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  • Cromatografa de Lquidos

    Elba Rojas Escudero

    ERE

  • Ab o Ad ???

  • Temario Fundamentos

    Definiciones bsicas Aspectos tericos

    Instrumentacin Elementos bsicos Columnas Inyectores Detectores y sistemas acoplados

    Anlisis cualitativo y cuantitativo

  • Cromatografa de lquidos

    Mtodo fsico de separacin

    La muestra se distribuye entre dos fases

    Fase estacionaria: slido o lquido

    Fase mvil: lquido o mezcla de lquidos

  • Elucin La muestra se aplica al principio de la

    columna como una banda fina

    El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos

    Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase mvil

    Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna

  • Gas Lquido

    Columna Plano

    CLS CLL CFE CII CE

    CPG CFG

    CCF CP

    Cromatografa

  • Tipos de CL PM < 2000

    Cromatografa de intercambio inico Adsorcin: lquido-slido Particin: lquido-lquido

    Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa

    PM > 2000 Cromatografia de exclusin por tamao

  • Requisitos de la muestra

    Soluble en la fase mvil

    Limpia

    No debe reaccionar con ningn componente del sistema cromatogrfico

  • HPLC ideal para muestras con:

    Presin de vapor baja

    Compuestos inicos

    Compuestos de peso molecular elevado

    Compuestos Termolbiles

  • Instrumentacin

    Fase mvil Bomba de alta presin

    Inyector

    Columna

    Detector

    Muestra

    Control de temperatura

    Gradientede elucin

    Registrador

  • Fase mvil

    Disolventes grado cromatogrfico Agua de 18 m Baja viscosidad No vlatil Miscibilidad Filtrada Sin oxgeno disuelto (degasificada)

  • Fase mvil

    Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min)

  • H = f (v)

  • Cromatografa

    FMFE

    Inyector Detector

  • Proceso Cromatogrfico

    La fase mvil fluye, arrastrando consigo los solutos

    Los solutos se reparten entre ambas fases

    MuestraFase estacionaria Fase mvil

  • Cromatografa de lquidos

    Se realiza en columna Separacin por adsorcin y particin Diversidad de tcnicas en funcin de

    la muestra

    Anlisis cualitativo y cuantitativo Separaciones analticas y preparativas Anlisis de mezclas relativamente

    complejas

  • Fase estacionaria (columna)

    Tubo de acero inoxidable

    Dimensiones Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm Dimetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm Tamao de partcula: 3, 5, 10 m Forma de la partcula: irregular o esfrica

  • Dimensiones de la columna

    L

    di

    dp

  • Fase estacionaria (columna)

    Empaque Slica gel, C8, C18, Ciano, Amino,

    Resinas, Polmeros

    Carga de Carbn 5-20 % w/w Intervalo de pH = f (FE) Lmite de presin de trabajo Compatible con la fase mvil

  • Fase estacionaria

  • Soportes de la FE

  • Permeacin o exclusin

  • Cuidados de la columna

    Instalacin Introduccin de muestras limpias Contaminacin por fase mvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma

    adecuada

    Lavarla despus de utilizarla condisoluciones reguladoras de pH

  • Precauciones

    No exceder la presin de trabajo Cambios bruscos de presin Intervalo de pH adecuado No utilizar H+ y OH- concentrados Filtrar la muestra y la fase mvil w de la muestra=f (dimensiones de la

    columna)

  • Cromatografa

    Fase Normal FE polar FM No-polar

    Fase Inversa FE No-polar FM polar

  • Cromatografa de fase inversa

    FE Slica qumicamente modificada con

    grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl

    FM Mezclas: agua/disolventes orgnicos

    H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)

  • Cromatografa de fase inversa

    Efecto solvofbico fuerte: Parte apolar de la molcula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)

  • Fases estacionarias

    Fases impregnadas Cubren uniformemente el soporte Insolubles en la FM Compatibles con el detector El flujo de la FM no debe ser elevado

    NO son Estables

  • Fases estacionarias

    Fases qumicamente unidas (Bonded phases) Unidas al soporte por enlaces covalentes Mayor eficiencia que las Fases impregnadas Costo elevado Son estables

  • Cromatografa de fase inversa

    Ventajas Reproducibilidad en las separaciones Estabilidad de la FE (pH 7) Mezclas: acuosos/orgnicos H2O

    +(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)

  • Fuerza del eluyente

  • Viscosidad del eluyente

  • Polaridad

  • Polaridad

  • Detectores

    Indice de refraccin Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroqumico Radioactividad Infrarrojo Espectrmetro de masas

  • Instrumentacin

    Fase mvil Bomba de alta presin

    Inyector

    Columna

    Detector

    Muestra

    Control de temperatura

    Gradientede elucin

    Registrador

  • Elucin

  • Problema general de la elucin

  • Gradiente de elucin

  • Gradiente de elucin

  • Elucin con alta presin

  • Elucin

  • Equipo con gradiente de elucin

  • Proceso Cromatogrfico

    El lecho cromatogrfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna)

    La fase mvil fluye a lo largo del lecho cromatogrfico en contacto con la fase estacionaria

  • Proceso Cromatogrfico

    Las mleculas de soluto en fase estacionaria se estancan

    Las mleculas en fase mvil avanzan con ella

    Mm

    M

    M

    m m

    mm

  • Proceso Cromatogrfico

    La velocidad del soluto vara inversamente con la afinidad por la fase estacionaria

  • Separacin de los solutos

    Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarn

    Mm

    M

    M

    MM

    M

    M

    m

    m

    m

  • Separacin de los solutos

  • H = f (v)

  • Ensanchamiento de banda

  • Ensanchamiento de la banda

    Transferencia de masa en la FE

  • Ensanchamiento de la banda

    Transferencia de masa en la FMmovimiento

  • Ensanchamiento de la banda

    Transferencia de masa en la FMestancada

  • H= f (ensanchamiento de la banda)

    HL = 2 DM / v HS = 2k

    1+k

    2vta

    HF = 2dp HD = vdp2 / DM

    HM = HF + HD

    HSM = (1- + k)2 dp2v

    30(1-)(1+k)2DM

  • H = f (ensanchamiento de la banda)

    H = HL + HS + HM + HSM

    H = HS + HM + HSM

    H = L / N

  • Ventajas

    Anlisis de compuestos inicos, de alto peso molecular

    Diversidad de columnas y detectores Formacin de derivados pre-columna y

    post-columna

    Separaciones con control de pH Separaciones preparativas

  • Limitantes

    Muestras relativamente limpias Solubilidad de la muestra en la fase mvil Viscosidad de la fase mvil Dimensiones de la columna Presin de trabajo Intervalo de pH Utilizar un filtro (pre-columna)

  • Cromatografa de Lquidos

    Formacin de derivados

    ERE

  • Derivados

    Fuera de lnea En lnea Pre-columna Post-columna

  • Equipo para la formacin de derivados

    FMFE

    Inyector Reactor Detector

    FMFE

    Inyector Reactor Detector

  • Derivados

  • Derivados

  • Cromatografa de Lquidos

    Aplicaciones

    ERE

  • CCF - CLAE

  • FE = f (dimetro interno)

  • Diferente

  • Cambio de

  • Aplicacin

  • Aminas

  • Aplicacin

  • Fluorescencia

  • Polar - No polar

  • Qu sucedi ???

  • Sensibilidad

  • Sensibilidad

  • Peso molecular

  • Propiedades = f (PM)

  • Oligosacridos

  • Oligoglucosa

  • Ejemplos

    Campo Mezclas tpicasFrmacos Antibiticos, sedantes,

    esteroides, analgsicosBioqumica Amincidos, protenas,

    carbohidratos, lpidosAlimentos Edulcorantes, antioxidantes,

    aflatoxinas, aditivosContaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB,

    fenolesQumicaforense

    Drogas, venenos, alcohol ensangre, narcticos

    Cromatografa de Lquidos Ab o Ad ???TemarioCromatografa de lquidosElucinCromatografaTipos de CLRequisitos de la muestra HPLC ideal para muestras con:InstrumentacinFase mvilFase mvilH = f (v)CromatografaProceso CromatogrficoCromatografa de lquidosFase estacionaria (columna)Dimensiones de la columnaFase estacionaria (columna)Fase estacionariaSoportes de la FEPermeacin o exclusinCuidados de la columnaPrecaucionesCromatografaCromatografa de fase inversaCromatografa de fase inversaFases estacionariasFases estacionariasCromatografa de fase inversaFuerza del eluyenteViscosidad del eluyente Polaridad Polaridad DetectoresInstrumentacinElucinProblema general de la elucinGradiente de elucinGradiente de elucinElucin con alta presin ElucinEquipo con gradiente de elucinProceso CromatogrficoProceso CromatogrficoProceso CromatogrficoSeparacin de los solutosSeparacin de los solutosH = f (v

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