v. Graefes Archiv tfir 0phthalmologie 163, 314---319 (1961)

Aus der Universit~ts-Augenklinik und dem Institut fiir experimentelle 0phthMmologie, Bonn (Direktor: Prof. Dr. H. K. MffLLER)

Die Altersabh~ingigkeit der Aldolase- und Malatdehydrogenase- aktivit~it in Meerschweinehenlinsen. Der Einflu8 yon Riintgen.

strahlen auf die Aktivit~it der beiden Enzyme* * *

Von W. PAuLus und 0. ItOCKWlN

Mit 3 Textabbildungen

Im Laufe der Versuche fiber Mtersbedingte Veri~nderungen ira Stoff- wechsel der Linse haben M f f z z ~ u. Mitarb. festgestellt, daG der Kohlen- hydratstoffwechsel der Mten Linse nicht nur insgesamt gegenfiber der jungen Linse geringer ist; wir beob~chteten aueh das Auftreten alters- bedingter Hemmungen an bestimmten Stellen im Ablauf der Glykolyse; die einzelnen Stoffwechselreaktionen werden offenbar be[m Altern der Linse unterschiedlich beeinflu~t.

Die Alters~bhs der Aldolaseaktivit~t in Rinderlinsen (K~psel, l%inde, Kern), sowie den EinfluB einiger katarakterzeugender Stoffe auf die Aldolase in w~l~rigen Linsenextrakten untersuchten bereits BAR- I)E~N~ U. Mitarb. und vor diesen MffLLEtr und IS~A~LnwIcz. Zur Ver- vollsti~ndigung dieser Versuehe, die immer nur zwei Zeitpunkte im Leben der Linse mitein~nder verglichen, bestimmten wir nun die Aldolase- aktiviti~t in Meersehweinchenlinsen angefangen yore EmbryonMstadium fiber verschiedene Altersstufen bis zu Mten Linsen, um eine Kurve zu erhalten, die die Fermentaktivit~t in Abh~ngigkeit vom Alter, bzw. yore Gewicht der Linsen zeigt. Aul~erdem interessierte uns der Verlauf dieser Kurve nach einer RSntgenbestrahlung der Linsen in vitro mit 100 kr, denn nach Beobachtungen yon Mi:~LLn~ u. Mitarb. ist zu erwarten, dM~ die Reaktion der Linse auf schi~digende Einwirkungen auch yon ihrem LebensMter abhs muB. - - PmIE bemerkte in Linsen junger Kaninehen, deren Augen in vitro mit 1,4 kr bestr~hlt worden waren, erst bei vorhandener Linsentriibung eine Verminderung der Aldolase-

* Die Arbeit wurde in dankenswerter Weise yon der Deutschen Forschungs- gemeinschaft unterstiitzt. Fraulein Cm~ISTA M~u danken wir ffir technische Assistenz.

** Die t~Sntgenbestrahlungen wurden im Institut ffir Biophysik der Universit~t Bonn ausgefiihrt, woffir wir an dieser Stelle I-Ierrn Priv.-Doz. Dr. H. D. BERGEDER danken mSchten.

Die Altersabh[ingigkeit der Aldolase- und Malatdehydrogenaseak$ivit~t 315

aktivit/~t, w/~hrend die Aktivit/it der Malat-Enzyme iiberhaupt nich~ beeinflul~t wurde.

Neben dem glykolytisehen Enzym Aldolase (ALD), das die Reaktion Fructose-l-,6-diphosphors/~ure (FDP)~-Glyeerinaldehydphosphat (GAP) ~- Dioxyacetonphosphat (DAP) katalysiert, untersuchten wit aueh das oxydative Enzym Ffalatdehydrogenase (MDH), das die umkehrbare Dehydrogenierung yon Mala~ zu Oxalacetat, einem wichtigen Abbau- produkt des Citronens/~urecyelus katalysiert, spezifisch fiir L-Malat ist and DPN-abh/~ngig :

Malat ~- DPN + ~ Oxalaceta~ + DPN-H ~- H +. Das Gleiehgewieh~ dieser Reaktion ist welt zugunsten yon Malat verschoben. Das Oxy- dationsvermSgen yon Linsengewebe f/ir )~pfels/iure wies bereits 1923 AHLGRE~r mit der Thunbergsehen Methylenblau-Methode nach; er stellte aueh eindeutig die enzymatisehe Natur dieses Vorganges fest. Naeh Untersuchungen yon WO~T~AN besitzt die Malatdehydrogenase in der Linsensubstanz (Rinde + Kern) eine 3faeh hShere Aktivits als in der Vorder- bzw. Itinterkapsel. Wir ermittelten die Altersabh/~ngig- keit und den Einflul~ yon RSntgenstrahlen auf die Aktivitgt des Enzyms in Meersehweinchenlinsen.

Die Aktivit/it beider Enzyme testeten wit nach einer optiseh- enzymatischen Methode (UV-Test mit DPN-H), die vor den bisher angewandten /ilteren Methoden den Vorzug grSBerer Genauigkeit hat und sich sehneller und einfacher ausffihren lal~t; es wurde in Anlehnung an eine yon Boehringer u. Soehne fiir das Serum ausgearbeiteten Vor- sehrift vorgegangen.

Zur Bestimmung der Aldolaseaktivitat in den mit Ringerphosphat- 15sung hergestellten Linsenextrakten wurden die pro Zeiteinheit aus FDP gebildeten TrJosephosphate ermittelt. Dazu wurde Dioxyaceton- phosphat (DAP) unter der enzymatischen Wirkung yon Glyeerophos- phatdehydrogenase mit DPN-H vollstandig zu 2-~-Glycerophosphat hydriert. Der Verbrauch an DPN-H, der spektrophotometriseh fest- gestellt wurde, ist proportional der gespaltenen Menge FDP. Bei der Bestimmung der Malatdehydrogenaseaktivit/~t wurde Oxalacetat unter enzymatischer Katalyse (MDH) mit DPNH als Coenzym in Malat iiberf/ihrt. Aus dem spektrophotometrisch verfolgbaren Umsatz von DPNH l&Bt sich die pro Zeiteinheit umgesetzte Menge Oxalaeetat ermitteln, die zugleich Bin MaD f/ir die MDH-AktivitKt i s t . Wegen der Instabilit/tt yon Oxalacetat in w/~Briger LSsung wurde das Substrat kurz vor der Messung im Bestimmungsansatz enzymatisch mittels Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) aus ~-Ketoglutarat und Asparaginat gebfldet:

316 W. PivLVS und O. tIocKW~N:

~CH~--C00I t H2C- -C00H t t2C- -C00H

H ~ C x c - - C O O H d- H - - C - - C O O H GOT > C - - C O O H -~,

N I l] O NH~ 0

u-Ketoglutars~ure Asparagins~ure Oxalessigsiure

/ C H 2 - - C O O H H ~ C (

\ C H - - C O O I t I

NH2 Glutamins~ure

Methodik Unmittelbar naeh dem Dekapitieren der Meersehweinchen werden die Linsen

den Augen ohne Besch~digung der Kapsel entnommen, nach sorgfaltiger Reinigung gewogen und nach einem yon KIz~sEv angegebenen Kultivierungsveffahren in einer NahrlSsung mit 120 rag-% Glucose kultiviert: 0,5 Std bei 37 o C dann 1 Std bei Raumtemperatur. Aufgeteilt in Geschwisterlinsen wird ein Tell der Linsen mit 100 kr bestrahlt (145 kV, 19 mA, 11,7 em FA, 1850 r/rain).

Die Linsen tier Embryonen wiegen 15--32 rag, die der jungen Tiere durch- schnittlich 43 rag, die der mittelalten Tiere durchschnittlich 95 mg und die der alten Tiere etwa 110 mg. Nach der Kul~ivierung werden die Linsen in eiskalter physiologischer Kochsalzl6sung gewaschen und sofort in einer Ringerphosphat- pufferlOsung (100 ml Ringerl6sung -4- 25 ml 0,1 m Na2HPO4-L5sung, die mit HC1 auf pH 4 eingestellt ist) unter Wasserkfihlung homogenisiert und das Homo- gen~t 45 rain bei 0 ~ C zentrifugiert. In einem Bereich yon 45--250mg LinsenmateriaI werden zur Extraktherstel]nng jeweils 7 ml Pufferl6sung verwendet.

Die Werte wurden in 2 voneinander unabhangigen Versuchsserien ermittelt. D~bei wurden ffir jede Altersgruppe die Linsen mehrerer Tiere verwendet, um die erforderliche ttomogenatdichte zu erha]ten. Die in den Abbildungen angegebenen Werte sind Mittelwerte aus je 3 Messungen.

Aldolase-Test. Die Ausfiihrung erfolgt mit der Testkombination von Both- ringer u. Soehne (TC-D Art.-Nr. 15974), die folgende L6sungen enth~lt:

I. 2 .10 -3 m FDP-LSsung (Substrat), die 0,056 m an Collidin (Puffer, pg 7,4) und 3 - 1 0 - I m an Monojodacetat ist (zur t temmung der weiteren Umwandlung der entstehenden Triosen).

I I . 1,5 �9 10-2m DPN-H-LSsung in 1%iger Natriumbic~rbonatlSsung. I I I . Eine Kristallsuspension yon Glycerophosphatdehydrogenase (GDH) und

Triosephosphatisomerase (TIM). T I ~ verschiebt alas Gleichgewicht yon GAP ~- RAP zu 96 % auf die Seite yon DAP.

Der Test wird in Cuvetten mit l0 mm Schichtdicke ausgeffihrt, in die man nacheinander pipettiert: 2,75 ml I, 0,04 ml I I und 0,01 ml III . Nach Durchmischen bringt man die Cuvetten in ein thermokonstantes Wasserbad yon 37 ~ C und liiltt wahrend 5 rain Spuren yon DAP aus dem FDP-Praparat abreagieren, bevor man 0,2 ml des Linsenextraktes zum Test einrfihrt. Nach weiteren 2- -3 rain effo]gt am Photometer ,,Eppendorf" die Extinktionsmessung E L bei 366 m/~ gegen Wasser und Extrakt. E 2 wird nach einer Inkubationszeit (37 o C) yon 20 rain gcmessen. Die Exthlktionsinderung LIE = E L - - E 2 ist ein Marl ~fir die Aldolaseaktivitat. Bei einem A E ~ 0,250 wird der Ext rak t mit I entsprechend verdfinn~. Von jedem Extrakt werden drei Proben gemessen und bei der Auswertung der Mit,telwert zugrunde gelegt. Die Aldolase wird in A E/g in 20 min angegeben und in einem Diagramm gegen das Linsengewicht aufgetragen (s. Abb. 1).

750

r

Die Al~ersabh~ngigkeib der Aldolase- und Malatdehydrogenaseaktivit~t 317

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Malatdehydrogenase-Test. Die verwendete Testkombination yon Boehringer und SShne (TC-L Art.JNr. 15981) enthi~lt folgende LSsungen:

I. 4,2 �9 10-2m Asparaginatl6sung in einem 0,1 m Phosphatpuffer (PH 7,4). II . 6 .10-2m Na-a-Ketoglutar~t in 1%iger Na-Bicarbona~lSsung.

I I I . 1,2 �9 10 -~ m DPN-H-LSsung. IV. Eine Kristallsuspension yon Glutama~-Oxalace~aVTransaminase (GOT). Der Test wird bei 250 C in 10 mm Cuvetten ausgeffihr~, in die man nacheinander

pipet$iert: 2,75 ml I, 0,05 ml II , 0,05 ml I I I und 0,05 ml IV. Bevor 0,1 m] Extrakt eingemischt wird, l~l~t man zur Bildung des Oxalaeetats 5 rain s~ehen, ttierauf wird die Reaktion am Photometer ,,Eppendorf" verfolgt, indem man fiber 6 min jedeMinute dieExtinktion abliest. Das gemesseneAEsollnichtgr6~er~ls0,030/min

/J'" sein; gegebenenfalls sind die Extrakte mit LSsung I zu ver- diinnen. Die Aktivit~t der MDH wird in A E/g/rain an- gegeben und in einem Dia- gramm gegen das Linsengewichb aufgetragen (s. Abb. 2).

3O

.... I r I I I I I I i i i , O I ~ I I I I I 70 20 30 40 SO 60 70 80 RO /O0 750 20 40 60 80 700 720

DufEhss Li/TsenffeWlChl i)7 mg ~LIPC/7$Chnl~]lcbe$ l/nsengei, v/chf /n mg

A b b . 1 A b b . 2

A b b . 1. A l t e r s a b h ~ n g i g k e i t der A l d o l a s e - A k t i v i t ~ t i n Meer schwe inchen i in sen . - - i n n o r m a l e n L i n s e n ; . . . . . . i n L i n s e n n a c h e ine r R S n t g e n b e s t r a h l u n g m i t 100 k r

A b b . 2. A b n a h m e t ier A l d o l a s e a k t i v i t i s i n M e e r s c h w e i n c h e n l i n s e n n a c h e ine r ROnt~en- b e s t r a h l u n g m i t 100 k r

Ergebnisse und Diskussion Aus Abb. 1 geht hervor , d~B mi t dem Al te rn der Meerschweinchen-

l insen, angef~ngen im E m b r y o n a l s t a d i u m , n ich t ein s te t iger Aktivi tg~s- abf~ll des g lyko ly t i schen E n z y m s Aldol~se e inhergeht ; v ie lmehr zeigte sich, dal~ die ALD-Akt iv i t i~ t der embryonMen Linse urn e twa 17% ger inger war als die der Lh]sen junger Tiere, die andererse i t s gegenfiber a l ten Tieren eine um e twa 50% erhShte A k t i v i t ~ t aufwiesen. Die A L D - A k t i v i t ~ t de r embryona l en Linsen lag abe r noch u m e twa 35% fiber der der a l ten Linsen. Die Her~bse tzung der A k t i v i t h t n~ch einer R6n~genbest r~hlung (100 kr) h ing ebenfal ls yore Al te r der Linsen ab, und zwar war die A k t i v i t ~ t in den embryona len Linsen und in den a l ten

318 W. PAULUS und O. HOCKWIN:

20

.E

Linsen weniger herabgesetzt (urn etwa 15 bzw. 10%) als in den jungen Linsen (urn etwa 30%) (s. Abb. 1 und 2). In keinem Falle aber war die Schi~digung 30%. Diese Ergebnissse lassen den Schlug zu, dab die Herabsetzung der ALD-Aktivit~t nach einer RSntgenbestrahlung der Linsen ein Sekund/irschaden ist; ein Prim/~rschaden mfigte sich in einer gleiehm/~Bigen Minderung der Aktivit/it bei allen Linsen bemerkbar machen. Auch die in vivo-Versuche mit jungen Kaninchen yon PIRIE, die erst bei vorhandener RSntgenkatarakt die Aldolase herabgesetzt land, lassen sich in dieser Richtung deuten. Die unterschiedlichen

Aktivits in embryona- en, jungen und alten Lin-

sen, sowie in den bestrahl- ,~,. ten Linsen erlauben aber

" , x keine Aussage fiber den • Substratumsatz in den Lin-

. . . . . . . . . . . ,:~___=~_: sen, denn die Enzymreserve ist so groB, dab nur ein Bruchtefl der gesamten Enzymaktiviti~t ausgenutzt wird.

I I [ r I i , I I I ' . Die Aktivit~tskurve des 70 20 30 qO 50 50 70 80 ~qO 700 750

Ourchschn,~/,ches L/nsengew/~b//n mg oxydativen Enzyms MDH A b b . 3. A l t e r s a b h ~ n g i g k e i t der M a l a t d e h y d r o g e n a s e - (S. nbb. 3) nimmt einen A k t i v i t a t i n ~ e e r s c h w e i ~ c h e n l i n s e n . in n o r m a t e n anderen Verlauf als die

Linsen ; . . . . . . i n L i n s e n n a c h e iner R S n t g e n b e s t r a h l u n g m i t 100 k r A L D - K u r v e (Abb. 1). D i e

grSgte Aktivit~t Iand sieh in den embryonalen Linsen; sie lag um etwa 40 % fiber der Aktivitiit der jungen und alten Linsen, die sich untereinander nicht in ihrer MDtt-Aktivit~t unterschieden. Das Altern der Linsen nach dem Embryonalstadium geht also nieht einher mi~ einem Naehlassen der MDH-Aktivit~t; desgleichen blieb eine Seh~digung der Linsen durch RSntgenstrahlen unter den hier eingehaltenen Versuchsbedingungen ohne EinfluB auf die MDH-Aktivitgt aller Linsen.

Die Ergebnisse geben einen weiteren Hinweis auf unsere schon mehrfaeh gemaehten Beobaehtungen, dab die Stoffweehselvorg~nge beim Altern der Linse untersehiedlieh beeinflugt werden; es scheint, dab eine R6ntgenbestrahlung der Linse vom jeweiligen Lebensalter abhgngig untersehiedliche Reaktionen zur Folge hat.

Zusammenfassung Mit einer opt.-enzymatischen Methode wurde d i e Aldolase- und

Malatdehydrogenase-Aktiviti~t in embryonalen, jungen, mittelalten und atten Linsen yon Meerschweinchen getestet. Die Enzymaktiviti~ten der

Die Altersabhangigkeit der Aldolase- und Malatdehydrogenaseaktivit~t 319

norma len Linsen wurden mi t solchen, die einer Bes t r ah lung yon 100 k r ausgese tz t wurden, vergl ichen. Die hSchste A L D - A k t i v i t i i t l a n d sieh in den jungen Linsen; sie lag u m 50% fiber der der a l t en Linsen und u m 17 % fiber der der embryonMen Linsen. Die RSn tgenbes t r ah lung se tz te die A L D - A k t i v i t ~ t in den e m b r y o n a l e n Linsen u m 15%, in den jungen Linsen u m 30% u n d in den a l ten Linsen u m 10% herab. Zwischen j ungen und a l ten Linsen be s t and ke in Unte rseh ied in der MDI-I-Akt iv i t~ t ; in den embryona l en Linsen war die MDt t -Akt iv i t i~ t u m 38 % gr61]er Ms in a l ten und jungen Linsen. Eine Sehadigung der Linsen dureh Bes t rah lung m i t 100 k r bl ieb bei allen Linsen ohne Einf lu~ auf die MDI-I-Aktiviti~t.

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Dr. W. PAULVS und Dr. 0. HOCKWIN, Bonn-Venusberg Universitats-Augenklinik