ctb biorreactores
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REACTORESTRANSCRIPT
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BiotecnologBiotecnologa Industriala Industrial
ProducciProduccin industrial de Metabolitosn industrial de Metabolitos
BiorreactoresBiorreactores
CONCEPTOS y TECNICAS deCONCEPTOS y TECNICAS de
BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
((FCEyNFCEyN UBA )UBA )
Miryan CassanelloPINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: [email protected]
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Estadstica: ao 2002(Fuente: Kent y Riegel, 2007)
Relevancia econmica de losproductos generados industrialmente
mediante procesos biotecnolgicos
ProductosProductosbiotecnolbiotecnolgicosgicos:: estn en todos los sectores de la
drogas (genricasy no-genricas)
productos de
bellezaprocesamiento dealimentos parahumanos y
animalesprocesamientotextil y artculosde limpieza
aplicacionesindustriales:
produccin masivade alcohol
suplementosnutricionales
vida diaria:
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Productos Organismo tpico utilizado Mercado
mundial(ton/ao)
Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones
Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum 2.000
cidosorgnicos
Acido ctrico Aspergillus niger 230.000
Acido glucnico Aspergillus niger 50.000
Acido lctico Lactobacillus delbrueckii 20.000
Aminocidos Acido L-glutmico Corynebacterium glutamicum 300.000
L-lisina Brevibacterium flavum 30.000
L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2.000
L-arginina Brevibacterium flavum 2.000Antibiticos Penicilinas Penicillium chrysogenum 40.000
Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000
Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 10.000
Productos obtenidos mediante procesos biotecnolProductos obtenidos mediante procesos biotecnolgicosgicos
(Fuente: Doran, 1995)(Fuente: Doran, 1995)
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Producto Organismo tpico utilizado Mercado mundial
(ton/ao)Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600
-Amilasa Bacillus amyloliquefaciens 400
Glucoamilasa Aspergillus niger 400
Glucosa isomerasaBacillus coagulans 100
Pectinasa Aspergillus niger 10
Polmeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000
Dextrano Leuconostoc mesenteroides 200Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10
Vacunas Difteria Corynebacterium diphterie < 50 kg/ao
Ttanos Clostridium tetani Pequea
Protenasteraputicas
Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/ao
Interfern-2 Escherichia coli recombinante 10
Hormona de
crecimiento
Escherichia coli recombinante o
clulas recombinantes de
mamferos
Pequea
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BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
BiotecnologBiotecnologaa
ROJAROJA
BiotecnologBiotecnologaa
BLANCABLANCA
BiotecnologBiotecnologaa
VERDEVERDE
BiotecnologBiotecnologaa
AZULAZUL
Biotecnologa BLANCA (o industrial):Aplicacin en la industria en general,
productos qumicos, nuevos materiales,biocombustibles, etc.
Biotecnologa VERDE:Aplicacin en agro-alimentos
Biotecnologa AZUL:Aplicacin enorganismos marinosBiotecnologa ROJA:
Aplicacin en medicina
IngenierIngenieraa QuQumicamica
QuQumicamica
BiologBiologaa
BioquBioqumicamica
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BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
INDUSTRIALINDUSTRIAL
Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la
aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al
procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer
bienes y servicios. (Definicin de la OECD)
Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y
enzimas.Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas,
productos medicinales, etc.
Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin deaguas y tratamiento de efluentes.
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Bibliografa libros de texto
Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, FikretKargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002.
Kent and Riegels Handbook of Industrial Chemistry and
Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial
Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A.Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007.
Principios de Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran,
Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998)Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F.
Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986.
Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour,Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452
Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen,
Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496;
ISBN-13: 978-0306473494
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Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrialXu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical
proteins with plant cell suspension cultures.Biotechnology Advances 29 (2011)278299
Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaeA review of technologies for
production, processing, and extractions of biofuels and co-products.Renewable and
Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant
protein production in plant cell suspension cultures.Biochemical Engineering
Journal 45 (2009) 168184
Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: aconcept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636643Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies:
Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155160
Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya sustainable alternative for chemical
industry. Research review paper.Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the
production of biopharmaceuticals.Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283291Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells.Appl Microbiol Biotechnol, 59
(2002) 135142
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Objetivo de la
produccin
industrial de
clulas o de
microorganismos
Producir las mismas clulas omicroorganismos (biomasa) en
gran escala
Producir en gran escala
compuestos (intracelulares o
extracelulares) resultantes del
crecimiento celular
(metabolitos)
Metabolitos
Primarios
Metabolitos
Secundarios
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Metabolitos primariosMetabolitos primarios
-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminosmetablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos.
-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de
actividad biolgica y frecuentemente son commodities
1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos:
protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y
polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa,ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico,
ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes
(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys,Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos
saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y
polisteres de reserva.
Microorganismos productores:bacterias, levaduras y hongos
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Metabolitos secundariosMetabolitos secundarios
-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicosno-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en
situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la
especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en
condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de
producir alto contenido de actividad biolgica
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionanen los organismos que los producen como:
1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas,
inhibidores enzimticos, pesticidas)2. Factores de crecimiento (hormonas)
3. Ionforos
4. Agentes de interaccin microbiana
5. Efectores externos
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PROCESOS BIOTECNOLOGICOS oPROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONESFERMENTACIONES
Biorreactoro
Fermentador
Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales
se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)
en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este finmicroorganismos, clulas o enzimas.
Operacionesunitarias
Operacionesunitarias
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Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:
1)Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo
congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de
una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen
del medio de cultivo.
Esterilizacin
Preparacin de
medios
FermentacinSeparacin
Purificacin
Propagacin
de los cultivos
2)Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se
siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de la escala
industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).
Tratamiento
de efluentes
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3)Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de
clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin osedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin,
adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquido-
lquido, extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de
afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto.
Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:
Esterilizacin
Preparacin demedios
FermentacinSeparacin
Purificacin
Tratamiento
de efluentes
Propagacin
de los cultivos
4)No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el
medio.
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SelecciSeleccin (n (screeningscreening))
En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin
prdida de sus caractersticas.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y
de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.
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Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera
gentica para crear diversidad.
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PreparaciPreparacin de medios de cultivon de medios de cultivoEsterilizaciEsterilizacinn
Los componentes de los medios de cultivo son los efectoresexternos de naturaleza qumica que deben cumplir con los
requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y
suministrar energa para el mantenimiento celular.
Componentes de un medio de cultivo:
1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes
de C, N, S, P, K y Mg
2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales
de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o g/L
3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos
que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica
especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas,
algunos aminocidos, etc.)
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PreparaciPreparacin de medios de cultivon de medios de cultivoEsterilizaciEsterilizacinn
Los medios pueden clasificarse considerando la naturalezaqumica de los componentes en:
1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos
2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen
sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de
levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.) que aportan
las sustancias fundamentales pero son qumicamenteindefinidas y de composicin variable.
Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente
a ponerse en contacto con el inculo.Esterilizar significa eliminartoda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva
a cabo por filtracin o calentamiento.
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SeparaciSeparacin y purificacin y purificacin (n (downstreamdownstream)): depende de la
eficiencia del proceso y del producto a obtener
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Cintica de crecimiento de biomasa
Definiciones
Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan
Cuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin
de Monod
Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato
FermentacionesFermentaciones --fermentadores ofermentadores obiorreactoresbiorreactores
Es el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posterioresetapas de separacin y purificacin.
Fermentaciones
Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del
crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la
velocidad de formacin de los productos deseados.
discontinuas o batch
semicontinuas (fed-batch)
continuas
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CinCintica de crecimiento microbianotica de crecimiento microbiano
nXPXS ++
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin auto-cataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la
concentracin de clulas.
biomasade
cantidadmayor
aresextracelul
productosbiomasaustratoS ++
aumento en el nmero de clulas
aumento del tamao de las clulasCrecimiento
dtdX
X1
netaX: concentracin msica de clulas (g/L)
t: tiempo (h)
Velocidad especfica neta decrecimiento (h-1):
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La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la
velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa
por muerte celular o por metabolismo endgeno:
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la
concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin
msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefierela concentracin msica.
Formas de medir la concentracin de clulas
Directos
IndirectosMtodos
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuestarpida.
dgnetak=
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DeterminaciDeterminacin de la concentracin de la concentracin mn msica de csica de clulas:lulas:
Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin):Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)
Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar
Absorcin de luz por clulas en suspensin
Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la
velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto.
Productos: etanol, CO2Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N
Propiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH
Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masade clulas.
UZLOATPuciferinalluciferasa
2 ++
Sensible
> 10-12 gATP/L
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CinCintica de crecimiento de un cultivo entica de crecimiento de un cultivo enbatchbatch
Etapas:Etapas:
1) de latencia o
induccin
2) de crecimientoexponencial
3) de desacelera-
cin
4) estacionario
5) de muerte odeclinacin
celular
1)1)LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende del inculo(edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ.
2)2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulascrecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3)3)DesaceleraciDesaceleracin:n:por consumo de un nutriente esencial o generacin desubproductos txicoscrecimiento desbalanceado, las clulas deben
readaptarse a las condiciones hostiles.
4)4)Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son
activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos,hormonas) productos de la desregulacin celular
5)5)Muerte:Muerte:baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la
etapa anterior.
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1)1)LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende del
inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptarex-situ.
2)2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulascrecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3)3)DesaceleraciDesaceleracin:n:por consumo de un nutriente esencial ogeneracin de subproductos txicoscrecimiento
desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4)4)Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas anson activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.
antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular
5)5)Muerte:Muerte:baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite conla etapa anterior.
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t
0netanetag
netaeXXdtX
dX
dt
dX
X
1 ===
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas
crecen con la misma velocidad
la composicin media de lasmismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimientoetapa de crecimiento
exponencialexponencial.
En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los
nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.
netad0
)2ln(X2X
==
Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
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Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no
crecen con la misma velocidad
la composicin media se modifica.Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionariaetapa estacionaria
El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de
subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil
induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevascondiciones.
dgnetagk=
Puede ocurrir:La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el
nmero de clulas viables.
X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo
de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertasconstituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).
X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin
celular produciendo metabolitos secundarios.
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Coeficiente de mantenimientoCoeficiente de mantenimiento:: se emplea para definir la velocidad
especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.
mdtSd
X1-m =
EnergEnerga de mantenimientoa de mantenimiento:: necesaria
para mantener la membrana celular activa
y el transporte de nutrientes, y parafunciones metablicas esenciales como la
movilidad y la reparacin de estructuras
daadas.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de
masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).
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Otras definiciones: Coeficientes de rendimientoOtras definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base
a la cantidad consumida de otro componente.
Rendimiento de formacin de clulas por masa
de sustrato consumida (g clulas/g S)
YX/S es un valor constante en la etapa de
crecimiento exponencial.Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser
constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea
para otros fines:
tenimiento-manpara
energia
cimiento-crepara
energiaproductosde
formacionbiomasade
formacionSSSSS +++=
Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:
S
PY;
DO
XY
P/SOX 2
=
=
/
S
XY
S/X =
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g/g4,19,0Y;g/g6,04,0Y2X/OS/X
==
Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en glucosa;
para la mayora de las bacterias y levaduras:
(en condiciones anaerbicas suelen ser menores)
Los rendimientosdependen del medio
y de la fuente de C.
Para la mayora delos casos:
=
consumidoCdegbiomasag
g/g4,01YS/X
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(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde
la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.
RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del crecimiento de biomasa con la formacin den de
productos:productos:
gX/PPY
dt
dP
X
1q ==Definimos la velocidadespecfica de formacinde producto, qP
X/PgP
Yq ==
+= gP
q
Se encuentran 3 situaciones:
(a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una
enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).
(b) qPparcialmente asociada (etapa de desaceleracin y
estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos
metabolitos secundarios.
0;tetanconsq gP ===
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RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del crecimiento de biomasa con la formacin den de
productos:productos:
dt
dX
X
1YY
dt
dP
X
1q
X/PgX/PP ===
gPq = +=
gPq =
Pq
Asociada Parcialmente asociada No asociada
Metabolitos primarios Metabolitos secundarios
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Factores que influyenFactores que influyen Temperatura del medioTemperatura del medio
-psicrfilos (Top < 20C)
-mesfilos (20
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Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero
de clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la decrecimiento.
Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con
Ea 1020 kcal/mol Ed 6080 kcal/mol
La muerte celular es ms sensible a T que el crecimiento(importante para la esterilizacin)
La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero
la Top
y la Ea
suelen ser distintas.
Tambin influye sobre el YX/Sporque para T>Top, la energa de
mantenimiento es mayorbaja YX/S
Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.
)/exp(' RTEA ag = )/exp( RTEAk ddd =
Factores que influyenFactores que influyen pHpH del mediodel medio
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Factores que influyenFactores que influyenpHpHdel mediodel medio
Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un
pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puedeincrementar el rango adaptando las clulas por incrementos pequeos.
Rango de
pH ptimo
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El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formacin de producto.
Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo.
El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 6- hongos: 3 7
- clulas vegetales: 5 6
- clulas animales: 6,5 7,5Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de
mantenimiento.
El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,aminocidos, CO2)
Factores que influyenFactores que influyen concentraciconcentracin de On de O disuelto (DO):disuelto (DO):
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Factores que influyenFactores que influyenconcentraciconcentracin de On de O22disuelto (DO):disuelto (DO):
Es un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas.
Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de
la velocidad de crecimiento.
La solubilidad del oxgeno en agua depende de la presin, de la
temperatura y de las sales disueltas (a presin atmosfrica es 7ppm).
La concentracin crtica de oxgeno
disuelto CO2,critica es aquella por debajo
de la cual comienza a controlar lavelocidad de crecimiento:
510% de la concentracin de
saturacin para bacterias y levaduras y
1050% de la concentracinde saturacin para hongos (segn
el tamao)
Transporte de oxgeno a las clulas
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Transporte de oxgeno a las clulas
El O2 se
introduce por
burbujeo y su
concentracin
depende de la
agitacin.
=
bO*OLGL
22
CCakOTR
Velocidad de consumo
de oxgeno (OUR):2
2O/X
g
O Y
X
XqOUR
==
Velocidad detransferencia:
-
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Factores que influyenFactores que influyenotros factoresotros factores
Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta relacionado
con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones de otros iones.Potencial de reduccin del medio:
Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de nitrgeno) o
por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S, HCl).
Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas
clulas y necesaria para otras.
Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.
Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el
interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la carga de los iones
en el medio:
( ) ( )+
++= HP060EmVE 2O0 loglog,
=i
2ii
2
1 ZcFI
G iG i d l i i t i bid l i i t i bi
-
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GeneraciGeneracin de calor por crecimiento microbianon de calor por crecimiento microbiano
4050% de la energa suministrada por las fuentes de C se
convierten en ATP (forma en que las clulas acumulan energa)
el resto se libera como calor.
El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpas de
combustin del sustrato y de la biomasa formada:celulasOHCO
22 ++
Ciclo entlpico
para calcular elcalor generado
Combustin de
las clulasHc (kJ/g)
Crecimiento
microbiano yrespiracin1/YH (kJ/g clula)
OHCOOSustrato22
)g/kJ(Hsustrato,
delcombustion
2S + +
cS/XS
S/XH
Hc
S/X
S
HYH
YY
Y
1H
Y
H
=+=
-
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Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulasYH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)
0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad de
calor que evoluciona por el metabolismo de las clulas.
Para clulas en crecimiento activo, el requerimiento para
mantenimiento es bajola evolucin de calor est directamente
relacionada con el crecimiento.
Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch se
calcula considerando la velocidad de crecimiento.
En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de
consumo de oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.
VY
1XQ
H
netagenerado =
2Ogenerado Q12,0Q =
Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa
-
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Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa
(b) serpentn externo (c) serpentn interno helicoidal (d) serpentn
interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo
-
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ReactorReactorbatchbatchdede
escala laboratorioescala laboratorio
-
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ReactorReactorbatchbatchdede
escala industrialescala industrial
EstequiometrEstequiometraa del crecimiento microbiano y formacidel crecimiento microbiano y formacin den de
-
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EstequiometrEstequiometraadel crecimiento microbiano y formacidel crecimiento microbiano y formacin den de
productosproductos Procesos complejosreflejan el transcurso de milesde reacciones intracelulares.
Es importante poder comparar el rendimiento y la generacin de calor
que se obtiene empleando distintos sustratos la estequiometra de
conversin de sustratos a biomasa y a productos extracelulares sesuele representar por ecuaciones pseudoqumicas simples.
22
32nm COeOHdNOCHcNHbOaOCH ++++
CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato
CHON representa un mol del material celular
La composicin del material celular depende del tipo de
organismo. Un mol de material biolgico es aquel que
contiene un tomogramo de C
Por que una frmula mnima escrita como: CH O N ?
-
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Composicin elemental de la bacteriaEscherichia coli
Elemento % en masa seca
C 50
O 20
N 14
H 8
P 3
S 1K 1
Na 1
Ca 0.5
Mg 0.5
Cl 0.5
Fe 0.2
Otros 0.3
92% de la masa seca
total esta formado porC, O, N, H
Componentes minoritarios
no se tienen en cuenta en la
frmula mnima
Por que una frmula mnima escrita como: CHaObNd ?
Los coeficientes estequiomtricos y la frmula mnima se calculan
-
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Balanceselementales:
22
32nmCOeOHdNOCHcNHbOaOCH ++++
=++=+ +=+
+=
c3b:N2edc2an:O 2dc3bm:H
ec1:C
Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2producidos por mol de
O2 consumido provee una indicacin del estado metablico y puedeemplearse para controlar el proceso.
a
e
consumidosOmoles
generadosCOmolesRQ
2
2 ==
Los balances para H y O pueden no dar informacin correcta por la
gran masa de agua que tienen las clulasse requiere informacin
adicional.
planteando balances elementales, la informacin del cociente
respiratorio y un balance de electrones disponibles.
-
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Para las reacciones mas complejas, con formacin de productosextracelulares, se agregan componentes hay un coeficiente
estequiomtrico ms y se requiere mayor informacin.
Adems, los balances elementales no se relacionan con los
cambios de energa involucrados en la reaccin.
se desarroll el concepto degrado de reduccin, ,para poder
plantear balances de electrones y protones en bioreacciones.
Balance de electrones disponibles:
Grado de reduccin: nmero de equivalentes de electrones
disponibles por tomo-gramo de C. Los electrones disponibles son
aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.
= productos,i iisustratos,i ii
reducciondegrados:;costriestequiome.coef: ii
CiCi ti d i i t i bi M d lti d i i t i bi M d l
-
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CinCintica de crecimiento microbiano: Modelostica de crecimiento microbiano: Modelos
nXPXS ++ ( )
dt
dX
X
1k
dgneta
biomasade
cantidadmayorproductosbiomasaustrato ++aresextracelul
S
X: concentracin msica de clulas (g/L)
t: tiempo (h)
neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1)g: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h-1)
kd: constante de muerte celular o disminucin de masa celular pormetabolismo endgeno (h-1)
CuantificaciCuantificacin de la cinn de la cintica de crecimiento: modelos cintica de crecimiento: modelos cinticosticos
-
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ff
Descripcin detallada debera involucrar diferenciaciones en la
estructura de la clula y la segregacin del medio de cultivo en
unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades
fsico-qumicas modelos estructurados-segregados
Modelos Estructurados Tienden a representar la estructura de las
clulas. Pueden dividir la clula en sus componentes y considerar las
reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona
de la clula, como respuesta a cambios en el medio.
Modelos Segregados Tienen en cuenta que el medio no es
homogneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y
de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del
medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten
considerar la posibilidad de agregacin de clulas.
AD
-
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El grado de realismo y complejidad de un modelodepende deldepende del
objetivoobjetivo se debe elegir el modelo ms simple capaz de
representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.
No estructurados
No segregados
Estructurados
No segregados
No estructurados
Segregados
Estructurados
Segregados
MAY
ORCOMPLEJIDA
MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD
Son ms
realistas, peroson complejos y
demandantes de
tiempo de
clculo.
Nos restringimos a los modelos No estructurados/No segregados
-
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Modelos No-Estructurados Suponen una composicin fija de
la clula (equivalente a suponer crecimiento balanceado).
-Son estrictamente vlidos para la etapa de crecimiento
exponencial en batch
-No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la
clula sea rpida y/o las perturbaciones sean leves.
Modelos No-Segregados Consideran un medio homogneo.
-Representan adecuadamente muchos casos.
Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados
Modelos cinModelos cinticos de crecimiento: controlados por sustratoticos de crecimiento: controlados por sustrato
-
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S (M)
g(h-1
)
Modelos cinModelos cinticos de crecimiento: controlados por sustratoticos de crecimiento: controlados por sustrato
Suponen que la cintica depende solamente de un nico sustratoesencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no
afectan. Ms difundido Modelo deModelo deMonodMonod
Supone que unSupone que un
nico sistemanico sistema
enzimenzimtico controla el consumo detico controla el consumo de
sustrato y que dicho sistemasustrato y que dicho sistema
determina la velocidad dedetermina la velocidad de
crecimiento de biomasacrecimiento de biomasa.
La premisa es generalmente falsa,
pero la ecuacin de Monod ajusta
una amplia gama de resultadosexperimentales y es la expresin
ms empleada para el diseo de
fermentadores.
SK
S
s
mg +
=
-
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S (M)
g(h-1
)
SK
S
sm
g +=
m: mxima velocidad especficade crecimiento de biomasa
smgKScuando >>=
Ks: constante de saturacin o develocidad media
sm21
gKScuando ==
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de
crecimiento y baja densidad de clulas.
Para cultivos concentrados se usan expresiones similares,modificando Ks:
SSK
S
0S
mg
0
+=
SSKK
So
0ss
mg
01 ++
=
Nociones de diseNociones de diseo de fermentadores oo de fermentadores obiorreactoresbiorreactores
-
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La eleccin del tipo de reactor y de la estrategia de operacin define
la produccin a obtener y la pureza del producto (nmero y tipo de
impurezas, reactivos sin convertir). Tambin determina si se puede
lograr un producto de calidad constante y una operacin confiable.
En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comnmente empleados
Discontinuos o batch: una vez que se carga, el procesoocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.
Continuos (quimiostato): hay alimentacion
continua de sustrato y retiro continuo de productosSemicontinuos (Fed-batch): hay ingreso
continuo o intermitente de sustratos, sin
retiro de productos.
Reactores discontinuos o batch
-
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Produccin de biomasa o de un producto asociado a crecimiento
(metabolito primario):
En un batch se observan 4 etapas:1) Preparacin para la nueva operacin (limpieza, esterilizacin,
llenado del reactor)2) Sembrado y perodo de induccin
3) Perodo de crecimiento exponencial
4) Recuperacin del producto del reactor
La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo
muerto, tm, a considerar en el diseo del reactor
vara con el tamao del reactor y con el tipo de fermentacin pero
generalmente es del orden de las horas (310 hs)tiempo total de operacin para llegar a una concentracin final de
biomasa Xf:
+=
0f
netamc X
X1tt ln
La concentracin final de biomasa, Xf, depende de la cantidad de
-
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sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:
( )SSYXX0S/X0f
=
La mayora de las fermentaciones operan con una relacin Xf
/X0
de
aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de biomasa
por operacin del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa
total que podemos formar por el tiempo que lleva la operacin:
( ) ( )m0fneta
0SXb tXX1
SYr
+=
ln//
Una operacin en un quimiostato en condiciones ptimas conduce
a una produccin significativamente superior.De todos modos, laDe todos modos, la
mayormayora de las fermentaciones son procesos discontinuosa de las fermentaciones son procesos discontinuos..
sm
kg
3
3m
kg
Por qu?
-
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En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;
el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la produccindel producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera
solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo de la
que lleva a la ptima productividad de biomasa.ParaParaproducciproduccin de metabolitos secundarios, la productividadn de metabolitos secundarios, la productividad
en unen un batchbatchpuede superar significativamente a la de unpuede superar significativamente a la de un
quimiostatoquimiostato..
Otra razn importante para que se prefiera la operacin
discontinua es la inestabilidad gentica. Los microorganismos que
se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen
menor velocidad de crecimiento que las originales.UnUn quimiostatoquimiostato impone una selecciimpone una seleccin severa cuando hayn severa cuando hay
mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidadmezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad
de crecimiento.de crecimiento.
Por qu?
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Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad
de la operacin. Los reactores batch conducen a productos conmucha variabilidadgenera problemas en las etapas de
purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla
mecnica o de control de alguna variable de operacin o de laesterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operaciLas consecuencias de una falla de operacin son mas gravesn son mas graves
en un sistema continuo y las pen un sistema continuo y las prdidas mayores.rdidas mayores.
La economa de mercado influye en la seleccin del reactor. Un
sistema continuo es un sistema dedicado a un dado procesoun
nico producto.
Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeMuchos productos de fermentaciones se requieren en pequeasascantidades y su demanda es difcantidades y su demanda es difcil de proyectar. Los sistemascil de proyectar. Los sistemas
batchbatch son mson ms verss verstiles, el mismo reactor puede emplearsetiles, el mismo reactor puede emplearse
para distintos productos.para distintos productos.
Cultivos continuosCultivos continuos se agrega un medio con nutrientes frescos en
forma continua a un volumen de control que contiene las clulas
-
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forma continua, a un volumen de control que contiene las clulas.
Se retiran continuamente productos y parte de las clulas.-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen
constantes en un dado punto del reactor.
-Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para
el crecimiento de las clulas y para la formacin de productoscalidadcalidad uniforme de los productosuniforme de los productos
-Pueden ser una herramienta importante para determinar como un
microorganismo responde al medio, y para generar un producto encondiciones ptimas.
Sistemas paralograr cultivos
continuos
Quimiostato
Turbidistato
Flujo Pistn Ideal (FPI):mezclado radialmezclado radial
perfecto y mezclado axial nuloperfecto y mezclado axial nulo; poco
empleado, salvo para inmovilizados
Sistemas conmezcladomezcladoperfectoperfecto: Tanques
continuos idealmenteagitados (TCIA)
Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controladot i t i l l t L
-
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por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las
condiciones qumicas del medio son constantes.
Turbidistato: la concentracin de clulas en el reactor se mantieneconstante La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la
-
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constante. La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la
densidad ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando laturbidez supera un lmite prefijado. El volumen se mantiene constante
retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega.
Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y porque el
medio cambia.
Puede ser muy til
para seleccionar
subpoblaciones quepuedan soportar
condiciones de
stress, porque la
concentracin de
clulas se mantiene
constante.
FPI (Flujo Pistn Ideal):
-
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como no hay retromezclado,
los elementos de fluido con
clulas activas no pueden
inocular elementos de fluido
nuevos aguas arribase requiere el reciclo
continuo de clulas para
inoculacin continua del
medio fresco alimentado.
Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posicin en el
reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.
Equipos con clulas inmovilizadas (trickling filters) se asemejan
a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en
tratamiento de efluentes.
L(+G,S)
L(+G,S)
Fotobiorreactor tubular helicoidal de
1000 L (Murdoch University Australia)
-
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1000 L (Murdoch University, Australia)
Recuperacin de microalgas a partirdel medio de cultivo por filtracin
Cyanotech Corporation
(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.
Cultivos continuos: Quimiostato ideal
Es un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA)
-
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Es un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA)
del medio de cultivo. La mayora requiere control (pH, T y CO2).Se alimenta medio estril (X0= 0) a un tanque perfectamente
agitado (y aireado si es fermentacin aerbica). Se deja salir la
suspensin de clulas para mantener las concentraciones y el
volumen de lquido constante.
Burbujeo
de gas
Fv
S0, X0, P0
Fv
S, X, P
Volumen de lquido =
volumen de reactor = V
Las concentraciones a la
salida del reactor son
iguales a las del interior
por la hiptesis demezclado perfecto
Balances de masa Ecuaciones de diseo
Planteando balances de masa para los distintos componentes se
-
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Planteando balances de masa para los distintos componentes, se
obtienen las ecuaciones de diseo.
=
+
V.C. deldentro
acumuladaMasa
V.C. deldentro
generadaMasa
V.C. deldentro
consumidaMasa
reactivos loscon
VCalentraqueMasa
productosloscon
VCdelsalequeMasa
Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO
Un quimiostato opera en estado estacionario se cancela el trmino
de acumulacin de masa:
+
=
+
V.C.deldentro
generadaMasa
reactivoslosconV.C.alentraqueMasa
V.C.deldentroconsumidaMasa
productoslosconV.C.delsalequeMasa
Quimiostato - ecuaciones de diseo
generadaMasa
V ClentraqueMasa
consumidaMasaV Cd l
salequeMasa
-
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Gas
Fv
S0, X0, P0Fv
S, X, P
V
Balance de masa de clulas:
+
=
+
V.C.deldentro
generadaMasa
reactivoslos
conV.C.al
V.C.deldentro
consumidaMasa
productoslos
conV.C.del
XVXFXFneta0VV
+=
XkVXFXFdg0VV
+=
Definiendo el factor de dilucin como caudal/volumen: D = FV/V
XkDXDXdg0 += Si se alimenta medio estril (X0= 0) yel mecanismo endgeno es despreciable
XkDXDXdg0
+= g
D =
FV: caudal volumtrico de mediode cultivo agregado (L/h)
Importancia de este resultado: En un quimiostato enEE, alimentado con medio estril y en condicionesD =
-
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, y
en las que el metabolismo endgeno es despreciable,la velocidad o factor de dilucin, D, iguala a lavelocidad de crecimiento de clulas
se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parmetro
independiente modificando las variables de operacin
el quimiostato es una herramienta experimental poderosa
Si la velocidad de crecimiento sigue la expresin de Monod
SK
SD
s
m
g +==
S: concentracin de sustrato limitante
del crecimiento de biomasa en EE
Si se impone un factor de dilucin D > m , las clulas no se podrnreproducir lo suficientemente rpido para mantenerse se lavan, o
se vaca el quimiostato (washout)
g
D=
BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endgeno):
-
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FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)S: concentracin de sustrato limitante del crecimiento (g/L)
V: volumen del reactor (L)
g: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h)X: concentracin de biomasa (g/L)qP (gP/gclulas/h): velocidad especfica de productos extracelulares
YMX/S (g clulas/gS) : mximo rendimiento de biomasa a partir de S
YP/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S
0VS/P
PMS/X
gV SFY
1
XVqY
1
XVSF =++
+
=
+
V.C.deldentrogeneradaMasa
reactivoslosconV.C.al entraqueMasa
V.C.deldentroconsumidaMasa
productoslosconV.C.del salequeMasa
Formacin de biomasa Formacin de producto
Concentracin msica de clulas en estas condiciones (EE y sinmetabolismo endgeno):
-
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g )
( ) YqXYXSSDS/P
PM
S/X
g0 +=
Como ademsg
= D , si la formacin deproductos extracelulares es despreciable: SSYX 0MS/X =
Estrictamente, depende de la concentracin de sustrato y de la
velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0
M
S/XY
La productividad en un fermentador continuo se
obtiene como el producto del factor de dilucin por laconcentracin de clulas, DX (g/Lh)
Productividad en un quimiostato, suponiendo vlida Monod(EE sinmetabolismo endgeno ni formacin de productos extracelulares): se obtiene del
-
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producto del factor de dilucin por la concentracin de clulas, DX (g/Lh):
La velocidad de dilucin que maximiza la produccin de biomasa se obtienede derivar DX con respecto a D e igualar a cero:
+=
0s
s
m)X(op SK
K1D
Es muy difcil lograr una operacin estable para D m. Generalmente, seusa un valor de D algo menor que Dop(X) como solucin de compromiso
para mejorar la estabilidad con buena productividad.
Normalmente Ks
-
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)
=
opm
sop
0op
M
S/Xop D
KDSDYDX
de biomasa DX:
Se obtiene la mxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en
un quimiostato en EE, sin metabolismo endgeno y sin formacin de
productos extracelulares:
) ( )( )0sss0
0s
s
m
M
S/XopSKKKS
SK
K1YDX ++
+
=
Normalmente Ks
-
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0.12 0.013 0.4340.24 0.033 0.417
0.31 0.04 0.438
0.43 0.064 0.422
0.53 0.102 0.427
0.6 0.122 0.434
0.66 0.153 0.422
0.69 0.17 0.43
0.71 0.221 0.39
0.73 0.21 0.352
0
0.1
0.2
0.3
0 0.2 0.4 0.6 0.8
DX
(kg/h.m3
)
D (h-1
)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.8
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
X (kg/m3)
S (kg/m3)
D (h-1)
0S
m
Algunas aplicaciones de lossistemas continuos:
- produccin de algunas protenas
-
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p g p
- tratamiento de efluentes, en particular cuando se empleanmicroorganismos o enzimas inmovilizadas.
- produccin de etanol
- produccin de productos asociados a crecimiento,
especialmente en gran escala (por ejemplo, cido
lctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en
bioprocesos
Quimiostato con reciclo
La generacin de biomasa es autocatalitica mayor
concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad decrecimiento.
Para lograr en un quimiostato una concentracin de biomasa
mayor, se pueden reingresar al reactor las clulas que salen.
Quimiostato con reciclo: el reciclo de clulas incrementa la
productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado
-
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productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado
que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes,
muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentacin).
Gas
Fv
S0,X0,P0
Fv
S1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
Separador de clulas: puede ser
por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin
: relacin de reciclobasada en caudalesvolumtricos.
c: factor de concentracinrelacin de la
concentracin declulas en la corriente
de reciclo sobre la que
sale del reactor
Balances de biomasa :
MasaMasaMasaqueMasaqueMasa
-
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=
+
V.C.deldentro
acumuladaMasa
V.C.deldentro
generadaMasa
V.C.deldentro
consumidaMasa
reactivosloscon
VCalentraqueMasa
productosloscon
VCdelsalequeMasa
Gas
Fv
S0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
Fv
S1,cX1,P1
( ) 0XVcXFXFXF1 1neta1V0V1V =++ fresca reciclo
En EE: dX1/dt = 0y si se alimenta medio
estril X0=0
( ) 1V1V1neta cXFXF1XV +=( )c1D
neta +=
Fv
S0,X0,P0Fv(1+)
FvS1,cX1,P1
[ ])c1(1Dneta
+=
-
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77/136
Gas
Fv
S1,X2,P1V
( )
S1,X1,P1
1 1 1
Como c > 1 (1-c) < 0
Dneta
-
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( )1V0V
S/P
1PM
S/X
1g1VSFSF
Y1XVq
Y1XVSF1 +=+++
( ) ( ) 1V10VMS/X1g SF1SSFY
1
XV ++=
( )10
M
S/Xg
1
SSYD
X =
[ ])c1(1D0kSinetagd
+=== (
( )c-11
SSYX 10
M
S/X
1 +
=
La concentracin de clulas en un quimiostato en EE con reciclo se
incrementa por el factor 1/[1+(1-c)]
Si es vlida Monod
y para kd=0 [ ] +==+
=
)c1(1DSK
S
neta
s
m
g
-
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( )[ ]( )[ ]Dc-11
Dc-11KS
m
s
++=
( )[ ]( )[ ]
( )[ ]
++
+=
Dc-11Dc-11KS
c-11
YX
m
s
0
MS/X
1
sin reciclo
con reciclo
X1,sr
Velocidad deVelocidad degeneracigeneracin den de
biomasabiomasa
c = 2 ; = 0.5
Gas
FvS0,X0,P0
Fv
S1,X2,P1
V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1X1,cr
Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para laproduccin de metabolitos secundarios (ej.:
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un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento debiomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones
ptimas son diferentes
con mcon mltiplesltiples quimiostatosquimiostatos, se pueden fijar condiciones, se pueden fijar condiciones
distintas en cada uno:distintas en cada uno:pHpH, temperatura,, temperatura, concconc. de nutrientes. de nutrientes
por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:
-Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa-Un segundo tanque donde se promueva la formacin de producto(*)
(*) el crecimiento ser desbalanceado y un modelo no-estructurado
no es el ms apropiado. Los resultados sern aproximados.
Fv,S0,X0Quimiostatos mltiples en cascada:
-
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V1 V2
X1S1
X2S2
Fv,X2,S2Fv,X1,S1Fv,S0,X0Primer quimiostato
en EE, vlido Monod y con metabolismo endgeno despreciable
1m
1s
1 D
DKS
=
10
M
S/X1SSYX =
Segundo quimiostato
BM de biomasa EEen0
dt
dXVXVXFXF 2
222,neta22V1V ==+
( )
==
2
1
22,neta22,neta12
2
V
X
X1DXXX
V
F
Como X1 < X2 neta,2 < D2
Ejemplo de aplicacin de un sistema multietapa con agregado de una
corriente:cultivo de clulas modificadas por ingeniera gentica
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En general se agregan promotores a los sistemas con clulas que
contienen ADN recombinante para inducir la produccin de la
protena de inters.
La presencia del promotor favorece la produccin de la protenapero reduce la velocidad de crecimiento de las clulas que contienen
plsmidos, respecto de las que lo han perdido.
un quimiostato de una nica etapa tendr problemas de
inestabilidad gentica.empleando un sistema de 2 etapas:
Primer quimiostato para produccin de clulas (sin promotor)
Segundo quimiostato para produccin de la protena (c/promotor):
Se logra mantener la estabilidad gentica por el continuo agregado
de clulas frescas.
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador
-
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en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigarproblemas de inhibicin por sustrato
V0
S0,X0,P0
X0,S0,P01)Carga
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin
Xf,Sf,Pf
Vf
Xf,Sf,Pf
3)Recuperacin
del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica,
el sistema se comporta como un batch:
0
M
S/Xm
SYX =Xm es la mxima X a alcanzar con S0 , que se da
cuando S
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nutrientes frescos con un caudal volumtricoFv y de una concentracin S0. La variacin de
volumen es:( )tFvVVFv
dt
dV0
+==
Durante la realimentacin, el BM de biomasa
es:
Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0(condicin de estado cuasi-estacionario). Luego:
Dneta
X,S,P
V
Fv,S0(X0)
2)Realimentacin
X,S,P
V
Fv,S0(X0)
X,S,P
V
Fv,S0(X0)
2)Realimentacin
( ) ( )DXdt
dXDXDX
dt
dV
V
XXX
V
F
dt
dXnetaneta0neta0
V +=+=
( )
dt
dVX
dt
dXV
dt
VXdXVXF
neta0V +==+
acumulasegeneraseentra =+
Como D porque V, neta va disminuyendo continuamente.
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
BM para el sustrato:XV
-
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Si no consideramos la formacin de
productos y dado que la masa de sustrato
se mantiene siempre
baja y constante:
( )( ) ( ) tYSFVXXVYSFXV
dt
XVd MS/X0V00
MS/X0Vneta +==
(es igual en ausencia de metabolismo endgeno)
Es decir, la masa de clulas generadas es linealmente proporcional
al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.
X,S,P
V
Fv,S0(X0)
2)Realimentacin
X,S,P
V
Fv,S0(X0)
X,S,P
V
Fv,S0(X0)
2)Realimentacin
( )M
S/X
g
0VY
XVSF
=
( )dtVSd
YXVq
YSF
S/P
PM
S/X
g0V =
acumulaseonsumecseentra =
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
1000V (mL) (h-1)
-
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Variacin de las
concentraciones de
biomasa, sustrato y
producto, y de lavelocidad de
crecimiento y volumen
del cultivo en funcin
del tiempo, para elprimer ciclo de un
reactor alimentado
(fed-batch):
0
200
400
600
800
0 0.5 1 1.5 2
0
0.2
0.4
0.6
V (mL)
X (g/L)
P (g/L)
X (g/L)P (g/L)
(h-1)
t h
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin
de microorganismos tiene aplicacin si los productos son
l l
-
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extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:
Proveen una alta concentracin de clulas
Las clulas se usan en forma continua y se eliminan costosos
procesos de recuperacin y reciclo de clulas
Se eliminan el problema del washout a altas velocidades de
dilucin
Se pueden lograr altas productividades
Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores
rendimientos y una mejor performance del biocatalizador
En algunos casos mejora la estabilidad gentica
En algunos casos disminuye el dao por abrasin de las clulas
Sistemas con microorganismos inmovilizados
-
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Desventajas respecto de los cultivos en solucin:
El problema ms grave es que no se pueden emplear para
productos que no sean excretados de las clulas
La inmovilizacin generalmente conduce a problemas de
limitaciones por transferencia de masa
El sistema se torna muy heterogneo por las limitaciones de
transporte y es difcil de controlar
Si las clulas estn vivas, el crecimiento y la evolucin de gases
ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los mtodos de inmovilizacin son similares a los que se utilizan
para enzimas. Se complica con las clulas vivas.
InmovilizacinActiva: captura o unin de clulas por
mtodos fsicos o qumicos
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Pasiva: formacin de biofilms, crecimiento
de mltiples capas de clulas sobre un
soporte slido
Tambin se pueden emplear reactores de membrana, generalmente
tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor decarcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable.
Las clulas se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los
tubos, a los cuales difunde el producto.
Un buen soporte debe ser rgido y qumicamente inerte; debe
contener a las clulas firmemente y tener alta capacidad.
Fermentadores: Equipos comnmente empleados
Tanques agitados
C l d b b j
-
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Esquema de una
columna de burbujeo
Columnas de burbujeo
Air-lift o reactor de arrastre
Lechos rellenos
Esquema de un tanque agitado
H/D~12
H/D~36
Tanques agitados de escala
l b i
-
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laboratorio
Tanques agitados de escala
laboratorio con clulas
-
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laboratorio con clulasinmobilizadas
Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2--20 litros)20 litros)
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Global Medical Instrumentation http://www.gmi-inc.com
Fermentadores de escala bancoFermentadores de escala banco--piloto (V ~ 15piloto (V ~ 15--75 litros)75 litros)
-
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Fermentadores deFermentadores de
escala pilotoescala piloto
V ~ 100V ~ 100--1000 litros1000 litros
-
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V ~ 100V ~ 100--1000 litros1000 litros
Biorreactor del il
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Biorreactor deescala piloto
Planta piloto de bioprocesos
-
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Esquema de un tanqueEsquema de un tanque
agitado de mayor escalaagitado de mayor escala
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Variables que se controlan en unVariables que se controlan en unbiorreactorbiorreactor industrialindustrial
-
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Esquema de un fermentador
tipo tanque agitado de escala
industrial (100m3).
-
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( )
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
Tiene lneas de vapor
para realizar laesterilizacin in situ de
las vlvulas, caeras y
sellos. Se debe esterilizartambin el aire que
ingresa por filtracin o
por calentamiento.
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Biorreactor de
escala industrial
-
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Reactor tanque industrial-generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado.-debe minimizar zonas muertas y permitir la insercin de sensores
-relacin de aspecto H/D=2.53.0 para crecimiento de bacterias porquemejora la transferencia de oxgeno Para clulas animales se usan tanques
-
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mejora la transferencia de oxgeno. Para clulas animales se usan tanquesde baja relacin de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado-se debe poder vaciar
totalmente-si tiene menos de500L pueden ser devidrio
Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la
agitacin que inducen
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Agitacin inducida por turbinas
radiales del tipo Rushton
Agitacin inducida por turbinas
axiales
Interior de un
tanque agitado
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Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vrtices
que se forman por la agitacin. Se los ubica levemente desplazadosde la pared para disminuir la formacin de zonas estancas
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de la pared para disminuir la formacin de zonas estancas.
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L
400rpm sin baffles 400rpm con baffles
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vrtice
Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados
La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y elcalor liberado son claves para el diseo de los fermentadores.
-
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p
La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersin de gas,
que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al
aumentar la velocidad de agitacin.
> RPM
Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la
dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactorde laboratorio de 2L.
-
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de laboratorio de 2L.
300 rpm 450 rpm 750 rpm
Tomografa de una seccin del
reactor agitado.
Jets gaseosos de los inyectores de gas
Fraccin gaseosa (adimensional)
-
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Perfil de velocidades (cm/s) del lquido
en un reactor gas-lquido agitado. Seobserva la formacin del vrtice
caracterstico de las turbinas radiales.
Reactor agitado en
suspensin de escala
banco: 20cm dedimetro y de alto
(volumen ~ 8L)
Reactor tanque agitado:
-
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Problemas ocasionados por
la evolucin de espuma:
-peligro de contaminacin
-complica la circulacin de
gases
-complica el mezclado
-cambian las velocidades
de transferencia masa y decalor
vrtice
Columna de burbujeo de escala banco: V~10L
Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
-
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Columnas de burbujeo
Regmenes de flujo en columnas de
burbujeo: depende del caudal de gas y del
distribuidor que se emplee
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distribuidor que se emplee
Columnas de burbujeo para el
cultivo de algas
-
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Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de
aire Air-lift
Configuraciones comunes de fermentadores
-
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Air-lift coninsercin de
aire en el
tubo central
Air-lift con insercinde aire en el anillo y
mezclado en el tubo
central
Air-lift con insercin de aire en
el tubo central y recirculacin
inducida
Reactor air-lift de
laboratorio con entrada deaire en el anillo circular
-
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Riser: zona donde se hace la
inyeccin de aire, el flujo esascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el lquido
desciende, a lo sumo tiene pequeasburbujas disueltas
Zona donde se produce laseparacin entre el gas que se
libera hacia el exterior delreactor y el lquido que recircula
Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles
de velocidades, energa cintica y tensin de deformacin
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Shear Stress Kinetic Energy
Escalabanco
(0,2 x 2)m
-
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Reactor de tipo air-lift circulante
Airlifts de forma
triangular para elcultivo de algas
( l t il t d
-
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(planta piloto de
cogeneracin de
energa del MIT)
Configuraciones comunes de fermentadores
Reactores de lecho fijo uso frecuente en tratamiento de efluentes y
en producciones dedicadasReactores trickle-beds o de lecho a goteo Columnas de burbujeo
-
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g
Cocorriente ContracorrienteColumnas de burbujeo
rellenas
Inmovilizacin pasiva (biofilms):
Los biofilms songrupos de clulas que crecen en multicapassobre soportes slidos.
El soporte puede ser inerte o biolgicamente activo.
La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacin
-
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La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacinindustriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos).
La interaccin entre las clulas y el soporte puede ser muy compleja.Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de lossistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.
Las condiciones dentro de un biofilm grueso varan con la posicin y
afectan la fisiologa de las clulas porque los nutrientes difundenhacia el interior del film y los productos hacia fuera.
El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos vana dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentracin de
biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que puedenser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr.
Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento debiomasa y otro para la formacin de productos.
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Estrategias de escalado:
-Multiplicacin
-Reglas de uso
-Anlisis del rgimen
-
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-Anlisis del rgimeny escalado hacia menor
tamao
Lamultiplicacin implica
replicar muchas veces el
resultado que se obtieneen un reactor de escala
relativamente pequea, en
lugar de llevar a cabo el
proceso en un reactor demayor tamao.
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Produccin de cido glucnico
-
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Produccin de gluconato de sodio conA. niger
-
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Produccin de antibit ico
-
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Produccin de lisina (10000 ton/ao)en 20 fermentadores de 250 m3
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Drogas medicinales
% de uso en la industria Criterio de escalado
Reglas de uso :basadas en anlisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parmetros
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30 Potencia/Volumen
30 kLaLG
20 Velocidad en la punta del agitador
20 Concentracin de oxgeno
Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; dimetro delagitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado
por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds
La concentracin de
Anlisis del rgimen
y escalado hacia
menor tamao
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oxgeno es diferente en
distintas zonas delreactor. Se puede simular
considerando varios
reactores con distinta
alimentacin de oxgeno
Modelo del sistema que suponedos compartimientos con distintaconcentracin de oxigeno
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