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Cromatografa de Lquidos

Elba Rojas Escudero

ERE

Ab o Ad ???

Temario Fundamentos

Definiciones bsicas Aspectos tericos

Instrumentacin Elementos bsicos Columnas Inyectores Detectores y sistemas acoplados

Anlisis cualitativo y cuantitativo

Cromatografa de lquidos

Mtodo fsico de separacin

La muestra se distribuye entre dos fases

Fase estacionaria: slido o lquido

Fase mvil: lquido o mezcla de lquidos

Elucin La muestra se aplica al principio de la

columna como una banda fina

El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos

Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase mvil

Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna

Gas Lquido

Columna Plano

CLS CLL CFE CII CE

CPG CFG

CCF CP

Cromatografa

Tipos de CL PM < 2000

Cromatografa de intercambio inico Adsorcin: lquido-slido Particin: lquido-lquido

Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa

PM > 2000 Cromatografia de exclusin por tamao

Requisitos de la muestra

Soluble en la fase mvil

Limpia

No debe reaccionar con ningn componente del sistema cromatogrfico

HPLC ideal para muestras con:

Presin de vapor baja

Compuestos inicos

Compuestos de peso molecular elevado

Compuestos Termolbiles

Instrumentacin

Fase mvil Bomba de alta presin

Inyector

Columna

Detector

Muestra

Control de temperatura

Gradientede elucin

Registrador

Fase mvil

Disolventes grado cromatogrfico Agua de 18 m Baja viscosidad No vlatil Miscibilidad Filtrada Sin oxgeno disuelto (degasificada)

Fase mvil

Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min)

H = f (v)

Cromatografa

FMFE

Inyector Detector

Proceso Cromatogrfico

La fase mvil fluye, arrastrando consigo los solutos

Los solutos se reparten entre ambas fases

MuestraFase estacionaria Fase mvil

Cromatografa de lquidos

Se realiza en columna Separacin por adsorcin y particin Diversidad de tcnicas en funcin de

la muestra

Anlisis cualitativo y cuantitativo Separaciones analticas y preparativas Anlisis de mezclas relativamente

complejas

Fase estacionaria (columna)

Tubo de acero inoxidable

Dimensiones Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm Dimetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm Tamao de partcula: 3, 5, 10 m Forma de la partcula: irregular o esfrica

Dimensiones de la columna

L

di

dp

Fase estacionaria (columna)

Empaque Slica gel, C8, C18, Ciano, Amino,

Resinas, Polmeros

Carga de Carbn 5-20 % w/w Intervalo de pH = f (FE) Lmite de presin de trabajo Compatible con la fase mvil

Fase estacionaria

Soportes de la FE

Permeacin o exclusin

Cuidados de la columna

Instalacin Introduccin de muestras limpias Contaminacin por fase mvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma

adecuada

Lavarla despus de utilizarla condisoluciones reguladoras de pH

Precauciones

No exceder la presin de trabajo Cambios bruscos de presin Intervalo de pH adecuado No utilizar H+ y OH- concentrados Filtrar la muestra y la fase mvil w de la muestra=f (dimensiones de la

columna)

Cromatografa

Fase Normal FE polar FM No-polar

Fase Inversa FE No-polar FM polar

Cromatografa de fase inversa

FE Slica qumicamente modificada con

grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl

FM Mezclas: agua/disolventes orgnicos

H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)

Cromatografa de fase inversa

Efecto solvofbico fuerte: Parte apolar de la molcula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)

Fases estacionarias

Fases impregnadas Cubren uniformemente el soporte Insolubles en la FM Compatibles con el detector El flujo de la FM no debe ser elevado

NO son Estables

Fases estacionarias

Fases qumicamente unidas (Bonded phases) Unidas al soporte por enlaces covalentes Mayor eficiencia que las Fases impregnadas Costo elevado Son estables

Cromatografa de fase inversa

Ventajas Reproducibilidad en las separaciones Estabilidad de la FE (pH 7) Mezclas: acuosos/orgnicos H2O

+(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)

Fuerza del eluyente

Viscosidad del eluyente

Polaridad

Polaridad

Detectores

Indice de refraccin Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroqumico Radioactividad Infrarrojo Espectrmetro de masas

Instrumentacin

Fase mvil Bomba de alta presin

Inyector

Columna

Detector

Muestra

Control de temperatura

Gradientede elucin

Registrador

Elucin

Problema general de la elucin

Gradiente de elucin

Gradiente de elucin

Elucin con alta presin

Elucin

Equipo con gradiente de elucin

Proceso Cromatogrfico

El lecho cromatogrfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna)

La fase mvil fluye a lo largo del lecho cromatogrfico en contacto con la fase estacionaria

Proceso Cromatogrfico

Las mleculas de soluto en fase estacionaria se estancan

Las mleculas en fase mvil avanzan con ella

Mm

M

M

m m

mm

Proceso Cromatogrfico

La velocidad del soluto vara inversamente con la afinidad por la fase estacionaria

Separacin de los solutos

Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarn

Mm

M

M

MM

M

M

m

m

m

Separacin de los solutos

H = f (v)

Ensanchamiento de banda

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FE

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FMmovimiento

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FMestancada

H= f (ensanchamiento de la banda)

HL = 2 DM / v HS = 2k

1+k

2vta

HF = 2dp HD = vdp2 / DM

HM = HF + HD

HSM = (1- + k)2 dp2v

30(1-)(1+k)2DM

H = f (ensanchamiento de la banda)

H = HL + HS + HM + HSM

H = HS + HM + HSM

H = L / N

Ventajas

Anlisis de compuestos inicos, de alto peso molecular

Diversidad de columnas y detectores Formacin de derivados pre-columna y

post-columna

Separaciones con control de pH Separaciones preparativas

Limitantes

Muestras relativamente limpias Solubilidad de la muestra en la fase mvil Viscosidad de la fase mvil Dimensiones de la columna Presin de trabajo Intervalo de pH Utilizar un filtro (pre-columna)

Cromatografa de Lquidos

Formacin de derivados

ERE

Derivados

Fuera de lnea En lnea Pre-columna Post-columna

Equipo para la formacin de derivados

FMFE

Inyector Reactor Detector

FMFE

Inyector Reactor Detector

Derivados

Derivados

Cromatografa de Lquidos

Aplicaciones

ERE

CCF - CLAE

FE = f (dimetro interno)

Diferente

Cambio de

Aplicacin

Aminas

Aplicacin

Fluorescencia

Polar - No polar

Qu sucedi ???

Sensibilidad

Sensibilidad

Peso molecular

Propiedades = f (PM)

Oligosacridos

Oligoglucosa

Ejemplos

Campo Mezclas tpicasFrmacos Antibiticos, sedantes,

esteroides, analgsicosBioqumica Amincidos, protenas,

carbohidratos, lpidosAlimentos Edulcorantes, antioxidantes,

aflatoxinas, aditivosContaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB,

fenolesQumicaforense

Drogas, venenos, alcohol ensangre, narcticos

Cromatografa de Lquidos Ab o Ad ???TemarioCromatografa de lquidosElucinCromatografaTipos de CLRequisitos de la muestra HPLC ideal para muestras con:InstrumentacinFase mvilFase mvilH = f (v)CromatografaProceso CromatogrficoCromatografa de lquidosFase estacionaria (columna)Dimensiones de la columnaFase estacionaria (columna)Fase estacionariaSoportes de la FEPermeacin o exclusinCuidados de la columnaPrecaucionesCromatografaCromatografa de fase inversaCromatografa de fase inversaFases estacionariasFases estacionariasCromatografa de fase inversaFuerza del eluyenteViscosidad del eluyente Polaridad Polaridad DetectoresInstrumentacinElucinProblema general de la elucinGradiente de elucinGradiente de elucinElucin con alta presin ElucinEquipo con gradiente de elucinProceso CromatogrficoProceso CromatogrficoProceso CromatogrficoSeparacin de los solutosSeparacin de los solutosH = f (v