Test keine signifikanten Unterschiede

über den zeitlichen Verlauf ermittelt werden . Der Gruppenvergleich wies jedoch in

den meningealen Infiltraten von den 7. - 98. Versuchstag signifikanten Unterschieden

nach. Weiterhin konnte in perivaskulären Infiltraten der weißen

Rückenmarkssubstanz signifikante Unterschiede am 56. und 98. Versuchstag

zwischen den Gruppen ermittelt werden (s. Anhang Tab. 41).

Während am 7. Tag pi in den meningealen Infiltraten vergleichbar hohe Werte

aktivierte Caspase-3+ Zellen bei den infizierten Mäusen ermittelt werden konnte,

sanken die Werte hiernach bei den infizierten C57BL/6-Mäusen deutlich ab. Es

ergaben sich im paarweisen Mann-Whitney-U-Test für die Versuchstage 14, 56, und

98 pi signifikant erhöhte Werte immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten

SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den infizierten C57BL/6-

Mäusen. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) waren bei beiden infizierten

Mäusepopulationen keine aktivierte Caspase-3+ Zellen nachweisbar (s. Anhang, Tab.

41).

Innerhalb der perivaskulären Infiltrate der grauen Substanz konnten nur am 98. Tag

pi einzelne positive Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen mittels des eingesetzten

Apoptosemarkers nachgewiesen werden (s. Anhang, Tab. 41).

In den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz des Rückenmarks fanden sich

am 7. Versuchstag bei beiden Mäusestämmen einzelne immunhistologisch positive

Zellen. Am 14. Tag pi konnten keine aktivierte Caspase-3+ Zellen detektiert werden.

Ergebnisse 127

Zu Beginn der chronischen Phase und im weiteren Verlauf (56. und 98. Tag pi) war

ein deutlicher Anstieg der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen zu verzeichnen,

wobei die Werte am 98. Tag pi signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere und

der infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht waren. Am 196. Versuchstag fanden sich

keine weiteren aktivierte Caspase-3+ Zellen (s. Abb. 50, Anhang, Tab. 41).

4.3.1.6 Aktivierte Caspase-3+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Lediglich in den hyperzellulären Arealen der weißen Substanz des Rückenmarks

infizierter SJL-Mäuse fand sich am 14. und 56. Versuchstag eine deutliche

Akkumulation Caspase-3+ Zellen, welche zum Ende der Messungen deutlich abfielen

(s. Anhang, Tab. 42). Hieraus ergab sich ein signifikanter Unterschied über den

zeitlichen Verlauf. Auf Grund des deutlichen Nachweises immunhistologischer Zellen

in der weißen Substanz infizierter Mäuse ermittelte der zeitpunktbezogene

Gruppenvergleich signifikante Unterschiede vom 14. bis zum 196. Versuchstag.

Innerhalb der parenchymatösen Läsionen der grauen Substanz fand sich eine

erhöhte Zahl aktivierter Caspase-3+ Zellen am 7. Versuchstag bei beiden infizierten

Mäusestämmen. Im Verlauf der Infektion konnte dann am 56. Tag pi vereinzelte

immunhistologisch positive Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen ermittelt werden (s.

Anhang, Tab. 42).

Innerhalb der parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz wiesen die infizierten

C57BL/6-Mäuse geringe Mengen aktivierte Caspase-3+ Zellen an den Tagen 14, 56

und 98 pi auf. An diesen Untersuchungszeitpunkten waren die Werte der infizierten

SJL-Mäuse im paarweisen Vergleich signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere

erhöht. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) fiel die Anzahl der aktivierte

Caspase-3+ Zellen der infizierten SJL-Mäuse deutlich ab (s. Abb. 50 und 51, Anhang,

Tab. 42).

128 Ergebnisse

Abb. 50: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56.Tag pi, aktivierte Caspase-3-Immunhistologie (DAB). 50a: Nachweis aktivierte Caspase-3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeile) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 50 µm. 50b: Vergrößerung von 50a. Aktivierte Caspase-3+ Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitze) und einzelner apoptotischer Myelinophage (Pfeil) in der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 20 µm.

Abb. 51: Aktivierte Caspase-3+ Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

50b50a

Ergebnisse 129

4.3.2 TUNEL+, pyknotische Zellen

4.3.2.1 TUNEL+, pyknotische Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

In den meningealen Infiltraten und den parenchymatösen Läsionen des

Hippocampus, der paraventrikulären Substanz und von Thalamus und Hypothalamus

fanden sich eine deutliche Dominanz TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen in der akuten Phase

der TMEV-Infektion (7. und 14. Tag pi). Alle anderen untersuchten Lokalisationen

wiesen ähnlich hohe TUNEL+ pyknotische Zellen in der akuten Phase (7. und 14.

Tag pi) bei dem Vergleich der resistenten und empfänglichen Mäusestämmen auf.

Ausnahmen hiervon fanden sich in den hyperzellulären Bereichen des Cortex cerebri

und des Corpus callosum. Hier ließen sich deutlich höhere Werte apoptotischer

Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen nachweisen.


bei beiden infizierten Mäusestämmen in den meningealen Infiltraten und den

perivaskulären Infiltraten des Hippocampus. Darüber hinaus fanden sich auch in den

perivaskulären Infiltraten des Cortex cerebri, des Corpus callosum und der

paraventrikulären Substanz der infizierten SJL-Mäuse ein signifikanter Unterschied.

Die infizierten C57BL/6-Mäusen wiesen über den zeitlichen Verlauf einen

signifikanten Unterschied in den perivaskulären Infiltraten des Thalamus und

Hypothalamus auf. In allen genannten Lokalisationen war eine deutliche

Akkumulation TUNEL+ pyknotischer Zellen in der Frühphase der Infektion (7.- 14-

Versuchstag) ermittelbar, dies ergab signifikante Unterschiede im Gruppenvergleich

aller untersuchter Lokalisationen am 7. Versuchstag (s. Anhang, Tab. 43). In den

meningealen Infiltraten und in den perivaskulären Infiltraten konnten zudem

signifikante Unterschiede am 14. Tag pi ermittelt werden.

In den meningealen Infiltraten zeigte sich am 7. Tag pi im paarweisen Vergleich eine

signifikante Erhöhung TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den infizierten SJL-Mäusen. Die

130 Ergebnisse

Werte blieben bei dem resistenten Mäusestamm am 14. Versuchstag konstant hoch,

die Werte bei den infizierten SJL-Mäusen stiegen an, so dass an diesem

Versuchstag die infizierten Mäuse signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu den

Plazebo-Mäusen aufwiesen. Im weiteren zeitlichen Verlauf fanden sich bei beiden

Mäusestämmen vereinzelt TUNEL+ pyknotische Zellen (s. Anhang, Tab. 43).

In den perivaskulären Infiltraten von Cortex cerebri und Corpus callosum fand sich

am 7. Versuchstag signifikant erhöhte Werte TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den

infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen. Am 14 Tag pi konnte

nur noch bei infizierten SJL-Mäusen geringe Mengen an TUNEL+ pyknotischen

Zellen nachgewiesen werden (s. Anhang, Tab. 43).

Innerhalb der perivaskulären Infiltrate der Hippocampusformation ermittelte der

Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Erhöhung der Werte TUNEL+ pyknotischer

Zellen am 7. und 14. Versuchstag bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu

den Plazebo-Tieren. Bei dem Vergleich der infizierten C57BL/6-Mäuse mit den

Plazebo-Tieren konnte dies nur am 7. Tag pi nachgewiesen werden. Am 56.

Versuchstag waren keine perivaskulären Infiltrate bei beiden Mäusestämmen

detektierbar (s. Anhang, Tab. 43).

In den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz und von Thalamus

und Hypothalamus zeigte sich in der akuten frühen Phase der TMEV-Infektion (7.

Tag pi) in der paraventrikulären Substanz bei den infizierten SJL-Mäusen und bei

den entzündlichen Infiltraten von Thalamus und Hypothalamus bei beiden infizierten

Mäusestämmen eine signifikante Erhöhung der Werte zu den Plazebo-Tieren. Am

14. Versuchstag fanden sich in den genannten Lokalisationen wenige TUNEL+

pyknotische Zellen bei beiden infizierten Mäusepopulationen (s. Abb. 52, Anhang,

Tab. 43).

4.3.2.2 TUNEL+ pyknotische Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

In allen untersuchten hyperzellulären Bereichen des Großhirns fand sich eine

deutliche frühe Akkumulation TUNEL+ pyknotischer Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämmen (s. Anhang, Tab. 44). Lediglich in hyperzellulären Bereichen des

Corpus callosum infizierter C57BL/6-Mäuse konnten nur wenige TUNEL+

Ergebnisse 131

pyknotische Zellen ermittelt werden. Der Kruskal-Wallis-Test wies somit signifikante

Unterschiede über den zeitlichen Verlauf bei beiden infizierten Mäusestämmen auf.

Die war in nahezu allen Regionen des Großhirns mit Ausnahme des Corpus

callosum infizierter C57BL/6-Mäuse ermittelbar. Der zeitpunktbezogene

Gruppenvergleich zeigte signifikante Unterschiede in allen Regionen des Großhirns

in der akuten Phase (7. und 14. Versuchstag).

Mittels paarweisen Mann-Whitney-U-Test fanden sich in den parenchymatösen

Läsionen des Cortex cerebri am 7. Versuchstag signifikant erhöhte Werte TUNEL+

pyknotischer Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen im Vergleich zu den

Plazebo-Tieren. Am 14. Tag pi waren die Werte bei den infizierten C57BL/6-Mäusen

deutlich abgesunken, so dass ein signifikanter Unterschied zwischen den infizierten

SJL-Mäusen und den infizierten C57BL/6-Mäusen sowie den Plazebo-Tieren

ermittelt werden konnte. Im weiteren zeitlichen Verlauf fanden sich keine TUNEL+

pyknotischen Zellen bei den infizierten Mäusestämmen (s. Anhang, Tab. 44).

In den hyperzellulären Bereichen des Corpus callosum fanden sich im paarweisen

Test am 7. und 14. Versuchstag signifikant erhöhte Werte bei infizierten SJL-Mäusen

im Vergleich zu Plazebo-Tieren. Da die Menge der apoptotischen Zellen bei den

empfänglichen SJL-Mäusen am 14. Versuchstag geringgradig gesunken war, konnte

nur in der akuten Frühphase (7. Tag pi) ein signifikanter Unterschied zwischen den

infizierten Mäusen ermittelt werden. Wie im Cortex cerebri fanden sich auch in dieser

Lokalisation keine weiteren immunhistologisch positiven Zellen in der chronischen

Phase (56.-196. Tag pi) (s. Abb. 53, Anhang, Tab. 44).

Es fand sich in der akuten Frühphase der TMEV-Infektion (7. Tag pi) identisch hohe

Werte TUNEL+ pyknotischer Zellen in den parenchymatösen Läsionen der

Hippocampusformation infizierter Mäuse. Die Werte beider infizierten Mäusestämme

waren zu diesem Zeitpunkt signifikant gegenüber denen der Plazebo-Tiere erhöht.

Am 14. Tag pi zeigte sich ein deutlicher Anstieg der Werte bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen, es konnte somit ein signifikanter Unterschied zwischen den

beiden infizierten Mäusestämmen als auch zwischen den infizierten Mäusen und den

Plazebo-Tieren nachgewiesen werden (s. Anhang, Tab. 44).

132 Ergebnisse

Am 7. Tag pi zeigte sich im Mann-Whitney-U-Test eine signifikante Dominanz der

Anzahl TUNEL+ pyknotischer Zellen in den parenchymatösen Läsionen der

paraventrikulären Substanz bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den

Plazebo-Tieren. Die Werte beider infizierter Mäusestämme waren zudem signifikant

gegenüber den Plazebo-Mäusen erhöht. Im weiteren zeitlichen Verlauf zeigte sich

am 14. Versuchstag geringgradig gesunkene Werte bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen, jedoch fand sich weiterhin eine signifikante Erhöhung gegenüber den

Plazebo-Mäusen zu diesem Zeitpunkt. Lediglich am 196. Versuchstag konnte bei

einer infizierten SJL-Maus (TAI 200) weitere TUNEL+ pyknotische Zellen ermittelt


In den parenchymatösen Läsionen von Thalamus und Hypothalamus zeigte sich im

paarweisen Vergleich am 7. und 14. Versuchstag eine signifikante Erhöhung der

Menge TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im

Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen. Beide TMEV-infizierten Mäusestämme

wiesen zudem signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu den Plazebo-Tieren auf.

Nachdem die Werte bei den infizierten Tieren deutlich gesunken waren, konnte am

56. und 196. Versuchstag eine vergleichbar hohe Anzahl positiver Zellen bei beiden

Mäusestämmen detektiert werden (s. Anhang, Tab. 44).

Abb. 52: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 154), 7.Tag pi, TUNEL-Methode. 52a: Nachweis TUNEL+, pyknotischer Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) und in perivaskulären Infiltraten (Pfeile) der paraventrikulären Substanz des Großhirns. Balken: 20 µm. 52b: TUNEL+, pyknotische Zellen in einem perivaskulären Infiltrat des Thalamus (Pfeilspitzen). Balken: 10 µm.

52a

52b

Ergebnisse 133

4.3.2.3 TUNEL+ pyknotische Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns

Während in der akuten Frühphase (7. und 14. Tag pi) identisch hohe Werte TUNEL+

pyknotischer Zellen in den meisten untersuchten Lokalisationen bei beiden

Mäusestämmen nachweisbar waren, zeigte sich ab dem 56. Tag pi nur noch bei den

infizierten SJL-Mäusen erhöhte Werte TUNEL+ pyknotischer Zellen. In der grauen

und weißen Substanz des Kleinhirns fanden sich keine apoptotischen Zellen.

Der Kruskal-Wallis-Test ermittelte in den meningealen Infiltraten und den

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz infizierter C57BL/6-Mäuse

einen signifikanten Unterschied über den zeitlichen Verlauf. Des Weiteren fanden

sich in perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz ebenfalls signifikante

Unterschiede bei beiden infizierten Mäusestämmen. In den meningealen Infiltraten

und den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz infizierter

C57BL/6-Mäuse zeigte sich eine frühe Akkumulation TUNEL+ pyknotischer Zellen,

wohingegen bei den infizierten SJL-Mäusen eher konstante Mengen TUNEL+

Abb. 53: TUNEL+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Corpus callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

134 Ergebnisse

pyknotischer Zellen nachweisbar waren. Hieraus ergaben sich signifikante

Unterschiede zwischen den Gruppen am 7. Versuchstag in den meningealen

Infiltraten sowie vom 7. bis 56. Versuchstag in den perivaskulären Infiltraten um den

vierten Ventrikel. In perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz des

Stammhirns zeigten beide infizierte Mäusestämme die Akkumulation TUNEL+

pyknotischer Zellen am 56. Versuchstag. Hiernach sanken die Werte deutlich ab (s.

Anhang, Tab. 45). Somit konnte mittels Kruskal-Wallis-Gruppenvergleich zu Beginn

der chronischen Phase (56. Tag pi) signifikante Unterschiede in den genannten

Lokalisationen ermittelt werden.

In den meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn konnte mittels paarweisen

Mann-Whitney-U-Test am 7. Tag pi signifikant erhöhte Werte TUNEL+ pyknotischer

Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen und

den infizierten SJL-Mäusen detektiert werden. Am 14. und 56. Versuchstag fanden

sich vergleichbar hohe Werte bei beiden Mäusestämmen. In der chronischen Phase

der TMEV-Infektion stiegen die Werte der infizierten SJL-Mäuse an und waren am

98. Versuchstag signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse und denen der

infizierten C57BL/6-Mäusen erhöht (s. Anhang, Tab. 45).

Auch in den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels waren am 7. und 14. Versuchstag bei beiden Mäusestämmen vergleichbar

hohe Werte TUNEL+ pyknotischer Zellen darstellbar, die Werte der infizierten Mäuse

waren an diesen Untersuchungszeitpunkten signifikant gegenüber denen der

Plazebo-Mäuse erhöht. Während die TUNEL+ pyknotischen Zellen bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen am 56. Versuchstag deutlich sanken, zeigten die infizierten SJL-

Mäuse konstant hohe Werte. Somit konnten signifikant erhöhte Werte bei den

infizierten SJL-Mäusen im Vergleich mit Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-

Mäusen ermittelt werden. Am 98. Tag pi konnten noch einzelne positive Zellen mit

pyknotischer Morphologie bei den infizierten SJL-Mäusen nachgewiesen werden (s.

Anhang, Tab. 45).

Am 7. und 14. Versuchstag waren vereinzelte TUNEL+ pyknotische Zellen in den

perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz des Stammhirns beider

infizierter Mäusestämme nachweisbar. Am 56. Tag pi waren die Werte bei den

Ergebnisse 135

infizierten SJL-Mäusen im paarweisen Vergleich signifikant gegenüber denen der

Plazebo-Mäuse und denen der infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht. Bis zum 196.

Versuchstag konnten wenige TUNEL+ pyknotische Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 45).

4.3.2.4 TUNEL+ pyknotische Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

In hyperzellulären Arealen der paraventrikulären Substanz der infizierten

Mäusestämme, sowie in hyperzellulären Bereichen der grauen Substanz des

Stammhirns infizierter C57BL/6-Mäuse zeigte sich eine deutliche Akkumulation

TUNEL+ pyknotischer Zellen, welche in der chronischen Phase nicht mehr detektiert

werden konnten (s. Anhang, Tab. 46). Hieraus ergaben sich in den genannten

Lokalisationen, mittels Kruskal-Wallis-Test ermittelt, signifikante Unterschiede über

den zeitlichen Verlauf. In hyperzellulären Arealen der paraventrikulären Substanz

sowie in der grauen Substanz des Stammhirns ermittelte der Kruskal-Wallis-Test von

den 7. bis 98. Versuchstag signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen. In

hyperzellulären Arealen der weißen Stammhirnsubstanz waren diese signifikanten

Unterschiede zwischen den Gruppen streng auf die chronische Phase beschränkt

(56. bis 196. Versuchstag).

Am 7. und 14. Tag pi war die Anzahl TUNEL+ pyknotischer Zellen in den

parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz des vierten Ventrikels

bei beiden infizierten Mäusestämmen vergleichbar hoch. Die infizierten Tiere wiesen

im Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren auf. Die Werte der infizierten SJL-Mäuse blieben zu Beginn der chronischen

Phase (56. Tag pi) auf einem konstant hohen Niveau und waren somit im Vergleich

zu den deutlich gesunkenen Werten der infizierten C57BL/6-Mäuse signifikant

erhöht. Im Verlauf der chronischen Phase (98. und 196. Tag pi) sanken die Werte bei

den infizierten, empfänglichen Mäusen langsam ab (s. Abb. 54 und 55, Anhang, Tab.

46).

136 Ergebnisse

In den parenchymatösen Läsionen der grauen Substanz des Stammhirns waren in

der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) die Werte TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant gegenüber denen der Plazebo-Mäuse erhöht,

während bei den infizierten SJL-Mäusen zu diesen Zeitpunkten nur wenige positive

Zellen detektiert wurden. In der chronischen Phase (56. - 196. Tag pi) zeigten sich

umgekehrte Werte. Schon am 56. Versuchstag war die Anzahl der TUNEL+

pyknotischen Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant gegenüber denen der

Plazebo-Mäuse und denen der infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht. Am 98. Tag pi

waren die Zahlen der infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Tieren

immer noch signifikant erhöht. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi) fanden

sich TUNEL+ pyknotischer Zellen nur noch bei dem empfänglichen Mäusestamm (s.


Während am 7. und 14. Versuchstag noch beide infizierte Mäusestämme identisch

hohe Werte TUNEL+ Zellen in den parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz

des Stammhirns zeigten, waren die Werte am 56. Tag pi bei den infizierten SJL-

Mäusen signifikant gegenüber den Werten der Plazebo-Tieren und den Werten der

infizierten C57BL/6-Mäuse erhöht. Im weiteren zeitlichen Verlauf fanden sich bei den

infizierten SJL-Mäusen deutlich erhöhte Werte (s. Anhang, Tab. 46).

Abb. 54: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56.Tag pi, TUNEL-Methode. 54a: TUNEL+, pyknotische Zellen in parenchymatösen Läsionen (Pfeile) um den vierten Ventrikel. Balken: 10 µm. 54b: Nachweis von TUNEL+, pyknotischen Zellen in parenchymatösen Läsionen der grauen Subsatnz des Stammhirns (Pfeilspitzen). Balken: 30 µm.

54a

54b

Ergebnisse 137

4.3.2.5 TUNEL+ pyknotische Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

In dem überwiegenden Teil der Lokalisationen des Rückenmarks zeigte sich

akzentuiert in der chronischen Phase (56. – 196. Tag pi) eine deutliche Dominanz

der TUNEL+ pyknotischen Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen.

Der Kruskal-Wallis-Test wies über den zeitlichen Verlauf signifikante Unterschiede in

den meningealen und den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz bei den

infizierten SJL-Mäusen nach. In diesen Lokalisationen fanden sich eine erhöhte

Mengen TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen. In den

meningealen Infiltraten waren diese Werte bei den infizierten SJL-Mäusen vom7. bis

14. Tag nahezu konstant hoch, weshalb an diesen Untersuchungstagen ein

signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen mittels Kruskal-Wallis-Test

nachgewiesen werden konnte. Weiterhin resultierten die erhöhten Werte der

apoptotischen Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen am 56. und 98. Versuchstag in

Abb. 55: TUNEL+ Zellen in hyperzellulären Arealen des vierten Ventrikels. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

138 Ergebnisse

signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen an diesen Zeitpunkten (s.

Anhang, Tab. 47).

Die infizierten C57BL/6-Mäuse wiesen nur vereinzelt ermittelbare TUNEL+

pyknotische Zellen in den meningealen Infiltraten am 7. Versuchstag auf. Bei den

infizierten SJL-Mäusen fanden sich im paarweisen Test signifikant erhöhte Werte am

7., 14., 56. und 98. Tag pi im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den infizierten

C57BL/6-Mäusen. Am 196. Versuchstag zeigten sich einzelne positive Zellen bei den

SJL-Mäusen (s. Abb. 56 und 57, Anhang, Tab. 47).

In den, in geringen Umfang vorhandenen, perivaskulären Infiltraten der grauen

Substanz des Rückenmarks wies am 98. Tag pi nur eine infizierte SJL Maus (TAI

189), die vereinzelte TUNEL+ pyknotischer Zellen auf.

In den perivaskulären Infiltraten der weißen Rückenmarkssubstanz konnten am 7.

Versuchstag wenige TUNEL+ pyknotische Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämmen nachgewiesen werden. Am 14. Tag pi war in den perivaskulären

Infiltraten der infizierten Mäuse keine positiven Zellen auffindbar. In der beginnenden

chronischen Phase der Infektion (56. und 98. Tag pi) konnten bei den infizierten SJL-

Mäuse im paarweisen Test signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen ermittelt werden. Am 196. Tag pi waren

nur noch wenige TUNEL+ pyknotische Zellen in den Infiltraten der SJL-Mäuse

detektierbar (s. Anhang, Tab. 47).

4.3.2.6 TUNEL+ pyknotische Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Der Kruskal-Wallis-Test konnte in den hyperzellulären Bereichen der weißen

Substanz einen signifikanten Unterschied über den zeitlichen Verlauf bei den

infizierten SJL-Mäusen ermitteln. Die wenigen apoptotischen Zellen in den

meningealen Infiltraten der infizierten SJL-Mäuse zeigten einen signifikanten

Unterschied zwischen den Gruppen an diesem Untersuchungszeitpunkt. Es fand sich

in den hyperzellulären Arealen der weißen Substanz infizierter SJL-Mäuse

beginnend am 14. Tag pi eine deutliche Akkumulation TUNEL+ pyknotischer Zellen,

Ergebnisse 139

nachweisbar bis zum Ende der chronischen Phase (196. Tag pi). Der Kruskal-Wallis-

Test wies somit einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen vom14. bis

196. Versuchstag nach (s. Anhang, Tab. 48).

Innerhalb hyperzellulärer Bereiche der grauen Rückenmarkssubstanz waren am 7.

Versuchstag geringe Werte TUNEL+ pyknotischer Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen messbar. Diese sanken jedoch zum 14. Tag hin deutlich ab und waren nur

noch am 56. und am 98. Versuchstag bei zwei Tieren ermittelbar (TAI 178, TAI 192)

(s. Anhang, Tab. 48).

Am 7. Tag pi fanden sich wenige TUNEL+ pyknotische Zellen in den hyperzellulären

Bereichen der weißen Rückenmarkssubstanz bei den infizierten C57BL/6-Mäusen.

Im weiteren zeitlichen Verlauf war an jedem Untersuchungszeitpunkt (14. – 196. Tag

pi) mittels Mann-Whitney-U-Test signifikant erhöhte Werte TUNEL+ pyknotischer

Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen

nachweisbar. Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen fanden sich signifikant erhöhte

Werte im Vergleich zu den Plazebo-Tieren am 14. Tag pi. Bis zum 98. Versuchstag

konnten vereinzelte TUNEL+ pyknotische Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen

ermittelt werden. Am Ende der chronischen Phase (196. Tag pi) zeigten die

infizierten SJL-Mäuse signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu den infizierten

C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 56, Anhang, Tab. 48).

Abb. 56: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56. Tag pi, TUNEL-Methode. 56a: Nachweis TUNEL+, pyknotischer Zellen in perivaskulären Infiltraten (Pfeile) und in parenchymatösen Läsionen (Sterne) in der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 250 µm. 56b: Vergrößerung von 56a. TUNEL+, pyknotische Zellen in parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz des Rückenmarks (Pfeilspitzen). Balken: 20 µm.

56a 56b

140 Ergebnisse

4.3.3 Fas+ Zellen

4.3.3.1 Fas+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns

Während die Menge der Fas+ Zellen in den perivaskulären Infiltraten aller

untersuchten Lokalisationen kaum messbar waren, zeigten sich in den meningealen

Infiltraten die höchsten Werte Fas+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen.

Der Kruskal-Wallis-Test detektierte in den meningealen Infiltraten und den

perivaskulären Infiltraten des Hippocampus signifikante Unterschiede bei den

infizierten C57BL/6-Mäusen über den zeitlichen Verlauf. Nur in diesen Lokalisationen

zeigte sich eine frühe geringe Infiltration Fas+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen (s. Anhang, Tab. 49). Hieraus ergaben sich im zeitpunktbezogenen

Gruppenvergleich signifikante Unterschiede am 7. und 14. Versuchstag in den

Abb. 57: TUNEL+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 141

meningealen Infiltraten, sowie am 14. Versuchstag in den perivaskulären Infiltraten

des Hippocampus.

Mittels Mann-Whitney-U-Test fand sich in den meningealen Infiltraten am 7. und 14.

Versuchstag eine signifikante Erhöhung der Menge Fas+ Zellen bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen gegenüber den infizierten SJL-Mäusen. Es zeigte sich an diesen

Versuchstagen auch ein signifikanter Unterschied im Vergleich der beiden infizierten

Gruppen mit den Plazebo-Tieren. Bis in die chronische Spätphase (196. Tag pi)

fanden sich einzelne Fas+ Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen (s. Abb. 58


In den perivaskulären Infiltraten von Cortex cerebri und Corpus callosum konnten bei

beiden Mäusestämmen keine Fas+ Zellen ermittelt werden.

Am 7. Tag pi fanden sich wenige Fas+ Zellen in den perivaskulären Infiltraten des

Hippocampus bei den infizierten SJL-Mäusen. Am 14. Versuchstag wiesen die

infizierten C57BL/6-Mäuse im paarweisen Vergleich eine signifikant erhöhte Menge

Fas+ Zellen zu den Plazebo-Mäusen des gleichen Stammes auf. Am 56. Tag pi

waren nur noch einzelne immunhistologisch positive Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen nachweisbar (s. Anhang, Tab. 49).

In den perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären Substanz und in Thalamus und

Hypothalamus konnten nach dem 14. Versuchstag bis zum 98. Versuchstag wenige

Fas+ Zellen bei den infizierten Mäusen beider Gruppen nachgewiesen werden.

4.3.3.2 Fas+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Großhirns

In den intraparenchymatösen Läsionen fanden sich in einigen Lokalisationen meist in

der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) und am Beginn der chronischen Phase (56.

Tag pi) einzelne Fas+ Zellen bei beiden infizierten Mäusestämmen.

In den untersuchten Lokalisationen fanden sich nur wenige Fas+ Zellen bei den

infizierten SJL-Mäusen. Lediglich im Corpus callosum konnte eine deutliche

Infiltration ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 50). Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen

fanden sich, mittels Kruskal-Wallis-Test nachgewiesen, über den zeitlichen Verlauf

signifikante Unterschiede in hyperzellulären Arealen des Cortex cerebri, des

142 Ergebnisse

Hippocampus und der paraventrikulären Substanz. In diesen Regionen war eine

deutliche, frühe Akkumulation von Fas+ Zellen zu verzeichnen. In hyperzellulären

Bereichen von Thalamus und Hypothalamus konnten ebenfalls deutliche

Ansammlungen immunhistologisch positiver Zellen detektiert werden, jedoch war die

Zellzahl bis zum Ende der Messungen nahezu konstant bei beiden infizierten

Mäusestämmen. Auf Grund der frühen Infiltration Fas+ Zellen in den hyperzellulären

Arealen des Cortex cerebri, des Hippocampus, der paraventrikulären Substanz und

von Thalamus und Hypothalamus waren im Gruppenvergleich des Kruskal-Wallis-

Test signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an diesen Zeitpunkten

nachweisbar. Nur in den hyperzellulären Arealen des Corpus callosum war eine

deutliche Infiltration am 56. Versuchstag nachweisbar. Es ergab sich somit in dieser

Lokalisation ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen.

Mittels Mann-Whitney-U-Test konnte am 7. Versuchstag in den parenchymatösen

Läsionen des Cortex cerebri ein signifikant erhöhter Wert bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den infizierten SJL-Mäusen ermittelt werden. Im

weiteren zeitlichen Verlauf konnte noch am 14. Tag pi geringe Werte Fas+ Zellen bei

den infizierten C57BL/6-Mäusen ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 50).

Am 14. Versuchstag fanden sich einzelne Fas+ Zellen in den parenchymatösen

Läsionen des Corpus callosum bei den infizierten C57BL/6-Mäusen. Am 56. Tag pi

zeigten sich bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant erhöhte Werte der

immunhistologisch positiven Zellen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen und den

infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 58 und 60, Anhang, Tab. 50).

In den parenchymatösen Läsionen der Hippocampusformation und der

paraventrikulären Substanz konnten am 7. Versuchstag eine geringe Anzahl Fas+

Zellen bei den C57BL/6-Mäusen nachgewiesen werden. Am 14. Tag pi ermittelte der

Mann-Whitney-U-Test einen signifikant erhöhten Wert Fas+ Zellen bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Mäusen und den infizierten SJL-

Mäusen. In der chronischen Phase der TMEV-Infektion (56. – 196. Tag pi) konnten

keine immunhistologisch positiven Zellen ermittelt werden (s. Anhang, Tab. 50).

Bei den infizierten C57BL/6-Mäusen konnte in der akuten Phase der TMEV-Infektion

(7. und 14. Tag pi) in den parenchymatösen Läsionen von Thalamus und

Ergebnisse 143

Hypothalamus signifikant erhöhte Werte Fas+ Zellen im Vergleich zu den infizierten

SJL-Mäusen detektiert werden. Im weiteren zeitlichen Verlauf fanden sich bei beiden

infizierten Mäusestämmen eine geringgradig erhöhte Anzahl immunhistologisch

positiver Zellen in den hyperzellulären Bereichen (s. Anhang, Tab. 50).

Abb. 59: Fas+ Zellen in meningealen Infiltraten des Großhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

58b

58a

Abb. 58: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 156), 7.Tag pi, Fas-Immunhistologie (DAB). 58a: Nachweis Fas+ Zellen in meningealen Infiltraten (Stern) des Großhirns. Balken: 50 µm. 58b: Fas+ Zellen in parenchymatösen Läsionen des Corpus callosum (Pfeile). Balken: 20 µm.

144 Ergebnisse

4.3.3.3 Fas+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns

Während in der akuten Phase (7. Tag pi) nahezu keine Fas+ Zellen nachweisbar

waren, fanden sich in den untersuchten Lokalisationen mit Ausnahme der grauen

und weißen Substanz des Kleinhirns, wo keine Fas+ Zellen ermittelt werden konnten,

am 14. Tag pi erste immunhistologisch positive Zellen bei beiden infizierten

Mäusestämmen. Ab dem 56. Versuchstag bestand eine deutliche Dominanz Fas+

Zellen bei den empfänglichen infizierten SJL-Mäusen in allen entzündlichen

Alterationen.

Es fanden sich in den entzündlichen Infiltraten der paraventrikulären Substanz beider

infizierter Mäusestämme und in den perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz

des Stammhirns der infizierten SJL-Mäuse signifikante Unterschiede über den

zeitlichen Verlauf. In diesen Lokalisationen waren zu Beginn der chronischen Phase

erhöhte Werte Fas+ Zellen nachweisbar, welche zum Ende der Messungen deutlich

Abb 60: Fas+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Corpus callosum. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 145

abfielen. In perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz beider infizierter

Mäusestämme fanden sich nahezu konstante Werte Fas+ Zellen. Nur in

perivaskulären Infiltraten der paraventrikulären fand sich schon am 14. Tag pi erste

immunhistologisch positive Zellen, weshalb an diesem Zeitpunkt der Kruskal-Wallis-

Guppenvergleich einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen ermittelte

(s. Anhang, Tab. 51). In allen anderen Infiltraten fanden sich Fas+ Zellen erst ab dem

56. Versuchstag. Im Gruppenvergleich resultierten signifikante Unterschiede in der

chronischen Phase in meningealen Infiltraten, in perivaskulären Infiltraten der

paraventrikulären Substanz, der grauen und weißen Substanz.

In den meningealen Infiltraten von Klein- und Stammhirn zeigten sich am 7.

Versuchstag erste Fas+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen, welche am 14.

Tag pi deutlich angestiegen waren. Zu diesem Zeitpunkt zeigten sich auch geringe

Mengen immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen. Auf

Grund des deutlichen Abfalls der Menge Fas+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen und des deutlichen Anstiegs der Werte bei den infizierten SJL-Mäusen fand

sich am 56. und 98. Versuchstag im Mann-Whitney-U-Test eine signifikante

Erhöhung der Fas+ Zellen der infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen. Die Werte blieben bei den infizierten

SJL-Mäusen bis in die chronische Spätphase hinein (56. -196. Tag pi) auf einem

erhöhten Niveau (s. Anhang, Tab. 51).


Ventrikels konnten am 7. Tag pi noch keine Fas+ Zellen detektiert werden. Am 14.

Versuchstag hingegen fanden sich bei beiden infizierten Mäusestämmen erste

immunhistologisch positive Zellen, diese waren im paarweisen Vergleich signifikant

gegenüber denen der Plazebo-Tiere erhöht. Die infizierten SJL-Mäuse zeigten am

56. Versuchstag einen deutlichen Anstieg dieser Werte und waren zu diesem

Zeitpunkt und am 98. Tag pi im Vergleich zu den geringen Werten der infizierten

C57BL/6-Mäuse signifikant erhöht. In der chronischen Spätphase (196. Tag pi)

fanden sich keine Fas+ Zellen bei beiden Mäusestämmen (s. Anhang, Tab. 51).

Während in der akuten Frühphase (7. Tag pi) der TMEV-Infektion keine Fas+ Zellen

in den perivaskulären Infiltraten der grauen und weißen Substanz des Stammhirns

146 Ergebnisse

bei beiden infizierten Mäusestämmen nachgewiesen werden konnten, fanden sich

am 14. Tag pi wenige Fas+ Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen. Zu Beginn der

chronischen Phase (56. Tag pi) waren die Werte der immunhistologisch positiven

Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen signifikant gegenüber den Plazebo-Tieren und

den infizierten C57BL/6-Mäusen erhöht. Zwar sanken die Zahlen hiernach deutlich

ab, waren aber bis zum 196. Tag pi bei den infizierten SJL-Mäusen nachweisbar (s.


4.3.3.4 Fas+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns

Der Kruskal-Wallis-Test ermittelte über den zeitlichen Verlauf signifikante

Unterschiede in hyperzellulären Bereichen der paraventrikulären Substanz beider

infizierter Mäusestämme und in hyperzellulären Arealen der grauen und weißen

Substanz des Stammhirns infizierter SJL-Mäuse. In diesen Regionen fanden sich

deutlich erhöhte Werte Fas+ Zellen vorwiegend zu Beginn der chronischen Phase (s.

Anhang, Tab. 52). Der Kuskal-Wallis-Gruppenvergleich zeigte signifikante

Unterschiede in der paraventrikulären Substanz beginnend am 14. bis zum 98.

Versuchstag, sowie in der grauen und weißen Substanz des Stammhirns vom 56. bis

196. Tag pi.

Während am 7. Tag pi bei keinem der untersuchten Mäusestämme Fas+ Zellen in

den parenchymatösen Läsionen der paraventrikulären Substanz des vierten

Ventrikels detektiert werden konnten, waren am 14. Versuchstag bei beiden

infizierten Mäusestämmen positive Zellen nachweisbar. Der Mann-Whitney-U-Test

zeigte an diesem Versuchstag signifikante Unterschiede zwischen den Werten der

infizierten SJL-Mäuse und denen der Plazebo-Tiere. Am 56. und 98. Tag pi zeigten

sich signifikant erhöhte Werte Fas+ Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen im

Vergleich zu den Plazebo-Tieren und infizierten C57BL/6-Mäusen. Am 196.

Versuchstag waren keine immunhistologisch positiven Zellen nachweisbar (s.

Anhang, Tab. 52).

In den parenchymatösen Läsionen der grauen und weißen Substanz des

Stammhirns konnten erst ab dem 14. Versuchstag bei den infizierten SJL-Mäusen

Ergebnisse 147

Fas+ Zellen detektiert werden. In der chronischen Phase (56. – 196. Tag pi) waren

die Werte bei den empfänglichen Tieren deutlich erhöht, so dass sich am 56. und am

196. Versuchstag im paarweisen Vergleich signifikante Unterschiede zwischen den

Werten der infizierten SJL-Mäuse und den Plazebo-Tieren und den infizierten

C57BL/6-Mäusen nachweisen ließen. Am 98. Versuchstag waren die Werte

immunhistologisch positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen gesunken, so

dass ein signifikanter Unterschied zu den Plazebo-Tieren ermittelt werden konnte,

nicht jedoch zu den infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 61, 62 und 63, Anhang,

Tab. 52).

61a 61b

Abb. 61: TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 176), 56.Tag pi, Fas-Immunhistologie (DAB). 61a: Fas+ Zellen in perivaskulären Infiltraten der grauen Substanz (Stern), sowie in perivaskulären Infiltraten (Dreiecke) und in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) der weißen Substanz des Stammhirns. Balken: 20 µm. 61b: Fas+ Zellen in parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz des Stammhirns (Pfeilspitzen). Balken: 20 µm.

148 Ergebnisse

Abb. 62: Fas+ Zellen in der grauen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Abb. 63: Fas+ Zellen in der weißen Substanz des Stammhirns. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Ergebnisse 149

4.3.3.5 Fas+ Zellen in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks

Zu Beginn der chronischen TMEV-Infektionsphase (56. Tag pi) zeigte sich in allen

Lokalisationen eine deutliche Dominanz der Fas+ Zellen bei den infizierten SJL-

Mäusen.

Die mittels Kruskal-Wallis-Test nachgewiesenen signifikanten Unterschiede über den

zeitlichen Verlauf in den meningealen Infiltraten und in den perivaskulären Infiltraten

der weißen und grauen Substanz der infizierten SJL-Mäuse resultierten aus der

Akkumulation der Fas+ Zellen in diesen Lokalisationen. Bei den infizierten C57BL/6-

Mäusen fanden sich nur wenige Fas+ Zellen (s. Anhang Tab. 53). Der

Gruppenvergleich wies auf Grund der ansteigenden Werte immunhistologisch

positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen signifikante Unterschiede in der

chronischen Phase (56. – 196. Tag pi) nach. Dies zeigte sich in den meningealen

Infiltraten und in den perivaskulären Infiltraten der weißen Substanz der

empfänglichen SJL-Mäuse. In perivaskulären Infiltraten fand sich nur am 56.

Versuchstag ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen (s. Anhang Tab.

53).

Ab dem 56. Versuchstag zeigten sich im paarweisen Vergleich gegenüber den

Plazebo-Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen signifikant erhöhte Zahlen Fas+

Zellen in der Meningen der infizierten SJL-Mäuse. Am 98. Tag pi waren die Werte

der infizierten C57BL/6-Mäuse gestiegen, so dass signifikant erhöhte Werte der

infizierten SJL-Mäuse im Vergleich zu den Plazebo-Tiere resultierten. Dies konnte

beim Vergleich mit den infizierten C57BL/6-Mäusen nicht nachgewiesen werden. In

der chronischen Spätphase (196. Tag pi) waren die Werte immunhistologisch

positiver Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen wiederum signifikant gegenüber den

Plazebo-Tieren erhöht und auch gegenüber den deutlich gesunkenen Werten der

infizierten C57BL/6-Mäuse (s. Abb. 64 und 65, Anhang, Tab. 53).

150 Ergebnisse

Am 14., 56. und 98. Versuchstag waren in den perivaskulären Infiltraten der grauen

Substanz geringgradig erhöhte Werte Fas+ Zellen bei den infizierten SJL-Mäusen

ermittelbar (s. Anhang, Tab. 53).

Innerhalb der perivaskulären Infiltrate der weißen Substanz fanden sich in der

chronischen Phase der TMEV-Infektion (56., 98. und 196. Tag pi) bei den infizierten

SJL-Mäusen signifikant erhöhte Werte Fas+ Zellen im Vergleich zu den Plazebo-

Tieren und den infizierten C57BL/6-Mäusen (s. Anhang, Tab. 53).

4.3.3.6 Fas+ Zellen in hyperzellulären Arealen des Rückenmarks

Der Kruskal-Wallis-Test ermittelte signifikante Unterschiede über den zeitlichen

Verlauf in hyperzellulären Arealen der weißen Substanz beider Mäusestämme. In der

chronischen Phase fand sich bei beiden Mäusestämmen eine deutliche

Akkumulation Fas+ Zellen in der weißen Substanz (s. Anhang, Tab. 54). Somit

resultierte im Gruppenvergleich signifikante Unterschiede an den Tagen 56, 98 und

196 pi.

In den parenchymatösen Läsionen der grauen Substanz zeigte sich beginnend ab

dem 14. Versuchstag bis zum 98. Versuchstag einzelne Fas+ Zellen bei den

infizierten Mäusen (s. Anhang, Tab. 54).

In den parenchymatösen Läsionen der weißen Substanz fanden sich, mittels Mann-

Whitney-U-Test ermittelt, am 56. Versuchstag signifikant erhöhte Werte Fas+ Zellen

bei den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den

infizierten C57BL/6-Mäusen. Am 98. Tag pi waren die Werte bei den infizierten

C57BL/6-Mäusen deutlich gestiegen, so dass sich signifikante Unterschiede

zwischen den infizierten Mäusen zu den Plazebo-Tieren darstellen ließen. Nachdem

die Fas+ Zellen bei den infizierten C57BL/6-Mäusen am 196. Tag pi deutlich

gesunken waren, ergaben sich hier wiederum signifikant unterschiedliche Werte bei

den infizierten SJL-Mäusen im Vergleich zu den Plazebo-Tieren und den infizierten

C57BL/6-Mäusen (s. Abb. 64 und 66, Anhang, Tab. 54).

Ergebnisse 151

Abb. 64 TMEV-infizierte SJL-Maus (TAI 180) 56.Tag pi, Fas-Immunhistologie (DAB). 64a: Nachweis von Fas+ Zellen in meningealen Infiltraten (Stern) und in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 30 µm. 64b: Fas+ Zellen in perivaskulären Infiltraten (Stern) sowie in parenchymatösen Läsionen (Pfeilspitzen) der weißen Substanz des Rückenmarks. Balken: 50 µm.

64a 64b

Abb 65: Fas+ Zellen in meningealen Infiltraten des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

152 Ergebnisse

Abb. 66: Fas+ Zellen in der weißen Substanz des Rückenmarks. Statistische Analyse mittels Mann-Whitney-U-Test.

Diskussion 153

5 Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde mittels immunhistologischer Untersuchungen eine

Charakterisierung der Entzündungsreaktion in detailliert aufgeschlüsselten

Kompartimenten des Groß-, Klein- und Stammhirns und des Rückenmarks (RM)

resistenter C57BL/6- und empfänglicher SJL-Mäuse im Verlauf der

demyelinisierenden Theilervirus-Enzephalomyelitis (TME) durchgeführt. Hierbei

erfolgte die Darstellung von T- und B-Zellen (CD3+ und CD45R/B220+ Zellen) sowie

von Makrophagen und Mikroglia (CD107b+ Zellen) prozentual in meningealen und

perivaskulären Infiltraten sowie pro Flächeneinheit in hyperzellulären Arealen.

Außerdem wurde die Anzahl von Astrozyten (GFAP+ Zellen) im Neuroparenchym

quantifiziert. Ein spezieller Aspekt der Immunphänotypisierung war die Darstellung

regulatorischer CD25+Foxp3+ T-Zellen (Treg) in den meningealen und perivaskulären

Infiltraten und im Parenchym der verschiedenen Regionen des ZNS. Ein weiterer

Schwerpunkt stellte die Untersuchung des Auftretens einer Fas-vermittelten

aktivierungsinduzierten Apoptose von Immunzellen in infizierten Mäusen dar. Zur

Ermittlung der Apoptose-Induktion während der Entzündungsantwort wurden die

TUNEL-Methode unter Berücksichtigung der pyknotischen Zellmorphologie und der

Nachweis der Aktivierung von Caspase-3 mittels Immunhistologie vorgenommen.

5.1 Immunphänotypisierung der Entzündungsreaktion im zentralen Nervensystem

5.1.1 Immunphänotypisierung der lymphozytären Infiltrate im Großhirn Die Untersuchungen zeigten neben den zeitlichen Veränderungen der

Entzündungsreaktion zusätzlich, dass die Immunantwort in verschiedenen

Kompartimenten des ZNS unterschiedlich stark ausgeprägt war. Hierbei konnten

Unterschiede zwischen SJL- und C57BL/6-Mäusen während der akuten Phase

festgestellt werden.

Die stärksten perivaskulären Infiltrate fanden sich im Hippocampus beider

Mäusestämme, während das Neuroparenchym von Thalamus und Hypothalamus vor

allem bei C57BL/6-Mäusen die höchste Infiltration von Entzündungszellen aufwies.

154 Diskussion

Dies bestätigt die Untersuchung von OLESZAK et al. (2004), die nach Infektion von

SJL-Mäusen die stärkste Entzündung im Diencephalon (Thalamus, Hypothalamus,

Subthalamus) und Hippocampus (Stratum pyramidale) feststellten.

Die Entzündung war bei beiden Mäusestämmen von CD3+ T-Zellen dominiert,

allerdings zeigte sich im Vergleich der Stämme eine prominentere T-Zellantwort im

Hippocampus und Corpus callosum der empfänglichen SJL-Mäuse. Mit Beginn der

chronischen Phase (56. Versuchstag) kam es zu einer weitestgehenden Elimination

der Entzündung im Großhirn. Interessanterweise konnte im Corpus callosum noch

am 56. Tag pi eine Entzündung festgestellt werden, wobei die Anzahl der T-Zellen im

Vergleich zu den Untersuchungszeitpunkten der akuten Phase (7. und 14. Tag pi)

deutlich angestiegen war. Das aus Nervenfasern (weiße Substanz) bestehende

Corpus callosum ist besonders für toxische Demyelinisierungen mittels Cuprizione

empfindlich (HIREMATH et al., 1988). Das Corpus callosum weist außerdem bei MS-

Patienten mit progressiver Verlaufsform (primär oder sekundär progressive Form der

MS) besonders starke entzündliche Infiltrationen mit Demyelinisierung und Atrophie

auf (EVANGELOU et al., 2000). Beschreibungen pathologischer Veränderungen im

Corpus callosum bei der TME liegen bisher nicht vor. Warum das Corpus callosum

trotz lang anhaltender Entzündung keine Demyelinisierung aufweist, bleibt aufgrund

der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unklar. Für eine Detektion potentieller

Myelinschäden in dieser Gehirnregion sind jedoch weiterführende Untersuchungen,

wie beispielsweise die Quantifizierung des Gehaltes verschiedener

Myelinbestandteile notwendig.

Im Vergleich zu der T-Zellantwort war die B-zellvermittelte Immunreaktion im

Großhirn in der akuten Phase geringer ausgeprägt. Auch bei MS können in akuten

Plaques 50 bis 100fach höhere Werte von T-Zellen als B-Zellen detektiert werden

(OZAWA et al., 1994). Interessanterweise fanden sich in dieser Arbeit signifikant

erhöhte Werte bei den SJL-Mäusen im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen in allen

parenchymatösen Läsionen des Großhirns in der TME-Frühphase (7. und 14. Tag

pi). Es ist bekannt, dass nur eine effektive zelluläre Immunantwort, insbesondere

eine adäquate CTL-Antwort, eine Elimination des Virus in resistenten

Mäusestämmen, wie den C57BL/6-Mäusen bewirkt (RODRIGUEZ et al., 1991;

Diskussion 155

BORROW et al., 1992). Möglicherweise führt die humorale Immunantwort zu einer

ineffektiven zellulären Immunreaktion im ZNS von TMEV-infizierten SJL-Mäusen. Die

Viruspersistenz wird hierbei eventuell durch die Produktion immunsuppressiv

wirkender Zytokine, wie IL-10 und TGF-ß, gefördert (LIN et al., 2005; MEINL et al.,

2006). Eine kürzlich veröffentlichte Genexpressionsanalyse verdeutlicht in diesem

Zusammenhang eine Aufregulation von B-zellabhängigen Genen in regionären

Lymphknoten von TMEV-infizierten SJL-Mäusen am 14. Tag pi (NAVARRETE-

TALLONI et al., 2010). Weiterhin fand sich in der vorliegenden Arbeit eine

persistierende B-Zellinfiltration im Corpus callosum der SJL-Mäuse am 56. Tag pi. B-

Lymphozyten sind selten in entzündlichen Infiltraten von klassischen Plaques bei der

akuten und remittierenden MS nachzuweisen, sie steigen aber deutlich während der

Entwicklung chronischer Plaques an. Die Bedeutung der Zellen hinsichtlich der

klinischen Ausprägung von MS ist bislang unklar, allerdings zeigen therapeutische

Ansätze zur Reduktion von Plasmazellen bei MS eine positive Wirkung auf den

Krankheitsverlauf (LASSMANN et al., 2007).

In Analogie zu der Expression von CD3 konnte eine Infiltration von Foxp3+ Treg in

der akuten Entzündungsphase der TME festgestellt werden. Hierbei dominiert die

Foxp3-Expression in der akuten Phase bei SJL-Mäusen in der Großhirnrinde sowie

im Corpus callosum und der paraventrikulären Substanz. Treg können einerseits

über den direkten Zell-Zellkontakt, andererseits über die Sekretion von Zytokinen,

wie TGF-ß, IL-10 und IL-35 immunsupprimierend auf Entzündungszellen wirken

(VIGNALI et al., 2008). Möglicherweise begünstigte im vorliegenden Fall die frühe

Infiltration von Treg die Viruspersistenz bei den SJL-Mäusen durch eine

unzureichende antivirale Immunantwort. TGF-ß, das von Treg exprimiert wird,

inhibiert unter anderem CD8+ T-Zellen sowie die T-Zellproliferation (CHANG et al.,

2000). CHANG et al. (2000) und OLESZAK et al. (2004) fanden in der Frühphase (8.

und 14. Tag pi) im Gehirn sowie in der chronischen Phase (30. bis 60. Tag pi) im

Rückenmark von DA-Stamm infizierten SJL-Mäusen eine bis zu 10-fach erhöhte

Konzentration von TGF-ß im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen. Diese hohe

Konzentration des immunsuppressiv wirkenden Zytokins könnte die Viruspersistenz

bei empfänglichen SJL-Mäusen schon in der frühen Phase ermöglichen und

156 Diskussion

zusätzlich in der chronischen Phase die antivirale Immunantwort beeinträchtigen.

Vorangegangene HIV-Studien zeigen, dass Treg die antivirale Effektor-T-Zellantwort

sowie die lokale Immunantwort bei dieser Retrovirus-Infektion supprimieren

(NILSSON et al., 2006; NDHLOVU et al., 2008). Dies ermöglicht die virale Invasion

und bedingt die Chronizität der retroviralen Erkrankung (DITTMER et al., 2004;

BELKAID und ROUSE, 2005; LI et al., 2008).

Mittels des CD25-Markers konnten nur wenige Zellen in den entzündlichen

meningealen und perivaskulären Infiltraten und im Neuroparenchym nachgewiesen

werden. CD25 wird sowohl auf Effektor-T-Zellen als auch auf Treg exprimiert.

Möglicherweise ist die geringe Anzahl CD25+ T-Zellen auf eine niedrige Sensitivität

des Markers in der Immunhistologie zurückzuführen.

5.1.2 Immunphänotypisierung der histiozytären und glialen Zellen im Großhirn

Generell konnten nur wenige CD107b+ Makrophagen in den meningealen und

perivaskulären Infiltraten der Tiere im Großhirn nachgewiesen werden. Wie schon

von TSUNODA et al. (1997) nachgewiesen, fand sich aber eine deutliche

Akkumulation dieser Zellen im Neuroparenchym. Auch hier war eine starke Infiltration

im Corpus callosum und Hippocampus bei SJL-Mäusen nachweisbar. Unter

Berücksichtigung der Morphologie handelt es sich hierbei vermutlich um aktivierte

Mikroglia. Allerdings ist eine Unterscheidung von infiltrierenden Makrophagen nicht

ohne weitere immunhistologische Marker möglich. Makrophagen/Mikroglia werden

als Reservoir bzw. als Zielzelle des TMEV in der chronischen Phase angesehen und

begünstigen damit die Erregerpersistenz (CLATCH et al., 1990). Die hier vorliegende

Studie wies die nahezu vollständige Entzündungselimination bereits in der akuten

Phase der TME aus dem Großhirn beider Mäusestämme nach, somit konnten

Ergebnisse von CLATCH et al. (1986) bestätigt werden. Diese Gruppe fand im

Großhirn weder eine Viruspersistenz noch Entmarkung bzw. „bystander“

Mechanismen.

Neben der Mikrogliose fand sich auch eine mittels Immunhistologie nachgewiesene

Astrogliose. Die ortsständigen Gliazellen sind an verschiedenen Immunreaktionen im

Diskussion 157

ZNS beteiligt. Unter anderem vermögen sie Antigene zu präsentieren sowie durch

die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) und TNF-α eine Gewebeschädigung zu

induzieren (MOLINA-HOLGADO et al., 1997; OLESZAK et al., 1997). Andererseits

sind astrogliale Reaktionen an Reparaturvorgängen im Neuroparenchym und der

Bluthirnschranke (BBB) beteiligt (BRADBURY, 1984; MUCKE und EDDLESTONE,

1993). Im Corpus callosum fand sich bei empfänglichen SJL-Mäusen bis zum 56.

Tag pi eine deutliche Astrogliose, in allen anderen Kompartimenten des Großhirns

war die Anzahl der Astrozyten bei beiden Mäusestämmen vergleichbar hoch und

sank am 14. Tag pi deutlich ab. Auf Grund der vollständigen Entzündungselimination

in allen Kompartimenten des Großhirns und der Wiederherstellung der

Gehirnmorphologie kann die These der astroglialen Reparaturvorgänge im

vorliegenden Fall formuliert werden. Weiterhin ist beschrieben, dass die TMEV-

Infektion der C57BL/6-Mäuse eine verstärkte Induktion von MHC-I Molekülen auf

Astrozyten bedingt. Diese führt zu einer deutlichen CD8+ T-Zellantwort

(CARPENTIER et al. 2008). Astrozyten exprimieren im ruhenden Zustand

normalerweise kein MHC-I, jedoch kann die Stimulation durch Zytokine, wie IFN-γ

oder auch eine virale Infektion die MHC-I Expression der Astrozyten aufregulieren

und so CD8+ T-Zellen aktivieren (LAVI et al., 1988; LIU et al., 1989). CARPENTIER

et al. (2008) beschrieben den Nachweis einer geringeren Empfänglichkeit der

Astrozyten von C57BL/6-Mäusen für eine Infektion mit TMEV in Kombination mit

einer verstärkten CTL-Antwort. Hieraus kann geschlussfolgert werden, dass eine

deutlich geringere virale Replikation im Gehirn in der frühen Infektionsphase bei

C57BL/6-Mäusen erfolgt und somit die Viruselimination bei diesem Mäusestamm

vereinfacht ist.

5.1.3 Immunphänotypisierung der lymphozytären Infiltrate im Klein- und Stammhirn

Nach Rückgang bzw. stellenweise vollständiger Elimination der Entzündungsantwort

im Großhirn fanden sich im zeitlichen Verlauf progressiv zunehmende zelluläre

Reaktionen im Stammhirn. Hierbei dominierte wie im Großhirn die Infiltration von

CD3+ T-Zellen. Dies konnte in vorangegangenen Studien von OLESZAK et al. (2003)

158 Diskussion

und TSUNODA et al. (1997) bestätigt werden. Hier bestanden die ZNS-infiltrierenden

Zellpopulationen, wie in der vorliegenden Studie vornehmlich aus T-Zellen und

Makrophagen/Mikroglia. Die zunächst nur paraventrikulär ausgebildete CD3-

Expression könnte in diesem Zusammenhang für eine paraventrikuläre Ausbreitung

der Infektion sprechen. Im weiteren Verlauf der TME fanden sich entzündliche

Infiltrationen auch in der grauen und weißen Substanz des Stammhirns der SJL-

Mäuse, während sie bei C57BL/6-Mäusen als Folge der Viruselimination

verschwanden. Im Kleinhirn konnten nur vereinzelte CD3+ T-Zellen nachgewiesen

werden. Als Ausdruck der Erregerpersistenz und hiermit assoziierter, zellulärer

Reaktion fanden sich bis in die chronische Spätphase (196. Tag pi) deutliche

parenchymatöse Infiltrate im Stammhirn der SJL-Mäuse.

Die B-Zellantwort war im Vergleich zur T-zellvermittelten Reaktion nur geringgradig

ausgeprägt, dominierte allerdings wie im Großhirn bei den SJL-Mäusen. Wie schon

bei den T-Zellen nachgewiesen, war auch bei den B-Zellen die früheste und höchste

Konzentration in der paraventrikulären Substanz am 14. Tag pi nachweisbar.

Interessanterweise fanden sich nur wenige B-Zellen im Neuroparenchym der weißen

Substanz des Stammhirns am 14. und 56. Tag pi bei SJL-Mäusen, während die

Anzahl der T-Zellen in dieser Region bis in die chronische Spätphase hinein sehr

hoch war. Eine mögliche Erklärung der eingeschränkten Infiltration von B-Zellen,

könnte die Abnahme der Konzentration pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1, IL-6

und TNF-α) in der chronischen Phase der TME sein. In der akuten Phase ist eine

hohe Konzentration dieser Zytokine im ZNS nachweisbar (CHANG et al., 2000),

diese bedingen, durch die Aufregulation von MHC-I und –II sowie von

Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen, Astrozyten und Mikroglia, die Aktivierung

und Rekrutierung von T- und B-Zellen in das ZNS (SCHALL und BACON, 1994;

PERRY et al., 1995; MARTINEY et al., 1998). Der stetige Anstieg von CD3+ T-Zellen

in der chronischen Phase könnte aus der anhaltenden Proliferation potentiell Myelin-

reaktiver T-Zellen resultieren, die im zeitlichen Verlauf eine bedeutende Rolle bei der

autoimmunen Reaktion einnehmen. Wie im Großhirn fanden sich trotz starker

Entzündungszellinfiltration im Stammhirn bei den empfänglichen SJL-Mäusen nur

wenige CD25+ T-Zellen.

Diskussion 159

In der chronischen Phase der TME fand sich bei C57BL/6-Mäusen nahezu keine

entzündlichen Reaktionen mehr, somit waren bei diesem Mäusestamm keine Foxp3+

Treg nachweisbar. In der weißen und grauen Substanz des Stammhirns und in

meningealen und perivaskulären Infiltraten der SJL-Mäuse konnten bis in die

Spätphase hinein Treg detektiert werden. Die Treg fanden sich erstmals in hoher

Konzentration in meningealen Infiltraten und der paraventrikulären Substanz des

vierten Ventrikels, so dass eine hämatogene Infiltration der Zellpopulation mit

anschließender Akkumulation um den vierten Ventrikel möglich scheint.

Verschiedene Studien bei „knock out“ Mäusen zeigten, dass eine kontinuierliche

periphere Stimulation durch IL-2, TCR-Aktivierung sowie kostimulierende Moleküle

wie CD28 und B7 essentiell an der Erhaltung und Proliferation von Treg beteiligt sind

(PAPIERNIK et al., 1998; SALOMON et al., 2000; KUMANOGOH et al., 2001). Die

stetige Abnahme der Treg in der chronischen Phase der TME bei anhaltend hohen

Werten von T-Zellen ist hinweisend auf die kontinuierliche periphere Stimulation

ausschließlich in der akuten Phase. Wie schon bei den B-Zellen beschrieben, fand in

der chronischen Phase keine weitere Infiltration der Treg statt.

Von besonderer Bedeutung ist die Produktion von IL-10 und die Sekretion von TGF-β

bezüglich der Treg vermittelten Suppression (MALOY und POWRIE, 2001). Eine

wichtige Funktion der IL-10 exprimierenden Treg ist die Inhibierung der Funktion von

Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie beispielsweise die Produktion von pro-

inflammatorischen Zytokinen (MALOY et al., 2003). Besonders die verminderte

Expression von IL-12, welches essentiell der Entwicklung von CD4+ Th1 Zellen dient

(MOORE et al., 2001) könnte die Viruspersistenz der empfänglichen SJL-Mäusen

verlängert haben. Weitere Untersuchungen sind daher notwendig um zu klären, ob

es sich bei diesen Infiltraten um immunmodulatorische Mechanismen handelt,

welche möglicherweise Hypersensitivitätsreaktion bzw. autoimmune Reaktionen

hemmen oder aber die Viruspersistenz durch ihre immunsuppressiven Eigenschaften

fördern.

160 Diskussion

5.1.4 Immunphänotypisierung der histiozytären und glialen Zellen im Klein- und Stammhirn

CD107b+ Makrophagen/Mikroglia fanden sich ebenfalls dominant in den

untersuchten Regionen des Stammhirns in der chronischen Spätphase der TME bei

infizierten SJL-Mäusen. Die starke Expression in empfänglichen Mäusen sowie

deren Assoziation mit Entmarkungsherden in der weißen Substanz des Stammhirns

sprachen hierbei für das Vorliegen von „bystander“ Mechanismen und einer

Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV („delayed type hypersensitivity“, DTH). Die

„bystander“ Demyelinisierung bezeichnet eine durch aktivierte Makrophagen

hervorgerufene Myelinzerstörung, wie sie unter anderem bei MS, TME, EAE und der

Hundestaupe vorkommen. Hierbei spielt die Freisetzung von pro-inflammatorischen

Zytokinen (insbesondere TNF-α), Proteasen und reaktiven Sauerstoffverbindungen

eine entscheidende Rolle (SELMAJ und RAINE, 1988; PAYA et al., 1990; RENNO et

al., 1995; BEINEKE et al., 2009). Die höchsten Werte CD107b+ Zellen fanden sich im

Stammhirn am 56. und 98. Tag pi bei den empfänglichen SJL-Mäusen. MILLER et al.

(1997) und KATZ-LEVY et al. (2000) wiesen erste autoimmune Zellen (CD4+ T-

Zellen) ab dem 50. - 60. Tag pi in Verbindung mit persistent infizierten F4/80+

residente Mikroglia und deutlicher Mikrogliose nach (KATZ-LEVY et al., 2000).

CLATCH et al. (1986) erbrachten außerdem den Nachweis einer CD4-bedingten

DTH zu diesem Zeitpunkt. Diese autoimmunen Reaktionen setzten jedoch erst nach

beginnender Demyelinisierung durch vorangegangene „bystander“ Mechanismen ein

(MILLER et al., 1997; KATZ-LEVY et al., 2000). Somit erfolgte der Nachweis der

höchsten Zahl von Makrophagen/Mikroglia zu Beginn der chronischen Phase in

Übereinstimmung mit vorangegangenen Studien. Auf Grund der Replikation des

TMEV in Makrophagen/Mikroglia und in Oligodendrozyten (RODRIGUEZ et al., 1983;

BLAKEMORE et al., 1988; LIPTON et al., 1995; PENA-ROSSI et al., 1997)

bedingten die nachgewiesenen hohen Werte dieser Zellen in der chronischen Phase

möglicherweise die Viruspersistenz bei empfänglichen SJL-Mäusen.

Wie bei den weiteren untersuchten Zellen des Immunsystems beschrieben, war in

der paraventrikulären Substanz die früheste Astrogliose (GFAP-Aufregulation)

detektierbar. Dies unterstreicht die Möglichkeit einer liquorogenen Virusausbreitung

Diskussion 161

mit assoziierter Astrogliose in dieser Region. Astrozyten gehören neben den

Mikroglia zu den immunkompetenten Zellen des zentralen Nervensystems und

haben eine zentrale Rolle in der Pathogenese verschiedener neurologischer

Erkrankungen (CHOI und BENVENISTE, 2004). Bei MS konnte die Produktion von

diversen Chemokinen und Zytokinen durch aktivierte Astrozyten gezeigt werden.

Dort erfolgt eine hochgradige astrogliale Produktion von IL-6, diese ist assoziiert mit

Neurodegeneration, dem Zusammenbruch der BBB, Neovaskularisation und einer

erhöhten Expression von Komplementfaktoren (BARNUM et al., 1996; CAMPBELL et

al., 1993). IL-6 defiziente Mäuse sind EAE resistent, während die Applikation von IL-

6, über die Aktivierung von autoreaktiven T Zellen, diese Mäuse für EAE empfänglich

macht (EUGSTER et al., 1998; OKUDA et al., 1998). Die nach Infektionen und

Traumata nachweisbare Astrogliose kann auf Grund der Formation von Glianarben

störend auf die neuronale Funktionalität wirken (HATTEN et al., 1991).

Weiterhin können Astrozyten die Entzündung des ZNS indirekt unterdrücken, da sie

regulatorisch wirksame T-Zellen induzieren können. TRAJKOVIC et al. (2004)

zeigten, dass primäre Ratten-Astrozytenzelllinien die IFN-γ Sekretion von T-Zellen

über einen Zell-Zellkontakt inhibieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine

erhebliche Sekretion von IL-10 und TGF-ß durch astrozytäre Tumoren sezerniert

wird. Diese erhöhen die Sekretion von IL-10 durch regulatorisch wirksame T-Zellen in

Abwesenheit von IFN-γ drastisch. So wird spekuliert, dass Astrozyten eine IL-10

sezernierende Typ1-Population von regulatorisch wirksamen T-Zellen generieren

und somit die Entzündung des ZNS indirekt suppremieren können (RONCAROLO et

al., 2001). Die astrogliale Produktion von Wachstumsfaktoren und Neurotrophin

stärkt zusätzlich die neuronale Regeneration pi (HATTEN et al., 1991). Unklar ist, ob

Astrozyten in der Lage sind, co-stimulierende Faktoren wie CD40 und/oder B7 zu

exprimieren und dadurch eine Proliferation von potentiell autoreaktiven CD4+ T-

Zellen zu bewirken (SOOS et al., 1998). Andererseits könnte ein Mangel co-

stimulierender Faktoren zu einer Suppression oder Apoptose von vermeintlich

autoreaktiven CD4+ T Zellen führen (GOLD et al., 1996; MATSUMOTO et al., 1992).

Die Induktion einer immunsuppressiven Th2-Antwort ist ebenfalls denkbar, so dass

162 Diskussion

Astrozyten, wie bei EAE gezeigt, die autoimmune Erkrankungen abschwächen

können (SAOUDI et al., 1995).

Somit kann in der vorliegenden Arbeit eine duale Bedeutung der Astrozyten an der

Pathogenese der TME nicht ausgeschlossen werden. Weiterhin offen ist die

Beantwortung der Frage, ob Astrozyten als virales Reservoir während der TME

dienen. LIPTON et al. (1995) und POPE et al. (1998) konnten nach Infektion mit dem

BeAn-Stamm kein virales Antigen in den Astrozyten nachweisen, wohingegen

ZHENG et al. (2001) zeigten, dass die höchste Bürde viralen Antigens in Astrozyten

vorhanden ist. Sie wiesen zudem eine geringe Virusreplikation in dieser

Zellpopulation nach, wodurch die Persistenz begünstigt wurde.

5.1.5 Immunphänotypisierung lymphozytärer Infiltrate im Rückenmark

Die vorliegende Studie wies auch im RM eine Dominanz von CD3+ T-Zellen

empfänglicher SJL-Mäuse im Verlauf der TME auf. Die ab dem 14. Tag pi

begonnene Entmarkung in der weißen Substanz der SJL-Mäuse (ULRICH, 2006;

ULRICH et al., 2006a) war assoziiert mit einer an diesem Versuchstag eingesetzten

Infiltration von T- und B-Zellen sowie CD25+ T-Zellen und Foxp3+ Treg in Verbindung

mit einer deutlichen Astrogliose. Auch bei den resistenten C57BL/6-Mäusen fand

sich am 14. Tag pi eine deutliche Infiltration von T-Zellen und Astrogliosen, jedoch

konnten bei diesen Tieren zu keinem Zeitpunkt axonale Schäden oder aber

Demyelinisierung ermittelt werden (ULRICH, 2006; GERHAUSER, 2007). Am 98.

Tag pi, an dem der höchste Verlust von Myelinscheiden auftrat (ULRICH, 2006), fand

sich auch die höchste Anzahl an T-Zellen, Makrophagen/Mikroglia und CD25+ T-

Zellen, so dass von dem Auftreten Myelin-reaktiver T-Zellen zu diesem Zeitpunkt

ausgegangen werden muss.

Im Vergleich zu den T-Zellen war die B-Zellantwort weniger deutlich ausgeprägt.

Allerdings konnte insbesondere in der chronischen Phase eine signifikante Infiltration

bei den empfänglichen SJL-Mäusen festgestellt werden. Die Bedeutung der

humoralen Immunantwort insbesondere in der chronischen Phase der TME ist

Gegenstand neuerer Untersuchungen (NAVARRETE-TALLONI et al., 2010; ULRICH

et al., 2010). Eine hohe Antikörper Konzentration im Serum von SJL-Mäusen 21

Diskussion 163

Tage pi, in Kombination mit der Aufregulation von IgG2c im Vergleich zu IgG1

scheint ein Hinweis auf eine Th2-vermittelte Immunantwort zu Beginn der

chronischen Phase zu sein (LIPTON und GONZALEZ-SCARANO, 1978; MARTIN et

al., 1998). Mittels Genexpressionsanalyse fand sich eine deutliche Korrelation

zwischen der Expression spezifischer B- und Plasmazellgene und der progressiven

Entmarkung im RM. Dies ist ein wichtiger Hinweis zur Darstellung des

Zusammenhangs der autoimmun-bedingten Demyelinisierung und der humoralen

Immunantwort in der chronischen TME (ULRICH et al., 2010). Inwieweit die

nachgewiesenen B-Zellen im Verlauf der TME eher protektiv oder aber destruktiv

wirken, konnte allerdings abschließend nicht geklärt werden. Einerseits führen sie

über die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-12 und

Lymphotoxin-α) zu einer Potenzierung der Entzündung, andererseits muss aber die

Produktion von anti-inflammatorischen Zytokinen wie TGF-ß und IL-10, sowie die

Abgabe von Neurotrophinen („nerve growth factor“, „brain-derived neurotrophic

factor“) im Verlauf entzündlicher ZNS-Erkrankungen berücksichtigt werden

(FILLATREAU et al., 2002; LUND et al. 2005; MEINL et al., 2006). Speziell die

immunsuppressive Wirkung durch die Produktion von IL-10 und TGF-ß konnte

bereits bei EAE beeindruckend dargestellt werden. Hier fand sich eine Abnahme der

Entzündung durch IL-10 produzierende B-Zellen (FILLATREAU et al., 2002) sowie

die Hemmung der ZNS-Entzündung durch TGF-ß (WYSS-CORAY et al., 1997).

Unter Berücksichtigung der Grundlage, dass EAE eine autoimmun-bedingte ZNS-

Erkrankung ist, erschließt sich die Hypothese der protektiven Wirkung der IL-10 und

TGF-ß produzierenden B-Zellen. Bei TME, einer durch virale Persistenz provozierte,

autoimmune Erkrankung kann die vermeintliche Produktion immunsuppressiver

Zytokine allerdings die virale Elimination verhindern.

Die vor allem in der weißen Substanz empfänglicher SJL-Mäuse nachgewiesenen

CD25+ T-Zellen können anteilig sowohl zu den Effektor T-Zellen als auch zu den

Treg gehören. Am 98. Tag pi zeigte sich die schwerwiegendste Entzündung und

hiermit assoziierte Demyelinisierung im RM (ULRICH, 2006). Sowohl die im

Neuroparenchym nachgewiesenen CD3+ T-Zellen als auch die Foxp3+ Treg zeigten

an diesem Versuchstag hohe Werte, jedoch fand sich im Gegensatz zu den Foxp3+

164 Diskussion

Treg, die bis zum Ende der Messungen konstant hohe Werte zeigten, ein langsames

Abklingen der Anzahl von CD3+ T-Zellen und auch ein deutlicher Abfall der CD25+ T-

Zellen. Aufgrund des zeitgleichen Abfalls der CD25+ und CD3+ T-Zellen kann

hypothetisch von einem überwiegenden Anteil an CD25+ Effektor T-Zellen

ausgegangen werden.

In meningealen Infiltraten der empfänglichen SJL-Mäuse waren bis zu 40% Foxp3+

T-Zellen bezogen auf die Gesamtzahl entzündlicher Zellen vorhanden, was

hinweisend auf die meningeale Infiltration peripherer Treg während der TME ist. Bis

zum 98. Tag pi fanden sich ansteigende Werte der Treg im Neuroparenchym der

weißen Substanz der SJL-Mäuse. Bis zu diesem Versuchstag zeigte sich eine

progressive Zunahme der Entzündung und der Demyelinisierung. Die hohen Werte

der regulatorisch wirksamen T-Zellen in der chronischen Phase der TME, sowohl im

Stammhirn als auch im RM, sind hinweisend auf die Unterdrückung einer adäquaten

antiviralen Immunantwort. TGF-ß und IL-10, zwei der von Treg gebildeten

immunsuppressiv wirkenden Zytokine, waren auch bei DA-infizierten SJL-Mäusen im

Vergleich zu infizierten C57BL/6-Mäusen im Gehirn in der akuten Frühphase und

auch im RM in der chronischen Phase deutlich aufreguliert (CHANG et al., 2000;

OLESZAK et al., 2003).

Aktuelle Untersuchungen der EAE weisen das Auftreten von Th17 T-Zellen, welche

sich durch die Produktion von IL-17 auszeichnen und als pro-inflammatorische Zellen

interpretiert werden, noch vor Auftreten erster klinischer Symptome nach (MURPHY

et al., 2010). In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass sich diese pro-

inflammatorischen Th17-Zellen in Anwesenheit von TGF-ß und IL-6 in Foxp3+ Treg

differenzieren (CHEN et al., 2003; BETTELLI et al., 2006; MARTINEZ et al., 2008).

Die vorliegenden Foxp3+ T-Zellen, die in nahezu konstanter Zellzahl in der

chronischen Phase der TME im Neuroparenchym empfänglicher Mäuse auftraten,

könnten aus der Peripherie immigriert oder sekundär aus Th17 T-Zellen lokal im ZNS

hervorgegangen sein. HOU et al. (2009) wiesen in diesem Zusammenhang IL-17

produzierende Th17 Zellen als Promoter der TMEV-Persistenz nach. Hierbei bewirkt

IL-17 eine Aufregulation anti-apoptotischer Moleküle und somit die Blockade des

Diskussion 165

zytotoxischen Potentials von CTLs. Dies ermöglicht das Überleben infizierter Zellen

im ZNS.

5.1.6 Immunphänotypisierung der histiozytären und glialen Zellen im Rückenmark

Die Makrophagen/Mikroglia waren in vorangangenen Studien zusammen mit den T-

Zellen die dominierende Zellpopulation (OLESZAK et al., 2003; SCHLITT et al.,

2003; LIPTON et al., 2005; GERHAUSER et al., 2007; TSUNODA und FUJINAMI,

2009). In der hier vorliegenden Untersuchung konnte dies bestätigt werden.

Die nachgewiesenen Makrophagen führen über eine konstante Antigenpräsentation,

sowie durch „bystander“ Mechanismen und Expression freier Radikale, TNF-α und

Matrix-Metalloproteinasen (MMP) zu einer konstanten Myelinschädigung (KATZ-

LEVY et al., 2000; Ulrich et al., 2006; OLSON und MILLER, 2009).

Interessanterweise fand sich bei den resistenten C57BL/6-Mäusen bis zum 98. Tag

pi eine deutliche Astrogliose in der weißen Substanz, obwohl nur bis zum 14. Tag pi

die entzündliche Infiltration von T- und B-Zellen ermittelt werden konnte. Darüber

hinaus waren die am 14. und 56. Tag pi nachgewiesenen Astrozytenzahlen der

resistenten Mäuse nahezu doppelt so hoch wie die der empfänglichen SJL-Mäuse.

Die Bedeutung der Astrozyten im entzündlichen Gewebe wird kritisch diskutiert. Im

vorliegenden Fall kann vor einer regional abhängigen protektiven Funktion

ausgegangen werden. Die Podozyten der Astrozyten stehen in enger Verbindung zu

der abluminalen Oberfläche des mikrovaskulären Endotheliums der BBB. Die

Astrozyten unterstützen somit die strukturelle und funktionelle Integrität der BBB

(WOLBURG et al., 1994) und verhindern möglicherweise die Infiltration weiterer

Entzündungszellen in der chronischen Phase der TME bei C57BL/6-Mäusen. Die

BBB besteht aus Endothelzellen, Basalmembran, perivaskulären Zellen und den

Podozyten der Astrozyten (RISAU und WOLBURG, 1990). Astrozyten und

Endothelzellen exprimieren Fas, sind aber resistent gegen die Fas-FasL-bedingte

AICD und bewirken so die Apoptose-Induktion von umgebenden AICD-

empfänglichen Zellpopulationen. Einerseits könnte die Expression von FasL von den

Endothelzellen zu einer verminderten Extravasation von Entzündungszellen bei den

166 Diskussion

C57BL/6-Mäusen führen und somit die Entzündungszellantwort unterdrücken

(WALSH und SATA, 1999). Andererseits könnten die AICD resistenten Astrozyten

und Endothelzellen über die pro-inflammatorische Antwort, wie die Expression von

IL-1, IL-6, TNF-α und IFN-β die Entzündungszellinfiltration bei den SJL-Mäusen

potenzieren und so die Demyelinisierung verstärken (HUANG et al., 1999; PALMA et

al., 2003). Während PALMA et al. (2003) in vitro auffällig viele apoptotische GFAP+

Astrozyten bei TME nachweisen konnte, wurde dies in der vorliegenden Studie nach

morphologischen Kriterien nicht bestätigt, was auf die postulierte AICD-Resistenz

zurückgeführt werden könnte.

Die Rolle Antigen-präsentierender Astrozyten und ihre Auswirkung auf die

zytotoxischen CD8+ T-Zellen im Sinne der Herstellung einer protektiven Immunität

oder aber der Potenzierung der demyelinisierenden, autoimmunen Erkrankung muss

ebenfalls kritisch diskutiert werden (CARPENTIER et al., 2008). Einerseits

potenzieren sie die Entzündung innerhalb des ZNS durch Produktion pro-

inflammatorischer Zytokine und Chemokine, andererseits führt die Abgabe von

Neurotrophin und Wachstumsfaktoren zur Regeneration des Neuroparenchyms

(CARPENTIER et al., 2008; ROLLS et al., 2009). Hinweise auf die förderliche

Entwicklung zur Regeneration des ZNS bei C57BL/6-Mäusen könnte somit die hohe

Konzentration von Astrozyten bis zum 98. Tag pi sein. Weiterhin induziert der Zell-

Zell-Kontakt zu den Astrozyten die Entwicklung von regulatorisch wirksamen T-

Zellen, die anschließend über lösliche Mediatoren die T-Zellproliferation inhibieren

und eine supprimierende Funktion induzieren (TRAJKOVIC et al., 2004). ALOISI et

al. (1998) zeigten, dass Astrozyten über lösliche Faktoren die mikrogliale Produktion

von IL-12 inhibieren. Zusätzlich produzieren sie immunsuppressive Moleküle wie

Prostaglandin E2 und TGF-ß (CONSTAM et al., 1992; ALOISI et al., 2000). In

aktiven, demyelinisierten Herden von MS-Patienten fand sich ebenfalls eine erhöhte

Konzentration von Astrozyten und Makrophagen, die eine hohe Expression von IL-10

und TGF-ß1, TGF-ß2 und TGF-ß3 aufwiesen (DE GROOT et al., 1999; HULSHOF et

al., 2002).

Diskussion 167

5.2 Apoptosenachweis im zentralen Nervensystem

5.2.1 Großhirn

Assoziiert mit der stärksten Ausprägung der Entzündung fanden sich auch die

meisten Apoptosen im Großhirn in der akuten Phase. Es zeigte sich in nahezu allen

Regionen eine signifikant gesteigerte Apoptose-Induktion bei den C57BL/6-Mäusen

im Vergleich zu den SJL-Mäusen. Die resistenten Mäuse besitzen offensichtlich die

Fähigkeit, durch gesteigerte Apoptose nicht nur die Entzündung einzudämmen,

sondern darüber hinaus die erfolgreiche virale Elimination in der Frühphase der

Infektion durchzuführen. Zudem weist die Aufregulation von Fas+ in der akuten Phase

(7. und 14. Tag pi) bei resistenten C57BL/6-Mäusen im überwiegenden Teil der

Großhirnkompartimente (Hippocampus, paraventrikuläre Substanz, Thalamus und

Hypothalamus) auf eine Fas-vermittelte Apoptose bzw. AICD von Immunzellen hin.

Aktuelle Untersuchungen zeigten eine verstärkt neuronale Degeneration im

Hippocampus von infizierten DA-TMEV-infizierten C57BL/6-Mäusen (LIBBEY et al.,

2008; STEWART et al., 2009). In der hier vorliegenden Studie fanden sich nur

wenige apoptotische Neurone in der Hippocampusformation, was möglicherweise auf

die Verwendung des BeAn-Stammes zurückzuführen ist. Interessanterweise zeigte

das Corpus callosum bereits am 7. Tag pi signifikant erhöhte Apoptosezahlen bei

den empfänglichen SJL-Mäusen im Vergleich zu den resistenten C57BL/6-Mäusen.

Die erhöhten Apoptosewerte bei den SJL-Mäusen könnten durch die deutlich

stärkere Infiltration von Entzündungszellen (T- und B-Zellen sowie

Makrophagen/Mikroglia) resultieren. Diese Entzündungsinfiltration ist bei den

resistenten C57BL/6-Mäusen nahezu nicht vorhanden. Eine mögliche Ursache der

Akkumulation von Entzündungszellen und assoziierten Apoptosen ist die virale

Ausbreitung nach dem „inside out“-Modell von TSUNODA und FUJINAMI (2002). So

könnte das Virus bereits am 7. Tag nach der Infektion entlang der Axone bis in die

weiße Substanz migriert sein und dort Apoptosen von glialen Zellen induzieren.

Zu Beginn der chronischen Phase (56. Tag pi) konnten keine apoptotischen Zellen,

aber signifikant erhöhte Anzahlen von Fas+ Zellen sowie T-Zellen, B-Zellen und

Makrophagen/Mikroglia sowie eine deutliche Astrogliose bei den SJL-Mäusen

168 Diskussion

nachgewiesen werden, was auf eine mögliche Apoptose-Resistenz der Zellen bei

infizierten SJL-Mäusen schließen lässt. Eine verminderte Apoptoserate von

Immunzellen wurde bei der TME bisher nur in chronischen Rückenmarksläsionen

nachgewiesen (TSUNODA et al., 1997; OLESZAK et al., 2003).

5.2.2 Klein- und Stammhirn In der akuten Phase der TME fanden sich hohe Apoptosezahlen vor allem in

parenchymatösen Läsionen, beginnend in der paraventrikulären Substanz des

vierten Ventrikels und im weiteren Verlauf verstärkt auch in der grauen und weißen

Substanz des Stammhirns. In der chronischen Phase fand sich bei den SJL-Mäusen

ein massiver Anstieg Fas+ Zellen, die in der akuten Phase nicht vorhanden waren.

Zeitgleich sank die Anzahl apoptotischer Zellen deutlich ab. Diese Zellen waren nur

noch am 98. Tag pi in geringer Zahl im Stammhirn nachweisbar. Die bis in die

chronische Spätphase der SJL-Mäuse nachvollziehbare Entzündungszellinfiltration

bei aufregulierter Fas-Expression spricht für das Vorliegen einer Apoptose-Resistenz

der Immunzellen und möglicherweise der glialen Zellen in der chronischen

Spätphase.

Entzündungszellen aber auch residente Zellen wie Mikroglia, Endothelzellen und vor

allem Astrozyten exprimieren Fas. Wie schon bei der Immunphänotypisierung der

Astrozyten von Klein- und Stammhirn beschrieben, sind Astrozyten, wie auch

Endothelzellen AICD-resistent. Nach der Ligation von Fas senden sie pro-

inflammatorische Signale aus und exprimieren FasL, welches eine Fas-vermittelte

AICD von umgebenden Fas-sensiblen Zellen (über Zell-Zellkontakt), wie T-Zellen,

Neurone und Oligodendrozyten induzieren kann. Dies kann zu progressiver

Demyelinisierung und Neuroregeneration führen (GOLD et al., 1996; PENDER und

RIST, 2001; BECHMANN et al., 2002; CHOI und BENVENISTE, 2004).

5.2.3 Rückenmark Während der chronischen Phase zeigten sich, wie schon im Stammhirn

nachgewiesen, signifikant erhöhte Werte Fas-exprimierender Zellen in meningealen

und perivaskulären Infiltraten sowie intraläsional in der weißen Substanz von SJL-

Diskussion 169

Mäusen im Vergleich zu C57BL/6-Mäusen. Außerdem konnten anhaltend hohe

Werte von Entzündungszellen und nur eine geringe Anzahl Caspase-3+ und TUNEL+,

pyknotischer Zellen nachgewiesen werden. Somit fand sich hier die Bestätigung

einer Apoptose-Resistenz entzündlicher Zellen bei empfänglichen SJL-Mäusen und

ein daraus resultierendes Versagen der Elimination potentiell autoreaktiver Zellen.

Inwieweit die infiltrierenden Fas-exprimierenden Entzündungszellen die Apoptose-

Resistenz bei der TMEV im RM aber auch im Stammhirn und im Corpus callosum

des Großhirns durch Aufregulation von Apoptose-inhibierenden Faktoren wie Bcl-2,

Survivin oder IAP aufrecht erhalten, bleibt Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Den Nachweis der Apoptose-Resistenz von Immunzellen durch verstärkte

Aufregulation von Bcl-2 in der chronischen Phase der TMEV konnte bereits von

OLESZAK et al. (2003) erbracht werden.

Makrophagen waren in bisherigen Studien, neben T-Zellen, die Zellpopulation

welche am häufigsten durch Apoptose zu Grunde ging (JELACHICH et al., 1995;

TSUNODA et al., 1997; OLESZAK et al., 2003; SCHLITT et al., 2003). In der

vorliegenden Untersuchung fanden sich nach morphologischen Kriterien vorwiegend

apoptotische Lymphozyten und Mikroglia. Diese Beobachtung sowie die mögliche

Mitbeteiligung von Astrozyten sollte in weiterführenden Studien durch

Doppelmarkierung näher untersucht werden.

5.3 Schlussbetrachtung

In der vorliegenden Studie wurde eine detaillierte, vergleichende Untersuchung des

zentralen Nervensystems von TMEV-infizierten SJL- und C57BL/6-Mäusen

durchgeführt. Dabei wurden deutliche regionale Unterschiede während des zeitlichen

Verlaufs der Entzündung in beiden Mäusestämmen beobachtet. Während ein

protektiver Effekt von regulatorischen T-Zellen bei der EAE nachgewiesen werden

konnte (LIU et al., 2006; STEPHENS et al., 2009), fanden sich in der vorliegenden

Arbeit Hinweise auf eine Suppression der antiviralen Immunantwort durch diese T-

Zellsubpopulation in empfänglichen SJL-Mäusen, wodurch möglicherweise die

Erregerpersistenz und nachfolgende immunpathologische Prozesse begünstigt

wurden. Im Hinblick auf eine postulierte infektiöse Genese der MS und die

170 Diskussion

beobachtete Reaktivierung latenter Virusinfektionen bei MS-Patienten (z.B.

progressive multifokale Leukoenzephalopathie durch Polyomaviren) infolge des

Einsatzes immunmodulatorischer Medikamente ist daher die therapeutische

Expansion dieser suppressiven T-Zellpopulation kritisch zu diskutieren (ASCHERIO

et al., 2001; LEVIN et al., 2003; HÖLLSBERG et al., 2003; SARASELLA et al., 2008;

CLIFFORD et al., 2009; OH et al., 2009; VENKEN et al., 2010; MILLONIG et al.,

2010).

Sowohl im Großhirn in der akuten Frühphase als auch im Stammhirn und RM

während der chronischen Spätphase fanden sich außerdem Hinweise auf eine

verminderte AICD bei infizierten SJL-Mäusen. Bei der MS des Menschen wird

gegenwärtig die Apoptose-Resistenz von Lymphozyten als eine Ursache für die

chronische Entzündungsreaktion und immunpathologische Prozesse im ZNS

angesehen (SHARIEF et al., 2002). Die Untersuchung des lymphozytären Zelltods

im Tiermodell stellt daher einen wichtigen Ansatzpunkt für innovative

Therapieansätze bei der MS dar (ZIPP, 2000).

Zusammenfassung 171

6 Zusammenfassung

Vergleichende Untersuchung der Immunphänotypisierung, Apoptose-Induktion und Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei empfänglichen und resistenten Mausstämmen im zentralen Nervensystem während der Theilervirus-Enzephalomyelitis

Stephanie Kristin Klein

Das Theiler-Enzephalomyelitisvirus („Theiler's murine encephalomyelitis virus“,

TMEV) verursacht eine chronische, demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis bei

empfänglichen SJL-Mäusen und dient als bedeutendes Tiermodell für die humane

Multiple Sklerose (MS) und die Leukoenzephalitis bei der Hundestaupe. Während

das Virus bei resistenten C57BL/6-Mäusen aus dem zentralen Nervensystem (ZNS)

nach einer akuten Polioenzephalitis eliminiert wird, führt eine ineffektive antivirale

Immunantwort bei SJL-Mäusen zur viralen Persistenz und verlängerten

Entzündungsreaktion und Entmarkung. Bei verschiedenen entzündlichen ZNS-

Erkrankungen bewirkt die Apoptose von residenten Zellen eine Zunahme der

pathologischen Veränderungen, wohingegen die Aktivierungs-induzierte Apoptose

(„activation induced cell death“, AICD) von Leukozyten das Ende der

Entzündungsantwort im ZNS hervorruft. Ziel der vorliegenden Studie war daher eine

detaillierte phänotypische Analyse der Entzündungsantwort und die Detektion von

Apoptosen in verschiedenen Regionen des ZNS bei TMEV-infizierten, empfänglichen

SJL- und resistenten C57BL/6-Mäusen.

Nach intrazerebraler Injektion von 60 SJL- und C57BL/6-Mäuse mit dem

schwachvirulenten BeAn-Virusstamm sowie von 60 Plazebo-infizierten SJL- und

C57BL/6-Mäusen erfolgte die Sektion am 7., 14., 56., 98. und 196. Versuchstag.

Eine immunhistologische Untersuchung (IHC) zur Ermittlung von CD3 (T-Zellen),

Foxp3 (regulatorische T-Zellen, Treg), CD25 (T-Effektorzellen/Treg), CD45R/B220

(B-Zellen), CD95 (Fas-exprimierende Zellen), CD107b (Makrophagen/Mikroglia) und

GFAP (Astrozyten) wurde an Paraffin-eingebetteten Schnitten bzw. nativen

Gefrierschnitten des Gehirns und Rückenmarks (RM) durchgeführt. Apoptotische

172 Zusammenfassung

Zellen wurden mittels IHC (aktivierte Caspase-3) und der TUNEL („TdT-mediated

dUTP-biotin nick end labelling“)-Methode detektiert.

Beide Mäusestämme zeigten eine T-zelldominierte Entzündungsantwort im Großhirn

(7. und 14. Tag post infectionem [pi]). Außerdem konnte eine prominente

Ansammlungen von CD3+ T-Zellen (14. bis 196. Tag pi) und Makrophagen/Mikroglia

(56. bis 196. Tag pi) im Stammhirn und RM infizierter SJL-Mäuse detektiert werden.

Weiterhin fand sich eine signifikante Aufregulation von Foxp3+-regulatorischen T-

Zellen und B-Zellen in der akuten Phase (7. und 14. Tag pi) im Großhirn der

infizierten SJL-Mäusen. Im weiteren zeitlichen Verlauf war eine konstante Anzahl von

Treg im Stammhirn und RM der infizierten SJL-Mäuse ermittelbar. Erhöhte Mengen

apoptotischer Zellen waren hauptsächlich im Hippocampus, Thalamus und in den

meningealen Infiltraten von C57BL/6-Mäusen am 7. und 14. Versuchstag

nachweisbar. Während in den meisten Regionen des Großhirns beider infizierter

Mäusestämme keine weiteren Entzündungszellinfiltrate nachweisbar waren, zeigte

sich im Corpus callosum infizierter SJL-Mäuse am 56. Tag pi eine signifikant

aufregulierte Fas-Expression, jedoch keine Apoptosen. Außerdem lag hier eine

Akkumulation von T-Zellen, B-Zellen, Makrophagen/Mikroglia und Astrozyten vor.

Eine lymphozytäre Infiltration und gliale Reaktionen mit Fas-Expression in

Verbindung mit einer verminderten Apoptoserate konnten ebenfalls in der weißen

Substanz des Stammhirns und RM von infizierten SJL-Mäusen während der

Spätphase beobachtet werden (196. Tag pi).

Apoptotische Zelluntergänge in frühen, entzündlichen, zerebralen Läsionen der

C57BL/6-Mäuse sind als Folge der AICD zu interpretieren und führen

möglicherweise zu der Termination der Entzündungszellen in TMEV-infizierten

resistenten Mäusestämmen. Eine reduzierte AICD in SJL-Mäusen und eine

potentielle Unterdrückung der antiviralen Entzündungsantwort bedingt durch Treg

und B-Zellen stellt eine potentielle Voraussetzung für die virale Persistenz und

konsekutive immunpathologische Prozesse mit demyelinisierender

Leukoenzephalomyelitis dar.

Summary 173

7 Summary

Comparative evaluation of immunophenotyping, apoptosis-induction and role of regulatory T-cells in the central nervous system of susceptible and resistant mouse strains during Theiler’s virus encephalomyelitis

Stephanie Kristin Klein

Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) causes a chronic demyelinating

leukoencephalomyelitis in susceptible SJL mice, similar to human multiple sclerosis

(MS) and leukoencephalitis due to canine distemper virus infection. In comparison, in

resistant C57BL/6-mice the virus is eliminated from the brain after an acute

polioencephalitis. However, ineffective antiviral immune responses contributes to

viral persistence and prolonged inflammation with subsequent myelin loss in SJL

mice, representing an important animal model for the chronic-progressive form of

MS. Apoptosis of resident neural cells contributes to lesion development, while

activation-induced dell death (AICD) of immune cells results in termination of

inflammatory responses in several central nervous system disorders. The aim of the

present study was to facilitate a detailed phenotypical analysis of inflammatory

responses and to detect apoptotic changes in the central nervous system (CNS) of

TMEV-infected susceptible SJL-mice and resistant C57BL/6-mice.

60 TMEV- or mock-infected SJL und C57BL/6 mice were necropsied at 7, 14, 56, 98,

and 196 days post infection (dpi). Immunhistochemistry (IHC) to detect CD3 (T cells),

Foxp3 (regulatory T cells, Treg), CD25 (effector T cells/regulatory T cells),

CD45R/B220 (B cells), CD95 (Fas-expressing cells), CD107b

(macrophages/microglia) and GFAP (astrocytes) was performed on paraffin-

embedded or frozen tissue brain and spinal cord samples. Apoptotic cells were

detected by a caspase-3 specific antibody using IHC and TdT-mediated dUTP-biotin

nick end labelling (TUNEL).

Both mice strains showed T cell-dominated inflammatory responses in the cerebrum

at 7 and 14 dpi and in the brain stem and spinal cord of infected SJL-mice starting at

the 14 dpi until the end of the study period (196 dpi). Macrophages/microglia were

174 Summary

found predominantly in the brain stem and spinal cord of SJL-mice during the late

phase (56 – 196 dpi). Additionally a significant upregulation of Treg and B cells in the

acute phase (7 and 14 dpi) in the cerebrum of infected SJL-mice was detected, while

a constant number of Treg was found in the brain stem and spinal cord. Increased

numbers of apoptotic cells were present in hippocampus, thalamus and meningeal

infiltrates of C57BL/6-mice at 7 and 14 dpi. While in most cerebral regions of both

mice strains no inflammatory infiltrates were detectable after the acute phase, the

corpus callosum of infected SJL mice showed a significant upregulation of Fas-

expression and infiltrations of T cells, B cells, macrophages/microglia and astrocytes

at 56 dpi. Inflammatory infiltrates and reduced numbers of apoptotic cells have been

detected in the spinal cord during the chronic infection phase.

Apoptosis in early cerebral inflammatory lesions of C57BL/6 mice might be a

consequence of AICD. Failure of AICD in the cerebrum during the acute phase of

infected SJL-mice and suppression of an adequate antiviral immune response

evoked by Treg and B cells in association with apoptotic resistance of inflammatory

cells might represent a prerequisite for viral persistence and subsequent immune

mediated demyelination, as describe for human MS.

Literaturverzeichnis 175

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Anhang 197

9 Anhang

9.1 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse der Immunphänotypisierung entzündlicher Herde im zentralen Nervensystem empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäuse

9.1.1 Großhirn

Tab. 4: Prozentualer Anteil von CD3+ T-Zellen (%) in entzündlichen

perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag post infectionem

Median (Minimum; Maximum)









Kompartiment Mäuse- stamm

Plazebo Infiziert Plazebo Infiziert Plazebo Infiziert Plazebo Infiziert Plazebo Infiziert

SJL 0** (0;70)

74** (59;84)

0** (0;62)

66** (60;88)

0 (0;0)

18 (0;52)

0 (0;0)

0 (0;60)

0 (0;0)

0 (0;67) Meningeale

Infiltrate C57BL/6 0**

(0;0) 79**

(44;90) 0**

(0;0) 78**

(68;85)0

(0;0) 39

(0;100)0

(0;0) 0

(0;77) 0

(0;0) 0

(0;100)

SJL 0** (0;0)

67** (63;74)

0 (0;0)

33 (0;83)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 82

(0;88) 0

(0;0) 0

(0;63) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

64** (49;71)

0 (0;0)

0 (0;67)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0*

(0;0) 63*

(0;85) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

79* (0;89)

0* (0;0)

75* (0;83)

0 (0;0)

0 (0;86)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

Hippocampus C57BL/6 0*

(0;0) 77*

(0;90) 0*

(0;0) 80*

(0;93) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

75* (0;89)

0 (0;0)

29 (0;70)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;69)

0 (0;0)

0 (0;88) Paraventrikuläre

Substanz C57BL/6 0

(0;0) 39

(0;83) 0*

(0;0) 74*

(0;90) 0

(0;0) 0

(0;75) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

76** (66;89)

0* (0;0)

76* (0;90)

0 (0;0)

23 (0;56)

0 (0;0)

0 (0;63)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus

und Hypothalamus C57BL/6 0*

(0;0) 79*

(0;87) 0*

(0;0) 81*

(0;90) 0

(0;0) 0

(0;67) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;63)

Vergleich von Theilervirus-infizierten Mäusen und Plazebo-Tieren

* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht

= erniedrigt p ≤ 0,01

Vergleich von SJL- und C57BL/6-Mäusen

p ≤ 0,05 = erhöht

= erniedrigt

198 Anhang

Tab. 5: Anzahl von CD3+ T-Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des

Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0** (0;80)

523** (283;603)

0** (0;0)

207** (152;368)

0 (0;2)

0 (0;10)

0 (0;3)

0 (0;7)

0 (0;0)

0 (0;2) Cortex

cerebri C57BL/6 0**

(0;48) 235**

(169;828) 0*

(0;0) 216*

(0;325) 0

(0;0) 0

(0;96) 0

(0;0) 0

(0;2) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

165** (154;272)

0** (0;0)

144** (96;272)

0** (0;0)

240** (152;240)

0 (0;4)

2 (0;10)

0 (0;2)

0 (0;3) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;272) 0*

(0;0) 136*

(0;261) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;5) 0

(0;3) 0

(0;2) 0

(0;3)

SJL 0** (0;160)

571** (432;912)

0** (0;0)

323** (224;472)

0 (0;0)

0 (0;224)

0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0 (0;8)

Hippocampus

C57BL/6 0** (0;224)

380** (224;632)

0** (0;0)

336** (288;384)

0 (0;96)

0 (0;96)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

SJL 0** (0;96)

688** (256;760)

0* (0;0)

264* (0;536)

0 (0;0)

0 (0;160)

0 (0;0)

0 (0;96)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0**

(0;0) 276**

(216;342) 0**

(0;0) 352**

(256;528)0

(0;0) 0

(0;288) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

445** (80;659)

0* (0;0)

329* (0;640)

0 (0;0)

0 (0;307)

0 (0;0)

0 0;155

0 (0;0)

0 (0;160) Thalamus


(0;293) 329*

(189;507) 216

(0;325) 267

(224;298)0

(0;96) 0

(0;277) 0

(0;0) 8

0;160 0

(0;0) 64

(0;180)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 199

Tab. 6: Prozentualer Anteil von CD45R/B220+ B-Zellen (%) in entzündlichen


7. Tag

post infectionem Median

(Minimum; Maximum)











SJL 0* (0;15)

14* (0;23)

0** (0;0)

27** (8;34)

0 (0;0)

2 (0;19)

0 (0;0)

0 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;0) Meningeale


(0;0) 21**

(14;25) 0**

(0;0) 22**

(8;32) 0

(0;0) 0

(0;20) 0

(0;0) 0

(0;14) 0

(0;0) 0

(0;29)

SJL 0* (0;0)

10* (0;30)

0 (0;0)

0 (0;18)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 10

(0;24) 0

(0;0) 0

(0;15) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

13** (5;22)

0 (0;0)

0 (0;22)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 2

(0;38) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

7* (0;15)

0* (0;0)

24* (0;90)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 15*

(0;40) 0*

(0;0) 18*

(0;23) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

9* (0;10)

0 (0;0)

15 (0;38)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;25)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 17

(0;50) 0

(0;0) 4

(0;23) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;43) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

8* (0;14)

0 (0;0)

1 (0;14)

0 (0;0)

0 (0;50)

0 (0;0)

0 (0;21)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 10*

(0;17) 0

(0;0) 1

(0;4) 0

(0;0) 0

(0;40) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

200 Anhang

Tab. 7: Anzahl von CD45R/B220+ B-Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären

Arealen des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;38)

46* (0;72)

0* (0;0)

34* (0;64)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0*

(0;0) 20*

(0;52) 0

(0;0) 0

(0;27) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

32** (21;38)

0** (0;0)

22** (16;72)

0** (0;0)

16** (16;32)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;30) 0

(0;20) 0

(0;24) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

201** (107;288)

0** (0;0)

168** (64;300)

0 (0;0)

0 (0;112)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 34*

(0;96) 0*

(0;0) 27*

(0;139) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

100** (26;272)

0* (0;0)

28* (0;120)

0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)



(0;0) 22**

(0;51) 0

(0;0) 16

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

73* (0;160)

0* (0;0)

53* (0;184)

0 (0;0)

0 (0;19)

0 (0;0)

0 (0;43)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus

und Hypothalamus C57BL/6 0**

(0;21) 37**

(29;43) 0

(0;27) 13

(0;20) 0

(0;0) 0

(0;21) 0

(0;0) 0

(0;43) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht


Vergleich von SJL- und C57BL/6 -Mäusen


= erniedrigt

Anhang 201

Tab. 8: Prozentualer von Wert CD25+ T-Zellen (%) in entzündlichen

perivaskulären und meninegalen Infiltraten des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

5** (0;24)

0* (0;0)

6* (0;15)

0 (0;0)

1 (0;10)

0 (0;0)

2 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;0) Meningeale


(0;0) 2**

(1;5) 0**

(0;0) 8**

(2;28)0

(0;0) 0

(0;45)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

1 (0;4)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 1

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;15)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

Hippocampus C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;8) 0

(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;11)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;50)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus

und Hypothalamus C57BL/6 0

(0;0) 18

(0;38) 0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

202 Anhang















SJL 0 (0;0)

0 (0;11)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

2 (0;40)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;16)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;24)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;5) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;50)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 0

(0;18) 0

(0;0) 0

(0;16)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 203

Tab. 10: Prozentualer Anteil von Foxp3+ Zellen (%) in entzündlichen


7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;15)

24** (13;32)

0** (0;0)

14** (3;17)

0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;4) Meningeale


(0;0) 29**

(19;45)0**

(0;0) 31**

(18;68)0

(0;0) 0

(0;14)0

(0;0) 0

(0;11) 0

(0;0) 0

(0;3)

SJL 0** (0;0)

21** (5;31)

0 (0;0)

0 (0;13)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0*

(0;0) 10*

(7;20) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;6)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0**

(0;0) 12**

(7;20) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

14** (6;58)

0* (0;0)

15* (0;29)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 19*

(0;40) 0

(0;0) 10

(0;20)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

15* (0;20)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;8)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0*

(0;0) 17*

(3;79) 0*

(0;0) 8*

(0;33)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;71) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

9* (0;24)

0 (0;0)

7 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;17)

0 (0;0)

0 (0;14)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 20**

(9;52) 0*

(0;0) 22*

(0;61)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

204 Anhang

Tab. 11: Anzahl von Foxp3+ T-Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen

des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0** (0;16)

70** (42;112)

0* (0;0)

29* (0;96)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0**

(0;0) 38**

(20;56) 0*

(0;0) 32*

(0;80) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

41** (16;59)

0** (0;0)

36** (8;128)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0*

(0;0) 16*

(0;16) 0**

(0;0) 61**

(48;64)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

75** (16;165)

0** (0;20)

64** (8;144)

0 (0;0)

0 (0;96)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

Hippocampus C57BL/6 0**

(0;20) 32**

(16;176)0*

(0;0) 92*

(0;112)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

80** (56;228)

0** (0;0)

45** (16;64)

0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)



(0;0) 35**

(19;56) 0*

(0;0) 72*

(0;144)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

72** (24;182)

0* (0;0)

44* (0;72)

0 (0;0)

0 (0;99)

0 (0;0)

0 (0;21)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;43) 90*

(29;137)24

(0;80) 133

(59;171)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;11) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 205

Tab. 12: Prozentualer Anteil von CD107b+ Zellen (%) in entzündlichen


7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0 (0;12)

0 (0;1)

0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;2)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Meningeale


(0;0) 2**

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;13)

SJL 0 (0;0)

1 (0;6)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

10** (5;12)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;17) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;4)

0* (0;0)

2* (0;16)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 1

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;12)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;11)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;29) 0

(0;0) 0

(0;15)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

1 (0;14)

0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 2*

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;17)0

(0;0) 0

(0;33)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

206 Anhang

Tab. 13: Anzahl von CD107b+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des














SJL 0* (0;38)

33* (0;112)

0 (0;21)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;16) 9

(0;79) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

27** (19;39)

0** (0;0)

40** (32;52)

0** (0;0)

224** (32;336)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;11) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

202** 125;300

0** (0;0)

54** (16;288)

0 (0;0)

0 (0;80)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

Hippocampus

C57BL/6 0* (0;0)

16* (0;35)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;56)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;75)

0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)



(0;0) 20**

(0;182)0

(0;0) 0

(0;8) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

35* (0;227)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;330)

0 (0;0)

0 0;176

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;59) 58*

(0;147)0*

(0;0) 19*

(0;81) 0

(0;16) 0

(0;37) 0

(0;0) 0

0;176 0

(0;0) 0

(0;11)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 207

Tab. 14: Anzahl von GFAP+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des














SJL 1** (0;112)

216** (56;520)

0** (0;11)

120** (16;136)

2 (0;43)

1 (0;5)

2 (0;6)

2 (0;8)

0 (0;2)

4 (0;5) Cortex

cerebri C57BL/6 14*

(2;64) 149*

(117;367)2

(2;18) 72

(0;216) 2

(0;24) 4

(0;112) 2

(0;6) 2

(0;4) 2

(0;3) 4

(0;15)

SJL 52** (13;93)

109** (89;256)

25** (0;43)

172** (72;528)

64* (40;78)

224* (200;272)

17 (0;70)

16 (0;28)

21 (8;40)

18 (0;28) Corpus

callosum C57BL/6 56

(48;75) 40

(20;80) 14

(3;38) 88

(0;165) 61

(27;123)40

(14;85) 19

(0;65) 16

(0;40) 12

(6;14) 10

(3;14)

SJL 53* (30;104)

197* (176;976)

38** (21;75)

172** (126;224)

61 (22;106)

54 (0;352)

50 (19;74)

45 (20;192)

56 (46;64)

50 (50;69)


(35;137) 206

(32;352)40**

(0;74) 177**

(141;272)79

(45;94) 22

(0;704) 34

(6;54) 16

(0;22) 22

(11;54) 18

(0;24)

SJL 16** (3;112)

224** (192;280)

13 (3;18)

101 (0;464)

12 (5;21)

3 (0;176)

3 (0;8)

4 (0;224)

8 (2;11)

2 (0;272)Paraventrikuläre

Substanz C57BL/6 22*

(5;61) 109*

(102;261)6**

(3;14) 224**

(120;352)5

(2;19) 8

(0;32) 7

(2;43) 3

(0;8) 2

(0;5) 2

(0;5)

SJL 20** (0;42)

86** (53;283)

7 (3;18)

108 (0;144)

14 (3;64)

26 (0;192)

12 (6;19)

16 (0;229)

11 (8;22)

5 (0;272)Thalamus


(8;367) 189

(125;294)74*

(0;216) 201*

(133;400)10

(2;40) 0

(0;252) 5

(2;20) 11

(0;229) 3

(2;26) 53

(0;128)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

208 Anhang

9.1.2 Klein- und Stammhirn


perivaskulären und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

71** (34;78)

0 (0;0)

0 (0;78)

0* (0;0)

64* (0;74)

0** (0;0)

48** (0;75)

0 (0;0)

69 (0;82) Meningeale

Infiltrate, Klein- und Stammhirn C57BL/6 0*

(0;0) 73*

(0;85) 0

(0;0) 35

(0;83) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

79* (0;93)

0** (0;0)

83** (68;89)

0** (0;0)

61** (7;73)

0* (0;0)

55* (0;88)

0 (0;0)


Substanz, vierter Ventrikel C57BL/6 0**

(0;0) 80**

(61;87) 0*

(0;0) 66*

(0;81) 0

(0;0) 0

(0;50) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;74)

0** (0;0)

65** (0;95)

0 (0;0)

0 (0;78)

0 (0;0)

0 (0;91) Graue Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;42) 0

(0;0) 40

(0;93) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;88)

0* (0;0)

75* (0;94)

0* (0;0)

65* (0;83)

0* (0;0)

69* (0;85)

0 (0;0)

67 (0;95) Weiße Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 209


Klein- und Stammhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;0)

338* (0;698)

0** (0;0)

387** (192;608)

0* (0;0)

244* (0;637)

0* (0;0)

84* (0;272)

0 (0;0)



(0;0) 394**

(128;781) 0*

(0;0) 171*

(0;312) 0

(0;0) 0

(0;172) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;416)

0 (0;0)

152 (0;568)

0** (0;0)

301** (0;632)

0* (0;0)

107* (0;272)

0* (0;0)

128* (0;172) Graue Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0*

(0;0) 320*

(0;528) 0*

(0;0) 232*

(0;472) 0

(0;0) 0

(0;176) 0

(0;0) 0

(0;304) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;208)

0 (0;0)

179 (0;651)

0* (0;0)

265* (0;533)

0** (0;0)

150** (86;192)

0* (0;0)

236* (171;352)Weiße Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0

(0;136) 0

(0;288) 0

(0;0) 0

(0;256) 0

(0;0) 0

(0;208) 0

(0;0) 0

(0;208) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

Weiße Substanz, Kleinhirn

C57BL/6 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht


Vergleich von SJL- und C57BL/6 -Mäusen


= erniedrigt

210 Anhang

Tab. 17: Prozentualer Anteil von CD45R/B220+ B-Zellen (%) in entzündlichen


7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

5** (2;22)

0 (0;0)

0 (0;23)

0 (0;0)

6 (0;9)

0* (0;0)

6* (0;19)

0 (0;0)

18 (0;19)Meningeale


(0;0) 23*

(0;60) 0

(0;0) 8

(0;33)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

5 (0;13)

0** (0;0)

20** (11;40)

0** (0;0)

8** (1;14)

0 (0;0)

6 (0;14)

0 (0;0)



(0;0) 29**

(22;52)0*

(0;0) 36*

(0;53)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;19)

0** (0;0)

6** (0;19)

0 (0;0)

0 (0;11)

0 (0;0)

0 (0;13)Graue Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;40)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

4 (0;30)

0* (0;0)

2* (0;30)

0 (0;0)

0 (0;20)

0 (0;22)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 211


Arealen des Klein- und Stammhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;0)

42* (0;108)

0** (0;0)

79** (24;192)

0* (0;0)

9* (0;37)

0 (0;0)

0 (0;48)

0 (0;0)



(0;0) 52**

(5;123) 0*

(0;0) 13*

(0;56) 0

(0;0) 0

(0;304)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;80)

0 (0;0)

0 (0;40)

0** (0;0)

48** (0;64)

0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;36) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;52)

0 (0;0)

27 (0;85)

0* (0;0)

23* (0;75)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;139)0

(0;0) 0

(0;197) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Graue Substanz,

Kleinhirn C57BL/6

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

SJL 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Weiße Substanz,

Kleinhirn C57BL/6

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

212 Anhang



7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

15** (8;60)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

7* (2;18)

0* (0;0)

4* (2;4) Meningeale


(0;0) 6*

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;17)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

16* (0;33)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;14)

0 (0;0)


Substanz, vierter Ventrikel C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;33) 0

(0;0) 2

(0;47)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;14)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;50)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 213















SJL 0 (0;0)

0 (0;2)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)



(0;0) 0

(0;5) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;16)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;32)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

214 Anhang

Tab. 21: Prozentualer Anteil von Foxp3+ Zellen (%) in entzündlichen














SJL 0 (0;0)

0 (0;15)

0 (0;0)

0 (0;13)

0* (0;0)

15* (0;24)

0 (0;0)

10 (0;30)

0* (0;0)

16* (16;27)Meningeale

Infiltrate, Klein- und Stammhirn C57BL/6 0**

(0;0) 16**

(8;28) 0

(0;0) 25

(0;65)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

17** (5;51)

0* (0;0)

6* (0;21)

0** (0;0)

29** (23;47)

0 (0;0)

1 (0;20)

0 (0;0)



(0;0) 23**

(10;32)0**

(0;0) 10**

(4;44)0

(0;0) 0

(0;29)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;11)

0** (0;0)

42** (13;63)

0 (0;0)

9 (0;32)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;17) 0

(0;0) 20

(0;30)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

3 (0;29)

0 (0;0)

3 (0;22)

0** (0;0)

33** (20;45)

0* (0;0)

7* (0;41)

0* (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 215

Tab. 22: Anzahl von Foxp3+ T-Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen

des Klein- und Stammhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0** (0;0)

60** (40;72)

0** (0;0)

53** (0;128)

0** (0;0)

77** (48;128)

0 (0;0)

0 (0;51)

0 (0;0)



(0;0) 60**

(48;133)0**

(0;0) 67**

(11;168)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;38)

0 (0;0)

8 (0;56)

0** (0;0)

131** (64;224)

0* (0;0)

12* (0;28)

0** (0;0)

64** (0;107)Graue Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0**

(0;0) 44**

(8;64) 0*

(0;0) 48*

(16;72)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;40) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)

0 (0;108)

0** (0;0)

87** (44;149)

0* (0;0)

38* (0;104)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;13) 0

(0;0) 0

(0;37) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

216 Anhang

Tab. 23: Prozentualer Anteil von CD107b+ Zellen (%) in entzündlichen














SJL 0** (0;0)

4** (0;16)

0 (0;0)

0 (0;13)

0 (0;0)

1 (0;6)

0** (0;0)

4** (0;6)

0 (0;0)

6 (0;10) Meningeale

Infiltrate, Klein- und Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

1 (0;10)

0 (0;0)

2 (0;5)

0** (0;0)

5** (3;21)

0* (0; 0)

4* (0;5)

0 (0;0)


Substanz, vierter Ventrikel C57BL/6 0*

(0;0) 3*

(0;6) 0

(0;0) 2

(0;12) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;30)

0 (0;0)

0 (0;6)

0 (0;0)

0 (0;14)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;7)

0* (0;0)

7* (0;8)

0 (0;0)

0 (0;41)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 217

Tab. 24: Anzahl von CD107b+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen














SJL 0 (0;0)

42 (0;164)

0 (0;0)

0 (0;48)

0* (0;0)

167* (0;483)

0* (0;0)

195* (0;296)

0 (0;0)



(0;0) 13

(0;195) 0

(0;0) 6

(0;40) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;96)

0 (0;0)

0 (0;64)

0* (0;0)

128* (0;856)

0** (0;0)

140** (72;208)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;56) 0

(0;0) 0

(0;56) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;24)

0 (0;0)

13 (0;52)

0* (0;0)

189* (0;340)

0** (0;0)

108** (24;608)

0* (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;4) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

218 Anhang















SJL 3 (0;24)

59 (0;130)

3* (0;8)

191* 107;283

3 (5;11)

227 (10;336)

5* (0;6)

184* (0;256)

3 (3;5)


Substanz, Klein- und Stammhirn C57BL/6 3*

(0;37) 81*

(61;315) 6

(3;11) 187

(0;448) 5

(3;8) 0

(4;192) 5

(5;5) 4

(2;16) 3

(2;5) 2

(0;4)

SJL 0 (0;0)

0 (0;112)

0 (0;0)

28 (0;160)

10 (3;24)

291 (0;968)

3 (0;8)

129 (0;192)

8 (6;11)


Stammhirn C57BL/6 3

(0;5) 68

(0;256) 1*

(0;6) 112*

(0;192) 2

(0;10) 0

(0;128) 1

(0;3) 0

(0;120) 0

(0;2) 0

(0;0)

SJL 11 (0;16)

0 (0;128)

6 (0;16)

11 (0;72)

38 (6;70)

133* (0;267)

13** (0;21)

112** (59;288)

24* (0;27)


Stammhirn C57BL/6 18

(2;22) 4

(0;96) 6

(5;14) 5

(0;32) 22

(3;56) 20

(0;72) 11

(5;86) 0

(0;128) 7

(3;10) 5

(3;10)

SJL 1 (4;12)

4 (4;8)

2 (0;13)

5 (3;12)

8 (2;9)

5 (5;5)

3 (1;8)

8 (4;10)

7 (3;5)


Kleinhirn C57BL/6 1

(1;6) 2

(1;6) 1

(1;8) 1

(1;6) 3

(2;8) 5

(2;9) 4

(2;9) 4

(0;9) 4

(0;10) 0

(0;8)

SJL 3 (3;7)

4 (1;10)

4 (4;9)

5 (4;10)

4 (6;12)

6 (5;9)

8 (0;14)

10 (10;15)

16 (8;20)

18 (10;26)Weiße Substanz,

Kleinhirn C57BL/6 1

(0;4) 3

(1;5) 4

(4;8) 5

(4;6) 8

(0;10) 10

(0;14) 10

(6;10) 14

(6;20) 14

(4;10) 18

(4;20)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 219

9.1.3 Rückenmark


perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

67** (49;74)

0** (0;0)

56** (14;69)

0** (0;0)

58** (53;63)

0** (0;0)

45** (31;65)

0** (0;0)

40** (14;72)Meningeale

Infiltrate C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;27) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;30) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

12 (0;67)

0 (0;0)

0 (0;84)

0 (0;0)

0 (0;0)

Graue Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;82) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;84)

0 (0;0)

0 (0;90)

0** (0;0)

38** (14;83)

0** (0;0)

69** (30;77)

0* (0;0)

60* (58;100)

Weiße Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;0)

448* (0;736)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;336)

0 (0;0)

0 (0;288)

0 (0;0)

0 (0;0) Graue

Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;27) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;69) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

352* (0;616)

0** (0;0)

382** (236;442)

0** (0;0)

183** (96;322)

0* (0;0)

127* (48;176)Weiße

Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0**

(0;0) 368**

(288;400)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;128) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

220 Anhang

Tab. 28: Prozentualer Anteil von CD45R/B220+ B-Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

11** (6;16)

0** (0;0)

31** (19;51)

0** (0;0)

14** (6;15)

0** (0;0)

13** (6;23)

0 (0;0)

10 (0;25)Meningeale


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;47)

0 (0;0)

0 (0;0) Graue Substanz

C57BL/6 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;11)

0 (0;0)

2 (0;20)

0 (0;0)

6 (0;15)

0** (0;0)

26** (6;33)

0 (0;0)

23 (0;25)Weiße Substanz

C57BL/6 0 (0;0)

0 (0;25)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Arealen des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;0)

64* (0;688)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;128)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

112* (0;224)

0** (0;0)

58** (40;80)

0** (0;0)

14** (9;45)

0* (0;0)

4* (0;16)


(0;0) 0

(0;0) 0*

(0;0) 16*

(0;16)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 221

Tab. 30: Prozentualer Anteil von CD25+ T-Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;20)

0* (0;0)

2* (0;16)

0 (0;0)

5 (0;20)

0* (0;0)

21* (13;24)Meningeale


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;10)

0** (0;0)

16** (8;21)

0 (0;0)

0 (0;25)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Tab. 31: Anzahl von CD25+ T-Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des














SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;32)

0 (0;0)

27 (0;40)

0* (0;0)

21* (0;24)

0 (0;0)

0 (0;8)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

222 Anhang

Tab. 32: Prozentualer Anteil von Foxp3+ Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0 (0;0)

8 (0;22)

0* (0;0)

38* (23;42)

0** (0;0)

18** (7;31)

0** (0;0)

25** (16;46)

0** (0;0)



(0;0) 0

(0;41) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;22) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;17)

0 (0;0)

26 (0;33)

0* (0;0)

6* (3;23)

0** (0;0)

45** (22;58)

0* (0;0)

24* (11;31)


(0;0) 0

(0;26) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Tab. 33: Anzahl von Foxp3+ T-Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen

des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0** (0;0)

60** (32;80)

0** (0;0)

48** (21;88)

0** (0;0)

61** (51;96)

0* (0;0)

69* (5;88)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;48)0

(0;0) 0

(0;32)0

(0;0) 0

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 223

Tab. 34: Prozentualer Anteil von CD107b+ Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0* (0;0)

33* (0;42)

0 (0;0)

5 (0;33)

0* (0;0)

23* (0;57)

0* (0;0)

42* (0;65)

0** (0;0)



(0;0) 0

(0;44) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;17)

0 (0;0)

0 (0;15)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;27)

0 (0;0)

2 (0;19)

0* (0;0)

20* (0;51)

0* (0;0)

32* (0;61)

0* (0;0)

30* (0;54)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Tab. 35: Anzahl von CD107b+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen














SJL 0* (0;0)

80* (0;416)

0 (0;0)

0 (0;48)

0 (0;0)

0 (0;128)

0 (0;0)

48 (0;176)

0 (0;0)

0 (0;144)


(0;0) 0

(0;400) 0

(0;0) 0

(0;96) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

0* (0;0)

133* (0;309)

0* (0;0)

285* (0;617)

0** (0;0)

101** (40;176)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;352) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

224 Anhang















SJL 11 (8;48)

18 (6;48)

10 (3;24)

13 (5;27)

7 (0;43)

23 (4;64)

14 (6;19)

17 (10;256)

16 (0;37)

16 (12;48)

Graue Substanz

C57BL/6 6 (0;10)

5 (2;41)

6 (0;10)

3 (0;8)

3 (0;6)

3 (0;96)

2 (0;6)

5 (0;42)

4 (0;10)

3 (0;6)

SJL 2 (2;34)

4 (2;10)

10 (2;26)

64 (0;240)

14** (5;18)

80** (32;96)

17** (11;27)

87** (24;130)

7* (0;26)

125* (48;165)

Weiße Substanz

C57BL/6 12 (6;40)

6 (4;64)

18* (5;30)

128* (48;208)

11* (3;26)

112* (48;128)

17* (6;21)

96* (80;144)

11 (0;18)

6 (0;11)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 225

9.2 Tabellarische Darstellung der Ergebnisse des Apoptosenachweis und der Fas-Expression in entzündlichen Herden im zentralen Nervensystem empfänglicher SJL- und resistenter C57BL/6-Mäuse

9.2.1 Aktivierte Caspase-3+ Zellen

Tab. 37: Prozentualer Anteil von Caspase-3+ Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;5)

1 (0;3)

0* (0;0)

2* (0;3)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Meningeale


(0;0) 4**

(2;7) 0*

(0;0) 3**

(0;10) 0

(0;0) 0

(0;13) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

4* (0;7)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;12) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

2** (0;6)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;8) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

2* (0;7)

0 (0;0)

1 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 2*

(0;9) 0

(0;0) 2

(0;12) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

3 (0;10)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 1

(0;14) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

1* (0;7)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 5*

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;17) 0

(0;0) 0

(0;13) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

226 Anhang

Tab. 38: Anzahl von Caspase-3+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen

des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;14)

12* (0;32)

0* (0;0)

8* (0;21)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0*

(0;16) 15*

(10;30) 0

(0;0) 0

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

18** (13;24)

0** (0;0)

16** (8;37)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;14) 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

59** (35;128)

0** (0;8)

11** (8;18)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;28) 32**

(16;80) 0**

(0;0) 28**

(21;48)0

(0;32) 0

(0;48) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

18* (0;40)

0 (0;0)

0 (0;16)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)



(0;0) 44**

(24;58) 0*

(0;0) 8*

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

26** (11;32)

0* (0;0)

11* (0;32)

0 (0;0)

0 (0;35)

0 (0;0)

0 (0;48)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;30) 62**

(34;80) 0**

(0;12) 21**

(13;40)0

(0;32) 0

(0;11) 0

(0;0) 0

(0;48) 0

(0;0) 0

(0;5)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 227

Tab. 39: Prozentualer Anteil von Caspase-3+ Zellen (%) in entzündlichen














SJL 0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;1)

0* (0;0)

1* (0;3)

0 (0;0)

3 (0;5) Meningeale


(0;0) 2*

(0;10) 0

(0;0) 0

(0;4) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

2* (0;4)

0* (0;0)

2* (0;4)

0** (0;0)

4** (1;6)

0* (0;0)

4* (0;9)

0 (0;0)



(0;0) 4*

(0;10) 0*

(0;0) 2*

(0;27) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

3 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;8) 0

(0;0) 0

(0;4) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;3)

0* (0;0)

3* (0;5)

0 (0;0)

2 (0;10)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

228 Anhang

Tab. 40: Anzahl von Caspase-3+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen














SJL 0* (0;0)

49* (0;80)

0* (0;0)

16* (0;32)

0* (0;0)

17* (0;28)

0 (0;0)

4 (0;16)

0 (0;0)



(0;0) 42**

(5;67) 0*

(0;0) 24*

(0;120)0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;64)

0 (0;0)

8 (0;40)

0* (0;0)

35* (0;48)

0 (0;0)

4 (0;40)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0*

(0;0) 24*

(0;96) 0*

(0;0) 22*

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)

0 (0;40)

0* (0;0)

19* (0;32)

0* (0;0)

14* (0;24)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;4) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 229

Tab. 41: Prozentualer Anteil von Caspase-3+ Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;0)

2 (0;4)

0** (0;0)

1** (1;2)

0* (0;0)

1* (0;1)

0** (0;0)

1** (0;2)

0 (0;0)

0 (0;0) Meningeale


(0;0) 0

(0;17) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

1 (0;3)

0* (0;0)

1* (0;2)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Tab. 42: Anzahl von Caspase-3+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen














SJL 0 (0;0)

4 (0;48)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;32)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;17) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

40* (0;64)

0** (0;0)

16** (15;32)

0** (0;0)

20** (6;23)

0 (0;0)

0 (0;3)


(0;0) 0

(0;24) 0

(0;0) 8

(0;32) 0

(0;0) 5

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;12) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

230 Anhang

9.2.2 TUNEL+, pyknotische Zellen

Tab. 43: Prozentualer Anteil von TUNEL+, pyknotischen Zellen (%) in

entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0 (0;5)

2 (0;4)

0** (0;4)

2** (0;2)

0 (0;0)

0 (0;6)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Meningeale


(0;0) 6**

(5;13) 0*

(0;0) 5*

(1;9) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;3)

SJL 0* (0;0)

4* (0;15)

0 (0;0)

0 (0;1)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;7) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

3** (1;5)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;7) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

3* (0;5)

0* (0;0)

2* (0;10)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 5*

(0;9) 0

(0;0) 3

(0;20) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

7* (0;20)

0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;9) 0

(0;0) 2

(0;8) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

2* (0;4)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 2*

(0;8) 0

(0;0) 0

(0;5) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 231

Tab. 44: Anzahl von TUNEL+, pyknotischen Zellen (Zellen/mm2) in

hyperzellulären Arealen des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0** (0;0)

26** (10;66)

0* (0;0)

11* (0;32)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0*

(0;16) 31*

(0;66) 0

(0;0) 0

(0;10) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

27** (19;37)

0** (0;0)

19** (16;56)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;19) 0

(0;0) 0

(0;24) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0** (0;0)

87** (13;112)

0* (0;14)

16* (8;32)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;36) 54**

(16;120)0**

(0;0) 32**

(24;67)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

20* (0;48)

0 (0;0)

0 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)



(0;0) 56**

(35;93) 0*

(0;0) 12*

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

31* (0;56)

0* (0;0)

8* (0;16)

0 (0;0)

0 (0;67)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;64) Thalamus


(0;66) 73*

(38;126)0**

(0;16) 23**

(18;43)0

(0;0) 0

(0;11) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;5)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

232 Anhang

Tab. 45: Prozentualer Anteil von TUNEL+, pyknotischen Zellen (%) in














SJL 0 (0;0)

0 (0;1)

0 (0;0)

0 (0;4)

0 (0;0)

1 (0;3)

0** (0;0)

2** (0;4)

0 (0;0)

4 (0;5) Meningeale

Infiltrate, Klein- und Stammhirn C57BL/6 0**

(0;0) 9**

(0;17) 0

(0;0) 0

(0;17)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0* (0;0)

1* (0;6)

0* (0;0)

1* (0;2)

0* (0;0)

2* (2;6)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)



(0;0) 6*

(0;35) 0*

(0;0) 2*

(0;18)0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;4)

0** (0;0)

5** (0;18)

0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;10)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;5)

0 (0;0)

0 (0;1)

0* (0;0)

5* (0;8)

0 (0;0)

0 (0;8)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 233

Tab. 46: Anzahl von TUNEL+, pyknotischen Zellen (Zellen/mm2) in

hyperzellulären Arealen des Klein- und Stammhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0* (0;0)

38* (0;86)

0* (0;0)

20* (0;43)

0* (0;0)

18* (0;41)

0 (0;0)

4 (0;16)

0 (0;0)


Substanz, vierte Ventrikel C57BL/6 0**

(0;0) 61**

(24;98)0*

(0;0) 38*

(0;128)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;48)

0 (0;0)

0 (0;24)

0* (0;0)

43* (0;80)

0** (0;0)

11** (0;32)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0**

(0;0) 16**

(0;24) 0*

(0;0) 24*

(0;48)0

(0;0) 0

(0;16)0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;12)

0 (0;0)

10 (0;27)

0* (0;0)

13* (0;24)

0 (0;0)

4 (0;18)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;16)0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;11) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

234 Anhang

Tab. 47: Prozentualer Anteil von TUNEL+, pyknotischen Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).

7. Tag


(Minimum; Maximum)











SJL 0** (0;0)

5** (4;6)

0* (0;0)

1* (0;2)

0** (0;0)

2** (1;3)

0** (0;0)

2** (1;5)

0 (0;0)

0 (0;2) Meningeale


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;8)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;7)

0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

2* (0;3)

0* (0;0)

2* (1;3)

0 (0;0)

0 (0;1)


(0;0) 0

(0;12) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) Tab. 48: Anzahl von TUNEL+, pyknotischer Zellen (Zellen/mm2) in

hyperzellulären Arealen des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;0)

5 (0;16)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;16)

0 (0;0)

0 (0;16)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;7) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

34* (0;80)

0** (0;0)

19** (4;48)

0** (0;0)

13** (11;34)

0* (0;0)

5* (4;6)


(0;0) 0

(0;16) 0*

(0;0) 16*

(0;64)0

(0;0) 8

(0;48)0

(0;0) 0

(0;32) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 235

9.2.3 Fas+ Zellen

Tab. 49: Prozentualer Anteil von Fas+ Zellen (%) in entzündlichen perivaskulären

und meningealen Infiltraten des Großhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

1* (0;2)

0 (0;0)

0 (0;23)

0 (0;0)

0 (0;20)

0 (0;0)

0 (0;7) Meningeale


(0;0) 2**

(1;2) 0**

(0;0) 20**

(8;68)0

(0;0) 7

(0;17)0

(0;0) 0

(0;40) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;6)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;2)

0 (0;0)

0 (0;2)

0 (0;0)

0 (0;10)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0*

(0;0) 4*

(0;70)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;13)

0 (0;0)

0 (0;13)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;14) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;18)

0 (0;0)

0 (0;56)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;0) 0

(0;1) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

236 Anhang

Tab. 50: Anzahl von Fas+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des














SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Cortex

cerebri C57BL/6 0*

(0;16) 16*

(0;44) 0

(0;0) 0

(0;16) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0** (0;0)

16** (10;128)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0) Corpus

callosum C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;96) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;8)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;44) 0

(0;8) 0**

(0;0) 16**

(11;32)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;11)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Substanz C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;16) 0*

(0;0) 8*

(1;24) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;3)

0 (0;0)

0 (0;170)

0 (0;0)

0 (0;144)

0 (0;0)

0 (0;0) Thalamus


(0;44) 17**

(0;48) 0*

(0;16) 19*

(2;48) 0

(0;0) 0

(0;21) 0

(0;0) 0

(0;144) 0

(0;0) 0

(0;16)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 237


und meningealen Infiltraten des Klein- und Stammhirns (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;4)

0** (0;0)

11** (0;18)

0** (0;0)

9** (0;65)

0 (0;0)

3 (0;23)Meningeale

Infiltrate, Klein- und Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;42) 0

(0;0) 13

(0;47)0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

1* (0;5)

0** (0;0)

16** (6;19)

0* (0;0)

14* (0;38)

0 (0;0)



(0;0) 0

(0;0) 0*** (0;0)

3*** (0;6)

0 (0;0)

0 (0;12)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;4)

0** (0;0)

16** (0;26)

0 (0;0)

0 (0;61)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;11)

0* (0;0)

16* (0;25)

0 (0;0)

5 (0;32)

0 (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

238 Anhang

Tab. 52: Anzahl von Fas+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des














SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

7* (0;32)

0* (0;0)

58* (0;216)

0* (0;0)

45* (0;160)

0 (0;0)



(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 3

(0;21) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

137* (0;592)

0* (0;0)

37* (0;140)

0* (0;0)

56* (0;112)Graue Substanz,

Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;144)0

(0;0) 0

(0;248) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;16)

0* (0;0)

90* (0;115)

0* (0;0)

20* (0;144)

0* (0;0)


Stammhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;3) 0

(0;0) 0

(0;139) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)


Kleinhirn C57BL/6 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

Anhang 239


und meningealen Infiltraten des Rückenmarks (Mann-Whitney-U-Test).













SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;4)

0** (0;0)

32** (25;50)

0** (0;0)

34** (21;37)

0** (0;0)



(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;12) 0

(0;0) 3

(0;74) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

25 (0;34)

0 (0;0)

0 (0;63)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0* (0;0)

26* (15;26)

0** (0;0)

22** (17;57)

0* (0;0)

38* (0;84)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;20) 0

(0;0) 0

(0;0) Tab. 54: Anzahl von Fas+ Zellen (Zellen/mm2) in hyperzellulären Arealen des














SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;256)

0 (0;0)

0 (0;48)

0 (0;0)

0 (0;0)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;10) 0

(0;0) 0

(0;12) 0

(0;0) 3

(0;74) 0

(0;0) 0

(0;0)

SJL 0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0 (0;0)

0** (0;0)

139** (75;172)

0** (0;0)

80** (36;112)

0* (0;0)

87* (35;124)


(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;0) 0

(0;80) 0*

(0;0) 56*

(0;80) 0

(0;0) 0

(0;0)


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt


* p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01 = erhöht




= erniedrigt

240 Anhang

Spezifität Hersteller mAk/pAk Spezies

Klon/ Antiserum

Kreuz-reaktivität

Block-serum

Sekundär-antikörper Nachweis

CD3 Dako pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum + - GaR-b 1:200 T-Zellen

CD25 BD Biosciences mAk; Kaninchen 7D4 + KNS 1:5 -

Regulatorische T-Zellen/

Effektor-T-Zellen

Foxp3 Natu Tec mAk; Ratte FJK-16s + KNS 1:5 RaR-b 1:200 Regulatorische

T-Zellen

CD45R/ B220

BD Biosciences mAk; Ratte RA3-6B2 + KNS 1:5 - B-Zellen

CD107b AbD Serotec mAk; Ratte M3/84 + - - Makrophagen/

Mikroglia

GFAP Dako pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum + ZNS 1:5 GaR-b 1:200 Astrozyten

Caspase-3 Cell Signaling pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum + ZNS 1:5 GaR-b 1:200 Effektor-

Caspase

Survivin Novus Biologics pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum - ZNS 1:5 GaR-b 1:200 IAP

TIAP ProSci Inc pAK; Kaninchen


c-IAP1 Novus Biologics pAk; Kaninchen


c-IAP1 R&D Systems pAK; Ziege

IgG Fraktion Ziegenserum - PNS 1:5 HaG-b 1:200 IAP

c-IAP2 R&D Systems pAK; Ziege


XIAP R&D Systems pAk; Ziege


NAIP Abcam pAk; Kaninchen


ML-IAP (Livin)

Novus Biologics pAk; Kaninchen


Bcl-2 BD Biosciences pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum - ZNS 1:5 GaR-b 1:200 anti-apoptotisch

Bax Santa Cruz pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum - ZNS 1:5 GaR-b 1:200 pro-apoptotisch

CD95 Santa Cruz pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum + ZNS 1:5 GaR-b 1:200 Fas Rezeptor

CD95L Santa Cruz pAk; Kaninchen

IgG Fraktion Kaninchenserum - ZNS 1:5 GaR-b 1:200 Fas Ligand

mAk = monoklonale Antikörper; pAk = polyklonale Antikörper; ZNS = Ziegennormalserum;

PNS = Pferdenormalserum; GaR-b = „Goat-anti-Rabbit-biotinylated“;

HaR-b = „Horse-anti-Rabbit-biotinylated“; IAP = “inhibitors of apoptosis protein”

Tab. 55: Tabellarische Auflistung der Primärantikörper und deren Kreuzreaktivität im murinen Gewebe

Anhang 241

9.3 Bezugsquellen für Reagienzen, Chemikalien und Antikörper

AbD Serotec, Oxford, UK

Biotin-konjugiert Ratte anti Maus CD107b, M4/84 BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA

Biotin-konjugiert Ratte anti Maus CD25 (IL-2 Rezeptor α Kette), 7D4 Biotin-konjugiert Ratte anti Maus CD45R/B220, RA3-6B2 Ratten-IgM-Isotyp-Kontrolle, R4-22

Camon Labor-Service GmbH, Wiesbaden, Deutschand

Vectastain ABC Kit Standard (Vector Laboratories), PK 6100 Chemicon International, Inc., Temecula, USA

ApopTag® in situ apoptosis detection kit (TUNEL) Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, USA (Vetriebspartner: New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland)

Anti-Cleaved Capase-3-Antikörper, Kaninchen ASP 175 DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland

Kaninchen anti-Human CD3, A0452 Anti-GFAP Antikörper, Kaninchen Z0334 Kaninchennormalserum, X0902

eBiosciences Inc., San Diego, CA, USA (Vetriebspartner: NatuTec, Frankfurt am Main, Deutschland)

Anti Maus/Ratte Foxp3, FJK-16s Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland

SJL/JHanHsd, weiblich, 3-4 Wochen, 87802F Menno Chemie Vertriebsges. mbH, Norderstedt, Deutschland

Venno Vet 1 super Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Domitor®, Medetomidin 1mg/ml R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA

Ratten IgG2A Isotyp Kontrolle, 54447 Rat IgG2ARatten IgG1 Isotyp Kontrolle, 43414

Roth C. GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

Ethanol, Rotipuran®, 9065 Ethanol, vergällt, K928.2 Formaldehyd 37%, 7398 Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2 Methanol, Rotipuran® 99.9% p.a., 4627

242 Anhang

Natriumchlorid /naCl), P029.2 2-Propanol, Rotipuran® (Isoprpylalkohol), 6752 Roti®-Histol, 6640

Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Niederlande

Tissue Tek® O.C.T.TM Compound, 4583 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA

Kaninchen anti-Maus CD95 (Fas), sc-1024 Serva Feinbiochemica GmbH und Co KG, Heidelberg, Deutschland

Zitronensäure Na3-Salz, reinst, 38642 SERVA Electrophoresis GmbH, Hamburg, Deutschland

Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) Na2-Salz 2 H2O p.a., 11280 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland

Bovines Serumalbumin BSA, A3059 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Dihydrat purum p.a., 32750 Isopentan (2-Methylbutan), 59075

Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland

Ssniff R/M-Haltung, V1534-727 Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien

Neolus Einwegkanülen 22-G x1¼“ (0,7 x 30 mm) Luer Neolus Einwegkanülen 23-G x1“ (0,6 x 25 mm) Luer Neolus Einwegkanülen 22-G x1“ (0,55 x 25 mm) Luer Neolus Einwegkanülen 22-G x1½“ (0,45 x 12 mm) Luer

Vector Labortatories Inc., Burlingame, USA

Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100 Vogel GmbH, Giessen, Deutschland

Histo-Comp® 56°C, VO-5-1002 VWR TM International GmbH, Darmstadt, Deutschland (ehemals Merck KGaA)

Ethanol (Alkohol) absolut p.a., 1.00983 Hämatoxylin krist., 1.15938.0100 Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498.1000 di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 x H2O) p.a., 1.06580.1000 Perhydrol® Wasserstoffperoxid 30% p.a., 1.07210

WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Garbsen, Deutschland

Ketamin 10%, Ketamin 100 mg/ml

Anhang 243

9.4 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel

Es sind nur die über eine Laborgrundausstattung (insbesondere eines Histologielabors) hinausgehenden Geräte aufgeführt: Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Deutschland (Vetriebspartner: Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH, Schortens, Deutschland)

Skalpell, BB084-R Klinge, BB522 Skalpell, BB073-R Klinge, BB513 Baby-Metzenbaumschere gebogen, BC603-R Irisschere gerade, BC110 Irisschere gebogen, BC111 Pinzette anatomisch, BD 320 Pinzette anatomisch gebogen, BD035-R

CEAG-Schirp Reinraumtechnik, Dortmund, Deutschland

Sterilbank Codan, Rodby, Dänemark

Spritzen 1 ml Tuberculin Luer, 0.01, REF62.1612 Spritzen 2 ml Luer, 0.1, REF62.2611

Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland

Pipette Reference 10 µl Pipette Reference 100 µl Pipette Reference 1000 µl Pipette Reference 20 µl Pipette Reference 200 µl

hilab.de Laborgeräte & Zubehör, Düsseldorf, Deutschland

Schütttelwasserbad für Hin/Herbewegung GFL-1083 Holger Veith Handelsvertretungen, Westerau, Deutschland

Philipps UV-Entkeimungslampe Kleinfeld Labortechnik, Gehrden, Deutschland

Clean Air Sicherheitswerkbank Knittel W. Glasbearbeitungs GmbH, Braunschweig, Deutschland

Deckgläser (24 x 50 mm) Medite Medizintechnik, Burgdorf, Deutschland

Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000 Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Deutschland

Laborwaage PC180

244 Anhang

Präzisionswaage LabStyle 204 Präzisionswaage PB3000

Menzel Gläser, Glasbearbeitungswerke GmbH & Co KG, Braunschweig, Deutschland

Superfrost Plus®-Objektträger, 041300 MICROM, Heidelberg, Germany

HM 500 OM, Mikrotom-Kryostat Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co KG, Gehrden, Deutschland

Magnetrührer IKAMAG® RCT Thermo Electron GmbH, Dreieich, Deutschland

Shandon CoverplatesTM, 72110013 Shandon Sequenza® Slide Racks, 7331017 Pathcentre (Autotechnicon)

Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland

Heraeus Wärmeschrank, ST6200 Heraeus Wärmeschrank, C57BL/60300 Heraeus Wärmeschrank, UT 6

Zeiss, Oberkochen, Deutschland

Zeiss Axioskop Mikroskop

9.5 Lösungen und Puffer

9.5.1 Histologie

10 %ige Ethylendiamin-tetraessigsäure-Natrium-Salz- (EDTA)-Lösung:

250 g EDTA in 750 ml Aqua dest. Auf Magnetrührer auf 50°C erwärmen und

mischen.

Tropfenweise 50 ml 40%ige Natronlauge zugeben.

pH-Wert durch Zugabe weitere Natronlauge auf 7,4 einstellen.

Mit Aqua dest. ad 1000 ml auffüllen.

Anhang 245

9.5.2 Immunhistologie

1 M Natronlauge:

40 g Natriumhydroxid

ad 1000 ml Aqua dest.

0,5%iges H2O2 in Methanol:

3 ml 30%iges H2O2

200 ml Metahnol

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung („phosphate buffered saline“, PBS):

40 g Kochsalz

8,97 g Natriumhydrogenphosphat


mit 1 M Natronlauge auf pH 7,1 einstellen

DAB-Lösung:

100 mg DAB (Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid)

200 ml PBS

200 µl 30%iges H2O2

Citratpuffer, pH 6,0:

2,1 g Zitronensäuremonohydrat


mit 1 M Natronlauge auf pH 6,0 einstellen

9.5.3 TUNEL Methode

Aqua bidest./Diethylpyrocarbonat-behandelt (DEPC):

1 ml Diethylpyrokarbonat DEPC-Reinsubstanz

ad 1000 ml Aqua bidest.

über Nacht rühren bis völlige Lösung

246 Anhang

Proteinase K-Stammlösung:

100 mg Proteinase K

2 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0)

20 µl 0,1 M Calciumchlorid

ad 10 ml DEPC-H2O

Verdaupuffer:

5 ml 1 M Tris-HCl (pH 8,0)

10 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)

0,5 ml Tween 20

ad 100 ml DEPC-H2O (autoklavieren, Lagerung bei 4°C)

Working-Strength-TdT-Solution:

38 µl Reaktion-Puffer

16 µl TdT-Enzyme

Stop-wash-Puffer:

5 ml Stop-Wash-Konzentrat


Anhang 247

9.6 Abkürzungen

AICD aktivierungsinduzierte Apoptose APC „antigen presenting cells“ BBB „blood-brain-barrier“ BIR „baculoviral IAP repeat“ (BIR)-Domäne CAD Caspase-aktivierte DNase CTL zytotoxische CD8+ T-Zellen DD „death domain“ DTH verzögerte Hypersensitivitätsreaktion vom Typ IV EBV Epstein-Barr-Virus EAE experimentelle allergische Enzephalomyelitis FADD Fas assoziiertes Protein mit “death domain” FasL Fas Ligand FLIP „viral-FLICE inhibitory proteins“ HIV Humanes Immundefizienz Virus IAP „inhibitors of apoptosis” IFN-γ Interferon-γ IL Interleukin LFB-KV „luxol-fast-blue“-Kresylechtviolett-Färbung MBP Myelin basisches Potein MHC „major histocompability complex“ MMP Matrix-Metalloproteinasen MOG Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein

248 Anhang

MS Multiple Sklerose NKT Natürliche Killerzellen pi post infectionem PLP Proteolipid Protein RM Rückenmark RNS Ribonukleinsäure TME murine Theiler’s Enzephalomyelitis TMEV Theiler-Enzephalomyelitisvirus TNF-α Tumor Nekrose Faktor-α TRAIL „TNF-related apoptosis inducing ligand” TGF „transforming growth factor“ Treg regulatorische T-Zellen ZNS zentrales Nervensystem

Danksagung 249

10 Danksagung

Herrn Prof. Dr. Andreas Beineke, danke ich für die Überlassung des interessanten

Themas, die freundschaftliche Zusammenarbeit, die kritische Auseinandersetzung

mit mir und dem Thema sowie die ständige Ansprechbarkeit. Nach einem

schwierigen Start, hat er mich nach Kräften unterstützt und stellt zudem ein

vortreffliches Ein-Mann-Publikum, inklusive aller erdenklichen Ablenkungsmanöver,

dar.

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner danke ich für die freundliche Zusammenarbeit

und konstruktive Kritik.

Petra Grüning und Bettina Buck gilt mein besonderer Dank für die immerwährende

freundliche und geduldige Unterstützung meines labortechnischen Talents.

Mein besonderer Dank gilt meiner Büromitbewohnerin und Freundin Annika und

meiner Kollegin und Freundin Ilka für ihre unendliche Geduld und ihr Talent in allen

Höhen und Tiefen für Ruhe zu sorgen.

Meinen Arbeitskollegen Verena, Frauke und Reiner danke ich für ihre stets

aufmerksame Unterstützung.

Danke auch an alle Mitarbeiter und Kollegen des Instituts für Pathologie für eine

immer freundliche, meist ziemlich witzige Arbeitsatmosphäre. Zusammenhalt und

fachspezifischer Humor machen dieses Institut zu einem besonderen Ort.

Meinen Freunden Anja, Anna, Annika, Björn, Diane, Dirk, Doris, Frauke, Hartwig,

Hinrich, Ilka, Jan, Jörg, Kai, Karl, Karsten, Katharina, Kathrin, Kerstin, Leila, Maren,

Maria, Mark, Markus, Patricia, Ralf, Reiner, Renate, Sascha, Simone, Thomas,

Tobias, Verena und Wolfgang möchte ich danken für eine wunderbare Zeit, einfach

um mich zu sein, viele intensive und konstruktive Gespräche.

Und unglaublich viel TiHo-interner und –externer Spaß!!!

250 Danksagung

Zu allerletzt möchte ich meiner Familie danken, denen auch diese Arbeit gewidmet

ist: meiner lieben, kleinen, größeren Schwester Julia-Christiane und meinen lieben

Eltern, Edith und Peter. Ohne Eure unermüdliche, niemals hinterfragte Unterstützung

und der unerschütterliche Glaube an mich, der mich sehr berührt, wäre ich niemals

bis hierher gekommen.

Oma, ich bin jetzt ein Doktor!!!

dissertation s klein final version rechts links anders · 2019. 1. 10. · inaugural –...

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