Die Xahrung

Aus dem Rega Institute for Medical Research in Leuven (Belgien)

11 I 1967 9-15

Die Membranverdauung der Starke

5. Mitt. Zur Zweigestaltigkeit der Membranverdauung der Starkel

P. DE LAEY

DK612.396.111:612.332 Sfarke, Darmverdauung Zweigestaltigkeit

Die umkehrbare Ad- und Desorption der pankreatischen Enzyme, welche die Grund- lage der Membranverdauung darstellt, bewirkt einen Anstieg der spezifischen AktivitiLt der Enzyme und der Wirlsuukeit der Verdauung. Diese Aktivierung kann durch einen besseren stereo-chemisehen Zustand des adsorbierten Enzyms und e k e hahere StabiIitAt gegeniiber pH und Temperatur bedingt win. Wie gezeigt, besitzt die an der Intestind- oberfliiche adsorbierte Amylase eine hohere Temperaturstabilitat und eine geringere Aktiviemngsenergie als geliste Amylase. Die Resorptionsgeschwindigkeit der Glucose nach der Verdauung.der Starke ist in den ersten Minuten schneller als bei der Glucose- Perfusion. Der die SWkeverdauung limitierende Schritt diirfte weniger auf adsorbierte Amylase zurtlckznflthren sein als auf die Permeabilitat der Darmwand fiir die Glucose. Die unterschiedliche Zweigestaltigkeit der Stlrkeverdauung vermindert sich mit voran- schreitendem Alter und als Folge der veriinderten Adsorptionseigenschaften des Ratten- Intestinalepithels fiir die Glucose.

Die umkehrbare Ad- und Desorption der Amylase auf der Dunndarmmem- bran, die das Pnnzip der Membranverdauung darstellt, fiihrt nach Mitt. I zu einer Erhohung der spezifischen Aktivitat des adsorbierten Enzyms.

Strukturelle hderungen der enzymatischen Proteine, des Apo-Enzyms, Erhohung der Enzymstabilitat und Beschleunigung seiner Kinetik infolge der Adsorption konnten diese Erhohung der spezifischen Aktivitat durch Adsorp- tion verursachen. I. Gewisse Enzyme miissen bekanntlich durch einen AktivierungsprozeB eine strukturelle Anderung erfahren, damit die Substratmolekale zum aktiven Zentrum der Enzyme Zugang finden. Eine solche Aktivierung stellt eine Ent- faltung der Molekiile dar, was durch die Adsorption der Enzyme auf einer ge- gebenen Unterlage - im vorliegenden Fall die Membran - erleichtert wird (NIRENBERG u. a. [I] ; YAGI u. a. [z]). SKOU [3] spricht die Vermutung aus, daD die katalytische Aktivitat nicht allein vom Entfaltungsgrad der Molekiile, son- dern auch von der Orientierung der Seitenkette abhangig ist. Durch Adsorption der Enzyme auf der Mucosa und durch die lokale Oberflachenspannung der

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Phase zwischen den Lipidschichten der Membran und dem Chymus konnte diese Orientierung und Entfaltung der Molekule vermutlich mit induziert werden. 2. Durch Adsorption auf der Diinndarmoberflache sollte die pankreas-enzyma- tische Aktivitat eine Beeinflussung von seiten des pH und der Zusammensetzung des Milieus eigentlich nicht erfahren, weil die aktiven Zentren der Enzympro- teine unter diesen Bedingungen gegen die Wirkung von Protease geschutzt sind. UGOLEV u. a. [4] haben tatsachlich eine erhiihte Stabilitat der adsorbierten Amylase gegen thermische und saure Denaturierung festgestellt. 3. Eine Beschleunigung der enzymatischen Kinetik infolge Adsorption auf der Epithelmembran ist gema8 der Beobachtung der Reaktionsgeschwindigkeit ge- sichert, die nur durch die freie Diffusion der Substratmolekiile hin zu den ge- bundenen und orientierten Enzymen limitiert ist. Nach dieser Vorstellung miiBte das Zusammentreffen eines fixierten Enzyms mit einem durch die inte- stinale Peristaltik bewegten Substratmolekiile begiinstigt werden.

Die Zweigestaltigkeit des Mechanismus der Membranverdauung wird, wie zu erwarten, durch eine solche Erhohung der spezifischen Enzymaktivitat beein- fluBt. Bei den vorliegenden Versuchen wird die Beziehung zwischen der Ge- schwindigkeit der Glucoseresorption und der Starke-Verdauung sowie der Temperaturstabilitat der adsorbierten Amylase studiert ; es handelt sich somit um jene Faktoren, die die Zweigestaltigkeit der Membranverdauung zu charak- terisieren vermogen.

Methode

I . Starkeuerdawung bei verschiedenen Temperaturen

0, i5y0ige StarkelBsung wird durch den Dunndarm von Ratten bei verschiedenen Tempe- raturen (0, 2 2 , 30. 37, 40, 50 bzw. 60 "C) perfundiert; die Perfusion bei o OC wird in einem offenen KiihIschrank ausgeftihrt. Die Temperatur des intestinalen Lumens der Ratte stellt sich auf I bis 2 O C ; die Perfusionsfliissigkeit wird bei o O C gehalten und der EinlaD rnit Eis gekiihlt. Die Temperatur der AuslaDkanule liegt bei o bis 0,5 "C. Unter diesen Bedingungen kann keine Ratte langer als 10 min am Leben bleiben. Fur die Perfusionen bei 22, 30, 37 und 40 OC ergeben sich keine Schwierigkeiten. Die Temperatur des Ein- und Auslasses wird jeweils kontrolliert und eine Schwankung hoher als 0,5 OC nicht zugestanden.

Da die Korpertemperatur der Ratte nach Nembutal-Narkose einen Abfall zeigt, haben wir die Tiere bei hoherer Temperatur vorbereitet. Eine halbe Stunde vor der Perfusion werden sie auf einer thermostatischen Perfusionstafel akklimatisiert und mit Watte bedeckt : nach einer halben Stunde bleibt die Korpertemperatur konstant.

2. Resorptionsgesch~indigkeit

Die Perfusion der proximalen und distalen Teile des Dunndarms mit 0,15%iger Starke- losung im RINGER-Puffer erfolgte, wie es in der I. Mitt. beschrieben worden ist, an Wistar- Ratten von verschiedenem Alter (42 bis 290 g schwer). Nach den gewmten Perfnsionszeiten wird die ,,in vivo"-Verdauung der Starke und der Glucose im Perfusat mittels des Glucose- Oxydase-Tests bestimmt.

Die gleichzeitige Ermittlung der Hydrolysegeschwindigkcit der Starke ,,in vivo" und des Gehalt s der Glucose im Lumen, die nicht resorbiert worden ist, kann als ein Ausdruck fIir das Verhd tnis der Membranverdauung/Membranadsorption betrachtet werden und veranschau- licht die Zweigestaltigkeit der Membran-Verdauung.

Membranverdauung der Starke. V 11

Die Resorptionsgeschwindigkeit der Glucose nach Verdauung der Starke wird ausgedriickt durch den Gehalt der verdauten Starke (Differem zwischen der Anfangs- und der Endkonzen- tration der nichtgespaltenen Starke im Perfusat) abztiglich der Glucose-Konzentration im Perfusat, ausgedrockt in mg/ml/min. Die Glucose-Resorption wahrend der Perfusion mit ciner 0,157bigen Glucoselosung wird an einer Gruppe von 7 Ratten bestimmt.

Ergebnisse and Diskassion

I . Die Temfieraturstabilitat der adsorbierten Amylase

Die ,,in vitro"-AmyIase-Aktivitat steigt bis zu den Temperaturen von 30 bis 37 "C an (Abb. I). Dariiber hinaus erhohte Temperaturen inaktivieren in zu erwartender Weise das Enzym. Der Temperaturkoeffizient zwischen 20 und

- 0 10 10 60 O C -

Abb. I, EinfluB der Temperatur auf die Reaktionsgeschwindigkeit der Starkeverdauung 0 ~ .--.--O = ,,in vivo"-Verdaaung; C- - - 0 = ,,in vitro"-Verdauung

30 'C lie@ bei z,13, die Aktivierungsenergie, berechnet aus dem Q,,-Wert, bei 13316 cal/Mol. Dieser Wert steht im Einklang mit der Aktivierungsenergie der menschliclien Speichelamylase, ,die sich nach BERNFELD [5] auf 13350 cal/Mol s tellt .

Die ,,in viva"-Amylase-Aktivitat zeigte ein Temperaturoptimum zwischen 37 und 40 "C; dieses optimale Gebiet - (90% des gesamten maximalen Bereichs) - umfaDt die Temperaturen von 30 bis 50 "C. Der Temperaturkoeffizient zwischen 20 und 30 "C ist 1,48, die Aktiviemngsenergie betragt G 912 cal/Mol.

Da die Adsorption des Enzyms auf der Membran die Aktivierungsenergie der Amylase herabsetzt - der zu iiberschreitende ,,Energieberg" wird dadurch er- niedrigt -, zeigt sich deutlich, daB die Zweigestaltigkeit der Membranverdauung

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durch die Adsorption der Amylase erhoht wird. Eine grol3ere Stabilitat und ein besserer Schutz der Amylase werden ,,in vivo" festgestellt.

2. Die Resor$tiom vom Glucose nach Verdauung de7 Starke

Die Resorption der Glucose nach Verdauung der o,~g%igen Starkelosung sowie diejenige bei der o,q%igen Glucose-Perfusion ist bei 2 Gruppen von je 7 Ratten (50 bis 55 g schwer) verglichen worden (Abb. 2) .

O 0 5 W min

Abb. 2. Die zeitliche Glucoseresorption im Diinndarm von jungen Ratten nach Verdauung einer o,~g%igen Starkelosung (0- 0) und nach

Perfusion einer 0,15%igen Glucosel6sun.g (0- - - 0 )

Bei den jungen Ratten verlauft die Glucose Resorption nach der vorgeschal- teten Verdauung der Starke zunachst schneller und intensiver als bei der Glu- cose-Perfusion, erniedrigt sich aber mit der voranschreitenden Zeit. Der beob- achtete Abfall der Glucose-Resorption stimmt mit der zeitlichen' Verminderung der Membranverdauung uberein ( JESUITOVA u. a. [6]). Die Menge der nicht re- sorbierten Glucose ist beim Versuch mit Starke von der Perfusionsgeschwindig- keit unabhangig und betragt o bis 13% der hydrolysierten Starke.

In dieser Altersgruppe der Tiere, die die am starksten ausgepragte Zwei- gestaltigkeit der Membranverdauung zeigen (DE LAEY [7]), erfolgt die intensive Glucose-Resorption nach einer Starke-Verdauung. Der Glucosegehalt im Per- fusat von verschiedenen Altersgruppen der Ratten zeigt eine deutliche Erho- hung mit ansteigendem Alter (Tab. I).

Gleichzeitige Perfusionen in proximalen und distalen Teilen des Diinndarms dokumentieren die unterschiedliche Zweigestaltigkeit der Membranverdauung in den 2 Darmabschnitten. Die ,,in vivo"-Verdauung der Starke im distalen Teil ist vermindert und die freigesetzte Glucose wird daselbst nur sehr verzogert resorbiert (Tab. 2 ) .

Membranverdauung der Stiirke. V

0,100

0,160

0,255 0.345

13

0,050 0,075 0,060 0,135

Tabelle I Der Glucose-Gehalt im Perfusat nach I und 5 min der StPrke- Verdauung im proximalen Danndarm der Ratten verschie- denen Alters. Die Mittelwerte von je 5Verkuchen sind far einen Perfusionsgeschwindigkeitsluxffizienten von I berechnet __- ______

nach I min 1 nach 5 min Altersgruppe der Ratten I der Stgrkeverdauung

! [mg/d/& Glu-1 ._ -- - -

I I

GWPpe 1 (40- 8og)

Gruppe IV (> 200 g)

Gruppe I1 (80-120 g) Gruppe I11 (120-200 g)

Tabelle 2

Die Zweigestaltigkeit der Glucose-Resorption nach StOrkeverdauung im proximslen bzw. distalen Teil des Dihndanns von Wzstar-Ratten (80-1zoog &wet): die M i a w e r t e von

je 5 Versuchen sind far den Perfnsionskoeffizienten von I berechnet

Proximaler Teil nach I min nach 5 min Distaler TeiE nach I min nach 5 min

,,in vivo"- St%rke-Verdauung

[mg/ml/minI

Glucose-Gehalt Glucose in yo im Perfusat der vertrauten [mg/d/minl i s*k

0,160 1 5 485 i 0,075

0,500 50 0,280

Im distalen Teil des Diinndarms wird eine lineare Korrelation zwischen dem Glucosegehalt und der Perfusionsgeschwindigkeit gefunden (P = 0,005). Je schneller das Perfusat durch das distale Lumen stromt, desto weniger wird re- sorbiert .

Diese Untersuchungsergebnisse ftihren zu folgenden Feststelltmgen:

I. Der die Starkeverdauung limitierende Schritt durfte weniger ein Effekt der ,,in vivo" gebundenen Amylase sein als vielmehr die Permeabilitat der Darmwand ftir die Glucose. Diese Folgerung wird durch die Beobachtung unterstutzt, daS die Hyperglychie nach einer Verdauung von Starke in gleicher Zeit auftritt wie nach Verabfolgung von Glucose unmittelbar.

2. Wenn die Membranverdauung der StBrke im distalen Teil des Diinndarms wirksam ist, konnte sich die Zweigestaltigkeit der Membranverdauung unter- schiedlich dadurch PuBern, daS die freigesetzte Glucose nur verlangsamt resor- bierbar ist. Die beobachtete Differenz der Glucoseresorption nach Tab. 2 zwi- schen dem proximalen und distalen Teil des Dunndarms stimmt mit Ergebnissen von FISHER u. a. [ S ] uberein ; sie haben die augenfallig limitierende Resorptions- gesehwindigkeit von Glucose bestimmt und finden im proximalen Teil eine

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Resorption von 3,2 bis 3,44 mg Glucose/ml/min, im distalen Teil aber nur I,77 his 1,9 mg Glucose/ml/min.

Die unterschiedliche Zweigestaltigkeit der Starkeverdauung vermindert sich mit voranschreitendem Alter nicht allein im Ausdruck der Anderungen des in vivolin vitro-Verhaltnisses des Verdauungsmechanismus (DE LAEY [7]), sondern auch als Folge der veranderten Absorptionseigenschaften des Ratten-Intestinal- epithels fur die Glucose.

S u m m a r y

P. DE LAEY: Membrane Digestion of Starch. Part 5. The efficiency of the membrane di- gestion

The reversible adsorption of pancreatic enzymes, which forms the basis of the membrane digestion, increases the specific activity of the enzymes and the efficiency of digestion.

This activation can be induced by the better stereochemical conditions of the sorbed enzymes and their higher stability against pH and temperature denaturation. According to our results the adsorbed amylase on the intestinal surface showed a higher temperature stability and a lower activation energy than the soluble amylase.

The resorption of glucose after starch digestion seems to be in the first minutes of the perfusion 3 times higher than the resorption of perfused glucose.

This means that the starch digestion through the adsorbed enzymes is very efficient. The rate limiting step of starch digestion is rather the adsorption of glucose through the intestinal W a l l .

The adsorption of glucose seems to diminish in function of the age of the rat, and is less efficient, for a same amount of digested starch, in the distal part of the gut of white rats.

L i t e r a t u r

[I] NIRENBERG, M. W., u. W. B. JAKOBY, Nature [London] 188, 747,(1960). [2] YAGI, K., u. T. OZAWA, Nature [London] 198, 483 (1962). [3] Sxou, J. C., Biochim. Biophysica Acta [Amsterdam] 30, 625; 31, I (1959).

Membranverdauung der SCarke. V 15

[4] UGOLEV, A M., u. T. I. SPIRIDENKOVA, ausParieta1 (Contact) Digestion, Moskau, Leningrad,

[5j BERNFELD, P., aus S. P. COLOWICK u. N. 0. KAPLAN. Methods in Enzymology, Vol. T ,

[6] JESUITOVA, N. N., P. DE LAEY u. A. M. UGOLEV, Biochim. Biophysica Acta [Amsterdam]

[ T I P. DE LAEY, Nature [London] 212, 78 (1966). [S] FISHER, R. B., u. D. S. PARSON, J . Physiology 119. 210 (1953).

SSSR Akad. Nauk 1963.

S. 153, Akad. Press, New York 1955.

86, 205 (1964).

Dr. P. DE LAEY, Rega Institute for Medical Research in Leuven (Belgien).

Eingegangen 8. 6. 1966.