control de microorganismos por agentes físicos y químicos

CAPÍTULO 7

Control

de microorganismos por agentes físicos y químicos

Bacterias retenidas sobre la superficie de un filtro de membrana utilizado para eliminar microorganismos de fluidos.

índice Conceptos

7.1 Definición de los términos más frecuentes 146

7.2 Cinética de muerte microbiana 147

7.3 Condiciones que influyen sobre la eficacia de la actividad de un agente antimicrobiano 148

7.4 Control microbiano por métodos físicos 149

Calor 149 Bajas temperaturas 152 Filtración 152 Radiación 154

7.5 Control microbiano por agentes químicos 155

Compuestos fenol icos 156 Alcoholes 156 Halógenos 157 Metales pesados 158 Compuestos de amonio

cuaternario 159 Aldehidos 159 Gases esterilizantes 159

7.6 Evaluación de la eficacia de los agentes antimicrobianos 159

1. La muerte de una población microbiana es exponencial y la eficacia de un agente antimicrobiano no es fija, sino que está influida por muchos factores ambientales.

2. Los objetos sólidos se pueden esterilizar con agentes físicos, como calor y radiación; los líquidos y gases se esterilizan con calor, radiación y filtración a través de un filtro apropiado.

3. La mayoría de los agentes químicos no destruyen fácilmente las endosporas bacterianas, por lo que no pueden esterilizar objetos; se emplean como desinfectantes, agentes de saneamiento y antisépticos. Los objetos se pueden esterilizar con gases, como óxido de etileno que destruye las endosporas.

4. Es imprescindible conocer los métodos de control microbiano para garantizar una seguridad sanitaria pública y personal.

146 Capítulo 7 Control de microorganismos por agentes físicos y químicos

Todos ludíamos contra nuestra propia curación, pues la muerte es

la curación de todas las enfermedades. Sir Thomas Browne.

os capítulos de la Parte II tratan de la nutrición, el cre-cimiento y el control de los microorganismos. Este capítulo se ocupa del control y la destrucción micro-

biana, una materia de gran importancia práctica. Aunque muchos microorganismos son beneficiosos y necesarios para el bienestar humano, las actividades microbianas pue-den tener consecuencias indeseables, como la putrefacción de los alimentos y el desarrollo de enfermedades. En conse-cuencia, es fundamental poder destruir los microorganismos o inhibir su crecimiento para minimizar sus efectos destruc-tivos. Por tanto, el objetivo es doble: 1) destruir patógenos para prevenir su transmisión, y 2) reducir o eliminar micro-organismos responsables de la contaminación del agua, ali-mentos y otros productos.

Este capítulo se centra en el control de los microorga-nismos por medio de agentes físicos y químicos. En el Capí-tulo 35 se explicará el uso de la quimioterapia antimicrobia-na para controlar enfermedades microbianas.

Desde el principio de la historia escrita, las personas han practicado métodos de desinfección y esterilización, aunque

durante mucho tiempo no se sospechó de la existencia de microorganismos. Los egipcios empleaban el fuego para esterilizar material infeccioso, desinfectantes para embalsa-mar los cuerpos, y los griegos quemaban azufre para fumi-gar los edificios. La ley de Moisés obligaba a los hebreos a quemar todas las ropas de los que morían de lepra. En la actualidad, la capacidad de destruir microorganismos no tiene menos importancia: hace posible la investigación microbiológica en condiciones asépticas, la conservación de los alimentos y la prevención de enfermedades. Las técnicas descritas en este capítulo son también esenciales para la seguridad personal, tanto en el laboratorio como en los hos-pitales (Recuadro 7.1).

Existen varias formas de controlar el crecimiento micro-biano que no se han incluido en este capítulo, pero deben analizarse para obtener una visión más completa del control microbiano. En el Capítulo 6 se describen los efectos de la actividad osmótica, el pH, la temperatura, el O2 y la radia-ción sobre el crecimiento y la supervivencia microbianas (véanse las pp. 128-139). El Capítulo 41 analiza el uso de los agentes físicos y químicos para conservar los alimentos (véanse las pp. 1051-1054).

7.1 Definición de los términos más frecuentes

La terminología tiene una especial importancia cuando se discute sobre el control microbiano porque hay términos como desinfectante y antiséptico que se emplean a menudo

Seguridad en el laboratorio de microbiología

a seguridad de los trabajadores debe ser una preocupación principal en todos los laboratorios de microbiología. Se ha

/estimado que miles de infecciones se adquieren en los laboratorios y muchas personas han muerto por ello. Las enfermedades bacterianas más comunes adquiridas en un laboratorio son las fiebres tifoideas y la brucelosis. La mayor parte de las muertes han sido causadas por fiebres tifoideas (20 muertos) y la fiebre manchada de las Montañas Rocosas (13 muertos). Las infecciones por hongos (histoplasmosis) y virus (encefalitis equina venezolana y hepatitis B adquirida de los monos) son también comunes. La hepatitis es la infección viral más frecuente entre las enfermedades adquiridas en laboratorios, especialmente en personas que trabajan en laboratorios clínicos y con sangre. Según una encuesta realizada a 426 trabajadores de hospitales de los EE.UU., el 40% de los de química clínica y el 21% de microbiología tenía anticuerpos frente al virus de la hepatitis B, indicando una exposición previa (aunque sólo el 19% de ellos había padecido síntomas de la enfermedad).

Se han hecho esfuerzos para determinar las causas de estas infecciones con el fin de mejorar las medidas de prevención. Aunque a menudo no es posible definir la causa directa de la infección, son obvios algunos riesgos potenciales. Una de las

causas fundamentales es la inhalación de un aerosol infeccioso. Un aerosol es una suspensión gaseosa de partículas líquidas o sólidas que se puede producir por accidentes y actividades de laboratorio, como derrames, accidentes durante las centrifucio-nes, al agitar tubos de ensayo y retirar los tapones, y la incinera-ción a la llama de asas contaminada. Son también frecuentes los accidentes con jeringas y agujas hipodérmicas, como la autoino-culación y la emisión de aerosoles por las agujas. Las agujas hipodérmicas deben emplearse sólo cuando sea necesario y con precaución. Las lesiones en la boca por accidentes con pipetas son otra fuente principal de infección; el aspirado no debe reali-zarse nunca con la boca sino con dispositivos apropiados, y tra-bajar con ellas de manera que se evite la formación de aerosoles. Los operarios deben trabajar con cuidado y con sentido común cuando se trabaja con microorganismos. Las actividades que podrían generar aerosoles infecciosos hay que llevarlas a cabo en una cabina de seguridad biológica. La superficie de las encimeras y las estufas de incubación deben desinfectarse regu-larmente. Los autoclaves deben tener un mantenimiento y fun-cionamiento adecuados para asegurar una esterilización apropia-da. El personal del laboratorio debe lavarse bien las manos antes y después de finalizar su trabajo.

L

7.2 Cinética de muerte microbiana 147

libremente. Esta situación es incluso más confusa porque un tratamiento particular puede inhibir el crecimiento o destruir los microorganismos, según las condiciones.

La capacidad de controlar las poblaciones microbianas en objetos inanimados, como utensilios de alimentación o instrumentos quirúrgicos tiene una importancia práctica considerable. A veces, es necesario eliminar todos los microorganismos de un objeto, mientras que en otras situa-ciones puede ser necesario sólo destruir parcialmente la población microbiana. La esterilización [latín sterilis, inca-paz de reproducirse] es el proceso por el que todas las célu-las vivas, esporas viables, virus y viroides {véase el Capítulo

18) son destruidos o eliminados de un objeto o habitat. Un objeto esterilizado está totalmente libre de microorganismos viables, esporas y otros agentes infecciosos. Cuando se rea-liza la esterilización con un agente químico, el agente se denomina esterilizante. Por el contrario, la desinfección

consiste en la destrucción, inhibición o eliminación de, al menos, los microorganismos que pueden causar enferme-dad. El principal objetivo es destruir patógenos potenciales, aunque la desinfección también reduce significativamente la población microbiana total. Los desinfectantes son agentes, normalmente químicos, empleados para desinfectar y se emplean normalmente sobre objetos inanimados. Un desin-fectante no esteriliza necesariamente un objeto porque pue-den permanecer esporas y algunos microorganismos viables. El saneamiento tiene una relación próxima con la desinfec-ción. Con este sistema, la población microbiana se reduce a niveles que se consideran seguros según las normas de salud pública. De esta manera, los objetos inanimados se limpian y resultan parcialmente desinfectados. Por ejemplo, los pro-ductos de saneamiento se emplean en restaurantes para lim-piar utensilios de alimentación.

Normalmente, es necesario controlar los microorganis-mos sobre tejidos vivos con agentes químicos. La antisepsia

[Griego, anti, contra, y sepsis, putrefacción] es la preven-ción de una infección o sepsis, y se realiza con antisépticos.

Son agentes químicos que se aplican sobre los tejidos para prevenir una infección, destruyendo o inhibiendo el creci-

miento de agentes patógenos; también reducen la carga microbiana en general. No deben dañar demasiado el tejido del huésped, por lo que los antisépticos no son tan tóxicos como los desinfectantes.

Se puede emplear un sufijo para caracterizar el efecto del agente antimicrobiano. Cuando el agente destruye orga-nismos, se dice que tiene efecto -cida [latín cida, destruir] —p. ej., un germicida destruye agentes patógenos y mu-chos no patógenos, pero no necesariamente endosporas—. Un desinfectante o antiséptico puede ser particularmente eficaz contra un grupo específico, en cuyo caso se denomina bactericida, fungicida, algicida o virocida. Otras sustan-cias químicas no destruyen, sino que previenen el creci-miento. Se empleará el sufijo -stático [Griego statikos, que causa detención] —p. ej., bacteriostático y fungistático.

Aunque estos agentes se han descrito por sus efectos sobre los organismos patógenos, hay que destacar que tam-bién destruyen o inhiben el crecimiento de organismos no patógenos. Su capacidad para reducir la población total microbiana, no sólo los niveles de organismos patógenos, es muy importante en muchas situaciones.

1. Defina los siguientes términos: esterilización, esterilizante, desinfección, desinfectante, saneamiento, antisepsia, antiséptico, germicida, bactericida, bacteriostático.

7.2 Cinética de muerte microbiana

Una población microbiana no se destruye instantáneamente cuando se expone a un agente letal. La muerte de una pobla-ción, al igual que su crecimiento, es generalmente exponen-cial o logarítmica —es decir, la población se reduce en nive-les iguales a intervalos constantes— (Tabla 7.1). Si se representa el logaritmo del número de microorganismos que permanece viable frente al tiempo de exposición del agente, se obtiene una línea recta (compárese la Figura 7.1 con

'' Se asume que la muestra inicial contiene 106 microorganismos vegetativos por mL, y que el 90 % de los microorganismos se destruyen durante cada minuto de exposición. La temperatura es de 121 °C.


la 6.2). Cuando la población se ha reducido notablemente la velocidad de destrucción puede disminuir debido a la super-vivencia de algunas variantes más resistentes de los micro-organismos expuestos.

Para estudiar la eficacia de un agente letal, hay que saber cuándo están muertos los microorganismos, tarea no tan fácil como en el caso de organismos de mayor tamaño (no se puede tomar el pulso a una bacteria). Una bacteria se considera muerta si no crece ni se multiplica cuando se inocula en un medio de cultivo adecuado para su creci-miento. Análogamente, consideraremos que un virus está inactivo cuando no es capaz de multiplicarse en un hués-ped apropiado.

1. Describa el modelo de muerte microbiana y cómo se sabe si los microorganismos están realmente muertos.

7.3 Condiciones que influyen sobre la eficacia de la actividad de un agente antimicrobiano

La destrucción de los microorganismos y la inhibición de su crecimiento no son asuntos sencillos porque la eficacia de un agente antimicrobiano (agente que destruye microorga-nismos o inhibe su crecimiento) depende de al menos seis factores.

1. Tamaño de la población. En cada intervalo de tiempo se destruye una fracción igual de población microbiana, por tanto, una población mayor necesitará más tiempo para morir que una más pequeña. Esto se puede comprobar con el experimento teórico de destrucción térmica que se muestra en la Tabla 7.1 y en la Figura 7.1. El mismo principio se aplica a los agentes químicos antimicrobianos.

2. Composición de la población. La eficacia de un agente varía considerablemente con la naturaleza de los organismos que se van a tratar porque éstos difieren sustancialmente en cuanto a susceptibilidad. Las endosporas bacterianas son mucho más resistentes a la mayoría de los agentes antimicrobianos que las formas vegetativas, y las células más jóvenes se destruyen normalmente con más facilidad que los organismos maduros. Por otra parte, algunas especies son capaces de soportar mejor que otras condiciones adversas. Mycobacterium tuberculosis, causante de la tuberculosis, es mucho más resistente a los agentes antimicrobianos que la mayoría de las bacterias.

3. Concentración o intensidad de un agente antimicrobiano. A menudo, pero no siempre, cuanto más concentrado esté un agente químico o más intenso sea uno físico, más rápidamente se destruyen los microorganismos. Sin embargo, la eficacia de un agente no está normalmente relacionada directamente con la concentración o intensidad. Así, un aumento pequeño de la concentración puede ocasionar un incremento exponencial de la eficacia, pero, por encima de este punto, puede que los aumentos no incrementen en absoluto la velocidad de destrucción. A veces, un agente es más eficaz en concentraciones más bajas. Por ejemplo, el etanol al 70 % es más eficaz que el de 95 %, ya que su actividad aumenta en presencia de agua.

4. Duración de la exposición. Cuanto más tiempo se exponga una población a un agente microbicida, más organismos se destruirán (Figura 7.1). Para conseguir una esterilización, hay que realizar una exposición suficiente para reducir la probabilidad de supervivencia a 10"6 o menos.

5. Temperatura. La actividad de los agentes químicos aumenta con la temperatura. Con frecuencia, concentraciones bajas de un desinfectante pueden ser eficaces a temperaturas más altas.

6. Ambiente local. La población microbiana que debe ser controlada no está aislada, sino en el contexto de una serie de factores ambientales que pueden ofrecerle protección o facilitar su destrucción. Por ejemplo, como el calor es más eficaz en medios con pH ácido, los alimentos y las bebidas acidas, como frutas y tomates, se pasteurizan con más facilidad que los alimentos con valores de pH más altos, como la leche. Otro factor ambiental importante es la materia orgánica que puede proteger a los microorganismos frente al calor y a los desinfectantes químicos. Por ello, puede ser necesario


limpiar un objeto antes de su desinfección o esterilización. Jeringuillas y equipamiento médico deberían limpiarse antes de la esterilización ya que la presencia de materia orgánica podría proteger a los patógenos, incrementando el riesgo de infección. El mismo cuidado hay que tener cuando se destruyen los agentes patógenos durante el tratamiento del agua para su potabilización. Cuando el suministro de agua de una ciudad tiene un contenido elevado de materia orgánica, hay que añadir más cloro para desinfectarlo. Los biofilms son también buenos ejemplos de condicionamientos en el control microbiano. La matriz orgánica que rodea el biofilm protegerá a los microorganismos, por ello, el biofilm y su microbiota son a menudo difíciles de eliminar.

Explique brevemente cómo varía la eficacia de los agentes antimicrobianos respecto del tamaño de la población, la composición de la población, la concentración o intensidad de un agente, la duración del tratamiento y las condiciones ambientales locales.

7.4 Control microbiano por métodos físicos

El calor y otros agentes físicos se suelen utilizar para esteri-lizar objetos, como lo demuestra el uso que todavía tiene el autoclave en todos los laboratorios de microbiología. Los cuatro agentes empleados con más frecuencia como agentes físicos son: calor, bajas temperaturas, filtración y radiación.

Calor

El fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esteri-lizar y desinfectar desde la época de los griegos, siendo el calor aún uno de los métodos más comunes para destruir microorganismos. Se puede aplicar húmedo o seco.

El calor húmedo destruye rápidamente los virus, las bacterias y los hongos (Tabla 7.2). Una exposición a agua en ebullición durante 10 minutos es suficiente para destruir células vegetativas y esporas de eucariotas. Lamentablemen-te, la temperatura de ebullición (100°C) no es suficiente para destruir endosporas bacterianas que pueden sobrevivir durante horas en ebullición. En consecuencia, este método se puede usar para desinfectar agua potable y objetos que no se dañen por el agua, pero no esteriliza.

Como el calor es tan eficaz para destruir los microorga-nismos, es esencial disponer de una medida precisa de su eficacia destructiva. Inicialmente, esta eficacia se expresaba con el punto de muerte térmica (PMT), la temperatura más baja a la que una suspensión microbiana se destruye en 10 minutos. Como el PMT implica que una determinada tem-peratura es letal a pesar de las condiciones ambientales, en

la actualidad se emplea más el término de tiempo de muerte

térmica (TMT). Se define como el tiempo más corto necesario para destruir todos los organismos de una suspen-sión microbiana, a una temperatura específica y en condicio-nes definidas. Sin embargo, esta destrucción es logarítmica y teóricamente no es posible «destruir completamente» los microorganismos de una muestra, incluso aumentando el tiempo de calentamiento. Por ello, la figura de tiempo de

reducción decimal (D) o valor D es más precisa y tiene más aceptación. El tiempo de reducción decimal es el tiem-po necesario para destruir el 90 % de los microorganismos o esporas en una muestra, a una temperatura específica. En una gráfica semilogarítmica en la que se representa la pobla-ción superviviente frente al tiempo de exposición al calor (Figura 7.1), el valor D es el tiempo necesario para que dis-minuya la población en un logaritmo (10 veces). El valor D

se escribe normalmente con un subíndice, que indica la tem-peratura aplicada. Estos valores se utilizan para estimar la resistencia relativa de un microorganismo a diferentes tem-peraturas a partir del cálculo del valor z. Este valor es el aumento de temperatura necesario para reducir D a 1/10 de su valor o en un logaritmo, cuando se representa log D frente a la temperatura (Figura 7.2). Otro método para describir la eficacia del calentamiento es el valor F. El valor F es el tiempo, en minutos, y a una temperatura determinada (nor-malmente, 121 °C), necesario para destruir una población de células o esporas.

La industria alimentaria utiliza frecuentemente los valo-res D y z. Por ejemplo, después de enlatar un alimento, hay que calentarlo para eliminar el riesgo de germinación de esporas de Clostridium botulinum. El tratamiento por calor se lleva a cabo durante el tiempo suficiente para reducir una población de 1012 esporas de C. botulinum a 10 (una espora); en consecuencia, hay muy pocas posibilidades de que las latas contengan una espora viable. El valor D para estas esporas es de 0.204 minutos, a 121 °C. Por ello, serían nece-sarios 12£> o 2.5 minutos para reducir 1012 esporas a una espora, calentando a 121 °C. El valor z para las esporas de C. botulinum es de 10 °C —esto es, se requiere un cambio de temperatura de 10 °C para modificar el valor D diez veces—. Si las latas se procesasen a 111 °C, en lugar de a


Figura 7.2 Cálculo del valor z. Valor z utilizado para calcular la relación entre el tiempo y la temperatura en la supervivencia de un determinado microorganismo, tomando como base los valores D a varias temperaturas. El valor z es el incremento de temperatura necesario para disminuir el tiempo de reducción decimal (D) en un 10%. Para este microorganismo concreto, el valor z es de 10.5 °C. Se representan los valores D en una escala logarítmica.

121 °C, el valor D aumentaría diez veces, a 2.04 minutos, y el valor 12D, a 24.5 minutos. En la Tabla 7.3 se indican los valores D y z para algunos agentes patógenos de origen ali-mentario. Se incluyen tres valores D para Staphylococcus

aureus para ilustrar la variación en la velocidad de destruc-ción en relación con el ambiente y el efecto protector de la materia orgánica. Procesamiento de alimentos (pp. 1051-1054); Botulismo (p. 1007).

La esterilización con calor húmedo debe realizarse a temperaturas superiores a 100 °C para destruir las endospo-

ras bacterianas; esto requiere la utilización de vapor satura-do bajo presión. La esterilización con vapor se realiza en un autoclave (Figura 7.3) aparato similar a una olla a presión. El desarrollo del autoclave por Chamberland, en 1884, esti-muló enormemente el progreso de la microbiología. Se hier-ve agua para producir vapor, que pasa a través de una cubierta al interior de la cámara del autoclave. Se expulsa el aire que inicialmente se encuentra en la cámara hasta que ésta queda llena de vapor saturado y se cierran las salidas. El vapor saturado y caliente continúa entrando en la cámara hasta que se alcanza la temperatura y presión deseadas, nor-malmente, 121 °C y 6.8 kg de presión. A esta temperatura, el vapor saturado puede destruir en 10-12 minutos todas las células vegetativas y endosporas presentes en un volumen pequeño de muestra. El tratamiento se continúa durante 15 minutos para conseguir un margen de seguridad. Evidente-mente, grandes contenedores o recipientes de muestras líquidas requerirán tratamientos más prolongados.

Se piensa que el vapor húmedo destruye eficazmente al degradar los ácidos nucleicos y desnaturalizar las enzimas y otras proteínas esenciales. También puede alterar las mem-branas celulares.

La esterilización en autoclave debe llevarse a cabo ade-cuadamente, de lo contrario los materiales procesados no quedarán estériles. Si no se extrae todo el aire de la cámara, no se alcanzará la temperatura de 121 °C, aunque puede alcanzar la presión de 6.8 kg. Los contenedores o recipientes no deben compactarse demasiado porque el vapor tiene que circular libremente y entrar en contacto con todo lo que esté dentro del autoclave. Las endosporas bacterianas se destrui-rán solamente si se mantiene una temperatura de 121 °C durante 10 a 12 minutos. Cuando hay que esterilizar un volumen grande, hay que alargar el tiempo de esterilización para que el centro del volumen alcance la temperatura de 121 °C; 5 litros de líquido pueden precisar casi 70 minutos. Debido a estos posibles inconvenientes, se suele esterilizar en el autoclave un indicador biológico junto con el resto del material. Este indicador consiste normalmente en una ampo-lla estéril con un medio y una tira de papel cubierta de espo-ras de Bacillus steamthermophilus o Clostridium PA3679.

Los valores se han tomado de F. L. Bryan, 1979, «Processes that Affect Survival and Growlh of Microorganisms», Time-Tcmperature Control of Foodbnrne pathogens, 1979. Atlanta: Ccnters for Disease Control and Prevenlion, Atlanta, GA, EE.UU.


Figura 7.3 Autoclave o esterilizador a vapor, (a) Autoclave moderno, controlado automáticamente o esterilizador, (b) Corte longitudinal de un autoclave típico mostrando algunas de sus partes y la ruta que sigue el vapor, (b) Tomado de John J. Perkins. Principies and Methods ofSterilization in Health Science, 2nd edition, 1969. Por cortesía de Charles C. Thomas, editor, Springfield, Illinois (EE.UU.).

Después del tratamiento en el autoclave, se rompe aséptica-mente la ampolla y el cultivo se incuba durante varios días. Si la bacteria indicadora no crece en el medio, se infiere que los materiales han quedado esterilizados. A veces se intro-duce también en el autoclave una cinta especial con la pala-bra estéril escrita, o una tira de papel indicador que cambia de color después de un tratamiento suficiente con calor. Si la palabra aparece en la cinta o si el color cambia después del tratamiento, se supone que el material está estéril. Estos métodos son prácticos y ahorran tiempo, pero no son tan fía-bles como el uso de endosporas bacterianas.

Muchas sustancias, como la leche, se tratan con calor controlado, a temperaturas por debajo del punto de ebulli-ción, proceso denominado pasteurización, en honor de

Louis Pasteur, quien desarrolló el proceso. En la década de 1860, la industria del vino francesa estaba acuciada por el problema del deterioro del vino, que dificultaba el almace-namiento y el transporte del vino. Pasteur examinó el vino alterado con el microscopio y detectó microorganismos que se parecían a las bacterias responsables de las fermentacio-nes del ácido láctico y del ácido acético. Entonces, observó que un calentamiento breve a una temperatura de 55 a 60 °C destruía estos microorganismos y conservaba el vino duran-te períodos largos de tiempo. En 1886, los químicos alema-nes V. H. y F. Soxhlet adaptaron la técnica para conservar la leche, disminuyendo las enfermedades transmisibles por ésta. La pasteurización se introdujo en los Estados Unidos en 1889. En la actualidad, se pasteurizan la leche, la cerveza


y otras bebidas. Este método no esteriliza una bebida, pero destruye cualquier agente patógeno que contenga y disminu-ye en gran medida la putrefacción, al reducir el nivel de microorganismos alterantes no patógenos.

La leche se puede pasteurizar de dos maneras. Según el método antiguo, la leche se mantenía a 63 °C durante 30 minutos. En la actualidad, grandes volúmenes de leche se someten a una pasteurización rápida o de «alta-temperatura y tiempo corto» (HTST, high-temperature short-term), que consiste en calentar rápidamente a 72 °C durante 15 segundos. La industria láctea utiliza también a veces la este-

rilización a temperatura ultraelevada (UHT, ultrahigh

temperature). La leche y los derivados lácteos se calientan a una temperatura de 140 a 150 °C durante 1 a 3 segundos. La leche tratada por UHT no necesita refrigeración y puede almacenarse a temperatura ambiente durante casi 2 meses sin que se produzcan cambios en el sabor. La porción cre-mosa del café que sirven en los restaurantes se prepara a menudo mediante esterilización por UHT. Pasteurización y la industria láctea (pp. 1052-1053).

Muchos objetos se esterilizan mejor en ausencia de agua mediante esterilización por calor seco. Los objetos que se van a esterilizar se colocan en una estufa a una tem-peratura de 160 a 170 °C durante 2 a 3 horas. La destrucción microbiana se produce aparentemente como consecuencia de la oxidación de los constituyentes celulares y la desnatu-ralización de las proteínas. Aunque el calor del aire seco es menos eficaz que el húmedo —las endosporas de Clostri-

dium botulinum son destruidas en 5 minutos a 121 °C por calor húmedo, pero son necesarias 2 horas a 160 °C, por calor seco—, posee ventajas claras. El calor seco no corroe utensilios de cristal ni metálicos, como lo hace el calor húmedo y puede emplearse para esterilizar polvo, aceite y otros materiales diversos. La mayoría de los laboratorios esterilizan el material de vidrio con calor seco. A pesar de estas ventajas, la esterilización por calor seco es lenta e ina-propiada para materiales termosensibles, corrió muchos objetos de plástico y goma.

Bajas temperaturas

Aunque hasta ahora se están discutiendo los sistemas para la destrucción de microorganismos, a menudo, la técnica de control más conveniente es inhibir su multiplicación mediante el empleo de la refrigeración o congelación. Este enfoque es particularmente importante en microbiología de los alimentos {véase la p. 1051). Una de las causas por la que, en general, los micoorganismos no se multiplican a las temperaturas de congelación (p. ej., -20 °C) es la ausencia de agua líquida libre. Incluso, a estas temperaturas algunos microorganismos son destruidos por los cristales de hielo que romperán sus membranas, aunque no destruirá todos. De hecho, la congelación es un buen procedimiento para la conservación de microorganismos por largos períodos de tiempo si se realiza apropiadamente, y numerosos laborato-

rios disponen de congeladores a -30 o -70 °C para la conser-vación de colecciones de cultivos microbianos. Debido a que la comida congelada puede contener numerosos microorga-nismos contaminantes, ésta debe prepararse y consumirse cuanto antes una vez descongelada, para evitar el crecimiento de microorganismos alterantes y patógenos. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano (pp. 132-135).

La refrigeración reduce enormemente el crecimiento microbiano pero no lo detiene completamente. Afortunada-mente, la mayoría de los patógenos son mesófilos y no se multiplican bien a temperaturas próximas a los 4°C. Los productos refrigerados pueden deteriorarse por el crecimien-to de microorganismos psicrófilos y psicrotrofos, particular-mente si está presente el agua. Por tanto, la refrigeración es un buen sistema para la conservación de alimentos u otros productos pero sólo durante cortos períodos de tiempo.

Filtración

La filtración es un método excelente para reducir, incluso esterilizar, la población microbiana en soluciones termosen-sibles. Más que destruir directamente los microorganismos contaminantes, el filtro simplemente los retira. Existen dos tipos de filtros. Los filtros de profundidad consisten en materiales fibrosos o granulosos que forman una capa grue-sa rellena de canales retorcidos de un diámetro pequeño. La solución que contiene los microorganismos se aspira a tra-vés de esta capa, quedando las células microbianas reteni-das, adsorbidas, en el filtro. Los filtros de profundidad se pueden fabricar con tierra de diatomeas (filtros de Berke-field), porcelana no vidriada (filtros de Chamberlain), asbes-tos o materiales similares.

Los filtros de membrana han sustituido a los de pro-fundidad en muchas aplicaciones. Estos filtros circulares son membranas porosas, con un grosor de aproximadamente 0.1 mm, de acetato de celulosa, nitrato de celulosa, po-licarbonato, fluoruro de polivinilo u otros materiales sinté-ticos. Aunque se dispone de una amplia variedad de tamaños, las membranas con poros de unos 0.2 \im de diá-metro se emplean para eliminar las células vegetativas, aun-que no virus, de soluciones con un volumen de 1 mL a varios litros. Las membranas se sujetan en soportes especia-les (Figura 7.4) y, a menudo, están precedidas por filtros de profundidad elaborados a partir de fibra de vidrio, para eli-minar partículas de mayor tamaño que podrían ocluir el fil-tro de membrana. Se pasa la solución por el filtro aplicando una presión con una jeringa, una bomba peristáltica o una botella de nitrógeno gas, o aspirándola tras aplicar vacío, y se recoge en recipientes esterilizados previamente. Los fil-tros de membrana eliminan los microorganismos cribándo-los, igual que un tamiz separa partículas de arena grandes de pequeñas (Figura 7.5). Estos filtros se utilizan para este-rilizar productos farmacéuticos, medios de cultivo, aceites, antibióticos y otras soluciones termosensibles. Uso de fil-tros de membrana para recuento microbiano (p. 125).


Figura 7.4 Esterilización con filtro de membrana. Equipo de filtro de membrana para esterilizar volúmenes intermedios de soluciones, (a) Corte transversal de la unidad de filtración de membrana. Se utilizan varias membranas para aumentar su efectividad, (b) Equipo completo de filtración. Se coloca la solución por esterilizar en un matraz (/), y se pasa por el filtro con ayuda de una bomba peristáltica (2). La solución se esteriliza al pasar por la unidad de filtración (3), recogiéndose en un recipiente estéril. Hay una gran variedad de equipos de filtración similares.

El aire también puede esterilizarse por filtración. Dos ejemplos muy comunes son las mascarillas y los tapones de algodón en los tubos de cultivo que permiten el paso del aire, pero sin microorganismos. Las cabinas de seguridad

biológica de flujo laminar utilizan filtros de alta eficacia

de retención de partículas del aire (HEPA, high-effi-

ciency particulate air), son uno de los sistemas de filtración de aire más importantes, capaces de eliminar el 99.97 % de las partículas de 0.3 (xm. Las cabinas de seguridad biológica de flujo laminar fuerzan al aire a través de filtros HEPA, cre-ando una cortina vertical de aire estéril en el frontal de la

cabina. Esto protege al trabajador frente a los microorganis-mos que esté manipulando en el interior de la cabina y evita la contaminación de la habitación (Figura 7.6). Se debe uti-lizar este tipo de cabina cuando se está trabajando con agen-tes peligrosos, como Mycobacterium tuberculosis, virus tumorales, y cuando se manipula DNA, para evitar su conta-minación. También se emplean en laboratorios de investiga-ción e industrias, como la farmacéutica, cuando se necesita una superficie de trabajo estéril para realizar los ensayos, preparar los medios, examinar los tejidos y otras actividades similares.

Figura 7.5 Tipos de filtro de membrana, (a) Bacillus megaterium sobre una membrana de nailon Ultipor con una capacidad de retención bacteriana de 0.2 uní (X2000). (b) Enterococcus faecalis sobre un filtro de membrana de policarbonato con poros de 0.4 um (x5900).


Figura 7.6 Cabina de seguridad biológica de flujo laminar,

(a) Técnico de laboratorio pipeteando un material potencialmente peligroso en una cabina de seguridad, (b) Diagrama esquemático mostrando el diagrama de flujo del aire.

Radiación

Los tipos de radiación y las formas en que daña o destruye a los microorganismos se han discutido ya previamente. Las aplicaciones de las radiaciones ultravioleta e ionizante para esterilizar objetos se describen brevemente a continuación. Radiación y sus efectos sobre los microorganismos (pp. 137-139).

La radiación ultravioleta (UV) de aproximadamente 260 nm {véase la Figura 6.17) es bastante letal, pero no atra-viesa eficazmente el cristal, las películas de suciedad, el agua ni otras sustancias. Debido a este inconveniente, la radiación UV se emplea como agente esterilizante en muy pocas situaciones. Las lámparas UV se colocan a veces en los techos de las habitaciones o en cabinas de seguridad bio-lógica para esterilizar el aire y cualquier superficie expuesta. Como la radiación UV quema la piel y lesiona los ojos, las personas que trabajan en estas zonas deben asegurarse de que estas lámparas estén apagadas cuando trabajen allí. Hay disponibles unidades de luz UV comerciales para el trata-miento del agua. Los agentes patógenos y otros microorga-nismos mueren al pasar una capa delgada del agua contami-nada bajo las lámparas.

La radiación ionizante es un agente esterilizante exce-lente y penetra en los objetos. Destruirá endosporas bacte-rianas y células vegetativas, tanto procariotas como eucario-tas; sin embargo, la radiación ionizante no es siempre tan efectiva frente a virus. La radiación gamma procedente de una fuente de cobalto 60 se utiliza para esterilizar en frío:

antibióticos, hormonas, suturas y suministros desechables de plástico, como jeringas. La radiación gamma se ha empleado también para esterilizar y «pasteurizar» carne y otros alimentos. La radiación puede eliminar de los alimen-tos patógenos como Escherichia coli O157:H7, Staphylo-

coccus aureus y Campylobacter jejuni. Tanto el Departa-mento de Alimentación y Fármacos de los EE.UU. (FDA, Food and Drug Administration) como la Organización Mun-dial de la Salud han aprobado la irradiación de los alimen-tos, y la consideran segura. Una instalación de irradiación comercial funciona en Tampa, Florida (EE.UU.). Sin embar-go, este proceso no se ha utilizado todavía ampliamente en los EE.UU. debido a su coste y por las dudas que existen sobre los efectos de la radiación gamma en los alimentos. Diversos gobiernos, como el de los EE.UU., han aprobado la utilización de la radiación para tratar aves de corral, carnes de ternera, cerdo y cordero, frutas, verduras y especias. Pro-bablemente, su uso se ampliará aún más en el futuro.

Defina: punto de muerte térmica (PMT), tiempo de muerte térmica (TMT), tiempo de reducción decimal (o valor D), valor z y valor F.

Describa el funcionamiento del autoclave. ¿Qué condiciones se requieren para esterilizar con calor húmedo y cuáles son las tres fases que hay que realizar cuando se trabaja con un autoclave, con el fin de garantizar un resultado positivo?


3. ¿Cómo se realizan la pasteurización, pasteurización rápida, esterilización con temperatura ultraelevada y esterilización por calor seco? Dé algunas aplicaciones prácticas de cada uno de estos métodos.

4. ¿De qué manera se pueden emplear las bajas temperaturas para el control microbiano?

5. ¿Qué son los filtros de profundidad y filtros de membrana y cómo se emplean para esterilizar líquidos? Describa el funcionamiento de una cabina de seguridad biológica.

6. Exponga las ventajas e inconvenientes de la luz ultravioleta y de la radiación ionizante como agentes esterilizantes. Indique algunos ejemplos de cómo se utiliza cada una con ese propósito.

7.5 Control microbiano por agentes químicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes físi-cos, las sustancias químicas se utilizan con más frecuencia para la desinfección y la antisepsia. Muchos factores influ-yen en la eficacia de los desinfectantes y antisépticos quí-micos, como ya se ha expuesto anteriormente. Hay que tener en cuenta factores como la clase de microorganismos

potencialmente presentes, la concentración y naturaleza del desinfectante que se emplee y la duración del trata-miento. Las superficies sucias deben limpiarse antes de aplicar un desinfectante o antiséptico. Un uso apropiado de los agentes químicos es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales (Recuadro 7.2; véase también el

Recuadro 36.1). Hay que destacar que los productos quí-micos se utilizan también para evitar el crecimiento micro-biano en los alimentos. Este aspecto se analiza en el ca-pítulo correspondiente a la microbiología de alimentos (véase la p. 1053).

Numerosos agentes químicos están disponibles para ser utilizados como desinfectantes, y cada uno tiene sus propias ventajas e inconvenientes. Para seleccionar un agente es importante tener presentes las características del desinfec-tante ideal. El paradigma de los desinfectantes debe ser efi-caz frente a una amplia variedad de agentes infecciosos (bacterias Gram positivas, Gram negativas, y ácido-alcohol resistentes, endosporas bacterianas, hongos y virus) tanto en diluciones elevadas como en presencia de materia orgánica. Aunque el producto químico debe ser tóxico para los agen-tes infecciosos, no debe serlo para las personas ni corrosivo para los materiales comunes. En la práctica, este balance entre efectividad y baja toxicidad para los animales es difícil de alcanzar. Algunos compuestos químicos se utilizan a pesar

Precauciones generales en laboratorios de Microbiología

a sangre y los líquidos corporales de los pacientes deben considerarse infecciosos.

1. Todas las muestras de sangre y líquidos corporales deben guardarse en un recipiente adecuado con tapón para evitar su derrame durante el transporte. Hay que tener precaución cuando se recoja cada muestra para evitar la contaminación del exterior del recipiente y de la etiqueta que acompaña la muestra.

2. Todas las personas que analicen sangre y muestras de líquidos corporales deben llevar guantes. Ante la posibilidad de un posible contacto de la mucosa con sangre o líquidos corporales del paciente, es necesario el uso de mascarilla y gafas protectoras. Hay que cambiarse de guantes y lavarse las manos después de tomar la muestra.

3. En análisis rutinarios, como estudios histológicos y anatomopatológicos o cultivos microbiológicos, no es necesario utilizar una cabina de seguridad. Sin embargo, estas cabinas deben emplearse cuando se realicen análisis de muestras con una posibilidad importante de generar aerosoles, por ejemplo, si se van a realizar mezclas, sonicación o una agitación intensa.

4. Hay que utilizar pipetas automáticas para manipular todos los líquidos en el laboratorio. No se debe pipetear con la boca.

5. Hay que limitar el uso de jeringas y agujas a situaciones en las que no haya otra alternativa, y siempre hay que seguir las recomendaciones generales para evitar lesiones con agujas (véase el Recuadro 36.1, p. 895).

6. Hay que descontaminar todas las superficies de trabajo con un germicida químico apropiado después de un derrame de sangre y otros líquidos corporales y cuando se haya finalizado el trabajo.

7. Los materiales contaminados empleados en las pruebas de laboratorio deben limpiarse y descontaminarse antes de ser reprocesados, o bien, guardarlos en bolsas y eliminarlos de acuerdo con las normas administrativas para residuos infecciosos.

8. El equipo de laboratorio que se haya contaminado con sangre u otros líquidos corporales debe descontaminarse y limpiarse antes de su reparación o de remitirlo al fabricante.

9. Todas las personas deben lavarse las manos después de finalizar las actividades de laboratorio y quitarse la ropa protectora antes de dejar el laboratorio.

10. No se debe comer, beber ni fumar en el área de trabajo.

Fuente: adaptado de Morbidity and Moitality Weekly Report, 36 (Suppl. 2S) 5S-10S, 1987, Centers for Disease Control and Prevention Guidelines.

L


de su baja efectividad ya que son relativamente no-tóxicos. Los desinfectantes deben ser estables al almacenamiento, sin olor o con un olor agradable, solubles en agua y lípidos para que puedan penetrar en los microorganismos, y con una tensión superficial baja, de manera que puedan entrar en los pequeños resquicios de las superficies. Si es posible, el desinfectante debe ser económico.

Sin embargo, el uso indebido de los desinfectantes puede conllevar serios problemas. Un ejemplo lo tenemos en el desinfectante triclosán, ampliamente empleado en productos tan variados como desodorantes, colutorios, jabones, e incluso en juguetes de niños. El triclosán parece encontrarse en cualquier lugar. Desgraciadamente, ya se ha detectado una cepa de Pseudomonas aeruginosa resistente al triclosán, que emplea una bomba activa para expulsar el antiséptico al exterior. Las bacterias parece que responden al abuso de los antisépticos de la misma forma como han reaccionado al abuso de los antibióticos {véanse las pp. 883-

886). Incluso, algunas evidencias señalan que el uso exten-sivo del triclosán también incrementa la frecuencia de resis-tencia a los antibióticos en bacterias. Así, el abuso en el empleo de los antisépticos puede presentar inesperadas consecuencias dañinas.

A continuación, se analizan las propiedades y usos de varios grupos de desinfectantes y antisépticos comunes. Muchas de sus características se resumen en las Tablas 7.4

y 7.5. Las estructuras químicas de algunos agentes comunes se ilustran en la Figura 7.7.

Compuestos fenólicos :

El fenol fue el primer antiséptico y desinfectante de uso generalizado. En 1867, Joseph Lister lo empleó para reducir el riesgo de infección durante las operaciones quirúrgicas. Actualmente, el fenol y sus derivados, como cresoles, xilenos y ortofenilfenoles se emplean como desinfectantes en labora-torios y hospitales. El desinfectante comercial Lysol está ela-borado a partir de una mezcla de compuestos fenólicos. Estos productos actúan desnaturalizando las proteínas y alterando las membranas celulares. Poseen algunas ventajas claras como desinfectantes: son tuberculocidas, eficaces en presen-cia de materia orgánica y permanecen activos en superficies después de mucho tiempo de su aplicación. Sin embargo, tie-nen un olor desagradable y pueden causar irritación cutánea. El hexaclorofeno (Figura 7.7) ha sido uno de los anti-sépticos más comunes porque persiste activo en la piel des-pués de su aplicación durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, puede producir lesiones cerebrales, y actualmente únicamente se emplea en los departamentos infantiles de los hospitales frente a brotes infecciosos por estafilococos.

Alcoholes

Los alcoholes se encuentran entre los desinfectantes y anti-sépticos más utilizados. Son bactericidas y fungicidas, pero no esporicidas; destruyen también algunos virus con envoltu-

Fuente: Seymour S. Block, Desinfection, Sterilization and Preservation. Derechos reservados © 1983 Lea & Febiger, Malvern, PA, EE.UU. 1983. Reimpreso con autorización. a Los desinfectantes de alto nivel destruyen las bacterias vegetativas, incluyendo M. tuberculosis, endosporas bacterianas, hongos y virus. Los de nivel intermedio destruyen lodas las formas anteriores, excepto las endosporas. Los de nivel bajo destruyen células vegetativas bacterianas excepto M. tuberculosis, hongos y virus con envoltura de tamaño medio (pero no endosporas bacterianas ni virus pequeños desnudos, sin envoltura). b En autoclave, entre 55 y 60 °C. c Yodo disponible d Cloro libre.


Clase Desinfectante Antiséptico Comentarios

Gas Óxido de etileno 3-4" O" Esporicida; tóxico; buena penetración; precisa una humedad relativa del

30% o superior; su actividad microbicida varía con el aparato que se emplee; lo absorbe el material poroso; las esporas secas son muy resistentes; debe haber humedad y es preferible mojar previamente los objetos

Liquido Glutaraldehído, acuoso Peróxido de hidrógeno estabilizado Formaldehído + alcohol Formaldehído, acuoso Derivados fenólicos

3 3 3 1-2 3

o o

o

o o

Compuestos clorados 1-2 0

Alcohol 1 3

Yodo + alcohol Yodóforos Yodo, acuoso Compuestos de amonio cuaternario

0 1-2 0 1

4 3 2 0

Hexaclorofeno 0 2

Clorhexidina Compuestos mercuriales

0 0 3 ±

Esporicida; solución activa inestable; tóxico Esporicida; la solución estable dura hasta 6 semanas; tóxico oral y

ocular; tóxico cutáneo leve; se inactiva algo por la materia orgánica Esporicida; desprende gases nocivos; tóxico; volátil Esporicida; desprende gases nocivos; tóxico Estables; corrosivos; se inactivan algo por la materia orgánica; irritan

la piel Acción rápida; se inactivan por la materia orgánica; corrosivos; irritan

la piel Microbicida rápido excepto para las esporas bacterianas y algunos virus;

volátil; inflamable; seca e irrita la piel Corrosivo; microbicida muy rápido; tiñe; irrita la piel; inflamable Algo inestables; relativamente suaves; tifien temporalmente; corrosivos Microbicida rápido; corrosivo; tiñe tejidos; tiñe e irrita la piel Suaves; se inactivan con el jabón y los detergentes aniónicos; los tejidos

los absorben; una solución antigua o diluida puede mantener el crecimiento de bacterias Gram negativas Suave; insoluble en agua,

soluble en alcohol; no se inactiva por el jabón; bactericida débil

Suave; soluble en agua y alcohol; bactericida débil Suave; se inactiva mucho por la materia orgánica; bactericida débil

Fuente: a partir de Seymour S. Block, Desinfection, Sterilization and Preservation. Derechos reservados © 1983 Lea & Febiger, Malvern, PA, EE.UU. 1983. Reimpreso con autorización. " Rango subjetivo de la utilidad práctica en un hospital (4 es de utilidad máxima; 0, de poca o nula; ± significa que una sustancia puede ser útil a veces, pero no siempre).

ra lipídica. Los dos alcoholes germicidas más comunes son el etanol y el isopropanol, empleados normalmente en una con-centración del 70 a 80 %. Actúan desnaturalizando las prote-ínas y, quizás, disolviendo los lípidos de membrana. Se requiere una inmersión en estos alcoholes durante 10 a 15 minutos para desinfectar termómetros y otros instrumentos.

Halógenos

Los halógenos pertenecen al grupo VIIA de la tabla periódi-ca (flúor, cloro, bromo, yodo y astatino). Existen en forma de moléculas diatómicas en estado libre, y forman sales con sodio y la mayoría del resto de los metales. Yodo y cloro son agentes antimicrobianos importantes. El yodo se utiliza como antiséptico cutáneo, y destruye los microorganismos al oxidar los constituyentes celulares y formar compuestos de yodo con las proteínas celulares. En concentraciones ele-vadas, puede incluso destruir algunas esporas. A menudo se aplica yodo como tintura de yodo al 2 % o más en una solu-ción de agua y etanol de yoduro potásico. Aunque es un antiséptico eficaz, puede lesionar la piel, deja manchas y se

pueden desarrollar alergias al yodo. Más recientemente, se ha combinado el yodo con un adyuvante orgánico para for-mar un yodóforo. Los yodóforos son hidrosolubles, esta-bles, no tiñen y liberan el yodo lentamente para minimizar las quemaduras e irritación en la piel. Se emplean en hospi-tales como antiséptico preoperatorio y como desinfectantes en hospitales y laboratorios. Algunas marcas comerciales conocidas son Wescodyne como antiséptico cutáneo y desinfectante de laboratorios, y Betadine para heridas.

El cloro es el desinfectante habitual del agua municipal y de las piscinas, y se emplea también en las industrias lácteas y alimentarias. Puede aplicarse como cloro gas, hipoclorito sódico o hipoclorito calcico, todos ellos producen ácido hipocloroso (HC1O) y, luego, oxígeno atómico. El resultado es la oxidación de materiales celulares y la destrucción de bacterias vegetativas y hongos, aunque no de esporas.


La destrucción de casi todos los microorganismos se produce en 30 minutos. La materia orgánica interfiere con la acción del cloro al reaccionar éste, por ello, se añade un exceso de cloro para asegurar la destrucción microbiana. Sin embargo, hay que tener en cuenta un problema potencial, y es que el cloro reacciona con la materia orgánica formando trihalometanos, compuestos cancerígenos, por lo que deben ser determinados periódicamente en el agua de bebida. En algunas ocasiones se ha empleado el ozono como alternativa al cloro en Europa y Canadá. Depuración de las aguas muni-cipales (pp. 701-704).

El cloro es también un excelente desinfectante para uso individual porque es eficaz, barato y fácil de manejar. Se pueden desinfectar pequeñas cantidades de agua potable con pastillas de halazona. Este producto (ácido dicloroamido-benzoico parasulfona) libera lentamente cloro cuando se añade al agua y la desinfecta en aproximadamente media

hora. Las utilizan con frecuencia los excursionistas que no tienen acceso a agua potable no contaminada.

Las soluciones de cloro son muy eficaces para desinfec-tar laboratorios y hogares. Una combinación excelente de desinfectante y detergente puede prepararse a partir de una dilución 1/100 de lejía de uso doméstico (10 mL de lejía/L) y una suficiente cantidad de detergente no iónico (7.8 mL/L, para obtener una concentración de detergente del 0.8 %). Esta mezcla elimina tanto la suciedad como las bacterias.

Metales pesados

Durante muchos años, los iones de metales pesados, como mercurio, plata, arsénico, cinc y cobre se han empleado como germicidas, aunque muchos metales pesados son más bacteriostáticos que bactericidas. Recientemente, se han

ntes.

7.6 Evaluación de la eficacia de los agentes antimicrobianos 159

sustituido por otros menos tóxicos y con un mayor poder germicida, aunque algunos de los tradicionales siguen utili-zándose, como la plata. Una solución del 1 % de nitrato de plata se aplica a menudo en los ojos de los niños para preve-nir gonorrea oftálmica (en muchos hospitales, se utiliza en su lugar eritromicina porque es eficaz frente a los géneros Chlamydia y Neisseria). La sulfadiazina de plata se emplea en quemaduras. El sulfato de cobre es un algicida potente muy utilizado en lagos y piscinas.

Los metales pesados se combinan con las proteínas, a menudo con sus grupos sulfhidrilos, inactivándolas. Tam-bién pueden precipitar las proteínas celulares.

Compuestos de amonio cuaternario

Los detergentes [latín deterger, limpiar] son moléculas orgánicas que actúan como agentes humectantes y emulsio-nantes porque poseen tanto extremos hidrófilos polares como hidrófobos no polares. Debido a su naturaleza anfipá-tica (véase la sección 3.2), los detergentes son capaces de solubilizar residuos que son insolubles en agua, por lo que se les considera agentes limpiadores muy eficaces. Son dife-rentes a los jabones, que se derivan de las grasas.

Aunque los detergentes aniónicos tienen algunas propie-dades antimicrobianas, sólo los catiónicos son desinfectantes eficaces. Los más comunes son los compuestos de amonio cuaternario, caracterizados por poseer nitrógeno cuaternario cargado positivamente y una cadena alifática hidrófoba larga (Figura 7.7). Estos productos alteran las membranas micro-bianas y pueden también desnaturalizar las proteínas.

Los detergentes catiónicos como el cloruro de benzalco-nio y el cloruro de cetilpiridineo destruyen la mayoría de las bacterias, pero no a M. tuberculosis ni las endosporas. Presen-tan las ventajas de ser estables, no tóxicos, suaves, pero se inactivan por el agua dura y el jabón. Los detergentes catióni-cos se emplean a menudo como desinfectantes de utensilios de alimentación y pequeños instrumentos, y son antisépticos cutáneos. Hay varias marcas comerciales: Zephiran contiene cloruro de benzalconio, y Ceepryn, cloruro de cetilpiridineo.

Aldehidos

Los dos aldehidos más utilizados, el formaldehído y el glu-taraldehído, son moléculas muy reactivas que se combinan con ácidos nucleicos y proteínas, inactivándolos, probable-mente al formar puentes cruzados y mediante alquilación (Figura 7.7). Son esporicidas y pueden emplearse como esterilizantes químicos. El formaldehído se disuelve normal-mente en agua o alcohol, antes de su uso. Una solución tam-ponada al 2 % de glutaraldehído es un desinfectante eficaz. Es menos irritante que el formaldehído y se utiliza para desinfectar material en hospitales y laboratorios. El glutaral-dehído desinfecta normalmente objetos en 10 minutos, pero requiere hasta 12 horas para destruir todas las esporas.

Gases esterilizantes

Muchos objetos termosensibles, como placas de Petri y jerin-gas desechables, piezas de las máquinas pulmón-corazón, suturas y catéteres se esterilizan actualmente con el gas óxido de etileno (Figura 7.7). El óxido de etileno (OE) es tanto microbicida como esporicida; destruye los microorganismos al combinarse con las proteínas celulares. Es particularmente eficaz como agente esterilizante porque penetra rápidamente a través de materiales embalados, incluso envolturas de plástico.

La esterilización se lleva a cabo en un esterilizador espe-cial de óxido de etileno, que recuerda bastante a un autocla-ve, que controla la concentración del OE, la temperatura y la humedad. Como el OE puro es explosivo, se suministra nor-malmente en una concentración entre el 10 y el 20 % mezcla-do con CO2 o diclorodifluorometano. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 horas a 38 °C, o de 3 a 4 horas a 54 °C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de OE es de 700 mg/L. Es necesario airear extensamente los materiales esterilizados para eliminar el OE residual porque es muy tóxico.

Betapropiolactona (BPL) se emplea a veces como gas esterilizante. En forma líquida se ha empleado para esterilizar vacunas y sueros. La BPL se degrada hasta una forma inacti-va después de varías horas y, por ello, no es tan difícil de eli-minar como el OE. También destruye los microorganismos más rápidamente que el óxido de etileno, pero no penetra tan bien los materiales y puede ser cancerígeno. Por estas razo-nes, la BPL no se ha empleado tan ampliamente como el OE.

Recientemente, se ha utilizado peróxido de hidrógeno en fase de vapor para descontaminar cabinas de seguridad biológicas.

1. ¿Por qué la mayoría de los agentes químicos antimicrobianos son desinfectantes, en lugar de esterilizantes? ¿Qué características generales se deberían tener en cuenta en relación con un desinfectante?

2. Describa cada uno de los siguientes agentes, según su naturaleza química, mecanismo de acción, modo de aplicación, usos comunes, eficacia, ventajas e inconvenientes: fenoles, alcoholes, halógenos (yodo y cloro), metales pesados, compuestos de amonio cuaternario, aldehidos y óxido de etileno.

7.6 Evaluación de la eficacia de los agentes

antimicrobianos

El análisis de los agentes antimicrobianos es un proceso complejo regulado en los EE!UU. por dos organismos fede-rales diferentes. El Departamento de Protección Ambiental controla los desinfectantes, mientras que los agentes que se


utilizan en seres humanos y animales están bajo el control de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA). El análisis de agentes antimicrobianos comienza a menudo con una prueba de investigación inicial para ver si son eficaces y a qué concentraciones. Esto puede continuar con un ensayo en condiciones más próximas a su uso real.

El método más utilizado para el estudio de un desinfec-tante es la prueba del coeficiente fenólico en la que se compara la eficacia de un desinfectante con la del fenol. Se prepara una serie de diluciones de fenol y del desinfectante experimental, y se inoculan con las bacterias de ensayo Sal-

monella typhi y Staphylococcus aureus; luego se mantienen en un baño a una temperatura entre 20 y 37 °C. A continua-ción, a intervalos de 5 minutos, se toman muestras de estos tubos que se cultivan en medios frescos comunes durante dos o más días. La mayor dilución del agente que destruya las bacterias después de 10 minutos de exposición, pero no después de 5 minutos, se emplea para calcular el coeficiente fenólico. El recíproco de esta dilución del desinfectante experimental se divide entre la del fenol para obtener el coe-ficiente. Si suponemos que la dilución del fenol era 1/90, y la dilución eficaz máxima de un desinfectante X fuese 1/450, el coeficiente fenólico de X sería 5. Un valor superior a 1 significa que el desinfectante es más eficaz que el fenol. Cuanto mayor sea el valor del coeficiente fenólico, más efi-caz será el desinfectante en estas condiciones del ensayo. En la Tabla 7.6 se presentan los valores de coeficientes fenóli-cos de algunos desinfectantes representativos.

La prueba del coeficiente fenólico es un método muy útil para el cribado inicial de un potencial desinfectante, pero este valor puede ser engañoso si se considera como una indicación directa de la potencia de un desinfectante durante su uso normal. Esto se debe a que el coeficiente fenólico se determina en condiciones rigurosamente controladas con cultivos puros bacterianos, mientras que los desinfectantes se utilizan normalmente en poblaciones mixtas, en presencia de materia orgánica y en variadas condiciones ambientales, como pH, temperatura y presencia de sales.

Para estimar con mayor precisión la eficacia de un desinfectante, se emplean a menudo otras pruebas. Se pue-den determinar y comparar la velocidad de destrucción de bacterias seleccionadas en presencia de diferentes agentes químicos. También se puede realizar la prueba de la dilu-

Tabla 7.6 Coeficientes fenólico

para algunos desinfectantes

Coeficiente fenólico"

Salmonella Staphylococcus Desinfectante typhi aureus Fenol 1 1 Cloruro de cetilpiridineo 228 337 O-fenilfenol 5 6 (20 °C) 4.0 p-cresol 2.0-2.3 2.3 Hexaclorofeno 5-15 15-40 Mertiolato 600 62.5 ' Mercurocromo 2.7 5.3 Lysol 1.9 3.5 ' Alcohol isopropílico 0.6 0.5 Etanol 0.04 0.04 Solución de I2 al 2 % en EtOH 4.1-5.2 (20 °C) 4.1-5.2 (20 °C)

* Todos los valores se han determinado a 37 °C excepto cuando se indique otra

temperatura.

ción de uso, para determinar la concentración más apropia-da del agente químico para su utilización en unas condicio-nes determinadas de uso. El ensayo se realiza en unas condi-ciones ambientales rigurosamente controladas, miméticas a las de su potencial uso real. Se contaminan cilindros de acero inoxidable con unas determinadas especies bacteria-nas. Los cilindros se secan ligeramente, se introducen en los desinfectantes de ensayo durante 10 minutos, y se pasan a un medio de cultivo donde se incubarán durante dos días. Así, se determina la concentración del desinfectante que destruye los organismos de la muestra en estas condiciones con un nivel de confianza del 95 %. Los desinfectantes se pueden también ensayar en condiciones diseñadas para simular situaciones de uso real. Estas técnicas permiten defi-nir con precisión una concentración apropiada del desinfec-tante para una situación particular.

1. Describa brevemente la prueba del coeficiente fenólico.

2. ¿Por qué puede ser necesario utilizar técnicas como la dilución de uso y las pruebas de uso real?

La esterilización es el proceso por el que todas las células vivas, esporas viables, virus y viroides son destruidos o eliminados de un objeto o habitat. La desinfección consiste en la destrucción, inhibición o eliminación de microorganismos (pero no necesariamente endosporas) que pueden causar enfermedad. Se emplean muchos términos para definir los sistemas de control de los

Resumen

microorganismos: esterilizante, desinfectante, saneamiento, antisepsia y antiséptico.

3. El sufijo -cida se emplea cuando un agente antimicrobiano destruye organismos; mientras que el sufijo -stático se emplea cuando el agente evita el crecimiento y la multiplicación; así, por ejemplo, un agente será bactericida o bacteriostático.

4. La muerte microbiana es normalmente exponencial o logarítmica (Figura 7.1).

5. La eficacia de un producto desinfectante o esterilizante depende del tamaño y composición de la población, la concentración o intensidad del agente, la duración de la exposición, la temperatura y la naturaleza del ambiente local.

Preguntas para razonar y repasar 161

6. La eficacia de la destrucción térmica se representa a menudo por el tiempo de muerte térmica o tiempo de reducción decimal.

7. Aunque el tratamiento en agua en ebullición durante 10 minutos destruye las formas vegetativas, hay que utilizar un autoclave para destruir las endosporas, calentando a una temperatura de 121 °C y 6.8 kg de presión (Figura 7.3).

8. El calor húmedo destruye los ácidos nucleicos, desnaturaliza las enzimas y otras proteínas y altera las membranas celulares.

9. Los líquidos termosensibles se pueden pasteurizar a una temperatura de 63 °C durante 30 minutos o a 72 °C durante 15 segundos (pasteurización rápida). Se puede también calentar entre 140 y 150 °C durante 1 a 3 segundos (esterilización a temperatura ultraelevada).

10. Los utensilios de cristal y otros objetos termoestables se pueden esterilizar con calor seco, entre 160 y 170 °C durante 2 a 3 horas.

11. La refrigeración y congelación se pueden utilizar para controlar el crecimiento y multiplicación microbiana.

12. Se pueden eliminar eficazmente los microorganismos por filtración, con filtros de profundidad o de membrana.

13. Las cabinas de seguridad biológica esterilizan el aire por filtración con filtros de alta eficacia de retención de partículas (Figura 7.6).

14. Las radiaciones de longitud delonda corta (ultravioleta) e ionizantes de alta energía pueden utilizarse para esterilizar objetos.

15. Los agentes químicos actúan normalmente como desinfectantes, y no como esterilizantes, porque no pueden destruir fácilmente las endosporas bacterianas. La eficacia de un desinfectante depende de su concentración, la duración del tratamiento, la temperatura y la presencia de materia orgánica (Figuras 7.4 y 7.5).

16. Los fenoles y alcoholes son antisépticos y desinfectantes comunes que actúan desnaturalizando las proteínas y alterando las membranas celulares (Figura 7.7).

17. Los halógenos (yodo y cloro) destruyen los microorganismos al oxidar los constituyentes celulares; también pueden formar complejos yodados con las proteínas. El yodo se aplica en forma de tintura o yodóforo. El cloro se

puede añadir al agua en forma de gas, hipoclorito o como derivado orgánico clorado.

18. Los metales pesados tienden a ser agentes bacteriostáticos. Se utilizan en situaciones especiales, como el nitrato de plata en los ojos de los recién nacidos, y sulfates de cobre en lagos y piscinas.

19. Los detergentes catiónicos se utilizan a menudo como desinfectantes y antisépticos; alteran las membranas y desnaturalizan las proteínas.

20. Los aldehidos como el formaldehído y el glutaraldehído pueden esterilizar y desinfectar porque destruyen endosporas.

21. El gas óxido de etileno penetra material de embalaje de plástico y destruye todas las formas de vida al reaccionar con las proteínas. Se emplea para esterilizar materiales termosensibles embalados.

22. Se pueden aplicar diversos métodos para determinar la eficacia de los desinfectantes, entre otros: la prueba del coeficiente fenólico, medición de la velocidad de destrucción con germicidas, ensayo de la dilución de uso, y pruebas de uso real.

agente antimicrobiano 148

algicida 147 antisepsia

147 antiséptico 147

autoclave 150 bactericida

147 bacteriostático 147 cabinas de seguridad biológica de flujo

laminar 153 desinfección 147

desinfectante 147

detergente 159

Palabras clave esterilización a temperatura ultraelevada

(UHT) 152 esterilización por calor seco 152

esterilización 147 filtros de alta eficacia de retención de partículas

del aire (HEPA) 153 filtros de membrana 152 filtros de profundidad 152 fungicida 147 fungistático 147 germicida 147 pasteurización

rápida 152 pasteurización 151

prueba del coeficiente fenólico 160 prueba de la dilución de uso 160 radiación ionizante 154 radiación ultravioleta 154 saneamiento 147 tiempo de muerte térmica (TMT) 149 tiempo de reducción decimal (D) 149 valor D 149 valor F 149 valor z 149 virocida 147 yodóforo 157

1. ¿Cómo se puede usar el valor D para estimar el tiempo necesario para esterilizar? Suponga que desea eliminar el riesgo de intoxicarse con Salmonella calentando su alimento. Considere que en esas condiciones: Dm = 0.40 minutos, valor z = 5.0. Calcule el valor \2D a 60 °C. ¿Cuánto se tardará en conseguir los mismos resultados calentando a 50, 55 y 65 °C?

2. ¿Cómo se pueden modificar las condiciones para aumentar la eficacia de un desinfectante?

3. ¿De qué forma se esterilizará mejor cada uno de los siguientes materiales: pipetas y matraces de cristal, tubos con caldo de

Preguntas para razonar y repasar

triptona y soja, agar nutritivo, solución antibiótica, interior de una cabina de seguridad biológica, placas de Petri de plástico embaladas?

4. ¿Qué desinfectantes o antisépticos se emplearán para tratar los siguientes materiales: termómetro de vidrio oral, superficie de las encimeras de laboratorios, agua de consumo, una zona de la piel antes de una intervención quirúrgica, instrumentos médicos pequeños (sondas, pinzas, etc.)? Enumere los productos químicos adecuados para cada caso.

5. Hasta relativamente hace poco tiempo, la leche en malas condiciones era responsable de una proporción importante de mortalidad infantil.

a. ¿Por qué se deteriora fácilmente la leche no tratada?

b. ¿Por qué no es conveniente hervir la leche durante un tiempo prolongado?

6. En la Tabla 7.3, ¿por qué el valor D es tan diferente en esas tres condiciones en las que S. aureus puede ser detectado?


Cuestiones para reflexionar

I. A lo largo de la historia, las especias se han utilizado como conservantes y para enmascarar los olores y sabores de los alimentos ligeramente deteriorados. El éxito de algunas especias permitió su utilización de una forma ritualizada, hasta mágica; incluso, la posesión de especias estuvo a menudo limitada a clérigos o miembros poderosos de otras comunidades.

a. Escoja una especia y trace su empleo desde un punto de vista geográfico e histórico. ¿Cuál es su utilización hoy en día?

b. Las especias se desarrollan y tienden a utilizarse predominantemente en climas templados. Explique por qué.

2. Diseñe un experimento para determinar si un agente antímicrobiano está actuando como agente «-cida» o «-stático». ¿Cómo determinaría si un agente es susceptible de ser

utilizado como agente antiséptico o desinfectante?

3. Suponga que está determinando la eficacia de desinfectantes mediante la prueba del coeficiente fenólico y obtiene los resultados listados en la siguiente tabla. ¿Qué desinfectante podría decir con seguridad que es el más efectivo? ¿Podría calcular su coeficiente fenólico a partir de dichos datos?

Lecturas suplementarias

General Barkley, W. E., and Richardson, J. H. 1994.

Laboratory safety. In Methodsfor general and

molecular bacteriology, P. Gerhardt. et al., editors, 715-34. Washington, D.C.: American Society for Microbiology.

Block, S. S. 1992. Sterilization. In Encyclopedia of

microbiology, lst ed., vol. 4, J. Lederberg, editor-in-chief, 87-103. San Diego: Academic Press.

Block, S. S., editor. 1991. Disinfection, sterilization

and preservation, 4th ed. Philadelphia: Lea and Febiger.

Centers for Disease Control. 1987. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. Morbid.

Mortal. WeeklyRep. 36(Suppl. 2):3S-18S. Centers for Disease Control. 1988. Update:

Universal precautions for prevention of transmission of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, and other bloodborne pathogens in health-care settings. Morbid.

Mortal. Weekty Rep. 37(24):377-88. Centers for Disease Control. 1989. Guidelines for

prevention of transmission of human immunodeficiency virus and hepatitis B virus to health-care and public-safety workers. Morbid.

Mortal. WeeklyRep. 38(Suppl. 6): 1-37. Centers for Disease Control and National Institutes

of Health. 1992. Biosafety in microbiological

and biomedical laboratories, 3d ed. Washington, D.C.: U.S. Government Printing Office.

Collins, C. H., and Lyne, P. M. 1976. Microbiological methods, 4th ed. Boston: Butterworths.

Henderson, D. K; 1995. HIV-1 in the health-care setting. In Principies and practice of infectious

diseases, 4th ed., G. L. Mandell, J. E. Bennett, and R. Dolin editors, 2632-56. New York: Churchill Livingstonc.

Martin, M. A., and Wenzel, R. P. 1995. Sterilization, disinfection, and disposal of infectious waste. In Principies and practice of infectious diseases,

4th ed., G. L. Mandell, J. E. Bennett, and R. Dolin editors, 2579-87. New York: Churchill Livingstone.

Perkins, J. J. 1969. Principies and methods of

sterilization in health sciences, 2d ed. Springfield, 111.: Charles C. Thomas.

Pike, R. M. 1979. Laboratory-associated infections: Incidence, fatalities, causes, and prevention. Annu. Rev. Microbio!. 33:41-66.

Russell, A. D.; Hugo, W. B.; and Ayliffe, G. A. J., editors. 1992. Principies and practice of

disinfection, preservation and sterilization, 2d ed. Oxford: Blackwell Scientiftc Publications.

Sewell, D. L. 1995. Laboratory-associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Rev. 8(3):389-405.

Strain, B. A., and Groschel, D. H. M. 1995. Laboratory safety and infectious waste management. In Manual ofclinical

microbiology, 6th ed., P. R. Murray, editor, 75-85. Washington, D.C.: American Society for Microbiology.

Warren, E. 1981. Laboratory safety. In Laboratory

procedures in clinical microbiology, J. A. Washington, editor, 729-45, New York: Springer-Verlag.

Widmer, A. F., and Frei, R. 1999. Decontaminalion, disinfection, and sterilization. In Manual of

clinical microbiology, 7th ed., P. R. Murray, et al., editors. 138-64. Washington, D.C.: ASM Press.

7.4 Control microbiano por métodos físicos

Brock, T. D. 1983. Membrane fdtration: A user's guide and reference manual. Madison, Wis.: Science Tech Publishers. S0rhaug, T.

1992. Temperature control. In Encyclopedia of microbiology, l s t ed., vol. 4. J. Lederberg, editor-in-chief, 201-11. San Diego: Academic Press.

7.5 Control microbiano por agentes químicos

Belkin, S.; Dukan, S.; Levi, Y; and Touati, D. 1999. Death by disinfection: Molecular approaches to understanding bacterial sensitivity and resistance to frce chlorine. In Microbial ccology and

infectious disease, E. Rosenberg, editor, 133-42. Washington, D.C.: ASM Press.

Borick, P. M. 1973. Chemical sterilization.

Stroudsburg, Pa.: Dowden, Hutchinson and Ross.

McDonnell, G., and Russell, A. D. 1999. Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12(1): 147-79.

Russell, A. D. 1990. Bacterial spores and chemical sporicidal agents. Clin. Microbiol. Rev. 3(2):99-119.

Rutala, W. A., and Weber, D. J. 1997. Uses of inorganic hypochlorite (bleach) in health-care facilities. Clin. Microbiol. Rev. 10(4):597-6 10.

control de microorganismos por agentes físicos y químicos

Documents