desde la sospecha clínica al hallazgo casual: evolución de...

Desde la Sospecha Clínica al Hallazgo Casual: Evolución de

los Estudios de Hemoglobinopatías

Teresa Villalba Hernández

Responsable de Hematología Catlab. Centre analítiques Terrassa

[email protected]

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2015

Hemoglobinopatías • 1925: TB Cooley. Primera descripción de talasemia Major en Detroit

(anemia eritroblástica o anemia de Cooley) – Anemia severa – Hepato-esplenomegalia – Discoloración de piel y esclera – Leucocitosis con presencia de eritroblastos – Aumento de huesos craneales y faciales – Congénita (luego se vió que hereditaria)

• A partir de ahí fuimos sabiendo cada vez mas cosas – Depósitos de hierro – Por su origen geográfico se le llamó thalassic anaemia, derivó en Talasemia – Pacientes de origen italiano incluidos progenitores de pacientes con talasemia major

con alteraciones características de hemograma. – Nuevas hemoglobinas con características definidas (HbS), Pauli et al, 1947 – Se aisló la HbA2, aumentada en pacientes con talasemia. – No en todos, al menos dos tipos de talasemia (Alfa y Beta) – Hb Bart’s, HbH: alfatalasemia, estudios moleculares


Tiene que ver con la hemoglobina, específicamente con las cadenas de la globina.

HbF: a2g2

HbA: a2b2

HbA2: a2d2


Hemoglobinopatías

Son las patologías monogénicas autosómicas recesivas (o codominantes) mas frecuentes.

• Alteración de síntesis de cadenas

– Déficit de síntesis: Talasemias, alfa y beta – Exceso de síntesis: Persistencia hereditaria de Hb fetal

• Alteraciones estructurales de las cadenas de globina – HbS, HbC, HbD…. – Drepanocitosis – Anemias hemolíticas – Policitemia – Cianosis

Puede haber cuadros compuestos o mixtos, diversos grados de severidad Importante distribución geográfica


Frecuencia alélica HbS


Beta talasemia major

• Inicio en la infancia (6m a 2años) – Anemia severa. RBC , VCM – Ausencia HbA. Predominio de HbF. Leve aumento de Hb A2

– Hepato-esplenomegalia – Aumento de huesos craneales y faciales – Congénita: autosómica recesiva – Tratamiento: transfusiones – Morbimortalidad: sobrecarga férrica, cardiopatía.

• Quelantes • Limitada expectativa de vida (mejora con control correcto)

– Años 90: trasplante alogénico de MO

Betatalasemia minor: Aumento de HbA2 (3.5-6%) – Clínica betatalasemia minor: leve anemia, asintomático.


The pathophysiology of beta thalassaemia [courtesy of Olivieri NF, The beta thalassaemias N Engl J Med. 1999]


Drepanocitosis

• Presencia de HbS en estado homocigoto. HbSS. Ausencia de HbA • Hemoglobina S polimeriza, deforma el hematíe, predispone a

oclusion vascular – Crisis vasooclusivas dolorosas – Anemia: cronica y/o cuadros agudos graves, hemólisis, secuestro

esplénico, litiasis biliar – Trombo-embolismos

• Síndrome torácico agudo • AVC: hemiparesias, afasia, convulsiones, microinfartos • Enfermedad ósea: osteopenia, osteonecrosis • Úlceras en EEII

– Complicaciones cardiacas : fallo cardiaco – Hipertensión Pulmonar – Infecciones – Enfermedad renal

• Desencadenantes: hipoxia, infecciones


Otras manifestaciones

• Hemoglobinas inestables: hemólisis

• Eritropoyesis ineficaz: hemólisis

• Poliglobulia

• Cianosis…


Hemoglobinopatías severas

• Betatalasemia Mayor • Hidrops fetalis por Hb Barts • Hb SS • Hb SC • Hb S/beta talasemia • Hb S/D Punjab • Hb S/O Arab • Hb S/E • Hb S/HPFH

Nota al margen: si no existe HbA normal NO PODREMOS determinar HbA1c!!!


Estudio clásico

Dirigido a unidad o laboratorio de hematología para estudio específico

– Anemias severas de inicio precoz

– Cuadros hemolíticos

– Anemias no explicadas

– Cianosis, poliglobulia

– Estudios familiares

– Consejo genético


Métodos diagnósticos

• Hemograma y morfología eritrocitaria • Electroforesis de Hb

– Alcalina – Ácida Seguidas de elución, o densitometría de las bandas

• Electroforesis capilar • Cromatografia de intercambio iónico • HPLC, primeros analizadores en 1982 • Isoelectroenfoque • Pruebas específicas: test de solubilidad, de

falciformación, de propanol para Hb inestables….


-Todos los índices de serie roja son importantes. En betatalasemia encontraremos -RBC: generalmente aumentado -Hb: normal o baja -Htº: normal o bajo -VCM: bajo, generalmente inferior a 75 fl -MCH: bajo, generalmente inferior a 27 pg -RDW: normal

-Descartar ferropenia -Morfología eritrocitaria: - microcitosis, ovalocitos, punteado basófilo grueso, dacriocitos, algún dianocito - células falciformes, hematíes en forma de nave, células irregularmente contraídas

Hemograma y morfología eritrocitaria Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2015

Métodos

PROS CONTRAS

Electroforesis Buena separación de bandas Cuantificación laboriosa poco exacta

Precisa técnica complementaria No es útil para A2

Electroforesis capilar Sensible Simple

Baja carga de trabajo

IEF (iso electroenfoque)

Buena separación

Baja carga de trabajo Dificultad de interpretación Equipo costoso No es útil para HbA2

HPLC Detecta y cuantifica fracciones de hemoglobinas Detecta picos anómalos en programas HbA1c Útil para cribado a gran escala

Precisa técnica complementaria


Electroforesis de hemoglobinas

Para una identificación presuntiva de una hemoglobina anómala - Alcalina: a ph 8.6 sobre acetato de celulosa. Variantes comunes de hemoglobina: - Hb S, C, D-Punjab, E, O Arab y Hb Lepore. - HbH y Hb Bart si el tiempo de procesado es el adecuado. - Tambien detecta otras variantes : J, N, Q, Hasharon… - Ácida: a ph 6.0 sobre gel de agarosa o gel de agar citratado. Método útil para distinguir bandas que presentaban dudas - Hb C, E, y O-Arab entre ellas -HbS de Hb D-Punjab.

Los patrones de migración son distintos según la matriz que se emplee.

HBAS

HBAC

HBAD

HBA normal

HBAS + del3.7kb aglob

HBAS en lactante

A F S/D

C/A2


Beta talasemia minor

HPLC HA-8160

-Modo talasemia: cuantifica HbA2 y F -En ambos modos (A1c y talasemia) detecta variantes -3 minutos/muestra modo HbA1c, 4.2 min/muestra modo talasemia.


HPLC HA-8180v

NORMAL -Rápido: 1.5 min/muestra -Detecta, identifica y cuantifica picos de HbS, C y D -Gráficas anómalas , sin resultado en otras variantes -Nueva versión HA-8180talasemia, 3.5 min/muestra


S SC

HEMOGLOBINA S

HBAS en lactante

A F S/D C/A2

HBAS HBAD

HBAS + del3.7kb aglob

normal


HEMOGLOBINA C

•Hemograma: leve microcitosis •Morfología: dianocitos •Heterozigoto: asintomático •Homozigoto: cuadro hemolítico moderado •Puede alterar resultado HbA1c (interferencia biológica) •Consejo genético: doble heterozigoto SC cuadro moderado

HBAC

HBA normal


Paciente 64 años

Ingresada en UCI por problema cardiaco Análisis de HbA1c por HPLC: no se obtiene resultado, patrón anómalo Electroforesis: migra en banda de HbF (discordante con HPLC) Envío a centro de referencia: secuenciación, nueva mutación


Mi experiencia

• Hematóloga

– Formación: área de anemias, técnicas especiales

• Trabajo en laboratorio de rutina, área hematología

– Hemogramas

– HbA2 y F: cromatografía en columna

– Electroforesis de hemoglobinas

– Estudios solicitados desde hematología clínica

• 2008: gran laboratorio, área de Hematología,

análisis de rutina del tubo EDTA: HbA1c

Por HPLC se pueden detectar portadores de hemoglobinopatías significativas!!!


Laboratorio: Catlab

• Localización en Barcelona, Vallés Occidental

• Área de influencia: un millón de personas

• Solicitudes hospitalarias, atención primaria

• 384096 Hemogramas /año

• 86982 determinacionesHbA1c/año

• Solicitud por médico de cabecera

– Hb A2 y F

– Electroforesis de hemoglobinas

– Estudio molecular de alfatalasemia


Resultados:

• Muchos resultados normales, sin alteraciones

• Confusión sobre prueba solicitada – solicitud de electroforesis para diagnóstico de talasemia,

– solicitud de HbA2 en lugar de HbA1c

– Solicitud de estudio de alfatalasemia como estudio inicial


Cambio de estrategia

• Valoración de microcitosis

– Utilizacion de sistema informático para bloqueo de validación.

Cut-off : VCM < 75 fl

– Añadir pruebas si se considera oportuno

• Parámetros del metabolismo del hierro

• Estudios por HPLC

• Electroforesis de hemoglobinas

• Estudio de alfatalasemia

– Iniciamos valoración de picos de Hb variante detectados al analizar HbA1c

– Anular pruebas solicitadas si no estaban justificadas


Decidimos comparar los resultados de nuestro trabajo en dos periodos:

- Noviembre de 2008 a Febrero de 2009

- Noviembre de 2009 a Febrero de 2010

Analizando - Nº de test realizados

- Solicitante

- Diagnósticos obtenidos

- Rendimiento de las técnicas


Comparativa resultados

154 126

39 19

39

34

13

0 0

50

100

150

200

250

Pacientesestudiados

HbA2 totales electroforesistotales

Alfatalasemia

PRIMER PERIODO

SOLIC FL SOLIC MC

NORMAL; 34

HBAS; 10

HBAC; 1

HBSS; 5 HBSC; 1 Hb

Lepore; 1

151

15 47 6 7 3

181

94 23 23 28 16 0

50

100

150

200

250

300

350

SEGUNDO PERIODO

SOLIC MC SOLIC FL

NORMAL; 9

HBAS; 11

HBAC; 4

HBAE; 1

HBSS diag; 1

HBSS control; 4


193

26

52

18 15 6

50

7

332

109

29 20

35 19

148

124

0

50

100

150

200

250

300

350

PRIMER PERIODO SEGUNDO PERIODO


Rendimiento diagnóstico

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

HPLC ELECTROF ALFA-TAL

13,47

34,62 40,00

32,83

68,97

54,29

% POSITIVOS 1P % POSITIVOS 2P


Hemograma: microcitosis morfología

Revisar datos históricos VCM y Parámetros férricos

Disminución reciente VCM

VCM bajo persistente sin

ferropenia

VCM bajo persistente con

ferropenia

EFHB

Estudio mtb hierro

Picos variantes

HbA2 y F por HPLC

Alterado

Diagnóstico Betatalasemia

HbA2 y F por HPLC

Estudio mtb hierro Estudio mtb hierro

HbA2 y F normales, sin variantes

Sin ferropenia

VCM bajo persistente

Añadir o recomendar estudio de alfatalasemia


Validación estudios de hemoglobinopatía

• Individualizada

• Revisar datos del hemograma actual, datos históricos, metabolismo del hierro y cromatogramas de cada caso

• Si existen picos variantes analizamos por los distintos programas (HbA1c, talasemia) y hacemos electroforesis

2010-2014 N

Determinaciones HPLC 3699

Beta talasemia minor 964

Beta talasemia major 1

Beta-delta talasemia 81

Hemoglobinopatías estructurales 426

Alfatalasemias 215


N

HbAS 253

HbSS 12

HbAC 113

HbCC 3

HbSC 2

Hemoglobinopatias estructurales

Electroforesis alcalina. N=426 N

HbAD 27

HbAJ 8

HbAE 3

HB Hope het 4

Hb Lepore het 6

Hb Lansing 2

HbS/beta talasemia 2

Hb Hafnia het 1

Hb Roane/Siriraj 1

Hb G Philadelphia het 1

Doble heterozigoto Hb G Philadelphia/HbS

2

Hb O Arab het 2

Hb Hope/Beta talasemia 1

Hb Arlington Park 1

Hb Variante alfa 1

Hb Vall d’Hebron 2

Hb pendiente de registrar 1

Enviadas a centro de referencia 71 Resultados 67 Normal 9 No aclarados 6


Estudios alfatalasemia: PCR + hibridación reversa

Mutación casos

Deleción 3.7 Kb homocigoto 94

Deleción 3.7 Kb heterocigoto 91

Doble del(--SEA) heterocigoto 5

Doble del(--SEA) homocigoto + mutación puntual en el codón 125 del

gen α2 (Hb Quong Sze) en hemicigosis. 1

Doble del.3.7Kb/4.2kb 5

Del. α2 IVS1 5nt heterocigoto 11

Del. 3.7Kb heterocigoto/del. α2polyA-1 hemicigoto 1

Del. 3.7Kb heterocigoto/del. α2 IVS1 hemicigoto 2

Doble del. 20.5Kb heterocigoto 1

Triplicación anti-3.7Kb 4

Wild type 154

Total 369


Rendimiento 2010-2014

Nº ESTUDIOS POS Rendimiento (%)

HPLC (Talasemias b y bd) 3699 1045 28,3

Hemoglobinopatias estructurales

498 426 85,5

a-talasemia 369 215 58,2

TOTAL 4566 1681 37,1


Cómo detectamos

• Talasemias

– Estudio pormenorizado de las microcitosis

– Añadido por facultativo de laboratorio

– Alfatalasemia: Añadido o sugerido desde laboratorio, estudio familiar

• Hemoglobinopatias estructurales

– Picos de Hb variantes por HPLC

– Si solicitan electroforesis hacer siempre HPLC, si cromatograma normal anulamos electroforesis.


¿Cuántas variantes detectamos de rutina??

• Periodo de 3 meses – 81361 hemogramas

– 18348 determinaciones HbA1c

– 50 variantes detectadas (la mayoria ya conocidas) • 36 Hb AS

• 8 Hb AC

• 2 Hb AD

• 1 Hb AE

• 1 Hb Lepore heterozigota

• 1 Hb Hope

• 1 Hb AJ


Informes de resultados

• Al analizar HbA1c informar de hallazgo de variante

• Resultado del estudio de variante: fenotipo compatible

• ¿Recomendar estudio familiar?

– En hemoglobinas que tengan trascendencia clínica: anemia, hemólisis, alteraciones de saturación de O2, interferencia HbA1c…

– En hemoglobinas que combinadas puedan dar lugar a cuadros severos

• ¿Recomendar consejo genético?

– En hemoglobinas que combinadas puedan dar lugar a cuadros severos


Conclusiones

• Tenemos a nuestra disposición en el laboratorio general unas muy buenas herramientas para el diagnóstico de hemoglobinopatías, solo hemos de usarlas

• La detección de portadores de hemoglobinopatía es importante para prevenir o para el diagnóstico precoz de enfermedades graves


desde la sospecha clínica al hallazgo casual: evolución de...

Documents