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Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Tecnologia Departamento de Engenharia Química

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

“Avaliação de dois clones de Escherichia coli recombinante quanto ao crescimento e expressão de antígenos de Leishmania chagasi (kmp11 e P36)”

Roberta Viana Araújo Chaves

Gorete Ribeiro de Macedo Orientadora

Márcia Regina da Silva Pedrini Co-Orientadora

Natal/RN Dezembro/2009

Roberta Viana Araújo Chaves

AVALIAÇÃO DE DOIS CLONES DE ESCHERICHIA COLI RECOMBINANTE QUANTO AO

CRESCIMENTO E EXPRESSÃO DE ANTÍGENOS DE LEISHMANIA CHAGASI (KMP11 E P36)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Mestre, sob a orientação da Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo e Coorientação da Profª Drª Márcia Regina da Silva Pedrini.

Natal/RN Dezembro/2009

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / PPGEQ / Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nicolas Solimo”.

Chaves, Roberta Viana Araújo. Avaliação de dois clones de Escherichia coli recombinante quanto ao crescimento e expressão de antígenos de Leishmania chagasi (kmp11 e P36). – Natal, 2009. 68 f. : il.

Orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo. Co-orientadora: Márcia Regina da Silva Pedrini. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.

1. Proteínas – Dissertação. 2. Escherichia coli recombinante – Dissertação. 3. Leishmania chagasi – Antígenos recombinantes – Dissertação. 4. Clones recombinantes – Dissertação. I. Macedo, Gorete Ribeiro. II. Pedrini, Márcia Regina da Silva. III. Título.

RN/UF/BSEQ CDU 547.96(043.3)

Avaliação de dois clones de Escherichia coli recombinante quanto ao crescimento e expressão de antígenos de Leishmania chagasi (kmp11 e p36)

Roberta Viana Araujo Chaves ii

CHAVES, Roberta Viana Araújo - Avaliação de dois clones de Escherichia coli recombinante quanto ao crescimento e expressão de antígenos de Leishmania chagasi (kmp11 e p36). Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Área de concentração: Engenharia de Processos. Natal/RN, Brasil. Orientadora: Profª. Drª Gorete Ribeiro de Macedo (DEQ – UFRN) Co-orientadora: Profª. Drª Márcia Regina da Silva Pedrini (DEQ – UFRN)

RESUMO: A leishmaniose visceral, causada pela espécie Leishmania chagasi, também conhecida como calazar, apresentou, no período de 1990 a 2005, taxa de incidência no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A região Nordeste, que até o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, está reduzindo sua participação na década atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produção de antígenos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagnóstico. A bactéria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produção de proteínas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influência da indução no crescimento celular e a verificação do tipo de expressão (intra ou extracelular) de antígenos de Leishmania chagasi através de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando três meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condições estabelecidas na literatura para E. coli (37°C à 200 rpm) e os meios suplementados com antibióticos para garantir somente o crescimento de células competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indução a fim de se verificar o comportamento cinético dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indução foi realizada através da adição de IPTG (concentração final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a expressão das proteínas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior nível foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos géis de eletroforese para o meio 2xTY e proteína kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentração de substratos, conseqüentemente, uma concentração celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combinação de meio e clone é mais indicada para produção das proteínas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcançado já que a proteína de interesse foi produzida. Conseqüentemente, este resultado motiva novos estudos para otimização da produção usando diferentes estratégias de cultivo.

Palavras-chave:

Proteínas, Escherichia coli recombinante, Leishmania chagasi – Antígenos recombinantes,

Clones recombinantes.


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ABSTRACT: Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37°C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms’ kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies.

Keywords:

Proteins, Recombinant Escherichia coli, Leishmania chagasi – Recombinant antigens,

Recombinant clones.


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Dedicatória

Dedico este trabalho a Deus, que em sua grande sabedoria sempre

colocou em meu caminho pessoas maravilhosas; sempre soube

me indicar o caminho a seguir; sempre me deu forças quando me

vi sem chão; sempre me deu conforto nas horas mais difíceis;

enfim, sempre esteve ao meu lado. Ele também me ensinou a

amar os meus amigos e todas as pessoas ao meu redor; a

aproveitar a vida, pois ela é única e, às vezes, curta demais; e a

ser amiga sempre, e forte quando necessário.

“Tudo posso naquele que me fortalece” Fp 4.13


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AGRADECIMENTOS

À Profª Gorete pela orientação, apoio e compreensão durante a realização de todo

trabalho e pela oportunidade de compartilhar tão vasto conhecimento..

À Profª Márcia pela orientação participativa, pelas discussões construtivas e pela

amizade sempre.

À Profª Luciana Gonçalves pelos conselhos durante toda graduação, em especial,

quando ative que decidir a respeito da realização do mestrado. Consegui!

A todos do PPGEQ que sempre foram receptivos e incentivadores do trabalho correto,

em especial à amiga Mazinha, com palavras de conforto e amizade sempre.

A todos do LEB por proporcionarem um ambiente de trabalho agradável e por

saberem compartilhar a estrutura física disponível.

A todos do Departamento de Biologia Molecular (UFRN) pelo apoio, auxílio e

compreensão, em especial à Profª Adriana Uchôa por toda ajuda e paciência.

A todos do Laboratório de Engenharia Ambiental e Controle de Qualidade (LEACQ)

por ceder espaço para realização de análises e pela disposição em ajudar, em especial, Anita e

Ana Karla presteza.

A meu pai, Roberto (in memoriam), por ter me ajudado a ser quem sou hoje, por estar

sempre ao meu lado, por toda compreensão, orientação, amizade, cumplicidade e amor de

toda vida. Amo-te!

À minha mãe, Lúcia, pelo exemplo de coragem, força e superação de obstáculos,

sempre determinada e com foco preciso. Amo-te!

Ao meu irmão, Osvaldo, presente de Deus em minha vida. Amo demais.

Ao meu marido, Eduardo, pelo apoio, compreensão, ajuda dada para conclusão dos

experimentos e por estar sempre me cobrando a conclusão desse trabalho. Amo-te!

Aos amigos do LEB, Andréa Almeida, Ana Katerine, Sirtys Lessa, Márcio Bezerra,

Andréa Karlla, Ana Carmen por toda experiência profissional compartilhada, pela amizade

sincera e pelos momentos de confraternização.

Aos amigos de Fortaleza que a ausência não distanciou, em especial a Poliana,

Marília, Myrella, Sheila, Gabrielle, Wiara e Vládia, pelo constante apoio e torcida positiva.

Aos Professores Everaldo Silvino, Daniella Martins e Luciana Gonçalves pela

disposição em discutir o trabalho e por seus questionamentos.

A todos os colegas da UFRN e a todos os amigos conquistados em Natal.


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À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cujas dependências realizei este

trabalho, pela oportunidade e condições oferecidas.

Ao CNPq, pelo suporte financeiro.

Enfim, agradeço a todos que, de uma forma ou de outra, contribuíram para realização

desse trabalho.


Roberta Viana Araujo Chaves viii

SUMÁRIO

RESUMO ............................................................................................................................. ii

ABSTRACT ........................................................................................................................ iv

DEDICATÓRIA................................................................................................................... v

AGRADECIMENTOS........................................................................................................ vi

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... x

LISTA DE TABELAS......................................................................................................... xi

LISTA DE NOMENCLATURAS...................................................................................... xii

1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................... 14

2. ASPECTOS TEÓRICOS ............................................................................................... 17

2.1 DNA recombinante .................................................................................................... 17

2.1.1 Conceito de clonagem gênica............................................................................... 17

2.2 Escherichia coli .......................................................................................................... 17

2.2.1 Metabolismo........................................................................................................ 18

2.3 Proteínas .................................................................................................................... 19

2.3.1 Expressão de proteínas heterólogas em E. coli ..................................................... 20

2.3.2 Estabilidade do plasmídeo ................................................................................... 21

2.3.3 Indução para expressão da proteína recombinante................................................ 22

2.3.4 Purificação .......................................................................................................... 23

2.3.4.1 IMAC (Immobilized Metal-Ion Afinity Chromatography).............................. 24

2.3.4.2 Eletroforese – SDS PAGE............................................................................. 25

2.3.5 Bioprocessos com recombinantes ........................................................................ 25

3. ESTADO DA ARTE ...................................................................................................... 29

4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 33

4.1 Microrganismo ........................................................................................................... 33

4.2 Manutenção dos clones............................................................................................... 33

4.3 Meios de cultivo......................................................................................................... 33

4.3.1 Antibióticos ......................................................................................................... 34

4.4 Condições de cultivo .................................................................................................. 34

4.5 Preparo do pré-inóculo e inóculo ................................................................................ 35

4.6 Procedimentos analíticos ............................................................................................ 35

4.6.1 Determinação da concentração celular (X)........................................................... 35


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4.6.2 Determinação do consumo de substrato (S).......................................................... 36

4.6.2.1 TOC (Total Organic Carbon) ....................................................................... 36

4.6.2.2 Concentração de glicose................................................................................ 37

4.6.3 Rompimento da parede celular............................................................................. 37

4.6.4 Purificação da Proteína ........................................................................................ 37

4.6.4.1 Preparo da resina........................................................................................... 38

4.6.4.2 Etapa de ligação das proteínas à resina.......................................................... 38

4.6.4.3 Etapa de eluição das proteínas de interesse.................................................... 39

4.6.5 Análise das Proteínas........................................................................................... 39

4.6.5.1 Quantitativa – Método de Lowry (Lowry et al., 1951)................................... 39

4.6.5.1.1 Soluções................................................................................................. 39

4.6.5.1.2 Procedimento analítico do método.......................................................... 40

4.6.5.2 Qualitativa – SDS-PAGE (Laemmli, 1970) ................................................... 40

4.6.5.2.1 Visualização das bandas ......................................................................... 41

4.7 Tratamento dos dados experimentais .......................................................................... 41

4.7.1 Cálculo de velocidades específicas ...................................................................... 41

4.7.2 Fatores de conversão............................................................................................ 42

4.7.3 Produtividade em biomassa (PX) .......................................................................... 43

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 45

5.1. Avaliação cinética dos clones em diferentes meios de cultivo sem indução por IPTG 45

5.2. Avaliação das alterações na cinética dos clones quando induzidos por IPTG ............. 51

5.3. Verificação da expressão das proteínas recombinantes através de SDS-PAGE........... 56

6. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 62

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 64

APÊNDICE .................................................................................................................... 71

ANEXO........................................................................................................................... 77


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Lista de Figuras

Figura 2.1. Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac: A) Na ausência do indutor;

B) Na presença do indutor.................................................................................................... 20

Figura 2.2. Esquema simplificado de uma coluna de cromatografia...................................... 24

Figura 2.3. Esquema de uma cuba eletroforética e migração das bandas ............................... 26

Figura 4.1. Fluxograma de rotinas dos procedimentos analíticos. ......................................... 36

Figura 5.1. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS01 (kmp11/2xTY). .. 46

Figura 5.2. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS02 (kmp11/TB). ...... 46

Figura 5.3. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS03 (kmp11/FASS). .. 47

Figura 5.4. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS04 (P36/2xTY). ....... 47

Figura 5.5. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS05 (P36/TB). ........... 48

Figura 5.6. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS06 (P36/FASS). ....... 48

Figura 5.7. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS07 (kmp11/2xTY). .. 52

Figura 5.8. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS08 (kmp11/TB). ...... 52

Figura 5.9. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS09 (kmp11/FASS). .. 53

Figura 5.10. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS10 (P36/2xTY). ..... 53

Figura 5.11. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS11 (P36/TB). ......... 54

Figura 5.12. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS12 (P36/FASS). ..... 54

Figura 5.13. Gel de eletroforese para proteína kmp11 por E. coli recombinante nos meios

2xTY e TB........................................................................................................................... 57

Figura 5.14........................................................................................................................... 58

Figura 5.15. Gel de eletroforese para proteína P36 por E. coli recombinante nos meios 2xTY e

TB. ...................................................................................................................................... 58

Figura 5.16. Gel de eletroforese para proteína P36 por E. coli recombinante no meio

FASS+EL. ........................................................................................................................... 59


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Lista de Tabelas

Tabela 4.1. Composição dos meios de cultivo. ..................................................................... 34

Tabela 5.1. Identificação dos ensaios realizados ................................................................... 45

Tabela 5.2. Parâmetros cinéticos dos ensaios sem indução. .................................................. 49

Tabela 5.3. Parâmetros cinéticos dos ensaios com indução. .................................................. 55

Tabela 5.4. Tabela com pontos em que eletroforese foi realizada.......................................... 57


Roberta Viana Araujo Chaves xii

Lista de Nomenclaturas

DNS 3,5-dinitrosalicílico

IPTG Tiogalactopiranosídeo de isopropila

kDa quilo Dalton

µmáx Velocidade específica de crescimento máxima (h-1)

µP Velocidade específica de formação de produto (h-1)

µS Velocidade específica de consumo de substrato (h-1)

µX Velocidade específica de crescimento (h-1)

Pmáx Concentração máxima de produto (g/L)

PP Produtividade em produto (g/L.h)

PX Produtividade em células (g/L.h)

rpm Rotações por minuto

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

tf Tempo final de fermentação (h)

tfP Instante de concentração máxima de produto (h)

tXmáx Instante de concentração máxima de células (h)

Xmáx Concentração celular máxima (g/L)

YX/S Fator de conversão de substrato em células (g cél/g subs)

Capítulo 1

Introdução Geral

Capítulo 01 – Introdução Geral

Roberta Viana Araújo Chaves 14

1. Introdução Geral

Leishmaniose é um grupo de doenças causadas por um parasita intracelular obrigatório

do gênero Leishmania (Silva et al., 2003). A doença é endêmica em partes da África, Europa

e nas Américas. De acordo com a espécie do parasita, podem produzir manifestações

mucocutâneas, cutâneas difusa e visceral (Dossi, 2006).

Segundo dados do Ministério da Saúde (2006), no período de 1990 a 2005, a taxa de

incidência de leishmaniose visceral para o país variou entre 1 e 3 casos por 100 mil

habitantes. Os valores são mais elevados para as regiões Norte e Nordeste, mas a doença

encontra-se em expansão nas regiões Centro-Oeste e Sudeste. Com relação ao número

absoluto de casos, a região Nordeste contribuiu com quase 90% dos casos registrados até o

ano de 2000. Essa participação tem se reduzido na década atual, chegando a 56% em 2005.

Devido ao alto custo e a toxicidade das drogas utilizadas na cura da leishmaniose, faz-

se necessário buscar uma alternativa para tratamento mais eficaz e menos agressivo ao

organismo (Rath et al., 2003). Por isso, há um interesse especial na produção de antígenos

através de microrganismos recombinantes para produção de kits diagnóstico e vacinas.

Essa produção se tornou possível com o advento da Engenharia Genética. Com ela, o

homem conseguiu intervir diretamente sobre os comandos da vida, podendo programar

geneticamente organismos vivos para produção de determinado metabólito desejado, ou até

mesmo para produção de determinado tipo de substância produzida apenas por outros

organismos. A relevância tecnológica desse processo é devida a uma importante redução nos

custos de produção, quando utilizados microrganismos para expressão de proteínas

heterólogas (Borzani et al., 2001).

Com o desenvolvimento das técnicas de Engenharia Genética, tornou-se possível

expressar qualquer gene em organismos hospedeiros, desde bactérias, fungos filamentosos,

leveduras e insetos, até plantas e mamíferos transgênicos, sendo necessário, para isso, o

desenvolvimento de vetores específicos para tal finalidade (Borzani et al., 2001).

A bactéria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como

hospedeiro para produção de proteínas recombinantes, como por exemplo, antígenos de

Leishmania chagasi. Isso ocorre devido ao fato de E. coli ser bem caracterizada em termos de

genética molecular, fisiologia e sistema de expressão (Choi & Lee, 2004; Makrides, 1996).

A obtenção de uma alta densidade celular em cultivos de E. coli recombinante é

importante para expressão de proteínas heterólogas tanto no meio extracelular quanto no meio

intracelular (Lee & Chang, 1990), o que tem sido conseguida através de cultivos em batelada

alimentada (Yee &Blanch, 1993).

Capítulo 01 – Introdução Geral


Na grande maioria dos processos, o desenvolvimento natural parte de uma escala de

produção menor para uma escala maior. Na escala de bancada, tendo em vista sua maior

flexibilidade e menor custo operacional, os dados básicos sobre o processo devem ser

levantados com o maior nível de detalhes possível. As tarefas básicas a serem realizadas são:

seleção do microrganismo e meio de cultivo, além de determinação das condições de pH,

temperatura e forma de operação do biorreator (Schmidell et al., 2001). Normalmente, ensaios

iniciais são realizados em incubador rotativo em condições de cultivo encontradas na

literatura, para otimização posterior.

Este trabalho teve como foco principal verificação da expressão das proteínas

recombinantes de Leishmania chagasi, kmp11 e P36, em condições básicas de cultivo, em

incubador rotativo. Nesse contexto, avaliou-se a influência da indução na cinética de

crescimento de E. coli recombinante em diferentes composições de meio de cultivo (2xTY,

TB, FASS+EL) e verificar se haverá expressão das proteínas de interesse no espaço

extracelular ou intracelular. Para isso, foram realizados ensaios sem indução e,

posteriormente, nas mesmas condições, ensaios com indução utilizando IPTG

(tiogalactopiranosídeo de isopropila).

No corpo deste trabalho será encontrada, inicialmente, uma fundamentação teórica

sobre assuntos pertinentes ao tema abordado (capítulo 2), seguido de um breve histórico do

estado da arte (capítulo 3). A descrição da metodologia utilizada na realização dos

experimentos, os resultados e discussão e a conclusão do trabalho podem ser lidos nos

capítulos 4, 5 e 6, respectivamente. No capítulo da conclusão são encontradas sugestões para

trabalhos futuros, com foco na otimização e aumento de escala desse bioprocesso.

Capítulo 2

Aspectos Teóricos

Capítulo 02 – Aspectos Teóricos


2. Aspectos Teóricos

2.1. DNA recombinante A partir da década de 70 do século XX, novas técnicas moleculares foram

desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num processo

chamado de clonagem gênica. A tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou

denominar este conjunto de técnicas, pode ser utilizada para estudar mecanismos de

replicação e expressão gênica, para determinação da seqüência de um gene e

conseqüentemente da proteína que ele codifica, ou para desenvolvimento de culturas

microbianas capazes de produzir substâncias úteis tal como a insulina humana, hormônio de

crescimento, soros e vacinas, enzimas industriais e proteínas em geral. Sua aplicação

comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável (Larson et al., 2007).

2.1.1. Conceito de clonagem gênica O fundamento central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem gênica, a

qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem gênica

compreende pelo menos dois estágios importantes: primeiro, o fragmento do DNA de

interesse chamado de inserto é ligado a uma molécula de DNA chamada de plasmídeo para

formar a molécula de DNA recombinante; segundo, a molécula do DNA recombinante é

introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A

célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de

transformante ou célula transformada. A origem do termo clonagem vem da Genética

Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone, pois todas as células são

geneticamente idênticas à bactéria inicial (Larson et al., 2007).

2.2. Escherichia coli

E. coli é uma bactéria Gram-negativa constituída de um DNA imerso no citoplasma e

um plasmídeo circular. O processo da expressão gênica (transcrição e tradução) está ligado

com a síntese de novo de RNA mensageiro (RNAm), ficando imediatamente disponível para a

tradução. Não há modificações pós-traducionais como ocorre em eucariotos. A E. coli pode

ser considerada como a mais simples célula hospedeira (Silva, 2000).

Uma grande variedade de proteínas de interesse comercial tem sido expressa em E.

coli recombinante, por exemplo, xilose isomerase, xilanase, assim como também uma



variedade de imunorreguladores humanos, hormônios e antígenos para produção de vacinas

(Donovan et al., 1996).

2.2.1. Metabolismo

A bactéria E. coli apresenta metabolismo aeróbio facultativo, ou seja, em condições de

aerobiose a fonte de carbono é utilizada no ciclo de Krebs para crescimento celular, no

entanto, em condições de anaerobiose a fonte de carbono é fermentada com produção de

subprodutos, tais como: etanol, acetatos, lactatos, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido

propiônico e ácido isobutírico (Liria, 1995).

Estudos revelam que para se ter um nível de expressão de proteínas recombinantes

elevado deve-se realizar cultivos de E. coli para obter uma alta concentração celular.

Consegue-se isso aumentando a concentração da fonte de carbono no meio (Liria, 1995) até

uma determinada razão que não implique numa inibição do crescimento, Efeito Crabtree,

quando o microrganismo passaria a realizar um processo fermentativo, além do processo

oxidativo (Schmidell et al., 2001).

O subproduto do processo fermentativo produzido em maior quantidade é o ácido

acético, que também exerce um sério efeito inibitório sobre o metabolismo bacteriano, já que

a partir de baixas concentrações desse, 5 a 13 mM, o crescimento é inibido. Os danos

ocorridos à célula devido à presença de ácido acético são causados pela redução do pH interno

celular (Lee & Chang, 1990).

Assim, devem-se realizar fermentações em que a concentração de glicose, quando

contida no meio, seja baixa até um determinado limite, que minimiza a produção de ácido

acético, bem como a possibilidade de ocorrer o Efeito Crabtree.

Para correção do pH do meio de cultivo para E. coli deve-se utilizar NH4OH ou HCl.

O uso de uma base de amônia para correção do pH é interessante, pois pode ser utilizada pela

célula como fonte de nitrogênio, o que justifica a não utilização de outras bases, como NaOH

ou KOH, por exemplo, que além de reduzir a taxa de expressão da proteína recombinante

ainda torna necessária a adição de uma fonte de nitrogênio no meio (Jensen & Carlsen, 1990).

Entretanto, é necessário um cuidado com o uso de NH4OH, pois em concentrações acima de 5

mM o crescimento é limitado (Kole et al., 1985).



O dióxido de carbono em certas concentrações, da ordem de 30% a 40% no gás, é

inibidor do crescimento (Riesenberg et al., 1990) e também induzem à produção de acetatos

(Pan et al., 1987).

A limitação de oxigênio no meio causa um desvio no metabolismo da bactéria, de

aeróbio para anaeróbio. Em condições de anaerobiose a E. coli ainda realiza o ciclo de Krebs,

embora em menor intensidade, para produção de algumas enzimas constitutivas (Gray, 1966).

A concentração crítica de oxigênio dissolvido em condições de aerobiose no crescimento é de

0,0082 mM de O2/L a 37,8°C (Bauer & Shiloach, 1974). A velocidade específica de consumo

de O2 é uma variável importante, pois ajuda no entendimento da cinética de crescimento do

microrganismo já que exprime sua regulação metabólica, sendo importante como dado para

aumento de escala (“scale-up’) e controle “on-line” de processo (Liria, 1995).

2.3. Proteínas

As proteínas são biopolímeros compostos por resíduos de aminoácidos ligados entre si

por ligações peptídicas. Este tipo de ligação se estabelece entre os resíduos de aminoácidos

com conseqüente perda de uma molécula de água. Cada alfa-aminoácido é constituído por um

grupo amino, um grupo carboxílico, um átomo de hidrogênio e uma cadeia lateral (diferente

para cada aminoácido), ligados a um carbono (carbono alfa). São vinte os aminoácidos que

combinados em número e seqüência diferentes dão origem a todas as proteínas existentes,

conferindo-lhes a estrutura e capacidade funcional (Monteiro et al., 2004).

A extremidade amino (grupo α-amino) é considerada como sendo o início da cadeia e

a extremidade carboxílica (grupo α-carboxílico) o fim. Uma cadeia peptídica é constituída por

uma parte que se repete regularmente (cadeia principal) e uma parte variável (cadeias

laterais), possuindo também polaridade (Monteiro et al., 2004).

O corpo humano produz milhares de proteínas diferentes, possuindo diferentes

funções no organismo, como por exemplo, estruturais (colágeno), catalíticas (lípases,

proteases, pepsina), contrácteis (actina e miosina), transportadoras (hemoglobina), de defesa

imunológica (linfócitos T) (Lopes, 1997), estando a estrutura tridimensional de cada proteína

diretamente relacionada a sua função biológica (Kinch & Grishin, 2002).



2.3.1. Expressão de proteínas heterólogas em E. coli

A descoberta de promotores e repressores específicos do genoma de E. coli, de uma

variedade de vírus de E. coli e de células eucarióticas permitiu a manipulação da expressão de

proteínas e a clonagem de genes sob o controle de um dado promotor, cuja expressão pode ser

indutível ou contínua. O primeiro, e mais comumente usado, sistema de expressão de

proteínas heterólogas em E. coli é baseado no operon lac. (Figura 2.1). Neste sistema, o DNA

de interesse é clonado em fago (no caso de biblioteca de cDNA de expressão) ou plasmídeo

contendo o lacI (repressor), lacP (promotor) e lacZ (gene estrutural transcrito para RNAm da

β-galactosidase). A indução da transcrição é obtida pela adição de um análogo de lactose

sintético e não degradável (tiogalactopiranosídeo de isopropila, IPTG), o qual se associa ao

repressor, inibindo-o e deixando o promotor livre para a interação com a RNA polimerase e

conseqüente transcrição do gene (Nascimento et al., 2003).

Figura 2.1. Esquema ilustrando o funcionamento do operon lac: A) Na ausência do indutor; B) Na presença do indutor (Fonte: Nascimento et al., 2003).

O sistema mais comumente utilizado para expressão de proteínas heterólogas utiliza E.

coli como célula hospedeira. Este sistema é amplamente difundido devido à facilidade e baixo

custo de se cultivar E. coli, bem como pela reprodutibilidade e abundância de proteína que

produz. Além disso, modificações nos vetores e linhagens de E. coli são freqüentemente feitas



no sentido de aumentar a eficiência e versatilidade do sistema original. Com isto, e com o

advento de novos sistemas de expressão em células de eucariotos (leveduras, insetos,

mamíferos), a expressão de proteínas clonadas tornou-se uma abordagem poderosíssima que

vem revolucionando os estudos de estrutura, função, purificação e identificação de novas

proteínas. Nestes outros sistemas, o recombinante a ser introduzido no hospedeiro alvo pode

ser facilmente construído e amplificado em E. coli (Nascimento et al., 2003).

O uso de E. coli para a obtenção de proteína em quantidade suficiente para o estudo da

estrutura e função da mesma ou para aplicações clínicas ou industriais é hoje disseminado,

constituindo-se em um marco na história do conhecimento da estrutura de proteínas

(Nascimento et al., 2003).

As proteínas inseridas no DNA da E. coli para expressão podem ser facilmente

purificadas se possuírem cauda de histidina em fusão. Isso porque existe uma grande

afinidade entre a cauda e alguns íons metálicos, como Ni2+, Cu2+ e Co2+, permitindo que o

produto em fusão seja rapidamente separado de outras proteínas existentes no meio, com

pureza de até 95% (Hengen, 1995).

2.3.2. Estabilidade do plasmídeo

A avaliação da estabilidade do plasmídeo deve ser realizada, visto que, com a indução,

só haverá expressão da proteína nos microrganismos portadores do plasmídeo recombinante.

Esse é um dado importante quando se pretende realizar uma produção em grande escala, já

que essa estabilidade é desejável e é fortemente influenciada pelas condições de cultivo e pela

genética e fisiologia dos hospedeiros (Siegel & Ryu, 1985).

Há uma forma indireta de se quantificar células com e sem plasmídeo, que é baseada

no seu crescimento em meio solidificado com e sem seletores de crescimento, geralmente

antibióticos. Considera-se que as células que crescem em meio com seletores possuem

plasmídeo, e as células que crescem em meio sem seletores são o total. Relacionando esses

valores, determina-se a porcentagem de células capazes de expressar a proteína (Yee &

Blanch, 1993).

Se o plasmídeo é considerado estável, o seu estoque pode ser feito em freezer, senão

haverá a necessidade de realizar um teste de indução antes dos testes desejados (Studier,

1990).



2.3.3. Indução para expressão da proteína recombinante

O operon lactose responsável pelo controle da expressão das enzimas β-galactosidase,

permease e acetilase já está completamente elucidado e tem sido amplamente utilizado em

sistemas de expressão de proteínas heterólogas em sistemas plasmidiais bacterianos e até

mesmo de mamíferos. Todos esses plasmídeos, principalmente bacterianos, utilizam a

seqüência do lac-operon (uma região do DNA denominada lac-operon, que regula a produção

de uma proteína) para a expressão de uma proteína recombinante de interesse. A expressão

dessa proteína é normalmente induzida pela adição de uma molécula glucídica não

metabolizada denominada tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG). O IPTG se liga

especificamente à proteína repressora levando à diminuição de sua afinidade pela região

promotora/operadora do operon lactose (Nascimento et al., 2003).

O IPTG representa hoje um dos indutores mais utilizados nos mais diversos sistemas

de alta expressão. Apesar de sua eficácia como indutor nos vários sistemas de expressão, uma

das grandes desvantagens do uso do IPTG consiste no fato de ser tóxico à maioria das células.

Assim, devido à sua toxidade o IPTG limita a produção, em maior escala, de uma proteína de

interesse. A descoberta de novos indutores, menos tóxicos e com a mesma eficácia de indução

do IPTG, poderia, portanto, ser de grande utilidade quanto à produção quantitativa de uma

determinada proteína (Humberto & Silva, 2006).

Um indutor alternativo ao IPTG é a lactose, porém um pequeno número de trabalhos

pode ser encontrado na literatura descrevendo esse último indutor para expressão de proteína

heterólogas (Donovan et al.,1996; Neubauer & Hofman, 1994; Foor et al., 1993). Em todos

esses trabalhos foram usadas baixas concentrações celulares (até 7 g/L massa seca) e níveis

equivalentes de proteína heterólogas foram alcançados sob indução de lactose e IPTG

(Gombert & Kilikian, 1998).

Apesar do menor custo e menor toxicidade, a lactose apresenta uma maior dificuldade

quando se pretende estabelecer condições ideais de indução. Isso ocorre pelo fato dela servir

simultaneamente como indutor e como fonte de carbono e energia (Gombert & Kilikian,

1998).



2.3.4. Purificação

O processo de purificação de proteínas e peptídeos de origem nativa ou recombinante,

na sua forma biologicamente ativa constitui uma etapa fundamental na obtenção de amostras

adequadas para o estudo estrutural.

Em geral, proteínas isoladas são moléculas lábeis. Além de serem facilmente

degradadas e alteradas por microrganismos, as proteínas são sensíveis à alteração de

temperatura, pH, sais, metais, etc. (Huo et al., 2006). Por isso, é muito importante estar atento

aos detalhes dos procedimentos de purificação em relação à composição dos tampões, à

temperatura, à seqüência e duração dos passos.

As propriedades físico-químicas das proteínas são muito variadas, portanto não há

uma maneira simples de descrever um protocolo geral de purificação. Desta forma, deve-se

familiarizar com os procedimentos e estratégias de purificação, usando o conhecimento e

criatividade na aplicação dos métodos para a solução de um eventual problema.

Uma das maneiras mais poderosas e usadas para purificação (ou separação de

misturas) é a cromatografia, porque é, freqüentemente, econômica e pode fornecer informação

tanto quantitativa quanto qualitativa (Atkins & Jones, 2001). A configuração física geral é a

de uma fase estacionária (matriz) empacotada em uma coluna, através da qual a fase móvel é

bombeada. Os solutos da fase móvel (proteínas, anticorpos, peptídeos) são adsorvidos ou

retidos no meio poroso, para posterior remoção por ação de um eluente, resultando na

separação das diferentes moléculas (Schmidell et al., 2001). Uma ilustração pode ser

verificada na Figura 2.2.

Dependendo da escolha da coluna, as proteínas podem ser separadas de acordo com a

carga (cromatografia de troca iônica), hidrofobicidade (HIC – cromatografia de interação

hidrofóbica), tamanho (GF – filtração em gel) ou capacidade de se ligar a grupos químicos

particulares (cromatografia de afinidade – Ni-Sepharose 6 Fast Flow) (Larson et al., 2007).



Figura 2.2. Esquema simplificado de uma coluna de cromatografia (Fonte: modificado de Larson et al., 2007).

2.3.4.1. IMAC (Immobilized Metal-Ion Afinity Chromatography)

Os princípios fundamentais da afinidade de biomoléculas por íons metálicos são

conhecidos desde o início do século passado. IMAC explora a interação entre espécies

doadoras de elétrons presentes na superfície de biomoléculas em solução e íons metálicos

quelatados imobilizados em um suporte sólido (Bresolin, Miranda & Bueno, 2009).

Entre muitos sistemas de métodos separação-fusão, a cromatografia de afinidade

metal-íon imobilizado histidina (His tag-IMAC) tem sido usada rotineiramente para

purificação de uma grande variedade de proteínas recombinantes, de glutaril acilase à

insulina, em laboratório e escala industrial, usando leito fixo e expandido (Aquino et al.,

2006).

As proteínas que ficam ligadas, por afinidade, ao metal imobilizado na matriz, são

eluídas através da passagem de solução com competidor pelo sítio ativo, podendo ser

utilizado, por exemplo, imidazol, solução salina ou EDTA. Estes atuaram deslocando a

proteína do sítio ativo por terem mais afinidade pelo metal (Henge, 1995).



2.3.4.2. Eletroforese – SDS PAGE

A eletroforese é uma técnica de separação de moléculas que consiste na migração de

moléculas com carga, numa solução, em função da aplicação de um campo elétrico (Figura

2.3). A velocidade da migração depende da força do campo aplicado, da carga, do tamanho e

da forma das moléculas e também da força iônica, viscosidade e temperatura do meio, onde

estas se movem. De um modo geral, no transporte eletroforético, à força do campo opõe-se a

resistência do meio, produzindo, quando se igualam, uma velocidade constante das partículas

(Larson et al., 2007).

O objetivo do SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) é desnaturar as proteínas, que têm

forma nativa globular, convertendo-as numa estrutura linear e conferindo-lhes densidade de

carga uniforme, para serem separadas por eletroforese somente em função de seus pesos

moleculares. O SDS tem uma alta carga negativa, pH neutro e uma cauda hidrofóbica que

interage com as cadeias das proteínas (polipeptídeos). O número de moléculas de SDS que se

ligam às proteínas é proporcional ao número de aminoácidos que constituem as mesmas, pois

se liga na razão de uma molécula por ligação peptídica (Larson et al., 2007).

Quando as proteínas desnaturadas são submetidas a um campo elétrico, todas irão

mover-se para o pólo positivo, na mesma proporção, sem possibilidade de avaliar a distância

migrada. Então, é necessário colocá-las num meio que permita que proteínas de variados

tamanhos se desloquem com velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel de

poliacrilamida (polímero de monômeros de acrilamida). Assim as moléculas de proteína de

menores dimensões migram a uma velocidade maior que a de grandes pesos moleculares

(Larson et al, 2007).

2.3.5. Bioprocessos com recombinantes

Processos que utilizam microrganismos como agentes transformadores e/ou produtores

para obtenção de produtos de interesse biotecnológico são denominados bioprocessos.

Podendo o microrganismo ser selvagem (sem alteração genética) ou recombinante (com

alteração genética). Os microrganismos recombinantes têm sua aplicação dirigida para área de

obtenção de produtos industriais de alto valor agregado.



Figura 2.3. Esquema de uma cuba eletroforética e migração das bandas (Fonte: modificado de Larson et al., 2007).

A biotecnologia de moléculas contendo a informação genética trabalha com

construções moleculares necessárias para expressão de proteínas em bioprocessos industriais

usando organismos vivos, ou a produção de vetores visando à transferência de genes

requerida em terapia gênica (Borojevic, acesso em 2009).

Inicialmente, devem ser realizados ensaios em incubador rotativo para estudo do

comportamento do microrganismo, bem como para estabelecimento das condições de cultivo

iniciais, pré-estabelecendo alguns parâmetros, tais como: temperatura, pH inicial, velocidade

de agitação, sendo também estudada a cinética de crescimento, para posterior determinação da

estratégia de indução (Gombert & Kilikian, 1998). A indução, nesse caso, deverá ser realizada

na fase exponencial de crescimento, sendo, esse ponto, observado pelo estudo do crescimento

celular. Os indutores mais empregados são IPTG (indutor “gratuito”) e lactose (pode ser

consumido pela célula como fonte de carbono) (Gombert & Kilikian, 1998).

Outro ponto importante que deve ser estudado é a influência da composição do meio

de cultivo na expressão da proteína induzida, pois isso pode viabilizar ou não a produção em

larga escala. Com isso, ensaios em incubador rotativo são de extrema importância quando se

deseja avaliar preliminarmente, antes de ensaios com maior complexidade, quais as



interferências causadas no nível de expressão quando se utiliza meios de cultivo com fontes

de nutrientes diversas e em diferentes concentrações. Lembrando ainda que não se pode

aumentar indefinidamente a concentração de substrato já que isso poderia levar a uma

inibição do crescimento microbiano e conseqüente redução na produção de proteína

(Schmidell et al., 2001).

Ensaios em biorreator, ainda em escala de laboratório, são realizados com a finalidade

de estudar a influência de algumas variáveis de processo na expressão da proteína

recombinante, como por exemplo, temperatura, pH do meio, razão de aeração, oxigênio

dissolvido, bem como para determinar qual a melhor estratégia de cultivo e indução. Os

cultivos podem ser realizados em batelada ou batelada alimentada, por exemplo, a fim de

verificar em qual terá a máxima expressão (produção) do produto de interesse.

Alguns trabalhos mostram que os ensaios em batelada alimentada são os mais

favoráveis à expressão (produção) de proteínas recombinantes. Observa-se também a

existência de uma relação entre a quantidade de indutor e a produção de proteínas

recombinantes. Devem ser consideradas duas variáveis: a quantidade de indutor utilizada e

como esse indutor será adicionado ao cultivo em biorreator, podendo ser em pulsos no

decorrer da fermentação.

Capítulo 3

Estado da Arte

Capítulo 03 – Estado da Arte


3. Estado da Arte

Jensen & Carlsen (1990) realizaram estudos comparativos em batelada e batelada

alimentada em biorreator com capacidade útil de 2,5 L (MBR) e 7,0 L (CHEMAP), a fim de

verificar a expressão do hormônio de crescimento humano (hGH) em E. coli recombinante.

Sendo observado uma superioridade do processo em batelada alimentada em relação ao

processo em batelada na produção de proteínas heterólogas em E. coli.

Liria (1995) realizou processos em batelada e batelada alimentada em biorreator de

capacidade útil de 4 L (New Brunswick), com Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS para

produção da proteína recombinante Troponina C (TnC), observando uma ligeira superioridade

do processo descontínuo alimentado em relação ao descontínuo, quanto a concentração

celular, bem como para concentrações finais de TnC. O autor verificou ainda uma estabilidade

do plasmídeo pET em 97% depois de 17 horas de cultivo em biorreator, bem como a não

interferência do crescimento celular devido à presença do vetor pET.

Donovan et al. (1996) realizaram uma revisão sobre fatores que influenciam a

expressão de proteínas heterólogas em E. coli sob controle de promotores tipo lac e tac, em

cultivos descontínuos e descontínuos alimentados em biorreator, discutindo condições para

maximizar a produção dessas proteínas. Especificamente, foram discutidos a influência da

concentração de IPTG, temperatura de cultivo e composição do meio. Concluíram que a

concentração do indutor influencia na localização do acúmulo de proteínas (extra ou

intracelular); observando a eficácia semelhante da lactose e do IPTG para indução da

produção da proteína recombinante, contudo, a lactose deve ser fornecida em condições

apropriadas, por servir de substrato para o microrganismo. Sistemas que excretam a proteína

no espaço periplasmático parecem beneficiar-se de temperaturas sub-ótimas de crescimento

(20-30°C) durante a fase de indução, podendo haver uma melhora na expressão da proteína

solúvel com uma indução em temperaturas mais baixas, dependendo do produto produzido,

bem como uma redução na degradação proteolítica.

Gombert & Kilikian (1998) estudaram a expressão de Troponina C (proteína

recombinante) em cultivos de E. coli em biorreator usando lactose como indutor. Foram

realizados experimentos para estabelecimento da melhor estratégia de indução, ou seja, como

a indução seria realizada (por exemplo, em pulsos) e em que momento ela deveria ser

iniciada. Verificaram, em seus experimentos, que a inibição do crescimento começava quando

a concentração de ácido acético no meio atingia valores em torno de 0,9 g/L.



Ramírez (1998) citou a descrição recente da proteína KMP-11 (peso molecular 14

kDa) em Leishmania, como maior componente da membrana da forma promastigota do

parasita; sendo a proteína clonada em vetor de alta expressão e a proteína recombinante

induzida e purificada de culturas de E. coli em cultivos em biorreator. Análise Imuno-blot

mostrou que 80%, 77% e 100% do soro dos pacientes com leishmaniose cutânea,

mucocutânea e visceral, respectivamente, reconheceram a proteína recombinante kmp11. Em

ensaio semelhante, 86% dos indivíduos assintomáticos infectados por Leishmania mostraram

anticorpos IgG contra rkmp11, com isso concluem ser possível a utilização da proteína kmp11

como marcador sorológico para infecção e doença causada por Leishmania na América.

Lima (2004) realizou estudo da produção de insulina humana em cultivos de

Escherichia coli recombinante em biorreatores para obtenção de altas densidades celulares.

Foram testadas algumas estratégias de fermentação, entre as quais: batelada alimentada com

cortes, batelada alimentada cíclica em dois estágios e fermentações com reciclo e

microfiltração. A cepa utilizada no estudo foi E. coli N-4830-1 transformada com plasmídeo

pHis. As fermentações foram realizadas em reatores de bancada de capacidade útil de 4,0 L e

12,0 L (NBS e Inceltech). Os estudos cinéticos das diferentes estratégias mostraram

incrementos em biomassa e proteínas de fusão, sendo o melhor resultado obtido para

fermentações com reciclo total de células, microfiltração do meio e alimentação exponencial

dos nutrientes. A concentração final em peso seco de células foi 173,8 g/L, com porcentagem

de expressão da proteína de fusão de 17,8%. A técnica mostrou-se adequada para remoção de

inibidores do meio de cultura, permitindo maior produtividade e, conseqüentemente, maior

crescimento celular, sendo até 3,5 vezes maior que os cultivos em batelada-alimentada

tradicional.

Silva (2005) realizou estudos utilizando a proteína P36/LACK (peso molecular 36

kDa) na indução de resposta imune e na proteção contra infecção por Leishmania chagasi em

camundongos BALB/c. Foi verificado nesse estudo que a vacina de DNA p36(LACK)

administrada pela via intramuscular se mostrou imunogênica e capaz de induzir resposta

imune do tipo 1 prolongada, mas não foi capaz de induzir proteção contra desafio sistêmico

por L. chagasi.

Bellão (2006), com a finalidade de produzir canacistatina – CC (inibidor competitivo e

reversível de proteases) em maior escala, realizou estudo da expressão de CC em E. coli BL21

(DE3), avaliando diferentes fontes de carbono, tipo de indutor e momento da indução em

incubador rotativo, bem como a comprovação das novas condições de expressão em



biorreator airlift com capacidade útil de 6 L. Nos ensaios em incubador rotativo foram obtidos

crescimento celulares semelhantes quando utilizado, como fontes de carbono, glicerol,

glicose, frutose e frutose + glicose, e baixo crescimento celular quando utilizada galactose.

Foi observada uma alta expressão quando utilizados galactose como fonte de carbono e IPTG

0,4mM como indutor. Com a utilização de lactose como indutor nas concentrações de 4 e

40mM, foi observada expressão de CC apenas nos cultivos com galactose como fonte de

carbono. Quanto aos cultivos em biorreator airlift, a expressão de CC foi superior à do cultivo

realizada em incubador rotativo, utilizando glicose como fonte de carbono, em torno de 80%

da produção obtida no cultivo padrão após uma hora de indução, alcançando 90% na segunda

hora.

Choi et al. (2006) realizaram uma revisão das estratégias de cultivo para produção de

proteínas recombinantes em cultivos de E. coli com alta densidade de células, em batelada e

batelada alimentada em biorreator. Para produção de proteínas recombinantes por E. coli, é

necessário um conhecimento amplo sobre seu metabolismo celular global e fisiologia, tendo

sido esta, bastante utilizada para produção de muitos produtos de interesse, tais como

hormônios e algumas proteínas farmacêuticas. A E. coli deve continuar sendo utilizada na

produção de proteínas recombinantes, necessitando de novos estudos para o estabelecimento

de seu sistema de expressão.

Capítulo 4

Material e Métodos

Capítulo 04 – Material e Métodos


4. Material e Métodos

4.1. Microrganismo

Os microrganismos utilizados nesse trabalho foram clones de Escherichia coli que

contêm o plasmídeo recombinante pQE30 e as proteínas de leishmania, kmp-11 e P36,

apresentando uma cauda (“tag”) de seis resíduos de histidina em fusão, o que permite a

purificação das proteínas em colunas quelantes de Ni2+. Esses clones foram gentilmente

cedidos pela Profª. Dra. Selma Maria Bezerra Jerônimo, do Laboratório de Imunogenética da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte e pela Profª. Dra. Mary E. Wilson da

Universidade de Iowa – EUA.

De acordo com dados da literatura, o peso molecular da proteína kmp11 é 14 kDa

(Ramírez et al., 1998), e da proteína P36 é 36 kDa (Silva et al., 2005).

4.2. Manutenção dos clones

Realizou-se cultivo dos clones em 50 mL de meio LB por cerca de doze horas.

Decorrido esse tempo, esse volume foi transferido para tubos estéreis e centrifugado por 10

minutos a 2700xg. O sobrenadante foi desprezado e as células ressuspensas em 5 mL de

glicerol 10%, de 1:1 (glicerol 10%:células suspensas), e homogeneizadas em agitador de

tubos tipo vortex. Em seguida, esse volume foi transferido para microtubos (eppendorfs) em

frações de 200 µL. Esses microtubos foram armazenados à - 20°C e - 80°C. Para cada

fermentação realizada, foi ativado (pré-inóculo) o volume de um microtubo para preparo do

inóculo. Todos os procedimentos foram realizados em câmara de fluxo laminar

(assepticamente).

4.3. Meios de cultivo

Os meios de cultivo foram preparados usando-se água destilada, esterilizados em

autoclave por 20 minutos a 120°C e depois suplementados com antibióticos (Item 4.3.1). A

composição desses meios pode ser verificada na Tabela 4.1.



Tabela 4.1. Composição dos meios de cultivo.

Composição Meios de cultivo

LB 2xTY TB FASS+EL

Triptona (g/L) 10 16 12 -

Extrato de Levedura (g/L) 5 10 24 1

NaCl (g/L) 10 5 - -

KH2PO4 (g/L) - - 2,31 13

K2HPO4 (g/L) - - 12,54 10

Glicerol (mL/L) - - 4 -

Glicose (g/L) - - - 10

(NH4)2HPO4 (g/L) - - - 3

NaH2PO4.H2O (g/L) - - - 4,6

MgSO4.7H2O (g/L) - - - 0,46

Sol. Micronutrientes* (mL/L) - - - 3

pH 7 7 7 7

* FeCl3.6H2O, 27g; ZnCl2, 1,3g; CoCl2.6H2O, 2g; Na2MoO4.2H2O, 2g; CaCl2.2H2O, 1g; CuCl2, 1g; H3BO3, 0,5g; HCl conc. 100mL; água q.s.p. 1 L (Bauer & Shiloach, 1974).

4.3.1. Antibióticos

Os antibióticos foram adquiridos em farmácia. As soluções foram preparadas com

água deionizada e esterilizadas através de filtração em membrana 0,22 µm.

• Ampicilina – estoque 100 mg/mL (concentração de trabalho: 100 µg/mL).

• Kanamicina – estoque 25 mg/mL (concentração de trabalho: 25 µg/mL).

4.4. Condições de cultivo

Todos os ensaios realizados em incubador rotativo foram conduzidos à temperatura de

37°C, sob agitação de 200 rpm. Os meios preparados, depois de autoclavados, foram

suplementados com os antibióticos ampicilina e kanamicina. Na ativação dos clones para

obtenção do pré-inóculo foram realizadas fermentações de 8 a 12 horas de duração, assim

como também para obtenção do inóculo. Na realização de fermentação para acompanhamento

da cinética, os ensaios foram realizados por 24 horas ou até a fase estacionária do crescimento

microbiano, o que podia ser verificado através de leitura de absorbância a 590 nm do caldo



fermentado. Todos os ensaios foram realizados em duplicata, no mesmo incubador rotativo,

concomitantemente.

Foram realizados dois tipos de ensaios: sem indução e com indução por IPTG. Nos

ensaios com indução, o IPTG foi adicionado ao meio no início da fase de crescimento

exponencial, t = 1h, quando a densidade ótica (DO590 nm) atingia valor entre 0,4 e 0,5. O

volume do indutor adicionado foi tal que sua concentração final no meio era de 1,0 mM.

4.5. Preparo do pré-inóculo e inóculo

Para a ativação do microrganismo foi transferido o conteúdo de um microtubo (Item

4.2) para 50 mL de meio (um dos três meios testados). Esse cultivo inicial foi realizado em

incubador rotativo por um período de 8 a 12 horas. Em seguida, foi realizada fermentação,

com mesma duração, em 45 mL do meio utilizando como inóculo 5 mL do meio com

microrganismo ativado. Ao final desse processo, foram inoculados 5 mL desse pré-inóculo

em 45 mL do meio para acompanhamento do crescimento, consumo de substrato e expressão

da proteína, quando realizada indução. Os meios eram suplementados com os antibióticos

(Item 4.3.1) imediatamente antes de se inocular a cultura.

4.6. Procedimentos analíticos

As rotinas para tratamento analítico das amostras são apresentadas através de

fluxograma mostrado na Figura 4.1. As análises foram realizadas em duplicata, exceto as

etapas de purificação de proteínas e eletroforese.

4.6.1. Determinação da concentração celular (X)

A concentração celular foi determinada por massa seca. Um determinado volume de

caldo fermentado foi centrifugado a 16.100xg por 20 minutos (duas alíquotas de 2,0 mL, em

microtubos), seguindo-se secagem em estufa a 85°C (até peso constante) e posterior pesagem

(massa seca). Associado à determinação da massa seca, medidas de turbidimetria foram

realizadas através de determinação da absorbância a 590 nm em espectrômetro



(ThermoSpectronic – Genesys 10uv), para verificação, concomitantemente ao experimento,

das fases de crescimento microbiano.

Figura 4.1. Fluxograma de rotinas dos procedimentos analíticos.

4.6.2. Determinação do consumo de substrato (S)

4.6.2.1. TOC (Total Organic Carbon)

A determinação da taxa de consumo de substrato foi realizada pelo método de TOC

(Total Organic Carbon), que expressa a quantidade de carbono orgânico no meio. Essa

análise foi realizada, quando no meio não tinha glicose (ou seja, 2xTY e TB).



A análise foi realizada no equipamento “TOC 5000A – Total organic carbon analyzer”

(Shimadzu) do Laboratório de Engenharia Ambiental/UFRN, cedido pela Profa. Dra. Josette

Lourdes Melo. O equipamento fornece a concentração de carbono inorgânico e total, obtendo-

se, por diferença, a concentração de carbono orgânico total.

4.6.2.2. Concentração de glicose

Para determinação da concentração de glicose foi utilizado o método colorimétrico do

3,5-dinitrosalicílico (DNS), descrito por Miller (1959), através do qual se quantifica os

açúcares redutores do meio (nesse caso, glicose) pela medida da absorbância obtida. Uma

curva padrão (Apêndice 1) foi previamente elaborada a fim de se obter os valores de

concentração de glicose a partir das leituras de absorbância das amostras analisadas. Essa

análise foi executada quando o meio de cultivo utilizado foi o FASS+EL, cuja principal fonte

de carbono é glicose.

4.6.3. Rompimento da parede celular

Para rompimento da parede das células foi utilizado tampão a base de uréia, cuja

composição é: NaH2PO4, 50 mM; Uréia, 8 M; pH 8,0 (QIAGEN, 2003). O procedimento

consiste em:

1. Deixar as células em banho de gelo por 15 minutos;

2. Ressuspendê-las em 5,0 mL de tampão de uréia;

3. Submetê-las a agitação em vortex por 15 a 60 minutos;

4. Centrifugar a 16100xg por 25 minutos;

5. Analisar proteínas intracelulares no sobrenadante.

4.6.4. Purificação da Proteína

A purificação das proteínas recombinantes kmp11 e P36 foi realizada como método

analítico para verificação do nível de expressão (produção), por meio de uma ligação

altamente específica com a resina Ni Sepharose, pois há em sua estrutura seis resíduos de



histidina em fusão com afinidade pelo íon Ni2+ da coluna. O procedimento de purificação foi

realizado seguindo o protocolo indicado no manual da resina e seus tampões (GE Healthcare,

2005), com auxílio de uma coluna cromatográfica montada em uma seringa de 5 mL. Para

purificação do material intracelular era adicionada, aos tampões de ligação e eluição, uréia 8

M, seguindo recomendação do manual, pois o rompimento da parede celular era realizado

com tampão a base de uréia, à concentração 8 M. A composição de todos os tampões, como

recomendado no manual da resina, pode ser verificada no Anexo 2.

4.6.4.1. Preparo da resina

A resina, já na coluna, era mantida em solução de etanol 20% para conservação. Para

utilização em procedimentos de purificação, a coluna era inicialmente lavada com cinco vezes

o volume da coluna de água deionizada, seguido de passagem de dez vezes o volume da

coluna de tampão de ligação para equilibrá-la. A vazão utilizada durante essa etapa de preparo

da resina foi 1,0 mL/min, o que era conseguido através de bomba peristáltica ajustada para

esta (essa mesma vazão para todas as etapas de purificação). Entre a purificação das amostras,

a coluna era equilibrada com dez vezes o volume da coluna, de tampão de ligação (preparo

entre amostras). Cada proteína (kmp11 e P36) tinha sua coluna exclusiva, o que minimizava

os trabalhos e o uso de reagentes, otimizando o tempo. Depois dessa etapa, procedia-se a

aplicação de 1,0 mL de amostra na coluna (mesmo volume de resina na coluna).

4.6.4.2. Etapa de ligação das proteínas à resina

Depois da aplicação da amostra à coluna, a resina foi lavada com tampão de ligação,

sendo acompanhada absorbância a 280 nm. Essa etapa de lavagem foi necessária para garantir

a retirada de todas as proteínas presentes na amostra que não se ligaram à resina (não tinham

afinidade pelos íons Ni2+). A verificação de que não havia mais, na coluna, proteínas, que não

a retida, era feita através de acompanhamento da absorbância a 280 nm do produto coletado

na base da coluna. A etapa de ligação era interrompida quando a absorbância lida atingia um

valor constante (ou zero), indicando não haver mais proteínas sendo “lavadas”. Testes

preliminares com diversos pontos foram realizados com a finalidade de se determinar qual o

volume médio de tampão de ligação necessário para se chegar a uma leitura de absorbância

“zero”, chegando-se a 15 mL de tampão para esse fim. A partir desses testes, para todos os



pontos analisados, o volume de tampão de ligação utilizado foi o mesmo, garantindo uma

mesma taxa de diluição em todas as análises.

4.6.4.3. Etapa de eluição das proteínas de interesse

Seguindo a etapa de ligação, era realizada a eluição da proteína de interesse através de

passagem de tampão de eluição, o qual continha uma concentração alta de imidazol (300

mM), que compete pelo sítio ativo da resina, deslocando a proteína retida, liberando-a. Nesse

caso, o volume recomendado de tampão de eluição a ser corrido pela resina era de dez vezes o

volume da coluna (10 mL). Esse foi o volume utilizado em todos os pontos, garantindo, da

mesma forma que na etapa anterior, uma mesma taxa de diluição da amostra analisada.

4.6.5. Análise das Proteínas

A constatação de onde ocorre a expressão da proteína recombinante, se intra- ou

extracelular, torna necessária a análise quantitativa e qualitativa dessas. Para determinação da

concentração protéica foi utilizado o Método de Lowry (Lowry et al., 1951) e para

visualização da proteína expressa foram realizados procedimentos de eletroforese SDS-PAGE

em gel de poliacrilamida (Laemmli, 1970).

4.6.5.1. Quantitativa – Método de Lowry (Lowry et al., 1951)

O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido

fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre redução quando reage com proteínas, na

presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima em 750 nm

(Zaia et al., 1998).

4.6.5.1.1. Soluções

• Solução D: 2 mL de solução 2% (p/v) CuSO4.5H2O e 2 mL de solução 4%

(p/v) tartarato de sódio e potássio são adicionados num balão de 100 mL e

aferidos com uma solução 2% (p/v) Na2CO3. Esta solução deverá ser preparada

na hora da análise.



• Reagente de Folin-Ciocauteu: a partir da solução 2N do reagente de Folin

(Merck), por diluição, será preparada uma solução 1N.

4.6.5.1.2. Procedimento analítico do método

Em tubos de ensaio contendo 5 mL da solução D foram adicionados 0,5 mL da

amostra a ser analisada, seguido de agitação em vortex. O branco continha, no lugar da

amostra, 0,5 mL de NaOH 1N. Decorridos 20 minutos, adicionaram-se 0,5 mL do reagente de

Folin-Ciocauteu 1N, agitando-se novamente. Depois de 90 minutos de repouso, procedeu-se

leitura da absorbância a 660 nm para determinação da concentração protéica. Esse

procedimento foi realizado para quantificação da proteína extra- e intracelular.

Para calibração, foram utilizadas soluções de albumina bovina em concentrações de 0,

10 mg/L a 420 mg/L (Apêndice 2).

4.6.5.2. Qualitativa – SDS-PAGE (Laemmli, 1970)

A eletroforese foi realizada para possibilitar a visualização das bandas protéicas das

proteínas de interesse expressas pelos dois clones de Escherichia coli, em cuba vertical que

comporta até dois “sanduíches” (aparato de duas placas de vidro, no meio do qual era

introduzido o gel).

As amostras, depois de misturadas em igual proporção ao tampão de amostra e

desnaturadas em banho (95°C por 5 min), foram aplicadas no gel. A aplicação se dá em

“submarino”, ou seja, quando a cuba eletrolítica está preenchida, até o nível necessário

(indicação na cuba), com tampão de corrida.

O gel foi submetido à tensão de 50V, para corrida no gel de concentração, e 150V para

corrida no gel de separação. O tempo de corrida, em média, foi de três horas. Quando

observado o final da corrida, indicado pela chegada da coloração do tampão de amostra ao

fundo do “sanduíche”, o gel de separação era submetido a procedimentos de coloração e

descoloração para visualização das bandas de proteínas (item 4.6.5.2.1). A composição de

todas as soluções e géis utilizados encontra-se no Anexo 3.



4.6.5.2.1. Visualização das bandas

Para visualização das bandas, foi realizada coloração do gel com Azul de Coomassie.

O procedimento foi realizado da seguinte forma: depois de decorrida a eletroforese, o gel é

retirado do “sanduíche”, descartando-se o gel de concentração e colocando o gel de separação

em solução corante de Azul de Coomassie 0,1% por cerca de doze horas. Em seguida

realizou-se descoloração por duas horas, ou até nitidez das bandas, através da imersão em

solução descolorante (ácido acético 10% / metanol 35%). Ao final desse procedimento, as

bandas protéicas já eram visualizadas.

Os géis então eram dispostos em “sanduíches” de papel celofane, digitalizados e

depois suportados em placas de vidro por tempo necessário para secagem. A digitalização foi

realizada para facilitar a determinação do peso molecular da proteína de interesse.

4.7. Tratamento dos dados experimentais

4.7.1. Cálculo de velocidades específicas

A velocidade de crescimento é proporcional à concentração de microrganismos em um

dado instante. A fração pela qual a população cresce na unidade de tempo é dada por µ, que

representa a velocidade específica de crescimento (Schmidell et al., 2001), é dada pela

Equação (1) e tem unidade de tempo-1 (h-1). Na fase exponencial (ou logarítmica) a velocidade

específica de crescimento é constante e máxima, sendo µX denominado de µmáx.

dt

dX

XX ⋅=

1µ (1)

Onde: X = massa celular (g);

t = tempo (h).

Como a concentração microbiana aumenta durante o cultivo descontínuo, há um

consumo de substrato, que é utilizado pelo metabolismo microbiano para produzir o produto.

Dessa forma, é mais coerente analisar as velocidades instantâneas de consumo de substrato e



formação do produto com uma relação à concentração microbiana, ou seja, relacionando-as ao

um valor de X em um dado instante (Schmidell et al., 2001), passando a ser denominadas de

velocidades específicas de consumo de substrato e formação de produto, sendo verificadas,

respectivamente, nas Equações (2) e (3).

−=

dt

dS

XS

1µ (2)

dt

dP

XP ⋅=

1µ (3)

Onde: S = massa de substrato (g);

P = massa de produto (g);

X = massa celular (g).

A determinação de µx, µs e µp foi realizada através de implementação das equações,

para determinação das respectivas derivadas, em planilhas conforme método proposto por Le

Duy & Zajic (Schmidell et al., 2001).

4.7.2. Fatores de conversão

O fator de conversão de substrato em células relaciona o crescimento celular, ou seja,

aumento da biomassa, ao substrato consumido para essa finalidade, indicando quanto o

microrganismo está utilizando do substrato para seu crescimento. Esse fator é obtido através

da Equação (4) e será utilizado como comparação dos ensaios sem indução aos com indução.

SS

XX

SX

−

−=Υ

0

0 (4)

Onde: X0 e X: massa celular (g);

S0 - S: massa de substrato consumido (g).



4.7.3. Produtividade em biomassa (PX)

A produtividade em biomassa (PX) é uma definição especial de velocidade, cujo

interesse prático está em avaliar o desempenho de um processo fermentativo (Schmidell et al.,

2001), sendo definido pela Equação (5), expressa em unidades de g/L.h.

f

mX

t

XXP 0−

= (5)

Onde: Xmáx: concentração celular máxima (g/L);

tf: tempo final de fermentação (h).

Capítulo 5

Resultados e Discussão

Capítulo 05 – Resultados e Discussão


5. Resultados e Discussão

Na Tabela 5.1 encontram-se de forma resumida as características e identificação de

todos os ensaios realizados neste trabalho. Os cultivos foram realizados em regime

descontínuo utilizando incubador rotativo, com pH inicial do meio igual a 7,0, sob agitação e

temperatura controladas a 200 rpm e 37°C, respectivamente.

Tabela 5.1. Identificação dos ensaios realizados

Ensaio Clone Meio de cultivo Indução (IPTG)

FS01 kmp11 2xTY -

FS02 kmp11 TB -

FS03 kmp11 FASS+EL -

FS04 P36 2xTY -

FS05 P36 TB -

FS06 P36 FASS+EL -

FS07 kmp11 2xTY +

FS08 kmp11 TB +

FS09 kmp11 FASS+EL +

FS10 P36 2xTY +

FS11 P36 TB +

FS12 P36 FASS+EL +

5.1. Avaliação cinética dos clones em diferentes meios de cultivo sem

indução por IPTG

Os ensaios sem indução foram realizados com a finalidade de se avaliar o crescimento

e consumo de substrato dos clones de E. coli recombinante, kmp11 e P36, em três meios de

cultivo, verificando-se em qual deles o crescimento é mais favorecido. A partir desses

experimentos, pode-se também decidir o momento para se realizar indução para expressão das

duas proteínas. Os perfis das referidas curvas, em relação ao tempo de cultivo, podem ser

verificados nas Figuras 5.1 a 5.6.



0 2 4 6 8 10 12

8

9

10

11

12

Tempo (h)

Con

c de

sub

stra

to (

g/L

)

0

1

2

3

4

( ) Biomassa ( ) Substrato

Biom

assa (g/L)

Figura 5.1. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS01 (kmp11/2xTY).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

13

14

15

16

17

18

19

Tempo (h)

Co

nc d

e s

ub

str

ato

(g

/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8


Bio

ma

ssa (g

/L)

Figura 5.2. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS02 (kmp11/TB).



0 2 4 6 8 10 12 14

0

2

4

6

8

10

12

Tempo (h)

Co

nc

de s

ub

stra

to (

g/L

)

0

1

2

3

4

5


Bio

ma

ssa (g

/L)

Figura 5.3. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS03 (kmp11/FASS).

0 2 4 6 8 10 12

9

10

11

12

13


Tempo (h)

Co

nc

de s

ubst

rato

(g/L

)

0

1

2

3

4

5

Bio

massa

(g/L

)

Figura 5.4. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS04 (P36/2xTY).



0 2 4 6 8 10 12 14 16

14

15

16

17

18

19

( ) Biomassa ( ) SubstratoTempo (h)

Co

nc d

e s

ub

stra

to (

g/L

)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Bio

ma

ssa (g

/L)

Figura 5.5. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS05 (P36/TB).

Figura 5.6. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS06 (P36/FASS).

0 2 4 6 8 10 12 14

0

2

4

6

8

10

12


Co

nc

de

su

bst

rato

(g/L

)

0

1

2

3

4

5

Bio

ma

ssa

(g/L

)



Analisando os resultados obtidos nos ensaios FS01 a FS06, foram obtidos os

parâmetros cinéticos, cujos valores são mostrados na Tabela 5.2.

Tabela 5.2. Parâmetros cinéticos dos ensaios sem indução.

Ensaio Xmáx (g/L) tXmáx (h) µmáx (h-1) PX (g/L.h) YX/S (g/g)

FS01 3,04 6 0,19 0,15 1,06

FS02 6,25 14 0,12 0,23 1,26

FS03 3,53 4 0,16 0,10 0,44

FS04 3,14 6 0,22 0,16 1,03

FS05 6,16 12 0,11 0,23 1,19

FS06 3,53 6 0,11 0,09 0,18

A partir das curvas de consumo de substrato referentes aos experimentos sem indução

(FS01-FS06), pode-se verificar que somente há esgotamento da fonte de carbono nos ensaios

cuja principal fonte é a glicose (FS03 e FS06). Isso se deve ao fato da glicose ser uma fonte

mais disponível quando comparada às fontes de carbono dos demais meios de cultivo

testados, sendo por isso de fácil absorção pelo microrganismo.

Observa-se através das curvas de crescimento microbiano que praticamente inexiste a

fase “lag”, ou seja, a fase de adaptação do microrganismo ao meio, que antecede a fase de

crescimento exponencial (fase “log”). Esse fato pode ser explicado pelo distanciamento do

primeiro ponto analisado, duas horas depois em relação ao início do cultivo, já que a literatura

relata que o tempo de geração da bactéria Escherichia coli pode apresentar um valor da ordem

de 20 minutos na temperatura de cultivo de 37°C (Schmidell et al., 2001). Também pode

significar que o microrganismo está plenamente adaptado ao meio, não necessitando de um

período de adaptação.

A comparação das curvas de crescimento dos dois clones nos diferentes meios também

evidencia uma semelhança do comportamento quanto ao crescimento e consumo de substrato.

Isso se justifica pelo fato de que, sem indução, os dois clones se comportam como bactérias E.

coli e não haveria porque haver diferença nos perfis cinéticos.

Avaliando-se o comportamento dos clones kmp11 e P36 no meio 2xTY (FS01 e FS04,

respectivamente), verifica-se que ambos encerram a fase de crescimento exponencial no

mesmo instante, 6 horas, no entanto a maior concentração celular é observada para o clone

P36, 3,14 g/L, que apresenta também uma maior velocidade específica de crescimento

máxima, µmáx = 0,22 h-1. Com relação ao consumo de substrato, percebe-se que o clone



kmp11 praticamente cessa o consumo, enquanto para o clone P36 ainda há um leve

decréscimo na curva de substrato, indicando ainda haver consumo, porém não mais para

crescimento celular, mas para sua manutenção. A produtividade em células e o fator de

conversão de substrato em biomassa, nesse caso, forneceram valores muitos próximos para

ambos os clones, como pode ser visto na Tabela 5.2.

Avaliando o comportamento dos clones no meio TB, que possui uma maior

quantidade de fonte de carbono (maior concentração de extrato de levedura e triptona, além de

glicerol), observa-se que o Xmáx é obtido em um tempo inferior para o clone kmp11.

Entretanto, seu valor é um pouco menor, aproximadamente 1,5%, não influenciando

significativamente no valor da produtividade, que foi bastante semelhante para os dois clones.

Com relação ao substrato, observa-se que há uma maior conversão em células no ensaio

FS02, quando comparado ao ensaio FS05. Para ambos os clones, verifica-se que há um

decréscimo pequeno, porém contínuo, da concentração de substrato na fase estacionária do

crescimento, indicando que o microrganismo continua usando pequenas porções da fonte de

carbono para manutenção de seu metabolismo.

Os ensaios discutidos até então utilizavam como fonte de carbono uma composição

complexa, motivo pelo qual não se conseguia definir precisamente qual a concentração de

fonte de carbono inicialmente no meio, se havia esgotamento da mesma, pois não sendo

fontes disponíveis (açúcares simples, por exemplo) demandava muita energia do

microrganismo para degradar materiais complexos. Nesse contexto, prossegue-se avaliando

agora o meio FASS+EL, cuja fonte de carbono principal é glicose, e é um meio melhor

definido. Nesse meio, como pode ser observado na Figuras 5.3 e 5.6, há o esgotamento da

fonte de carbono mais disponível, glicose. No entanto, observa-se uma baixíssima

produtividade em células para os dois clones. Isso pode ser devido ao chamado Efeito

Crabtree (Schmidell et al., 2001), no qual há uma inibição do crescimento pela liberação do

meio de produtos do próprio metabolismo microbiano, em especial, quando se está

trabalhando com glicose, a produção de ácido acético. Este, mesmo em baixas concentrações,

5 a 13 mM, exerce um acentuado efeito inibitório sobre o metabolismo bacteriano (Lee &

Chang, 1990).

Observando os parâmetros cinéticos dos ensaios FS03 e FS06 pode-se ressaltar que

para o clone kmp11 tanto µmáx quanto YX/S apresentam valores superiores aos obtidos para o

clone P36, sendo, respectivamente, 45,5% e 144,5% maiores. Isso demonstra que o clone

kmp11 cresceu mais rapidamente e alcançou a máxima concentração celular em menor tempo,



como já foi verificado graficamente, assim como também utilizou melhor o substrato no

crescimento. Nesse meio, observa-se, para os dois clones, que continua havendo consumo de

substrato até seu esgotamento, mesmo com o fim da fase “log”.

Comparando agora o comportamento do clone kmp11 nos três meios de cultivo,

ressaltam-se os seguintes pontos: a maior concentração celular é verificada no meio TB, assim

como são maiores PX e YX/S; no meio 2xTY, o µmáx teve o maior valor, 0,19 h-1, no entanto

uma menor concentração máxima de células, com PX e YX/S intermediários; já no meio

FASS+EL, obtiveram-se os menores valores de PX e YX/S, e valores intermediários de Xmáx e

µmáx.

O meio TB apresentou-se como o mais favorável ao crescimento do clone kmp11 e

obtenção de maior densidade celular. No entanto, o tempo levado para alcançar essa

concentração máxima, 14h, é bastante elevado quando se imagina e objetiva um aumento de

escala e uma industrialização desse processo. Já o meio FASS+EL, apresentou resultados que

levam a crer que ocorreu realmente uma inibição do crescimento devido à “alta” concentração

de glicose no meio, conhecido pelo Efeito Crabtree. Já nos ensaios realizados com o meio

2xTY, observa-se a maior velocidade específica máxima de crescimento, e um tempo de 6

horas para alcançar a concentração máxima de células, mesmo sendo o meio relativamente

mais “pobre” em fontes de carbono, o que ratifica que o excesso de substrato dos demais

meios podem estar influenciando negativamente o crescimento dos clones.

5.2. Avaliação das alterações na cinética dos clones quando induzidos por

IPTG

A partir dos resultados obtidos nos ensaios anteriores (item 5.1), decidiu-se realizar

ensaios com indução por IPTG, para uma concentração final no meio de 1mM, nas mesmas

condições dos ensaios sem indução (200 rpm, 37°C, e pH inicial 7,0), a fim de se verificar a

influência de sua adição nos perfis cinéticos, bem como se haveria e onde haveria expressão

das proteínas kmp11 e P36. O momento de indução escolhido foi o início da fase exponencial,

t = 1h, correspondendo ao momento de DO590 nm entre 0,4 e 0,5, quando o microrganismo está

em atividade de crescimento plenamente desenvolvida. Os perfis de crescimento e consumo

de substrato podem ser verificados nas Figuras 5.7 a 5.12, cujas indicações do momento de

indução estão apontadas por setas em cada gráfico.



0 2 4 6 8 10 12 14

10

11

12


Conc d

e s

ub

stra

to (

g/L

)

1

2

3

4

Bio

massa

(g/L

)

Figura 5.7. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS07 (kmp11/2xTY).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

13

14

15

16

17

18


Tempo (h)

Conc

de s

ub

str

ato

(g/L

)

1

2

3

4

5

6

7

8

Bio

ma

ssa

(g/L

)

Figura 5.8. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS08 (kmp11/TB).



0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

0

2

4

6

8

10


Conc d

e s

ubstr

ato

(g

/L)

1

2

3

4

5

Bio

ma

ssa (g

/L)

Figura 5.9. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS09 (kmp11/FASS).

0 2 4 6 8 10 12

9

10

11


Tempo (h)

Co

nc

de

su

bst

rato

(g

/L)

1

2

3

4

Bio

ma

ssa

(g/L

)

Figura 5.10. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS10 (P36/2xTY).



0 2 4 6 8 10 12 14 16

13

14

15

16


Conc

de

subst

rato

(g

/L)

2

3

4

5

6

7

Bio

massa

(g/L

)

Figura 5.11. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS11 (P36/TB).

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

2

4

6

8

10


Tempo (h)

Conc d

e s

ubst

rato

(g

/L)

2

3

4

5

Bio

massa

(g/L

)

Figura 5.12. Perfil de crescimento e consumo de substrato do Ensaio FS12 (P36/FASS).



Analisando os resultados obtidos nos ensaios FS07 a FS12, foram obtidos os

parâmetros cinéticos, cujos valores são mostrados na Tabela 5.3.

Tabela 5.3. Parâmetros cinéticos dos ensaios com indução.

Ensaio Xmáx (g/L)

tXmáx (h)

ttotal (h)

µmáx1 (h-1) µmáx

2 (h-1)

FS07 3,40 8 14 0,12 0,10

FS08 6,23 11 18 0,21 0,08

FS09 3,25 12 20 0,23 0,11

FS10 3,33 7 12 0,28 0,14

FS11 5,11 8 16 0,18 0,09

FS12 4,15 7 16 0,15 0,08 1 Calculado antes da indução.

2 Calculado depois da indução, durante a fase “log”.

Avaliando-se os resultados obtidos nos experimentos com indução (FS07-FS12)

através das Figuras 7 a 12 e Tabela 5.3 e comparando-os com os resultados obtidos dos

ensaios sem indução (FS01-FS06), podem-se verificar algumas alterações no comportamento

do microrganismo quando submetido à indução.

No meio 2xTY, pode-se verificar que o tempo necessário para alcançar o Xmáx foi

maior nos ensaios com indução para os dois clones (ensaios FS07 e FS10), o que indica uma

menor velocidade específica de crescimento. Os valores obtidos de concentração celular

máxima foram equivalentes nos dois ensaios (com e sem indução) para ambos os clones. Em

relação à concentração de substrato, no ensaio FS07, pode ser observado que houve uma

maior variação entre concentração inicial e final quando comparado ao seu correspondente

sem indução, FS01, indicando uma maior necessidade energética por parte do microrganismo

quando submetido à indução. Para o clone P36 nada pode ser ressaltado já que a variação de

consumo de substrato durante os experimentos foi similar.

Nos ensaios com indução utilizando o meio TB, similarmente aos ensaios sem

indução, foram obtidos os maiores valores de concentração celular quando comparados aos

demais meios. Entretanto, para o clone P36 foi observada uma redução no valor máximo

obtido, o que pode ser justificado pelo desvio de metabolismo do microrganismo para

expressão das proteínas, quando submetido à indução.

O último meio de cultivo testado para avaliação da indução na cinética de crescimento

e consumo de substrato foi o FASS+EL, cuja principal fonte de carbono é glicose. Para esse



meio, pode ser observado, através de comparação dos resultados apresentados nas Tabelas 5.2

e 5.3, que o tempo necessário para atingir a concentração máxima de células foi maior para os

ensaios com indução.

Fazendo uma comparação das velocidades máximas específicas de crescimento de

todos os ensaios da segunda etapa de experimentos (Tabela 5.3), calculados antes e depois do

momento de indução, pode-se verificar claramente que depois da indução há uma queda nos

valores de µmáx. Isso ocorre, pois, com a indução, há um desvio do metabolismo celular para

produção da proteína recombinante, evidenciada através de nítidas bandas nos géis de

eletroforese, conforme será visto no item 5.3.

5.3. Verificação da expressão das proteínas recombinantes através de SDS-

PAGE

Os ensaios com indução foram analisados quantitativamente, através do Método de

Lowry, e qualitativamente, através de eletroforese em sistema desnaturante (SDS-PAGE).

Como o objetivo deste trabalho foi a verificação da produção em diferentes composições de

meio e influência da indução do comportamento cinético, não houve preocupação em uma

quantificação mais precisa das proteínas produzidas.

Os resultados obtidos através das análises pelo Método de Lowry são úteis para se ter

uma idéia do perfil da curva de expressão. Os pontos experimentais foram analisados depois

de submetidos à etapa de purificação (passagem pela resina), conforme descrito no item 4.6.4,

a fim de estimar a concentração da proteína de interesse produzida em cada combinação

microrganismo/meio.

De acordo com os valores de concentração das proteínas obtidos por Lowry (Apêndice

3), observou-se uma discrepância quando comparados aos géis eletroforéticos adquiridos. Por

exemplo, quando se observa nos géis (Figuras 5.13-5.16), as colunas de corrida de material

extracelular com passagem pela resina, não se observa banda única da proteína de interesse,

ou sequer qualquer banda protéica (apresenta maiores valores de concentração por Lowry).

Enquanto nas colunas correspondentes à proteína intracelular purificada, verifica-se

claramente banda única, indicando presença das proteínas de interesse (com menores valores

de concentração por Lowry). Essa observação põe em desacordo os resultados obtidos quanti

e qualitativamente, o que corrobora a inadequação, neste trabalho, do Método de Lowry para



quantificação das proteínas recombinantes estudadas. Os resultados quantitativos de proteínas

encontram-se no Apêndice 3.

Os pontos experimentais para realização da eletroforese correspondem ao final da fase

exponencial de crescimento em cada cultivo, conforme Tabela 5.4, e foram escolhidos por

representarem momento de pico de concentração celular.

Tabela 5.4. Tabela com pontos em que eletroforese foi realizada.

Ensaio teletrof intrac. (h) FS07 8 FS08 6 FS09 9 FS10 5 FS11 9 FS12 9

Os géis obtidos através da realização de eletroforese evidenciam a produção das

proteínas recombinantes, kmp11 e P36, nos três meios de cultivo testados. Na Figura 5.13,

pode ser verificado o gel para o clone kmp11, nos meios 2xTY e TB, e na Figura 5.14, o gel

referente ao meio FASS+EL.

Figura 5.13. Gel de eletroforese para proteína kmp11 por E. coli recombinante nos meios 2xTY e TB. 1) Padrão protéico; 2) 2xTY extracelular com passagem pela resina; 3) 2xTY

extracelular sem passagem pela resina; 4) 2xTY intracelular purificada; 5) 2xTY intracelular sem passagem pela resina; 6) TB extracelular com passagem pela resina; 7) TB extracelular sem passagem pela resina; 8) TB intracelular purificada; 9) TB intracelular sem passagem

pela resina.

14,4 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9

14 kDa

97 kDa

66 kDa

45 kDa

30 kDa

20,1 kDa



Figura 5.14. Gel de eletroforese para proteína kmp11 por E. coli recombinante no meio FASS+EL. 1) Padrão protéico; 2) Intracelular purificada; 3) Intracelular sem passagem pela

resina; 4) Intracelular ponto de indução sem passagem pela resina; 5) Extracelular com passagem pela resina; 6) Extracelular sem passagem pela resina; 7) Extracelular ponto de

indução sem passagem pela resina.

Os resultados obtidos através de eletroforese para a expressão da proteína P36 estão

dispostos na Figura 5.15, para os meios 2xTY e TB, e na Figura 5.16, para o meio FASS+EL.

Figura 5.15. Gel de eletroforese para proteína P36 por E. coli recombinante nos meios 2xTY e TB. 1) Padrão protéico; 2) 2xTY extracelular com passagem pela resina; 3) 2xTY extracelular

sem passagem pela resina; 4) 2xTY intracelular purificada; 5) 2xTY intracelular sem passagem pela resina; 6) TB extracelular com passagem pela resina; 7) TB extracelular sem passagem pela resina; 8) TB intracelular purificada; 9) TB intracelular sem passagem pela

resina.

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9

14 kDa

36 kDa

14,4 kDa

97 kDa

66 kDa 45 kDa

30 kDa

20,1 kDa

14,4 kDa

97 kDa

66 kDa

45 kDa

30 kDa

20,1 kDa



Figura 5.16. Gel de eletroforese para proteína P36 por E. coli recombinante no meio FASS+EL. 1) Padrão protéico; 2) Intracelular purificada; 3) Intracelular sem passagem pela

resina; 4) Intracelular ponto de indução sem passagem pela resina; 5) Extracelular com passagem pela resina; 6) Extracelular sem passagem pela resina; 7) Extracelular ponto de

indução sem passagem pela resina.

Como todas as amostras foram submetidas à mesma rotina de tratamento e análise até

aplicação no gel para realização de eletroforese, pode-se relacionar a intensidade das bandas

obtidas com a concentração de proteínas no meio. Os pesos moleculares foram calculados

baseando-se no manual do kit de calibração fornecido pelo fabricante (GE Healthcare, 2006),

conforme metodologia encontrada no Anexo 1. Os pesos moleculares das proteínas utilizadas

como padrão também estão no Anexo 1.

A partir dos géis referentes às proteínas kmp11 e P36 (Figuras 5.13 a 5.16), foi

realizado procedimento para cálculo de seus pesos moleculares (Anexo 1), através do qual

constatou-se que seria, respectivamente, 14 kDa e 36 kDa, corroborando os dados da literatura

(na seqüência, Ramírez et al., 1998 e Silva et al., 2005).

Nos experimentos para expressão da proteína kmp11, observa-se claramente pelas

Figuras 5.13 e 5.14, que o nível de expressão decresce com o aumento na disponibilidade de

substrato no meio, sendo o meio 2xTY o que apresenta maior intensidade de banda, seguido

do meio TB e FASS+EL. Dessa forma, constata-se que uma maior disponibilidade de

substrato favorece o crescimento, no entanto, desfavorece a produção da proteína

recombinante.

Um comportamento semelhante ao observado para expressão da proteína kmp11 é

também verificado para proteína P36. No caso dessa proteína, entretanto, observa-se menor

1 2 3 4 5 6 7

36 kDa

14,4 kDa

97 kDa

66 kDa

45 kDa

30 kDa

20,1 kDa



intensidade das bandas para os três meios (Figuras 5.15 e 5.16), quando comparadas às

observadas para proteína kmp11, o que indica que um menor nível de expressão foi alcançado

para proteína P36.

Capítulo 6

Conclusões

Capítulo 06 – Conclusões


6. Conclusões

De acordo com os resultados mostrados, pode-se concluir que o objetivo proposto para

esse trabalho foi plenamente alcançado, já que foi possível verificar a influência da indução

no crescimento microbiano, bem como verificar, através de eletroforese, que o tipo de

expressão observado foi predominantemente intracelular e os pesos moleculares das proteínas.

Como foi mostrado, as proteínas kmp11 e P36 apresentaram pesos moleculares iguais a 14

kDa e a 36 kDa, respectivamente.

Nesse contexto, foi constatado que a indução por IPTG para expressão de proteínas

recombinantes causa uma redução na velocidade máxima específica de crescimento, o que

pode ser explicado pelo desvio no metabolismo celular do microrganismo. Por esse motivo,

estudos para testar diferentes estratégias de indução e formas de condução do processo são

muito importantes.

Foi verificado que o Método de Lowry não se mostrou adequado à quantificação de

proteínas recombinantes para este trabalho. Isso motiva realização de estudos futuros a fim de

se estabelecer condições ideais para realização desse método e/ou se implementar um novo

método de quantificação.

Quanto à influência do meio de cultivo, observou-se que uma maior disponibilidade de

substrato favorece o crescimento microbiano, no entanto desfavorece a expressão de

proteínas. Isso provavelmente ocorre devido à produção, pelo microrganismo, de produtos

secundários que funcionam como inibidores da expressão. De posse dos resultados obtidos

nesse trabalho, pode-se estudar a possibilidade de realização de ensaios em batelada

alimentada, a fim de minimizar essa produção secundária, maximizando a produção do

bioproduto de interesse.

Comparando os resultados obtidos para os três meios de cultivo, verifica-se que o

meio TB proporcionou alcançar maiores concentrações celulares nesses ensaios em batelada,

em shaker. Como já citado no corpo do trabalho, a obtenção de alta densidade celular é

importante na expressão de proteínas recombinantes. No entanto, para futuros testes em

biorreator, nos quais sejam adotados cultivos em batelada alimentada (por exemplo) a

utilização do meio FASS+EL seria o mais indicado, pois se pode facilmente determinar a

quantidade de substrato adicionado ao meio. Isso é difícil de realizar com o meio TB, devido

a sua maior complexidade de composição.

Capítulo 7

Referências bibliográficas

Capítulo 07 – Referências Bibliográficas


7. Referências Bibliográficas

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Apêndice

Apêndice


Apêndice 1 – Curva de calibração de DNS para determinação da concentração de glicose.

Curva padrão de DNS

y = 1,5361x

R2 = 0,9957

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

ABS (590 nm)

Co

nce

ntr

ação

de

gli

cose

(g

/L)

Apêndice


Apêndice 2 – Curva de calibração de albumina bovina para determinação da concentração de

proteínas.

Curva padrão de albumina bovina

y = 0,67277x - 0,01743

R2 = 0,99176

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

ABS (660 nm)

Co

nce

ntr

ação

de

pro

teín

as (

g/L

)

Apêndice


Apêndice 3 – Curvas de produção de proteínas quantificadas pelo Método de Lowry referente

à segunda etapa de experimentos (FS07 – FS12).

0 2 4 6 8 10 12 14

24

28

32

36

40

44

48

52

56

60

64

68

72

Biomassa Intrac Extrac Totais

Tempo (h)

Co

nc

de

pro

teín

a (

mg

/L)

1

2

3

4

Bio

massa

(g/L

)

Curva de concentração de proteínas recombinantes – Ensaio FS07 (kmp11/2xTY).

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

24

28

32

36

40

44

48

52

56

60

64

68

Biomassa Intra Extra Totais

Tempo (h)

Co

nc d

e P

rote

ína

(m

g/L

)

2

3

4

5

6

7

Bio

massa

(g/L

)

Curva de concentração de proteínas recombinantes – Ensaio FS08 (kmp11/TB).

Apêndice


0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

Biomassa Intra Extra TotaisTempo (h)

Conc

de p

rote

ína (

mg/L

)

0

1

2

3

4

5

6

Bio

ma

ssa (g

/L)

Curva de concentração de proteínas recombinantes – Ensaio FS09 (kmp11/FASS).

0 2 4 6 8 10 12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

52

56

60

64

68


Conc

de p

rote

ína (

mg/L

)

0

1

2

3

4

5

Bio

massa

(g/L

)

Curva de concentração de proteínas recombinantes – Ensaio FS10 (P36/2xTY).

Apêndice


0 2 4 6 8 10 12 14 16

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

Biomassa Intra Extra Totais

Tempo (h)

Co

nc d

e p

rote

ína

(m

g/L

)

2

3

4

5

6

7

8B

iom

assa

(g/L

)

Curva de concentração de proteínas recombinantes – Ensaio FS11 (P36/TB).

0 2 4 6 8 10 12 14 16

20

24

28

32

36

40

44

48

52

56


Conc

de p

rote

ína (

mg/L

)

2

3

4

5

6

Bio

ma

ssa (g

/L)

Curva de concentração de proteínas recombinantes – Ensaio FS12 (P36/FASS).

Anexo


Anexo 1 – Dados das proteínas utilizadas como padrão nas análises de eletroforese e

metodologia para determinação dos pesos moleculares das proteínas expressadas.

Padrões de proteínas utilizados:

De acordo com os pesos moleculares (PM) dessas proteínas do padrão, mede-se no gel a

distância percorrida por cada banda e elabora-se um gráfico que relaciona log10(PM) com

essas distâncias (Rf).

Onde:

ototalpadrãDesloc

proteínaDeslocR f

.

.=

Calcula-se o Rf da proteína de interesse e, a partir do gráfico acima, obtém-se o seu peso

molecular.

Anexo


Anexo 2 – Tampões utilizados nos procedimentos de purificação de proteínas (GE Healthcare,

2005) e lise de células (QIAGEN, 2003).

Etapa Tampão* Composição

Purificação extracelular

Tampão de ligação Fosfato monossódico 20

mM; NaCl 0,5 M; Imidazol 20-40 mM (pH 7,4)

Purificação extracelular

Tampão de eluição Fosfato monossódico 20

mM; NaCl 0,5 M; Imidazol 300 mM (pH 7,4)

Purificação intracelular

Tampão de ligação Fosfato monossódico 20

mM; Uréia 8 M; Imidazol 20-40 mM (pH 7,4)

Purificação intracelular

Tampão de eluição Fosfato monossódico 20

mM; Uréia 8 M; Imidazol 300 mM (pH 7,4)

Lise de células e corpos de inclusão

Tampão de lise - uréia

Fosfato monossódico 50 mM; Uréia 8 M

*Todos os tampões devem ser preparados com água ultra pura (deionizada).

Anexo


Anexo 3 – Composição dos géis e tampões utilizados nos procedimentos de eletroforese em

gel de poliacrilamida (Laemmli, 1970).

Composição dos géis

Gel de concentração (mL)* Gel de separação (mL)**

H2O 3,4 2,3

Sol Acrilamida 30% 0,83 5,0

Tris 1,5 M (pH 8,8) - 2,5

Tris 1,0 M (pH 6,8) 0,63 -

SDS 10% 0,05 0,1

APS 10% 0,05 0,1

TEMED 0,005 0,004

* q.s.p. 5,0 mL ; ** q.s.p. 10,0 mL. Fonte: CHANG BIOSCIENCE

Composição dos tampões e soluções

Tampão de amostra Tris HCl 12 mM (pH 6,8); 2-Mercaptoetanol 2mM; Glicerol 5%; SDS 0,4%; Azul de bromofenol 0,02%

Tampão de corrida Tris 25 mM; Glicina 192 mM; SDS 10%

Sol. Coloração Metanol 40%; Ácido acético 10%; Azul de comassie

BlueR 0,1%

Sol. Descoloração Metanol 35%; Ácido acético 10%; Glicerol 2%

dissertação de mestrado - versão final public biblioteca · carried out through the addition of...

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