contenido - tecnm

CONTENIDO Justificación: ........................................................................................................................................ 2

Objetivos: ............................................................................................................................................ 3

General: ........................................................................................................................................... 3

Específicos: ...................................................................................................................................... 3

Problemas a resolver, priorizándolos .................................................................................................. 3

Procedimiento y descripción de las actividades realizadas: ............................................................... 4

Identificación de Sintomatología. ................................................................................................... 4

Toma de muestra. ........................................................................................................................... 5

Metodología para la toma de muestra. .......................................................................................... 5

Extracción de ARN. .......................................................................................................................... 6

Protocolo para la extracción de ARN Tripure de Roche. ................................................................. 7

Reactivos para la extracción de ARN. .............................................................................................. 7

Análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras extraídas. ......................................................... 8

Protocolo para la cuantificación de ARN. ........................................................................................ 9

RetroTranscripción. ......................................................................................................................... 9

Protocolo para la Retrotranscripción de Promega. ....................................................................... 10

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). ................................................................................ 12

Protocolo para la PCR. ................................................................................................................... 13

Electroforesis en gel para verificar integridad de las muestras. ................................................... 14

Protocolo de electroforesis. .......................................................................................................... 15

Resultados, planos, gráficas, prototipos, maquetas, programas, entre otros .................................. 16

Conclusiones y recomendaciones: .................................................................................................... 22

Competencias desarrolladas y/o aplicadas: ...................................................................................... 24

JUSTIFICACIÓN:

La papaya se obtiene del árbol conocido como papayo, originario de las zonas tropicales de México

y Centroamérica. Se cultiva en terrenos de muy distinta naturaleza, pero es fundamental que éstos

sean ricos en materia orgánica y que contengan una humedad abundante (AMSDA, 2015).

La papaya es un frutal de gran producción en el mundo. México es el quinto productor con

764,514 toneladas, con un rendimiento de 514,166 Hg/Ha (FAOSTAT, 2013). Para el año 2014,

Colima tuvo una producción de papayo de 98, 499 toneladas, con un rendimiento de 53.58

Ton/Ha de papaya generando un valor de producción de 462.612 millones (SIAP, 2014). En Colima

se generan más de 1500 empleos directos, lo que convierte a este sistema producto en uno de los

tres principales con mayor derrama económica en el estado después del limón y plátano.

(Coepapaya, 2009).

El virus de la mancha anular de la papaya (Papaya ring spot potyvirus, PRSV) es la enfermedad más

limitante de la producción de esta fruta, causando una enorme devastación de cultivos en varios

países de todo el mundo, reflejándose en un descenso de la producción del fruto. Un ejemplo

claro de la naturaleza devastadora de este virus es la destrucción total de los cultivos comerciales

de la industria de la papaya hawaiana en los 1990s. La presencia de áfidos vectores durante todo

el año en las plantaciones de papaya constituye una importante vía para la diseminación del PRSV,

por lo que la industria papayera ha sufrido daños que se reflejan en cuantiosas pérdidas en campo

(50-80%) y en postcosecha (30 y 40%).

En la naturaleza, la supervivencia de los virus que infectan a las plantas depende en gran medida

de su capacidad para dispersarse a nuevos hospederos; las especies arvenses que se encuentran

en los cultivos de papaya pueden fungir como reservorios de varios virus, incluyendo el PRSV. Por

lo anterior, resulta relevante investigar la existencia de hospederos alternos del PRSV para así

poder tomar medidas para su control.

OBJETIVOS:

General:

- Detectar mediante RT-PCR la presencia del PRSV en especies arvenses del cultivo del

papayo.

Específicos:

- Realizar la colecta de muestras vegetales de papaya y especies arvenses en la comunidad

conocida como “las conchas” municipio de Ixtlahuacán, Colima.

- Extraer el ARN utilizando el protocolo del reactivo Tripure de Roche.

- Verificar la calidad e integridad del RNA extraído mediante espectroscopía y electroforesis

en geles de agarosa.

- Realizar las reacciones de retrotranscripción a las muestras con el kit “Reverse

Transcription System” de Promega.

- Realizar las reacciones de PCR con primers universales para Potyvirus.

PROBLEMAS A RESOLVER, PRIORIZÁNDOLOS

El control convencional del PRSV se realiza en campo con una cuadrilla de personal llamados “los

buscadores de virus”, los cuales están capacitados para identificar plantas enfermas en campo y

eliminarlas para evitar la propagación del virus en la plantación. Gran parte de los cultivos

comerciales de papayo en el estado de Colima tienen mal manejo o carecen de manejo

agronómico para el control de malezas. Por lo anterior, el principal problema es la elevada

cantidad de especies arvenses entre los surcos y periferia de los cultivos, de las cuales, algunas

presentan síntomas virales, que podrían estar asociados al PRSV. Para contribuir a minimizar los

daños ocasionados por PRSV es importante hacer del conocimiento de los productores cuales son

las especies de maleza que son hospederas del virus para que puedan tomar medidas directas de

control.

PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS:

Identificación de Sintomatología

La planta enferma presenta síntomas variados. Inicialmente se observan clorosis y moteados en

las hojas más nuevas acompañados de aclaramiento de las nervaduras. Posteriormente se

presentan mosaico y bolsas o vejigas en las hojas, lo que le da un aspecto rugoso o encarrujado a

la lámina foliar. Cuando el ataque es severo ocurre la deformación de los folíolos y reducción de la

lámina quedando restringida a las nervaduras principales (filiformes). Sobre el tallo, pecíolos y

pedúnculos se observan manchas en forma de bandas, o irregulares, de color verde oscuro y de

apariencia aceitosa. En los frutos estas manchas son en forma de anillos concéntricos. Así mismo

pueden deformarse, pierden el aroma y presentan descenso en el contenido de sólidos solubles.

Las plantas afectadas en alto nivel se estancan en su desarrollo, por lo cual su crecimiento se

retarda, las hojas formada son pequeñas y el pecíolo se acorta (Fig. 1).

Las malezas hospederas generalmente son plantas de la familia Cucurbitaceae, como la sandía,

melón, pepino, ahuyama, calabaza, mostacha, meloncillo (melón de golero) y balsamina. Igual

Fig. 1

Sintomatología del VMAP en papayo

ocurre con plantas de la familia Chenopodiaceae como cenizo y quinoa, y algunas leguminosas

silvestres, que son hospedantes asintomáticos (Fig. 2).

Fig. 2

Maleza hospedera de virus de la familia Curcubitaceae, en la foto de la izquierda se observa la

clorosis en hoja, síntoma típico de VMAP y a la derecha, la maleza en estado sano.

Toma de muestra

La toma de muestra se realizó en la comunidad conocida como “Las Conchas”, municipio de

Ixtlahuacán, Colima. Identificando la sintomatología en las plantas; recolectando malezas

reportadas como hospederas asintomáticas, así como posibles malezas portadoras que

presentaban síntomas virales en general.

Metodología para la toma de muestra

1. Identificación de plantas enfermas.

2. Corte de planta (conservando tallo y tejido foliar).

3. Colectar el tejido obtenido en bolsas de polietileno cerradas herméticamente para evitar

contaminación y rápida oxidación del tejido.

4. Almacenaje de muestras en hielo para su transporte y posterior análisis.

5. Realizar el protocolo de extracción de ARN en cuanto la muestra llegue al laboratorio.

Comentario [MB1]: En la carpeta que te mande hay fotos de cucurbitáceas. Utiliza fotos que tomamos y evita fotos de internet. Igual para las de papaya anteriores.

Comentario [ITC2]:

Extracción de ARN

El ARN es una molécula menos estable que el ADN, por consiguiente, se requiere de un manejo

cuidadoso para evitar su degradación. Esta inestabilidad se debe a que el azúcar de la ribosa del

ARN tiene dos grupos hidroxilo unidos al anillo de pentosa, mientras que el ADN tiene solo un

grupo hidroxilo. Esto es un problema, debido a que hace a la molécula propensa a los ataques de

ribonucleasas (RNAsas), las cuales son enzimas muy estables y por lo general no requieren

cofactores para funcionar. Es importante recalcar que una mínima cantidad de enzima es capaz de

degradar nuestra muestra.

Este problema puede ser resuelto tratando las soluciones a utilizar en el proceso de extracción con

dietilpirocarbonato (DEPC); este químico inactiva las RNAsas por modificación covalente. Para la

extracción de ARN, el químico tiocianato de guanidina (Fig. 3), es uno de los más eficaces

desnaturalizantes de proteínas utilizados, y es actualmente, uno de los más utilizados para

elaborar soluciones comerciales para extracción de ARN, tales como Trizol (Invitrogen) y Tripure

(Roche).

Fig. 3

Estructura química del Tiocianato de

Guanidina

Protocolo para la extracción de ARN Tripure de Roche

1. Agregar 1 ml de Tripure® por 50-100 mg de tejido pulverizado.

El volumen de la muestra no debe ser más grande que 10% del volumen de Tripure®

2. Homogeneizar tejido

La cantidad de moléculas de ADN en la purificación de ADN depende de la fuerza aplicada

durante la homogeneización.

3. Centrifugar a 12,000 g / 10 min. A 4 °C y recuperar el sobrenadante.

4. Incubar 5 minutos a una temperatura de 15-25 °C para disociar nucleoproteínas

complejas.

5. Agregar cloroformo (0.2 ml por cada ml de Tripure®), agitar vigorosamente 15 seg. Incubar

de 2 a 15 minutos a una temperatura de 15 – 25 °C

6. Centrifugar el tubo a 12,000 g por 15 minutos a 4 °C

No exceder 12,000 g durante la centrifugación

7. Tomar la parte superior incolora del tubo y transferirla a un tubo nuevo

Se obtienen 3 fases después de la centrifugación, en la fase acuosa encontramos ARN, en

la interfase blanca ADN y la parte orgánica de color rojo proteínas.

8. Agregar isopropanol (0.5 ml por cada ml de Tripure®) y mezclar por inversión, incubar de

5-10 min a una temperatura de 15-25 °C

9. Centrifugar a 12,000 g por 10 min a una temperatura de 4 °C y retirar el sobrenadante

10. Lavar el pellet con etanol al 75% (1 ml de etanol por cada ml de Tripure®)

11. Centrifugar a 7,500 g 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante

12. Secar por 7 min, resuspender en agua-Depc, incubar de 10 a 15 min a una temperatura de

55-60 °C.

13. Almacenar a una temperatura de -15 a -25 °C.

Reactivos para la extracción de ARN. Tripure

Etanol al 75%

Dietilpirocarbonato en agua libre de RNAsas o en solución de SDS al 0.5%

Isopropanol.

Análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras extraídas.

La espectrofotometría es un método de análisis óptico que nos permite comparar la radiación

absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una

que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Para el análisis de las muestras extraídas de los tejidos vegetales obtenidos, se utilizó el equipo

Nanodrop 2000, este aparato puede medir con precisión muestras purificadas de ADN y ARN con

concentraciones cercanas a <15,000 ng/μl y sin dilución. El software utiliza automáticamente la

trayectoria óptima de la longitud de la luz para medir la absorbancia de cada muestra.

La relación de absorbancias 260/280 nm (Fig. 4), se utiliza para evaluar la pureza del ADN y ARN.

Una proporción de aproximadamente 1.8 es generalmente aceptable como un ADN puro, mientras

que para el ARN la proporción es de 2.0. Si la relación es un poco más baja, en cualquiera de los

casos, esto es indicador de la presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes que absorben

fuertemente en longitudes de onda sobre los 280 nm.

Fig. 4 Relación de absorbancias 260/280 para ácidos nucleicos.

La relación de absorbancias a 260 y 230 nm es una medida secundaria de la pureza de los ácidos

nucleicos, los valores de la proporción 260/230 son superiores a los de la relación 260/280 y se

encuentran en el rango de 1.8 a 2.2. Si estos coeficientes son menores, es indicativo de la

presencia de contaminantes que absorben a 230 nm tales como fenol y carbohidratos (Gallager,

2008).

Protocolo para la cuantificación de ARN.

1. Encender el Nanodrop y computadora para que se establezca la conexión entre ellos, esperar a

que se muestre el display del software, indicar el parámetro a medir (ácidos nucleicos, type RNA).

2. Calibrar el equipo con un microlitro de solución buffer (el utilizado para diluir la muestra),

colocándolo en el detector, dar click en la opción “Blank”, esperar la lectura del Nanodrop y

posteriormente limpiar el pedestal.

3. Una vez calibrado el equipo, se coloca un microlitro de muestra a cuantificar, ahora damos click

en la opción “Measure” y se limpia el pedestal. Cuando se hace la primera lectura, el equipo ofrece

la opción de guardar la corrida, se guarda en la carpeta y el nombre a elegir y se prosigue con el

protocolo.

4. Se repite el paso 3 hasta terminar de leer todas las muestras.

RetroTranscripción.

La retrotranscripción es un proceso de la biología molecular que implica la generación de una

cadena de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena a partir de un ácido ribonucleico

(ARN) de cadena simple. El Producto de doble cadena obtenido recibe el nombre de ADNc (ADN

complementario). Dicha actividad está mediada por varias enzimas, si bien la clave es la

transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.

Se describió por primera vez en virus de la familia Retroviridae (Fig. 5), de forma independiente

por los investigadores Howard Temin and David Baltimore en 1970, su descubrimiento supuso la

primera excepción del dogma central de la biología molecular, en el que la información génica fluía

solo desde el ADN al ARN.

Fig. 5 Proceso de la RetroTranscripción realizada por los Retrovirus.

El kit para la retrotranscripción utilizado fue el de Reverse Transcriptios System de Promega

de la casa Promega, este procedimiento requiere de hasta 5μg de ARN total por reacción, poli ( A)

+ mRNA o ARN sintético, y se lleva a cabo en 20μl de componentes del Sistema Reverse

Transcriptios System de Promega™ .

Protocolo para la Retrotranscripción de Promega.

El siguiente procedimiento se basa en convertir 5µg de ARN en aproximadamente 500ng de

poli(A) ARN que será la hebra simple de ADNc.

1. Mezcle y centrifugue cada componente antes de utilizarlo, se preparará el coctel inicial de la

siguiente manera:

ARN extraído (aproximadamente 5µg/reacción) X µl

Primer [Oligo(dT)15 (0.5µg/reacción) y/o

Random Primer (0.5µg/reacción)

o gene-specific primer (10–20pmol/reacción)] X µl

Agua libre de nucleasas X µl

Volumen final 5µl

2. Cierre cada tubo de ARN con fuerza. Coloque los tubos en un baño maría a 70 ° C durante 5

minutos. Inmediatamente enfríe en agua con hielo durante al menos 5 minutos. Centrifugar cada

tubo durante 10 segundos en una microcentrífuga para recoger el condensado y mantener el

volumen original. Mantener los tubos cerrados y en hielo hasta que se añade la mezcla de reacción

de transcripción inversa.

3. Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa mediante la combinación de los

siguientes componentes del Sistema de Transcripción Inversa ™ en un tubo de microcentrífuga

estéril en hielo. Preparar suficiente mezcla para permitir que se realice cada reacción de síntesis

de ADNc. Determinar los volúmenes necesarios para cada componente, y combinarlos en el orden

indicado. Vortexear suavemente para mezclar, y mantener en hielo antes de la dispensación en los

tubos de reacción.

Concentración de componentes:

Agua libre de endonucleasas (para un volumen final de 15µl) X µl

5X Reaction Buffer 4.0µl

MgCl2 (Concentración final 1.5–5.0mM) 1.2–6.4µl

PCR Nucleotide Mix (Concentración final de cada dNTP 0.5mM) 1.0µl

Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (opcional) 20u

Reverse Transcriptase 1.0µl

Volumen final 15.0µl

4. Añadir alícuotas de 15μl de la mezcla de reacción de transcripción inversa a cada tubo de

reacción en hielo. Tenga cuidado para evitar la contaminación cruzada. Añadir 5μl de ARN y

mezcla de primers a cada reacción para un volumen final de reacción de 20μl por tubo. Si hay una

preocupación acerca de la evaporación en los pasos posteriores, superponer la reacción con una

gota de aceite mineral libre de nucleasas para evitar la evaporación y la condensación.

5. Ensamble: Coloque los tubos en un bloque de calor a temperatura controlada, equilibrada

a 25 ° C, e incubar durante 5 minutos.

6. Extensión: Incubar los tubos en un bloque de calor de temperatura controlada a 48 ° C por un

máximo de una hora. La temperatura de extensión puede ser optimizada entre 37 ° C y 55 °C.

Las reacciones se pueden mantener congelado para el almacenamiento a largo plazo

7. Desactivar transcriptasa inversa: Si el objetivo experimental es proceder con PCR, la

transcriptasa inversa debe inactivarse térmicamente antes de la amplificación. Incubar los tubos

de reacción en un calor de temperatura controlada a 95 ° C durante 15 minutos y después a 0°C

por 5 minutos.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La PCR fue conceptualizada por Kary Mullis en 1983, y ésta ha revolucionado el análisis molecular

de las ciencias de la vida hasta el punto que el Dr. Mullis recibió su premio nobel de química en

1993 por su “invención”.

Los requerimientos para una mezcla de reacción estándar para PCR son: una ADN polimerasa

dependiente, la cual es termoestable, un ADN molde, un par de oligonucleótidos (cebadores,

primers) de interés, solución buffer de reacción, deoxi-ribonucleótidos trifosfatados (dNTP´s) y

agua grado molecular. Toda esta mezcla se coloca en tubos para PCR y se someten a determinadas

condiciones de temperaturas por tiempos determinados en un termociclador programado de

manera automática.

Un programa típico de PCR consiste de una etapa de desnaturalización, una etapa de alineamiento

y una etapa de extensión.

En la desnaturalización, se rompen los puentes de hidrógeno existentes entre las cadenas de los

ácidos nucleicos, logrando de esta manera que las dos hebras de la plantilla de ADN se separen;

este proceso en su etapa inicial dura aproximadamente 5 min a una temperatura de 94°C, una vez

que inician los ciclos, su tiempo se reduce a 30 s a la misma temperatura.

En el alineamiento, ocurre la hibridación de las cadenas separadas con los primers, la temperatura

a la cual se lleva a cabo este proceso es generalmente de 55°C (aunque depende de las

características de los oligonucleótidos), su tiempo dentro del ciclo es de aproximadamente 30s.

En la extensión, la polimerasa emplea los dNTP´s para llevar a cabo la elongación de la cadena, es

un proceso que se lleva a cabo a una temperatura de 72°C, con una duración por ciclo de 90 s, y la

extensión final tiene una duración de aproximadamente 5 min.

Protocolo para la PCR.

1. Descongelar los reactivos y hacer los cálculos necesarios de acuerdo al número de muestras a

amplificar.

2. Realizar la Coctel madre de reactivos en un tubo eppendorf de 1.5 ml estéril de acuerdo a la

siguiente tabla:

Reactante Concentración inicial Concentración final μl por reacción

Buffer de reacción 10X 1X 2.5

MgCl2 50mM 1.5 mM 0.75

dNTP´s 250 μM 100 μM 10

Primer F 25 μM 0.5 μM 0.5

Primer R 25 μM 0.5 μM 0.5

ADN polimerasa 5 U/ μl 1.5 U 0.3

ADN molde 20 ng/μl 100 ng 5

H2O - - 5.2

Tabla 1.

Concentraciones requeridas para una corrida de PCR estándar.

3. distribuir 20 μl de esta mezcla de cada uno de los tubos para PCR previamente etiquetados y

colocar 5 μl de ADNc a 20 ng/ μl.

4. Colocar los tubos en el termociclador y programar los ciclos adecuados para el ADN blanco que

se desea amplificar.

5. Analizar los productos amplificados por electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) en

amortiguador TAE 1X.

Electroforesis en gel para verificar integridad de las muestras.

La electroforesis es una técnica comúnmente usada en Biología Molecular que consiste en el

movimiento de una molécula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. En una

electroforesis típica, la muestra se carga cerca del electrodo negativo del depósito del gel.

Cuando se aplica una corriente eléctrica, las moléculas cargadas negativamente migraran hacia el

electrodo positivo. Los ácidos nucleicos tienen carga negativa debido a sus grupos fosfato

orientados hacia el exterior (Gallagher,2008).

La separación de ácidos nucleicos por electroforesis en gel de agarosa es el método de elección

para el análisis de productos de PCR, así como para el análisis de ADN plasmídico digerido por

enzimas de restricción. Esta técnica se utiliza también para purificar fragmentos de ADN generados

por las enzimas de restricción y los productos de PCR para fines de clonación.

Un amortiguador con un pH de 8 a 8.3 es incluido en la cámara de electroforesis para

contrarrestar los cambios de pH y permitir el paso de la corriente (Armstrong y Schulz, 2008).

El gel está conformado por lo general por agarosa, la matriz de agarosa permite la separación de

ácidos nucleicos de acuerdo a sus tamaños, las moléculas más pequeñas migran más rápido a

través de los poros de la matriz, en tanto que moléculas más pesadas migran más lentamente.

El rango de voltaje empleado normalmente para esta técnica es de 1 a 10 V por cm de longitud de

electrodo a electro de la cámara de electroforesis (V/cm) y depende también del tamaño de la

macromolécula de ácido nucleico. La resolución de fragmentos grandes de ADN (por encima de 5

Kbp) se mejora si el gel corre más lentamente. Un voltaje demasiado alto provoca el

sobrecalentamiento del buffer y una mala resolución del gel, mientras que un voltaje demasiado

bajo ocasiona la difusión de los ácidos nucleicos de menor tamaño (Armstrong y Schulz, 2008).

Los ácidos nucleicos no son visibles por si solos, se requiere utilizar una solución colorante que

migren a la par con el ADN para de esta manera, observar el recorrido que realiza a través de la

cámara de electroforesis. Algunas de las soluciones utilizadas son el naranja G 6X, y el

amortiguador de carga azul de Bromofenol 6X.

Protocolo de electroforesis.

1. Preparar un gel de agarosa al 1% (p/v). Para eso se pesa 1 gramos de agarosa y se disuelve

calentándolo en 100 ml de buffer TAE 1X.

2. Dejar enfriar un poco sin que llegue a gelificar, y vaciar en la base de la cámara de electroforesis

con el peine puesto.

3. Dejar que solidifique el gel y colocarlo dentro de la cámara de electroforesis. Adicionar buffer

TAE 1X hasta cubrir por completo el gel.

4. colocar las muestras a analizar con amortiguador de carga azul de bromofenol 6X.

5. Colocar el marcador de pesos moleculares en el primer pocillo del gel.

6. Cerrar la cámara y conectarla a la corriente eléctrica a un voltaje de 100 V, en un tiempo

considerable hasta que el avance sea de ¾ del gel.

7. Apagar la fuente eléctrica.

8. Colorearlo con una solución de BrEt durante 5 min. Sacarlo y enjuagarlo con agua.

9. Visualizar en un transiluminador de luz UV.

10. Guardar imágenes y analizar.

RESULTADOS, PLANOS, GRÁFICAS, PROTOTIPOS, MAQUETAS,

PROGRAMAS, ENTRE OTROS

Se tomaron muestras de la comunidad Las Conchas, municipio de Ixtlahuacán Colima.

Coordenadas: 18°53’56.16” N, 103°37’52.32”

Se recolectaron muestras de maleza que presentaban los síntomas más visibles del virus, la

clorosis y moteado en tejido foliar, las malezas de las que se tomó muestra fueron: A. cristata, C.

afoetidissima, A. abutilastrum, y 2 muestras no identificadas que fueron enviadas al herbario

para su identificación morfológica.

Fig. 6

Predio “los cuates”, Comunidad de “las conchas”, Municipio de

Ixtlahuacán, Colima.

Para C. Papaya, se tomaron muestras de plantas que presentaban los síntomas típicos: clorosis en

hoja, pequeños halos concéntricos en el fruto (Fig. 8), deformación en el fruto y oscurecimiento

del tejido dérmico del fruto.

Fig. 7

Maleza con sintomatología típica de VMAP, colectada en la

comunidad de las conchas.

Fig. 8

Halos concéntricos en el fruto de papayo, síntoma

más visible en el fruto.

Comentario [MB3]: Muy distorsionada la foto

Las muestras tomadas fueron trasladadas al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,

Agrícolas y Pecuarias Unidad Tecomán para su análisis. El traslado se realizó a una temperatura

media de 4°C para evitar la oxidación acelerada del tejido. Las muestras se procesaron en cuanto

llegaron al laboratorio de Biotecnología Vegetal del INIFAP, esto para garantizar la frescura de las

muestras y evitar la sobreproducción de mucílago, el cual interfiere de una manera importante en

el análisis de resultados.

El protocolo de extracción de ARN utilizado fue el de Tripure de Roche, cuidando celosamente el

material a utilizar; esterilizado en autoclave por 15 min a 1.5lbf/plg2, además de un riguroso

enjuague con agua estéril y reposo con agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC), para evitar

contaminación con RNAsas.

Posterior a la extracción, se realizó una lectura de integridad de ARN en Nanodrop, las lecturas

obtenidas para las malezas analizadas, se muestran en la tabla siguiente:

Sample ID

User

Date and Time Nucleic

Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type

Calabacilla

IRVING 22/09/2015 09:03:34 a. m. 2472.3 ng/µl 61.809 29.492 2.1 1.6 RNA

IRVING 22/09/2015 09:04:10 a. m. 3143.5 ng/µl 78.587 39.367 2 1.49 RNA

Cristata -1



Cristata - 2



Cristata - 3



Cristata - 4



Tabla 2.

Cuantificación del RNA extraído de las muestras de maleza y papaya.

Se observa que las purezas en la extracción oscilan en el rango de 1.8 – 2.1, lo cual nos indica un

ARN que se puede trabajar para la RT. En la muestra “Cristata-3”, observamos un bajo rendimiento

en el proceso de la extracción, esto se debe a la presencia de tejido mucilaginoso, el cual está

compuesto por carbohidratos complejos e impide que la extracción de ARN se lleve a cabo con

éxito, sin embargo, la relación de absorbancias 260/280 nos da un rango aceptable para

procesamiento, por lo que la muestra seguirá el protocolo establecido de análisis.

#

Sample ID

User Date and Time Nucleic

Acid Unit A260 (Abs) A280 (Abs) 260/280 260/230 Sample Type

Abutilon -1

INIFA 22/09/2015 09:14:34 a. m. 556.7 ng/µl 13.918 6.888 2.02 0.74 RNA

INIFA 22/09/2015 09:15:01 a. m. 519 ng/µl 12.976 6.48 2 1.71 RNA

Abutilon -2

INIFA 22/09/2015 09:15:28 a. m. 278.3 ng/µl 6.956 3.51 1.98 0.43 RNA

INIFA 22/09/2015 09:15:58 a. m. 344.5 ng/µl 8.612 4.489 1.92 0.56 RNA

X1 - 1

INIFA 22/09/2015 09:16:32 a. m. 363.1 ng/µl 9.078 8.882 1.02 0.71 RNA

INIFA 22/09/2015 09:17:13 a. m. 178.5 ng/µl 4.462 2.619 1.7 0.39 RNA

X1 - 2

INIFA 22/09/2015 09:19:14 a. m. 165.8 ng/µl 4.145 3.197 1.3 0.69 RNA

INIFA 22/09/2015 09:19:38 a. m. 116.8 ng/µl 2.921 2.953 0.99 0.21 RNA

X2 - 1

INIFA 22/09/2015 09:20:12 a. m. 268.5 ng/µl 6.713 3.523 1.91 0.89 RNA

INIFA 22/09/2015 09:20:36 a. m. 337.4 ng/µl 8.435 4.347 1.94 1.02 RNA

X2 - 2

INIFA 22/09/2015 09:21:04 a. m. 1080.1 ng/µl 27.002 13.368 2.02 1.53 RNA

INIFA 22/09/2015 09:21:33 a. m. 1212.5 ng/µl 30.312 15.223 1.99 1.55 RNA

Tabla 3.

Lecturas de malezas en Nanodrop (continuación).

Para la siguiente relación de malezas (Tabla 2), se observa que para la muestra catalogada como

“X-1”, se tiene un nivel de pureza aceptable, mientras que la concentración es muy baja en

comparación con las demás muestras, esta muestra en especial, tenía mucha cantidad de

mucílago, lo que dificultaba su extracción.

Para las demás muestras, la dificultad no fue mucha, por lo que se obtuvieron resultados

favorables desde la primera extracción.

Para verificar la integridad del ARN extraído, se procedió a realizar un gel de Agarosa utilizando

como base el buffer SB (Sodium Borate), esto debido a que los buffer convencionales para la

corrida, tales como TAE y TBE, contienen Tris en su formulación; El Tris reacciona con el DEPC

inactivado su mecanismo de acción dentro de la solución y por ende, se desnaturaliza nuestra

molécula de ARN.

Se corrió el gel dentro de la cámara de electroforesis por un tiempo de 2.5 horas

aproximadamente con un voltaje de 150 volts, utilizando como buffer de carga una mezcla de azul

de metileno con naranja de metilo.

Para la lectura del gel, se metió en una solución con bromuro de etidio al 1% por 15 minutos,

enjuagando el gel en una solución con agua destilada por 10 minutos, se dejó secar el gel y se

pasó al fotodocumentador Bio-rad de Biosystems, se tomó una fotografía exponiendo el gel a luz

UV por 35 segundos.

Fig. 9

Gel de Agarosa con las muestras de ARN por carriles de izquierda a derecha: 1. Calabacilla, 2.

Cristata-1, 3. Cristata-3, 4. Cristata-4, 5. Papayo-1, 6. Papayo-3, 7. Papayo-5, 8. Abutilon-1, 9.

abutilon-2, 10. X1-1, 11. X2-1, 12. X2-2.

.

Se puede observar que en el carril 1, que pertenece a la muestra de Calabacilla, hay una especie

de barrido, en el que la muestra no se alcanza a distinguir de una manera uniforme como en los

carriles subyacentes, esto se puede deber a la presencia de carbohidratos en la muestra o a una

mala manipulación a la hora de cargar la muestra, de la misma manera en el carril 8, que

pertenece a Abutilon-1, se observa el mismo barrido.

Las muestras de ARN fueron almacenadas a -20°C para mantener su integridad y permitir su

reprocesamiento. Las muestras almacenadas a estas temperaturas, tienen una viabilidad

aproximada de una semana, debido a la naturaleza inestable de la molécula, por ello se debe

realizar una RT-PCR para pasar de una cadena de ARN a una doble cadena de ADNc.

Para el protocolo de Retro Transcripción, se tomó por reacción 2μl de MgCl2 25mM, 1μl de Buffer

10x, 1μl de DNTP´s 10 mM, 0.25 μl de inhibidor, 8U de RTasa, 0.5 μl de Random Primers, 3 μl de

RNA molde y 1.93 μl de Agua grado molecular.

Se trabajaron 17 reacciones de RT, cuidando en todo momento las temperaturas a emplear y que

las muestras no hayan sufrido ningún daño previo por choque térmico, manipulación,

contaminación ambiental, etc.

Las temperaturas y tiempos de trabajo se establecieron de acuerdo al protocolo de la siguiente

manera.

La muestra de ARN se mantuvieron por 10 minutos a una temperatura de 70°C, antes de que se le

agregara el coctel preparado para la reacción, posteriormente ya agregado el coctel se dejó 10

minutos a temperatura ambiente, después se pasó a una temperatura de 48°C por un tiempo de

15 minutos, por último, se mantuvo 5 minutos a 95°C y se le dio un choque térmico a 0°C por 5

minutos para después almacenar las muestras a una temperatura de -20°C.

El siguiente paso es la amplificación del segmento de ADNc que pertenece al PRSV, para ello se

trabajó con primers universales para Potivirus, el NIb2F y NIb3R, con secuencia

GTITGYGTIGAYGAYTTYAAYAA y TCIACIACIGTIGAIGGYTGNCC 1 respectivamente, estos primers

producen un amplicón de 350 pares de bases y se usaron de acuerdo a los trabajos realizados por

(Zhen et. al., 2008).

La ADN polimerasa utilizada fue la amplificasa® de BioTecMol, utilizando sus complementos del

mismo lote para asegurar su correcto funcionamiento.

La amplificación con PCR se llevó aplicando 95°C por 3 minutos para la Desnaturalización inicial,

después 35 ciclos de 95°C por 45 s, 45°C por 45 s and 72°C por 45 s; al final se dio una extensión

final por 5 min a 72°C. La concentración utilizada de primers, amplificasa y otros componentes de

la PCR se realizaron de acuerdo a (Pappu et al., 1993; Gibbs & Mackenzie, 1997; Thompson et al.,

2003).

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

Las muestras colectadas en la comunidad de las conchas presentaban la sintomatología referida

en la literatura referente a la enfermedad del Virus de la Mancha Anular del Papayo; La mayoría

de las muestras no presentaron mucha dificultad en el proceso de extracción, sin embargo,

1 Para las secuencias referidas, N = A+C+G+T, V = A+C+G, R = A+G, W = A+T, Y = C+T, I = deoxyinosine.

Comentario [MB4]: Se manejo anteriormente en ingles PRSV, mantenerlo de esta forma y no en español

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-3059.2009.02201.x/full#b23




algunas de las muestras presentaban una cantidad abundante de carbohidratos complejos tipo

goma que se conoce como “mucilago”.

La función principal del mucilago dentro de la planta es proveer de humedad a la planta en el

proceso de germinación de la semilla, además de ser la respuesta a una herida provocada en esta.

La dificultad de trabajar con este producto de la planta, es que es insoluble en sustancias

orgánicas, como las que se utilizan en el proceso de extracción de ARN; Por ello las lecturas en

Nanodrop arrojan contaminación por carbohidratos y las corridas en el gel de integridad se ven

barridas.

En general, las extracciones realizadas ofrecen valores de pureza aceptables, por lo que el

protocolo pudo ser reproducible sin ningún problema, sin embargo, fue necesario realizar varias

veces el protocolo para afinarlo; El trabajar con protocolos nuevos y herramientas que no son

parte de nuestra formación dentro de la carrera, nos obliga a practicar para poder mejorar la

técnica y el manejo de las herramientas.

Las muestras de ARN se deben almacenar a -80°C después de extraídas, se pueden guardar a

mayor temperatura como a -20°C, teniendo en cuenta que la molécula de ARN es más inestable

que la de ADN, y más fácil que se desnaturalice a esas condiciones, por lo que el almacenamiento

a esta temperatura no deberá rebasar una semana antes de su reprocesamiento.

La integridad de las muestras se vio reflejada también en el gel de agarosa, con excepción de 2

casos donde se presentó barrido, las demás se muestran más diferenciadas con respecto a las

bandas de las diferentes sub unidades de ARN. En este punto también fue necesario afinar el

método de cargado, la técnica del buffer a emplear y el voltaje requerido, ya que en un principio

se utilizaba el buffer convencional “TAE”, que al contener Tris, reaccionaba con el DEPC y las

bandas de ARN se veían difusas en el fotodocumentador; Se trabajó con buffer “SB” para evitar

esa interacción de compuestos químicos, y observar unas bandas más definidas.

La RT y la PCR dieron resultados favorables, se logró la amplificación de 6 muestras, de las cuales 3

corresponden al Papayo (Carica Papaya), 2 a la familia Curcubitaceae y 1 a una de las muestras de

las que no se tiene identificación.

El próximo paso es realizar la secuenciación de los fragmentos amplificados, y de esta manera

confirmar que se trata del VMAP.

COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS:

Comprender, identificar, analizar y relacionar los mecanismos de control y

regulación del metabolismo celular, para aplicar en el aprovechamiento de los

procesos y recursos bióticos.

Comprender, identificar, analizar y relacionar los conceptos de la genética,

estructura y función de los ácidos nucleicos.

Comprender, identificar, analizar y relacionar los mecanismos y regulación de la

replicación, trascripción y traducción genética, para aplicar en el aprovechamiento

de los procesos y recursos bióticos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Y VIRTUALES.

AMSDA. (24 de 09 de 2015). AMSDA. Obtenido de AMSDA:

http://www.amsda.com.mx/Prnacionales/Nacionales/Prnpapaya2.Pdf

Coepapaya. (2009). El cultivo de papaya en Colima. Colima: Campo Colima.

FAOSTAT. (2013). Producción en cultivos. México: Organización de las Naciones Unidad para la

Alimentacion y la Agricultura Dirección de Estadistica.

Gallager, S. R. (2008). Overview of electrophoresis. Curr. Protoc. Essential Lab., 7.1.1-7.1.6.

SIAP. (2014). Producción Agricola por Cutivo. Colima: Servicio de Información Agroalimentaria y

Pesquera.

contenido - tecnm

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