conservacion de especies peruanas de orquideas utilizando tecnicas de cultivo de tejidos vegetales
DESCRIPTION
Adaptacion de metodos de propagacion in vitro para especies peruanas de orquideasTRANSCRIPT
UUNNIIVVEERRSSIIDDAADD NNAACCIIOONNAALL AAGGRRAARRIIAA
LLAA MMOOLLIINNAA FFAACCUULLTTAADD DDEE CCIIEENNCCIIAASS
CCOONNSSEERRVVAACCIIÓÓNN DDEE EESSPPEECCIIEESS PPEERRUUAANNAASS DDEE
OORRQQUUÍÍDDEEAASS UUTTIILLIIZZAANNDDOO TTÉÉCCNNIICCAASS DDEE
CCUULLTTIIVVOO DDEE TTEEJJIIDDOOSS IINN VVIITTRROO
Tesis para optar el Título de
BIÓLOGO
MARCO A. LEÓN MARTÍNEZ
LIMA - PERÚ
1995
“NULLIUS ADICTUS JURARE
IN VERBA MAGISTRI”
HORACIO
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Antonietta O. Gutiérrez Rosati, Jefa del Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales - Genética de la UNALM por haberme dado la oportunidad de trabajar en este
Laboratorio. Su trabajo y esfuerzo han sido siempre motivación y ejemplo para nosotros.
A los profesores: MSc. Blgo. Raúl Salinas Mondragón por su continuo estímulo y sus
sugerencias, que hicieron posible la culminación de este trabajo; Blga. Rosa Espejo por su
ayuda constante y sus consejos, y al Blgo. Juan Juscamaita.
A Reynaldo Alvarez Grillo por su ayuda en parte de la redacción y en la edición de este
trabajo, por sus sugerencias y el cuidado de las plantas en vivero e in vitro durante mis salidas
al campo; a Wenceslao Jorge V., con quien iniciamos los primeros trabajos de germinación de
semillas; a Carlos Canchaya S., Roberto Yoshida T, Ángel Borda S. y Ulises Luya E.; a todos
ellos agradezco su comprensión, paciencia y tolerancia en mis errores.
Un muy profundo y sincero agradecimiento al Blgo. Benjamín Collantes Meza por su
invalorable ayuda al encargarse de la parte fotográfica de este trabajo, por su amistad y
continua ayuda.
Al Centro de Investigación en Recursos Genéticos y Biotecnología Vegetal (CIRGEBV)
por financiar la edición y parte de la publicación de este trabajo.
A la Asociación Peruana de Orquideología (APOR) por financiar parte de la publicación
de este trabajo.
A los cultivadores de orquídeas que me proporcionaron material vegetal : Los Ings.
Manuel Morán y Carlos Bohórquez; a mis amigos Don José Macedo, Román Ramírez y
Manuel Camacho de Tarapoto, y a Angel Seminario de Ayabaca quienes me ayudaron en las
recolecciones de material vegetal y la toma de datos de colección en el campo.
A Cecilia Flores por su ayuda en las correcciones de este trabajo.
A todas las personas que hicieron posible la realización de este trabajo: A Moisés
Cavero; al Blgo. Ricardo Fernández por proporcionarme mucha de la información que poseo en
el tema; al Ing. Percy Rojas; al Ing. David Bennet por sus valiosos consejos; a Marilú Hoyos y
Teresa Dolorier por su constante amistad y apoyo.
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS
CCOONNSSEERRVVAACCIIÓÓNN DDEE EESSPPEECCIIEESS PPEERRUUAANNAASS DDEE OORRQQUUÍÍDDEEAASS
UUTTIILLIIZZAANNDDOO TTÉÉCCNNIICCAASS DDEE CCUULLTTIIVVOO DDEE TTEEJJIIDDOOSS IINN VVIITTRROO
TTeessiiss pprreesseennttaaddaa ppoorr::
MARCO A. LEÓN MARTÍNEZ
Para optar el Título de:
BIÓLOGO
Sustentada y aprobada ante el siguiente jurado:
__________________________ Blgo. Aldo Ceroni Stuva
PRESIDENTE
_____________________________ __________________________ M.Sc. Abelardo Calderón R. M.Sc. Raúl Salinas M.
MIEMBRO MIEMBRO
_____________________________ Dra. Antonietta Gutiérrez R.
PATROCINADORA
ÍNDICE GENERAL Pag.
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE CUADROS
ÍNDICE DE FOTOGRAFÍAS
ABREVIATURAS UTILIZADAS
I. INTRODUCCIÓN 1
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 7
2.1 Aspectos Históricos
2.1.1 La Germinación Simbiótica De Semillas De Orquídeas 7
2.1.2 El Cultivo De Meristemas De Orquídeas 8
2.2 La Semilla 9
2.2.1 Germinación 10
2.2.2 Viabilidad De Semillas 11
2.2.3 Pruebas De Viabilidad De Semillas 12
2.3 Tipos De Propagación In Vitro 14
2.3.1 Propagación Por Semillas 14
a. Por Semilla Proveniente De Cápsula Dehiscente. 14
b. Por Semilla Proveniente De Cápsula No
Dehiscente (Cápsula Verde) 14
2.3.2 Propagación Vegetativa o Clonal 15
2.4 Condiciones De Cultivo 16
2.5 Sustancias Orgánicas Complejas Usadas en La Germinación
Asimbiótica De Semillas De Orquídeas 17
2.6 Soluciones Amortiguadoras o Buffer 18
2.7 Carbón Activado 19
III. MATERIALES Y MÉTODOS 21
3.1 Materiales 21
3.1.1 Material Vegetal 21
3.1.2 Reactivos y otros 21
3.1.3 Tinglado 22
3.1.4 Condiciones De Cultivo 23
3.1.5 Lugar de ejecución 23
3.2 Métodos 23
3.2.1 Propagación Por Semillas 23
a. Siembra De Semillas Provenientes De
Cápsula Dehiscente 24
b. Siembra De Semillas Provenientes De Cápsula No
Dehiscente (Cápsula Verde) 24
3.2.2 Propagación Por Yemas de Brote Vegetativo 32
3.2.3 Replante 45
3.2.4 Aclimatación 46
a. Preparación Del Sustrato 46
b. Preparación De Las Plántulas 46
c. Siembra 46
3.2.5 Diseños Estadísticos 48
a. Propagación Por Semillas 48
b. Propagación Por Yemas de Brote Vegetativo 48
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49
4.1 Propagación Por Semillas 49
4.1.1 Siembra De Semillas Provenientes de cápsula
dehiscente 49
4.1.2 Siembra De Semillas Provenientes de cápsula no
Dehiscente (Cápsula Verde) 51
4.2 Propagación Por Yemas de Brote Vegetativo 54
4.3 Replantes 59
4.4 Aclimatación 61
V. CONCLUSIONES 63
VI. RECOMENDACIONES 64
VII. RESUMEN 65
VIII. BIBLIOGRAFÍA 68
IX. APÉNDICE 73
ÍNDICE DE FIGURAS
Nº Titulo Pag.
1. Semilla De Orquídea y Sus Partes. 9
2. Partes Del Protocormo. 10
3. Cortes A La Cápsula No Dehiscente y Siembra. 32
4. Corte Del Brote Vegetativo En Cattleya. 34
5. Cortes De La Yema. 38
6. Plántulas En Aclimatación. 47
7. Cámara De Aclimatación Con Macetas Comunitarias. 48
8. Siembra De La Yema Aislada. 55
INDICE DE CUADROS
Nº Titulo Pag.
1. Prueba De Viabilidad De Semillas De Orquídeas. 13
2. Preparación Del Buffer Fosfato . 18
3. Medios De Cultivo Utilizados En La Germinación De Semillas
De Orquídeas. 30
4. Tiempos De Cosecha De Cápsula Verde Para La Siembra De
Semillas De Orquídeas. 31
5. Medio Murashige & Skoog Modificado Para El Cultivo De
Yemas De Cattleya. 44
6. Medios De Cultivo Para El Replante De Protocormos y Plántulas
De Orquídeas. 45
7. Cuadro De Análisis De Variancia De la Germinación De Semillas
Provenientes De Cápsula Dehiscente. 50
8. Cuadro De Análisis De Variancia De La Germinación De Semillas
Provenientes De Cápsula No Dehiscente (Cápsula Verde). 52
9. Cuadro De Análisis De Variancia Para La Siembra De Yemas De
Cattleya rex y Cattleya maxima. 58
10. Respuesta De Las Plantulas y Protocormos a Los
Medios De Replante. 59
11. Influencia De Los Medios De Cultivo En El Crecimiento y
Desarrollo De Protocormos y Plántulas. 60
INDICE DE FOTOGRAFÍAS
Foto Nro. Título Pag.
1. Flor de Cattleya rex O’brien. 3
2. Flor de Cattleya maxima Lindley. var. semi-alba. 4
3. Flor de Cattleya maxima Lindley. 5
4. Flor de Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem 6
5. Esterilización de semillas. 25
6. Enjuague de las semillas. 26
7. Sobre exponiendo las semillas de orquídeas para su siembra. 27
8 Extracción y siembra de las semillas en el medio de cultivo. 28
9 Dispersión de las semillas en el medio de cultivo. 29
10 Corte del brote vegetativo de Cattleya maxima Lindley. 33
11 Materiales para la siembra aséptica de yemas de orquídeas. 35
12 Proceso de esterilización del Brote (1a esterilización). 36
13 Brote sin hojas envolventes. 37
14 Brote durante la 2a esterilización. 39
15 Brote luego de la 2a esterilización mostrando 3 yemas. 40
16 Vista Frontal de una Yema sin hojas envolventes. 41
17 Vista lateral de una yema sin hojas envolventes 42
18 Siembra de las yemas en el medio de cultivo líquido. 43
19. Germinación de semillas de Cattleya maxima Lindley 55
20. Protocormos formados a partir de una yema. 56
1
CCOONNSSEERRVVAACCIIÓÓNN DDEE EESSPPEECCIIEESS PPEERRUUAANNAASS DDEE OORRQQUUÍÍDDEEAASS
UUTTIILLIIZZAANNDDOO TTÉÉCCNNIICCAASS DDEE CCUULLTTIIVVOO DDEE TTEEJJIIDDOOSS IINN VVIITTRROO
I. INTRODUCCIÓN.
Los bosques tropicales de nuestro país sufren un progresivo proceso de degradación
como consecuencia de la extracción maderera, la agricultura migratoria y, últimamente, debido al
incremento en las áreas de cultivo de Coca. La deforestación causa una considerable pérdida de
germoplasma, patrimonio de incalculable valor científico, ya que muchas especies vegetales son
aún desconocidas para la botánica (Cavero, et. al. 1991).
La gran mayoría de especies de orquídeas que se comercializan en nuestro país son
producto de recolecciones ilegales e indiscriminadas en estos bosques tropicales.
Consecuentemente la tala del bosque, junto a la recolección no controlada con fines comerciales,
vienen produciendo una rápida disminución de las poblaciones naturales de orquídeas, algunas
de las cuales se encuentran en peligro de desaparecer. Es el caso de Cattleya rex O’brien en el
departamento de San Martín. Cientos de plantas de esta especie recolectadas anualmente son
enviadas a Lima, para ser exportadas, o donde generalmente mueren (León, 1993). Las
poblaciones de Cattleya maxima Lindley en Ayabaca (Dpto. de Piura), uno de los lugares más
importantes de recolección de esta especie, están retrocediendo año a año, y las poblaciones de
Huancabamba han sido diezmadas por la actividad de un solo conocido colector. Se ha registrado
que más de 4000 plantas de Cattleya maxima Lindley son recolectadas anualmente en Ayabaca.
Lo mismo ocurre con otras especies de los géneros Masdevallia, Phragmipedium, Mormodes,
Catasetum, Oncidium, Odontoglossum y muchos otros en diferentes lugares del país.
Nuestras especies nativas de orquídeas, amenazadas o en peligro de desaparecer,
pueden protegerse utilizando las técnicas de propagación masiva in vitro siempre y cuando se
asegure su reproducción en cantidades adecuadas (Ospina, 1968). Las plantas propagadas
podrían distribuirse a viveros comerciales, lo que produciría una disminución de la extracción
2
ilegal en sus hábitats naturales; asimismo, podrían ser reintroducidas a los hábitats en los que ha
desaparecido completamente.
Un adecuado programa de propagación permitiría obtener un beneficio económico que
luego podría ser utilizado para la propagación y cultivo de otras especies en peligro. Por otra
parte, permitiría mantener las reservas adecuadas y realizar una continua selección dentro de
cada especie, lo que las haría más valiosas para fines floriculturales (Ospina, 1968).
Desafortunadamente actualmente en nuestro país no se vienen desarrollando programas
de propagación masiva de orquídeas aplicando las técnicas de cultivo in vitro, aún en los viveros
dedicados al cultivo y exportación de las mismas.
En el presente trabajo se estudia la estandarización de las técnicas de propagación in
vitro en tres especies epífitas peruanas de orquídeas: Cattleya maxima Lindley, Cattleya rex O’brien
y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem (fotografías Nro. 1, 2, 3 y 4), teniendo como
objetivo brindar un método alternativo para la conservación de estas especies y proyectar su
utilización a otras especies peruanas de orquídeas amenazadas o en peligro de desaparecer.
3
FOTO Nro. 1: Flor de Cattleya rex O’brien.
4
FOTO Nro. 2: Flor de Cattleya maxima Lindley var. semi-alba.
5
FOTO Nro. 3: Flor de Cattleya maxima Lindley.
6
FOTO Nro. 4: Flor de Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem.
7
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. ASPECTOS HISTÓRICOS
2.1.1 LA GERMINACIÓN SIMBIÓTICA DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS
Los primeros intentos de germinación de semillas de orquídeas fueron realizados en
Europa por Moore (1849) al sembrarlas en compost o sustratos que habían sido utilizados para
cultivar plantas adultas, práctica que fue adoptada por los cultivadores comerciales de su
época (Arditti, 1984).
Posteriormente Noel Bernard realizó una serie de experimentos que le permitieron
explicar el rol del hongo micorrítico en la germinación de semillas de orquídeas (Bernard,
1909), demostrando la importancia de esta asociación simbiótica y germinando exitosamente
distintas especies e híbridos de orquídeas terrestres y epífitas. Otros investigadores (Hans
Burgeff; Doroty Downie y John Curtis) continuaron su trabajo (Arditti, 1990).
Las investigaciones de Bernard y Burgeff sugirieron a Lewis Knudson que la
germinación de las semillas de las orquídeas puede obtenerse mediante el uso de ciertos
azúcares, es decir que podían germinar sin la necesidad de su asociación con el hongo
micorrítico siempre que se asegurara que el embrión recibiera los nutrientes indispensables
para su desarrollo. Por ello entre 1918 y 1957 realizó un conjunto de experimentos que le
permitieron desarrollar una metodología para la germinación asimbiótica de semillas de
orquídeas (Knudson, 1921, 1922, 1924, 1925, 1927, 1946) .
Por varias razones este descubrimiento fue uno de los más importantes eventos para
la ciencia de las orquídeas hasta nuestros días. Las tasas de germinación se incrementaron
exponencialmente y se volvieron más predecibles; en consecuencia la cantidad de híbridos y
plantas de orquídeas en circulación aumento súbitamente, disminuyendo los precios y
reduciéndose la importación de plantas de los trópicos. Finalmente, esta metodología es el más
8
práctico procedimiento para la preservación de cultivares deseables y de especies de
orquídeas en peligro de extinción (Pridgeon, A., 1990)
2.1.2 EL CULTIVO DE MERISTEMAS DE ORQUÍDEAS
En 1946 Ball publica el primer trabajo de propagación de ápices vegetativos
(“meristemas”) en Lupinus y Tropaeolum, estableciendo que pueden usarse estos ápices
vegetativos para regenerar plantas, lo cual dio inicio a la actual técnica de propagación
vegetativa o micropropagación in vitro.
El primer trabajo exitoso de propagación vegetativa in vitro de orquídeas lo llevo a cabo
Gavino Rotor (Rotor, 1949), quien cultivó secciones de varas florales de Phalaenopsis hasta
obtener nuevas plantas. Posteriormente Thomale en 1957 (Arditti, 1993) obtuvo plántulas
usando como explantes secciones de tubérculo de Orchis maculata que contenían yemas,
describiendo el potencial del cultivo de tejidos como un medio de propagación clonal rápida de
orquídeas.
George Morel (1960) aplicó la técnica de cultivo de meristemas originalmente utilizada
para eliminar virus en ciertos cultivos de papa y Dahlia, para la eliminación de virus en
importantes cultivares e híbridos de orquídeas del genero Cymbidium. Posteriormente se
observó que esta técnica permitía a su vez la propagación masiva y rápida de estas plantas y
que podía ser aplicada con éxito a otras especies (Wimber, 1963; Morel, 1964).
Luego de su publicación, los trabajos de Morel fueron rápidamente acogidos por los
viveros dedicados al comercio y cultivo de orquídeas en América y Europa, pudiendo así
realizarse la propagación en gran escala, difundiéndose el cultivo de las orquídeas. Ello
condujo a la disminución del precio de híbridos originalmente caros y a la aparición de la
industria del cultivo de orquídeas para flor cortada.
9
2.2 LA SEMILLA
La semilla de las orquídeas es muy pequeña, entre 0.4 y 1.25 mm de longitud, consiste
de un embrión indiferenciado suspendido dentro de una estructura reticulada (la testa) y
rodeado de un gran volumen de aire, lo que le permite flotar por periodos largos (Fig. 1).
Algunas especies pueden producir 1300 semillas por cápsula, mientras que otras pueden
producir hasta 4 millones (Arditti, 1992).
Las semillas carecen de endosperma y de cotiledón, salvo algunas excepciones en las
que este último es rudimentario.
El embrión esta formado por células relativamente indiferenciadas con abundantes
cuerpos lipídicos y de proteínas que constituyen su única fuente de reservas. Existe una ligera
diferenciación de las células en el embrión: las células apicales, de la región meristemática,
son más pequeñas y densas, las basales son más grandes y vacuoladas (Harrison, 1977).
TESTA EMBRION SUSPENSO
FIG. 1
SEMILLA DE ORQUIDEA Y SUS
10
2.2.1 GERMINACIÓN
Durante la germinación el pequeño embrión se hincha, rompiendo eventualmente la
testa; luego se agranda para formar una estructura en forma de cono denominada protocormo
(Fig. 2). Bajo condiciones naturales el embrión permanece en este estado, consumiendo sus
reservas lipídicas, hasta ser infectado por el hongo micorrítico apropiado (Burgeff, 1932, citado
por Arditti, 1990). Después de la infección aparecen las primeras hojas en el ápice del
protocormo y luego aparecen las raíces.
RIZOIDE
SUSPENSOR
HOJAS
PARTES DEL
Fig.2
11
Cuando se cultivan asépticamente (in vitro) las semillas pasan por los mismos
estadíos, pero necesitan de una adecuada fuente externa de carbohidratos para que puedan
continuar su desarrollo pues las reservas que poseen no son suficientes (Harrison and Arditti,
1978). La incapacidad de la semilla para utilizar sus reservas lipídicas y convertirlas en
carbohidratos explica por que requiere de esta provisión exógena de carbohidratos durante la
germinación.
Varios cambios citologicos y fisiológicos ocurren durante la germinación de la semilla,
las células basales del embrión se hinchan, el numero de mitocondrias aumenta, los plastidios
se diferencian y los cuerpos de proteínas se vuelven menos densos. Hasta aproximadamente
20 días luego de la siembra el protocormo necesita de una fuente exógena de energía, sólo
posteriormente es capaz de realizar fotosíntesis y es propiamente autotrófica
2.2.2 VIABILIDAD DE SEMILLAS
La longevidad de las semillas de orquídeas depende de las condiciones de
almacenamiento de las mismas. Muchas pierden rápidamente su viabilidad si se mantienen a
temperatura ambiente (20-24°C). La viabilidad puede mantenerse por más tiempo si las
semillas se guardan con un desecante apropiado (cloruro de calcio o silicagel) y a bajas
temperaturas (0-10°C) (Arditti, 1979).
Una alternativa para la conservación de germoplasma de orquídeas ha sido el
almacenamiento de las semillas a temperaturas bajo cero, entre -40 y -10ºC,(Kopowitz, 1994).
La posibilidad de congelar y descongelar semillas de orquídeas sin que estas pierdan su
viabilidad ha sido repetidamente demostrada con muchas orquídeas, casi todos los estudios
demostraron que las semillas podían germinar luego del almacenamiento a temperaturas bajo
cero. Bowling and Thompson (1972) reportaron que se mantenía la viabilidad de semillas de 30
diferentes especies tropicales de orquídeas luego de un proceso de congelamiento a -10 ºC y
del subsecuente descongelamiento.
12
Existen varias posibles explicaciones a la perdida de viabilidad de semillas
almacenadas. El debilitamiento y la fractura de las membranas celulares del embrión ante un
muy rápido descongelamiento, para el caso de la preservación a bajas temperaturas; la
inadecuada deshidratación o la rehidratación durante el almacenamiento a consecuencia de la
ruptura de los sellos herméticos, la variación de la temperatura de congelamiento o el
congelamiento y descongelamiento continuos.
2.2.3 PRUEBAS DE VIABILIDAD DE SEMILLAS
George Lakon desarrolló una metodología para probar la viabilidad de semillas de
cereales como el trigo, el maíz y la cebada. Esta se fundamenta en la reducción del cloruro de
2,3,5-trifenil tetrazolium incoloro, a formazan de color rojo no difusible en las células vivas. La
coloración de una célula con el tetrazolium es una indicación definitiva de su viabilidad, pues
las células necróticas permanecen incoloras (Lakon, 1949).
Este procedimiento fue aplicado a orquídeas con buenos resultados (Singh, 1981). La
prueba consiste en la inmersión de las semillas en una solución de este reactivo al 1% por un
periodo que varia entre 24 a 72 horas dependiendo de la especie, cuidando de mantenerlas en
un frasco herméticamente cerrado y en completa oscuridad (Cuadro Nro. 1). La ventaja del
método de Lakon para probar la viabilidad de semillas de orquídeas radica en la rapidez y
facilidad con que se pueden realizar las pruebas (solamente se necesita un microscopio para el
conteo), no es el caso del método en el cual se emplea el acetato de fluoresceina, que requiere
de iluminación de las semillas con luz ultra-violeta y el uso de lentes protectores apropiados
(ARDITTI, 1993).
13
Cuadro Nro. 1
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA VIABILIDAD DE LAS SEMILLAS DE ORQUÍDEAS
1. Se prepara una solución acuosa de cloruro de 2,3,5-Trifenil-tetrazolium (TTZ) al
1%. Este reactivo es sensible a la luz, por ello al ser manipulado debe evitarse su
exposición a la luz directa o a luz difusa prolongada. Conservada en oscuridad
puede mantenerse activa por varios meses y para reaccionar adecuadamente
debe tener un pH de 6 a 7.
2. Se toma una muestra de las semillas asegurándose de que sea representativa y
se ubica en un frasco pequeño, de preferencia oscuro y de cierre hermético, al
que se le agrega previamente la solución de TTZ. Debe cuidarse que las semillas
se mantengan sumergidas en la solución, evitándose su prolongado contacto con
el aire. Con una fuerte agitación nos aseguramos que las semillas estén
completamente humedecidas. Se guarda el frasco en oscuridad por 24 a 72 horas
(el tiempo depende de la especie con la que se esta trabajando). Luego se extrae
con un gotero una muestra de semilla, se la ubica en una placa porta objeto, se
agrega una o dos gotas del colorante verde de malaquita y se procede al conteo.
Las semillas viables son aquellas cuyos embriones se tiñen de color rojo, lo que
es fácil de observar debido al efecto contrastante del colorante verde de
malaquita.
3. El crecimiento de bacterias en el frasco puede alterar los resultados al momento
del conteo pues también se colorean de rojo. Para evitar esto se transfieren las
semillas a una solución de cloruro mercúrico al 0.1%, pudiendo leerse la prueba
un tiempo después sin ningún problema.
14
2.3 TIPOS DE PROPAGACIÓN IN VITRO
Las técnicas de propagación in vitro de orquídeas pueden ser de dos tipos:
2.3.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLAS
a. Por Semilla Proveniente De Cápsula Dehiscente.
Se utilizan semillas de cápsulas dehiscentes. Las semillas son esterilizadas
con una solución de Hipoclorito de calcio o Hipoclorito de sodio (lejía comercial) en
concentraciones que varían entre 0,5 a 10 %, por 10-30 minutos, tiempo que depende del tipo
de semillas que se esta usando. Para favorecer la esterilización de las semillas es conveniente
usar un agente que rompa la tensión superficial de la solución esterilizante (Tween-20), este es
un agente que permite el mejor contacto del esterilizante con la semilla. Se utiliza Tween-20 a
razón de 2 gotas por cada 100 ml, pero este puede también ser reemplazado por detergente
líquido casero. Las soluciones de Hipoclorito de calcio o de sodio son los esterilizantes más
usados, aunque puede emplearse también peróxido de hidrogeno al 3% por 30 minutos (Snow,
1985).
Luego de la esterilización las semillas son enjuagadas tres veces en agua destilada
estéril, para posteriormente ser sembradas en los medios de cultivo.
b. Por Semilla Proveniente De Cápsula No Dehiscente (Cápsula Verde)
En este caso se siembran semillas provenientes de cápsulas no dehiscentes.
La cápsula es separada de la planta madre, se eliminan las partes que no serán necesarias o
que pueden ser una fuente de contaminación (restos de pétalos y de columna), se enjuaga con
agua y detergente y se sumerge por unos segundos en alcohol etílico al 75%. Luego se
esteriliza sumergiéndola en una solución de Hipoclorito de calcio al 2 o al 4% por 20 minutos.
15
La siembra se realiza directamente sin necesidad de enjuague. Para abrir la cápsula se
hacen dos cortes longitudinales a lo largo de la sutura de dehiscencia y dos cortes
transversales, se retira el pedazo de cápsula seccionado y se procede a la siembra (Fig. 3).
2.3.2 PROPAGACIÓN VEGETATIVA O CLONAL
Se han desarrollado distintos métodos de propagación por meristemas dependiendo
del tipo de explante y la especie a propagar (Arditti, 1977,1993).
En la propagación por meristemas de yemas de brotes vegetativos se utilizan como
fuente de explante brotes vegetativos en crecimiento, los cuales son esterilizados en
Hipoclorito de calcio o de sodio al 4% por 20-30 minutos. Luego se enjuagan en agua destilada
estéril y se procede al aislamiento y siembra de los meristemas o de las yemas.
Otro tipo de propagación vegetativa se lleva acabo utilizando las yemas de los brotes
de vara floral, esta técnica a sido aplicada con éxito en Cymbidium y Phalaenopsis (Intuwong et.
al., 1972). Consiste en el corte de los nudos que contienen yemas dormantes, su esterilización,
enjuague y siembra en medios de cultivo con hormonas que inducen la formación de nuevas
plántulas a partir de esas yemas.
Se han usado también ápices foliares jóvenes de plántulas cultivadas in vitro para la
obtención de protocormos en Cattleya con éxito solo en el caso de utilizar como explante hojas
muy jóvenes (Churchill, et. al., 1971) Los trabajos de propagación de orquídeas usando ápices
radiculares, inicialmente exitosos en la propagación de especies de poco valor comercial se
han ampliado incluyendo otras especies como Cattleya y Phalaenopsis, abriendo la posibilidad
de propagar especies horticulturalmente importantes sin afectar los órganos vegetativos de las
mismas.
16
2.4 CONDICIONES DE CULTIVO
Existe una gran diversidad de condiciones y de medios usados en el cultivo in vitro de
orquídeas. El estado del medio de cultivo (liquido o sólido) depende de la especie con la que se
este trabajando y debe ser determinado empíricamente. Generalmente la proliferación es
mayor y más rápida en medio liquido y la diferenciación se ve favorecida en substratos o
soportes sólidos.
Aun cuando es recomendable la agitación del medio liquido, se han obtenido éxitos con
cultivos estacionarios (Kako, 1973; citado por Arditti, 1993) y con medios líquidos agitados solo
ocasionalmente (Arditti, 1993). Las tasas de agitación rotatoria recomendadas varían desde
0.25 r.p.m. (Jasper, 1966) hasta 200 r.p.m. (Scully, 1966). las condiciones apropiadas deben
ser determinadas experimentalmente. La agitación del medio de cultivo favorece la
proliferación de protocormos debido a la eliminación de la polaridad, retardo o prevención del
desarrollo de raíces y brotes (Scully, 1967; Wimber, 1963,1965), mejor aireación y dilución
rápida de metabolitos tóxicos (Arditti, 1993).
Las intensidades de luz usadas tanto para cultivo de semillas como para cultivo de
meristemas o yemas van desde la oscuridad hasta los 3000 lux, generalmente obtenidos con
fluorescentes y algunas veces complementados con lamparas incandescentes. Los
fotoperiodos más adecuados para la mayoría de especies tropicales son aquellos de 12-18
horas luz. En general los fotoperiodos adecuados para germinación de semillas y cultivo de
plántulas son también adecuados para el cultivo de meristemas (Arditti, 1993).
Tanto para el cultivo de meristemas como para el cultivo de semillas el rango de pH
más adecuado para el cultivo in vitro de orquídeas es de 4.8 a 5.5. Cuando el pH del medio de
cultivo es muy ácido antes del autoclavado, puede ocurrir la hidrólisis de algunos componentes
del medio, lo que puede resultar en la formación de soluciones semisólidas y la producción de
algunos compuestos tóxicos para el explante (Arditti, 1993).
17
Las temperaturas apropiadas para el cultivo varían desde 24 a 26ºC. Aunque
temperaturas superiores también pueden ser toleradas por los cultivos, algunas especies
pueden tener una menor tolerancia o requerimientos específicos.
2.5 SUSTANCIAS ORGÁNICAS COMPLEJAS USADAS EN LA GERMINACIÓN
ASIMBIÓTICA DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS.
Un gran numero de aditivos se usan para favorecer la germinación asimbiótica de
semillas de orquídeas y el subsecuente desarrollo y diferenciación de los protocormos (Arditti,
1967). Los más frecuentemente usados son el endosperma líquido de coco, el jugo de tomate y
el fruto del plátano. Steward and Simmonds (1954) reportaron que las capas formativas del
fruto del plátano poseen sustancias que estimulan la división en células de zanahoria; con solo
esta evidencia disponible, Khalifah (1966 b) llegó a la conclusión de que estas sustancias
responsables de la división celular eran las citokininas.
Van Staden y Stewart (1975) encontraron que el fruto del plátano contiene pequeñas
cantidades de compuestos inductores de la división celular [zeatina, zeatin-ribosido y 6-(Δ2-
isopentilamino) purina] pero que comparados con el endosperma líquido del coco su actividad
era extremadamente baja: 20 ml. de este aditivo daban una respuesta similar a 500 g de
plátano. Sin embargo, existen evidencias de que el efecto del plátano sobre el desarrollo de las
orquídeas puede deberse a la presencia de otros compuestos distintos a las citokininas, pues
se ha reportado la presencia de compuestos afines a giberelinas y auxinas en el mismo
(Khalifah, 1966a, 1966b).
Valmayor (1972) reportó que el endosperma líquido del coco solamente permite una
pobre diferenciación en protocormos de Dendrobium, Vanda y Cattleya, mientras que su
combinación con extractos de plátano resulta en un buen desarrollo de raíces y tallos.
18
2.6 SOLUCIONES AMORTIGUADORAS O BUFFER.
Arditti (1982) sugiere el uso de buffer fosfato para mantener estable el pH (Cuadro Nro.
2). Dado el tiempo que deben permanecer el protocormo y las plántulas en el medio de cultivo
(2-4 meses) son inevitables las variaciones de pH, a consecuencia de los metabolitos liberados
por estos.
Sin embargo el poder amortiguador (capacidad para soportar las variaciones de pH)
del buffer fosfato es muy limitado para valores de pH de 5.1 - 5.4, que son valores óptimos para
el cultivo de meristemas, yemas y semillas de orquídeas.
Cuadro Nro. 2
PREPARACIÓN DE BUFFER FOSFATO
El buffer fosfato se aplica al medio de cultivo para mantener estable el pH. 1. Preparar una solución 0.1M de KH2PO4 agregando 1.3 g de esta sustancia en
100 ml de agua destilada.
2. Preparar una solución 0.1M de K2HPO4 agregando 1.74 g de esta sustancia a
100 ml de agua destilada.
3. Mezclar 975 ml de la solución 1. con 25 ml de la solución 2. para preparar un
Stock de Buffer.
4. Usar 18 ml del Stock de Buffer por cada litro de medio de cultivo preparar.
NOTA:
El Stock de Buffer debe mantenerse siempre en refrigeración para evitar su
contaminación con hongos o bacterias
Fuente: Arditti (1982)
19
2.7 CARBÓN ACTIVADO
El carbón activado utilizado en cultivo de tejidos es el carbón resultante de la
combustión de tejidos vegetales (madera, residuos de madera, papel, lignina, etc). Actualmente
es incluido con frecuencia en la formulación de medios de cultivo In Vitro de orquídeas, tanto
para la siembra de plántulas como de protocormos obtenidos a partir de semillas o de
meristemas (Yam et. al., 1990).
Las propiedades de adsorción del carbón activado tienen una relación directa con el
diámetro y el área de sus partículas, encontrándose la forma comercial de este producto con
áreas especificas muy grandes que van desde 600 a 2000 m²/g (Clark G., 1957).
Algunos solutos de una solución son adsorbidos por el carbón activado cuando entran
en contacto con este; el grado de adsorción depende de la temperatura, el pH, y la
composición química de la sustancia adsorbida, siendo mayormente adsorbidos los
compuestos moderadamente polares y poco solubles, como fenoles, fito-hormonas y vitaminas,
en comparación con los muy polares o los apolares: azucares, sorbitol, manitol, inositol, etc.
que no son adsorbidos (Weatherhead et. al., 1979).
Las sales inorgánicas muy disociadas no son adsorbidas por el carbón activado, pero
si lo son los de muy baja solubilidad como cationes di- o poli-valentes. Es por ello en estos
casos importante el uso de agentes quelantes (EDTA) que incrementan la solubilidad de los
mismos (Yam et. al., 1990).
Varios mecanismos se han propuesto para explicar el efecto benéfico del carbón
activado en el cultivo de orquídeas (Weatherhead et. al., 1978). En primer lugar la contribución
de minerales en forma de impurezas estaría enriqueciendo el medio de cultivo. Segundo, la
capacidad para adsorber metabolitos fitotóxicos que estarían siendo liberados al medio de
cultivo por los tejidos (fenoles y sus oxidados, hidroxiquinonas, ácido para-hidro-
benzoico).Tercero la adsorción de sustancias producidas durante la esterilización en el medio
20
de cultivo, como el hidroximetil-furfural, resultado de la deshidratación de las hexosas que
afectan el crecimiento y desarrollo de las plántulas. Cuarto, la adsorción de etileno (Ernst,
1975) que inhibe el crecimiento y la diferenciación de las plántulas y protocormos.
Para el cultivo de orquídeas se utiliza carbón activado en medios de germinación de
semillas y en medios de desarrollo como para etapas posteriores (replante) a una
concentración de 2 g/l. Por su capacidad para adsorber hormonas vitaminas y nutrientes poco
solubles no debe ser usado en los medios de cultivo a excesivas concentraciones (Yam et. al.,
1990). Puesto que el carbón activado se asienta debe ser debe ser agitado antes que el medio
se solidifique.
21
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES.
3.1.1 MATERIAL VEGETAL
- Frutos inmaduros (cápsulas)
- Semillas provenientes de cápsulas dehiscentes
- Brotes vegetativos de 5-15 cm. de longitud
de las especies Cattleya maxima Lindley (recolectadas en el Dpto. de Piura), Cattleya rex
O’brien y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem (recolectadas en el Dpto. de San
Martín). Una parte del material vegetal utilizado en las pruebas de siembra de yemas de brote
vegetativo y de semillas fue gentilmente donado por Don José Macedo y Manuel Camacho en
Tarapoto, el Blgo. Benjamín Collantes, el Ing. Manuel Morán y el Ing. Carlos Bohorquez en Lima.
3.1.2 REACTIVOS Y OTROS:
- Sales Nutritivas Básicas del Medio de Cultivo Murashige & Skoog (1962)
- Medio Knudson C (1946)
- Agar
- Gel-Rite
- Sucrosa
- Tiamina
- mio-Inositol
- Carbón Activado
- Acido α-Naftalenacético
- Kinetina
- Alcohol etílico al 96%
- Hipoclorito de Calcio
22
- Hipoclorito de Sodio al 10% (Lejía comercial concentrada)
- Tween-20
- Trifenil tetrazolium
- Verde de Malaquita
- Gradillas inclinadas
- Tubos de ensayo (25x150mm.)
- Tapas de Tubos (25mm. diámetro)
- Magentas
- Frascos BBF
- Fertilizantes (Nitrofoska)
- Fungicidas (Benlate)
- Insecticidas (Lannate, Tamarón)
- Hormonas enraizadoras
- Baldes
- Aspersor
- Macetas plásticas
- Macetas de arcilla
- Musgo
- Carbón vegetal
- Polipropileno.
3.1.3 TINGLADO:
El tinglado consta de una estructura de madera protegida con malla antiáfidos. El
techo está cubierto con malla de rafia de color negro que proporciona 70-80 % de luz.
23
3.1.4 CONDICIONES DE CULTIVO.
Las semillas, protocormos, plántulas y los explantes fueron cultivados en un cuarto de
cultivo a una temperatura de 24 ± 2 ºC, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad y
con una intensidad luminosa de 2500-3000 lux provista por fluorescentes de luz blanca.
3.1.5 LUGAR DE EJECUCIÓN
El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales -
Genética de la UNALM, siendo financiado con recursos propios del Laboratorio.
La parte correspondiente al cultivo in vitro (siembra de semillas, de yemas de brote
vegetativo, replante y aclimatación) fue desarrollada en los ambientes del Laboratorio de
Cultivo de Tejidos y la parte correspondiente al cultivo en vivero y las etapas posteriores a la
aclimatación fueron llevadas a cabo en el tinglado del Campo Experimental del Laboratorio.
3.2 MÉTODOS.
Se aplicaron las técnicas de cultivo in vitro en la propagación de las especies nativas de
orquídeas, a partir de semillas (ARDITTI, 1982) y de yemas (MOREL, 1984), de la siguiente
manera
3.2.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLAS
Se realizó la propagación a partir de semillas de las especies:
- Cattleya rex O’brien
- Cattleya maxima Lindley
- Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem
24
De acuerdo al tipo de material recolectado, se siguieron los procedimientos para semilla
proveniente de cápsula dehiscente o para semilla proveniente de cápsula no dehiscente (cápsula
verde).
a. Siembra de semillas provenientes de cápsula dehiscente.
Las semillas maduras fueron extraídas del fruto (cápsula) luego de la dehiscencia
(cuando la cápsula recién está abriéndose). Para su esterilización las semillas fueron colocadas
en un pequeño sobre de papel filtro cuidando que este se encuentre bien cerrado, a fin de evitar
que se pierdan las semillas durante la esterilización o el enjuague (Foto Nro. 5). Se utilizó una
solución de Hipoclorito de Calcio o de Sodio al 2 %, (a la cual se agregaron 2 gotas de Tween-20
/ 100 ml de Hipoclorito), durante 15-25 minutos.
Pasado este tiempo el sobre se trasladó a agua destilada estéril para el enjuague (Foto
Nro. 6); se abrió luego el sobre (Foto Nro. 7) y se procedió a sembrar las semillas en condiciones
asépticas (Foto Nro. 8 y 9) en el medio basal de Murashige and Skoog (1962) suplementado con
0.4 ,mg/l de Tiamina, 0.5 mg/l de Ácido Nicotínico, 2 g/l de Carbón Activo, 2 g/l de Gel-Rite ó 8.0
g/l de Agar, y 20 g/l de Sucrosa (Cuadro Nro. 3); y en el medio Knudson C suplementado con 20
g/l de Sucrosa, 2 g/l de Carbón Activo y 2 g/l de Gel-Rite, ó 8.0 g/l de agar. Se evaluaron los
porcentajes de germinación de las tres especies en ambos medios de cultivo.
b. Siembra de Semillas provenientes de cápsula no dehiscente (Cápsula Verde)
Se colectaron los frutos (cápsulas) antes de la dehiscencia pero luego de la fertilización,
para lo cual se siguieron las recomendaciones planteadas en la literatura (Cuadro Nro. 4). El fruto
inmaduro (cápsula verde) fue limpiado, eliminando los pétalos secos o cualquier posible fuente de
contaminación. Luego fue lavado con una escobilla suave, agua y detergente.
25
FOTO Nro. 5: Esterilización de semillas provenientes de cápsula dehiscente en sobre de papel filtro.
26
FOTO Nro. 6: Enjuague de las semillas.
27
FOTO Nro. 7: Sobre exponiendo las semillas de orquídeas para su siembra.
28
FOTO Nro. 8: Extracción y siembra de las semillas en el medio de cultivo.
29
FOTO Nro. 9: Dispersión de las semillas en el medio de cultivo.
30
Cuadro Nro. 3
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS
CONSTITUYENTES MURASHIGE & SKOOG (1962) modificado para
germinación1
MURASHIGE & SKOOG (1962) modificado para
germinación2
MEDIO DE KNUDSON C
(1946)
SALES MACRO Y MICRO NUTRIENTES (mg/l)
Nitrato de Amonio NH4NO3 1650.000 1650.000
Nitrato de Potasio KNO3 1900.000 1900.000
Nitrato de Calcio CaNO3 1000.000
Sulfato de Amonio NH4SO4 500.000
Cloruro de Calcio CaCl2.2H2O 440.000 440.000
Sulfato de Magnesio MgSO4.7H2O 370.000 370.000 250.000
Fosfato de Potasio KH2PO4 170.000 170.000 250.000
Sulfato de Manganeso MnSO4.4H2O 16.000 16.000 7.500
Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O 8.600 8.600
Ácido Bórico H3BO3 6.200 6.200
Ioduro de Potasio KI 0.830 0.830
Ac Molibdico Na2MoO2.2H2O 0.250 0.250
Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.025 0.025
HIERRO (mg/l):
Sulfato Ferroso FeSO4.7H2O 27.800 27.800 25.000
Agente quelante Na2-EDTA 37.300 37.300
VITAMINAS (mg/l):
Tiamina-HCl 0.400 0.400
Ac. Nicotínico 0.500 0.500
OTROS:
Sucrosa 20.00 g/l 20.00 g/l 20.00 g/l
Agar 8.00 g/l 8.00 g/l
Gel-Rite 2.00 g/l
Buffer Fosfato 13 ml/l 13 ml/l
Carbón Activo 2.00 g/l 2.00 g/l 2.00 g/l
1,2 Medios de Cultivo formulados en el presente trabajo.
31
Cuadro Nro. 4
TIEMPOS DE COSECHA DE CÁPSULAS VERDES PARA LA SIEMBRA DE SEMILLAS DE ORQUÍDEAS
Esta tabla muestra el intervalo de días entre la polinización y la cosecha de las cápsulas para el cultivo de semillas inmaduras de orquídeas mediante la técnica de siembra de cápsula verde. Los datos son solo referenciales (aproximados), las condiciones especificas de cultivo y las características de la planta madre afectan el tiempo de maduración de las semillas; cuanto más cerca este la cápsula al tiempo de maduración y dehiscencia mayor será el porcentaje de germinación de las semillas.
Anguloa clowesi 150 - 160 uniflora 260 Bollea violacea 220 Brassavola cucullata 75 - 80 nodosa 70 - 75 especies 120 - 150 Brassia especies 170 Cattleya amethystoglossa 220 bicolor 250 - 270 iricolor 220 labiata 200 - 300 maxima 240 - 270 skinneri 85 - 90 trianaei 250 violacea 80 - 85 unifoliadas 120 - 200 Chondrorhyncha wailesiana 160 Cirrhopetalum picturatum 140 Cochleanthes discolor 180 Comparettia macroplectron 200 Cymbidium especies 280 - 360 Cypripedium especies 30 Cyrtopodium especies 150 - 270 Dendrobium superbum 160 - 250 . 160 - 250 formosum 210 nobile 150 - 180 phalaenopsis 120 - 140 senile 110 stratiotes 150 - 200 tosarense 120 Doritis pulcherrima 65 - 70 especies 90 Encyclia especies 130 -180 cochleata 70 - 75 tampensis 70 - 75 Epidendrum ibaguense 100
pseudepidendrum 150 - 180Galeandra lacustris 135Gongora armeniaca 100 quinquenervis 45Keferstenia parvilabris 135 tolimensis 140Laelia anceps 120 - 150 cinnabarina 110 - 120 purpurata 120 - 180Lockartia especies 80 - 100Lycaste brevispatha 200 - 220Masdevallia amabilis 100 caudata 130 - 145 chaparensis 130 coccinea 135 decumana 140 instar 130 - 150 pandurilabia 120 strobellii 110 - 140 tovarensis 120 - 140 veitchiana 130 - 150 yungasensis 100Maxillaria rufescens 140 especies 120 - 140Miltonia especies 120 - 140Miltoniopsis roezlii 250 - 270 vexillaria 140Notylia barkeri 110Odontoglossum especies 80 - 90Oeceoclades saundersiana 160 - 170Oncidium ampliatum 45 - 50 baueri 110 - 140 cebolleta 110 - 130 lanceamun 180 - 240 luridum 100 - 180 papilio 90 - 120 sanderae 90 - 120 splendidum 130 - 170
Paphiopedilum callosum 230 concolor 235 druryi 450 venustum 220 especies 240 - 300Phalaenopsis especies 110 - 120Phragmipedium caudatum 230 wallisii 300 - 330Pleurothallis Palliolata 120 Phalangiphera 130 - 150 restrepioides 90 - 100Polycycnis barbata 125Polystachya galeata 200 pubescens 120Porroglossum meridionale 110 muscosum 95 portillae 95Renanthera especies 150 - 180Rhyncholaelia glauca 210 - 220 especies 120 - 180Rodriguezia especies 110 - 130Schomburgkia superbiens 380Scuticaria hadwenii 110Sophronitis brevipedunculata 170 - 200 coccinea 200 - 300Stanhopea wardii 185Stenia pallida 210Trichopilia marginata 135 suavis Vanda coerulea 290 tessellata 300 especies 150 - 250Zygopetalum intermedium 250 - 260
Fuentes: ARDITTI. J. (1982); RHODEHAMEL, W. (1994); SAULEDA, R. (1976).
32
La esterilización superficial se llevó a cabo con una solución de Hipoclorito de sodio (lejía
comercial concentrada) al 4% a la que se agregó Tween-20 (2 gotas / 100 ml). El tiempo de la
esterilización fue de 20-30 minutos. Pasado este tiempo la cápsula fue retirada del agente
esterilizante y ubicada en una placa petri estéril, se realizaron los cortes, se abrió la cápsula (Fig.
3) y se extrajeron las semillas que fueron sembradas asépticamente en el medio basal de
Murashige and Skoog (1962) suplementado con 0.4 mg/l de Tiamina, 0.5 ppm de Ac. Nicotínico, 2
g/l de Carbón Activo, 2 g/l de Gel-Rite (ó 8.0 g/l de Agar), y 20 g/l de Sucrosa; y en el medio
Knudson C suplementado con 20 g/l de Sucrosa, 2 g/l de Carbón Activo y 2 g/l de Gel-Rite (ó 8 g/l
de Agar) (Cuadro Nro. 3). A las 4 semanas de la siembra se evaluaron los porcentajes de
germinación de las tres especies en ambos medios de cultivo.
3.2.2 PROPAGACIÓN POR YEMAS DE BROTES VEGETATIVOS
Se realizó la propagación por yemas de brote vegetativo de las especies:
- Cattleya rex O’brien
- Cattleya maxima Lindley
Se colectaron brotes vegetativos de Cattleya maxima Lindley y Cattleya rex O’brien en
pleno crecimiento de 5 a 15 cm de longitud, mediante un corte en la parte basal de los mismos
(Foto Nro. 10 y Fig. 4). Los materiales necesarios para la obtención y la siembra de las yemas
(“meristemas”) se muestran en la Foto Nro. 11.
CORTES CÁPSULA ABIERTA SIEMBRA
FIG. 3
CORTES A LA CAPSULA NO DEHISCENTE Y SIEMBRA
33
FOTO Nro. 10: Corte del brote vegetativo de Cattleya maxima Lindley. El bisturí indica el lugar adecuado del corte.
34
FOTO Nro. 11: Materiales para la siembra aséptica de yemas de orquídeas.
35
Se eliminaron los restos de tejido muerto o necrótico que podían ser una fuente de
contaminación. Los brotes fueron lavados con una escobilla suave, agua y detergente, para luego
ser sumergidos por unos segundos en alcohol al 75%
FOTO Nro.12: Proceso de esterilización del brote. 1a esterilización.
36
Se hicieron dos esterilizaciones superficiales: En la primera esterilización los brotes
enteros fueron sumergidos por 20 minutos en una solución de Hipoclorito de sodio al 4% a la cual
se agregó Tween-20 (2 gotas / 100 ml).Ver Foto Nro. 12.
Pasado este tiempo el brote se ubicó en una placa petri estéril (no es necesario el
enjuague) y se eliminaron las hojas envolventes descubriendo las yemas (Foto Nro. 13).
Seguidamente se realizó la segunda esterilización de los brotes sumergiéndolos por 10 minutos
en una solución de Hipoclorito de sodio al 2% a la cual se agregó 2 gotas / 100 ml de Tween-20
(Ver Foto Nro. 14). Se enjuagaron en 100 ml de agua destilada estéril y se ubicaron en una placa
petri estéril.
BROTE
SEUDOBULBO
CORT
CORTE DEL BROTE EN Cattleya
37
FOTO Nro. 13: Brote sin hojas envolventes.
38
meristema yema
nudo
VISTA LATERAL Meristema apical
Tomado de Scully,1967
Cortes de la yema para extraer el meristema
FIG. 5
39
FOTO Nro. 14: Brote durante la 2a esterilización.
40
El aislamiento de las yemas de brote vegetativo se realizó mediante cortes laterales a las
yemas expuestas (Fig. 5 y Foto Nro. 15 , 16 y 17). Los explantes obtenidos se sembraron en
medio basal de Murashige and Skoog (1962) (Ver Foto Nro. 18) suplementado con 0.4 mg/l de
Tiamina, 100 mg/l de mio-Inositol, 1.0 y 2.0 mg/l de Ácido Naftalen-Acético (ANA) y 1.0 y 2.0 mg/l
de Kinetina (KIN) (Cuadro Nro. 5).
FOTO Nro. 15: Brote luego de la 2a esterilización mostrando 3 yemas.
41
FOTO Nro. 16: Vista Frontal de una Yema sin hojas envolventes.
42
FOTO Nro. 17: Vista lateral de una yema sin hojas envolventes.
43
FOTO Nro. 18: Siembra de las yemas en el medio de cultivo líquido.
44
Cuadro Nro. 5
MEDIO MURASHIGE & SKOOG (1962) MODIFICADO PARA EL CULTIVO DE YEMAS DE Cattleya
CONSTITUYENTES CANTIDAD / L
SALES (Macro- y Micro- Nutrientes) mg./l.
Nitrato de Amonio NH4NO3 1650.000
Nitrato de Potasio KNO3 1900.000
Cloruro de Calcio CaCl2.2H2O 440.000
Sulfato de Magnesio MgSO4.7H2O 370.000
Fosfato de Potasio KH2PO4 170.000
Sulfato de Manganeso MnSO4.4H2O 16.000
Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O 8.600
Acido Bórico H3BO3 6.200
Ioduro de Potasio KI 0.830
Ac. Molibdico Na2MoO2.2H2O 0.250
Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.025
HIERRO:
Sulfato ferroso FeSO47H2O 27.800
Agente quelante Na2 -EDTA 37.300
VITAMINAS:
Tiamina-HCl 0.400
HORMONAS:
ANA [*] KIN [*] OTROS:
mio-Inositol 100.00
[*] Dosis hormonales utilizadas en los Tratamientos:
T1: ANA 1.0 mg/l , KIN 1.0 mg/l
T2: ANA 2.0 mg/l , KIN 2.0 mg/l
T3: ANA 2.0 mg/l ‘ KIN 1.0 mg/l
45
3.2.3 REPLANTE
Los protocormos y plántulas obtenidos a partir de yemas o de semillas fueron transferidos
al medio de desarrollo habiéndose utilizando el medio Murashige & Skoog (1962) suplementado
con 0.4 mg/l de Tiamina, 20 g/l de Sucrosa, 2 g/l de Carbón Activo, 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de
Agar, y 100 g/l de plátano homogenizado ó 100 ml/l de endosperma líquido de Coco (Cuadro Nro.
6).
Cuadro Nro. 6
MEDIOS DE CULTIVO PARA EL REPLANTE DE PROTOCORMOS Y PLANTULAS DE ORQUIDEAS
CONSTITUYENTES M & S + mio-I * M & S + P10 * M & S + C *
SALES (Macro- y Micro- Nutrientes) mg./l. mg./l. mg./l.
Nitrato de Amonio NH4NO3 1650.000 1650.000 1650.000
Nitrato de Potasio KNO3 1900.000 1900.000 1900.000
Cloruro de Calcio CaCl2.2H2O 440.000 440.000 440.000
Sulfato de Magnesio MgSO4.7H2O 370.000 370.000 370.000
Fosfato de Potasio KH2PO4 170.000 170.000 170.000
Sulfato de Manganeso MnSO4.4H2O 16.000 16.000 16.000
Sulfato de Zinc ZnSO4.7H2O 8.600 8.600 8.600
Acido Bórico H3BO3 6.200 6.200 6.200
Ioduro de Potasio KI 0.830 0.830 0.830
Ac. Molibdico Na2MoO2.2H2O 0.250 0.250 0.250
Cloruro de Cobalto CoCl2.6H2O 0.025 0.025 0.025HIERRO:
Sulfato Ferroso FeSO47H2O 27.800 27.800 27.800
Agente quelante Na2 -EDTA 37.300 37.300 37.300VITAMINAS:
Tiamina-HCl 0.400 0.400 0.400SUSTANCIAS ORGANICAS COMPLEJAS
Plátano 100000.00
Agua de Coco 100 ml OTROS:
mio-Inositol 100.00
Gel-Rite 1 2000.00 2000.00 2000.00
Agar 2 8000.00 8000.00 8000.00
Buffer fosfato (stock de buffer) 13.00 ml 13.00 ml 13.00 ml
Carbón Activo 2000.00 2000.00 2000.00
Sucrosa 20 g/l 20 g/l 20 g/l * Medios de Cultivo: - M & S + mio-I : Usado para inducir proliferación de protocormos. - M & S + C : Para enraizamiento y desarrollo vegetativo. - M & S + P10 : Para enraizamiento y desarrollo vegetativo. 1,2 Agentes solidificantes : Usados por separado, nunca juntos en un mismo medio de cultivo.
46
3.2.4 ACLIMATACIÓN
Luego del segundo replante, cuando las plántulas desarrollaron varias hojas y un buen
sistema radicular, fueron extraídas de los frascos y sometidas al proceso de aclimatación.
a. Preparación del Sustrato
El sustrato en el que se sembraron las plántulas fue una mezcla de musgo y
pequeños trozos de carbón (3 partes de musgo: 1 parte de carbón) que permitía una buena
retención de humedad y a la vez una buena ventilación de las raices. Este sustrato fue
esterilizado previamente en una estufa a 80 ºC por 6 horas .
b. Preparación de las Plántulas.
Las plántulas fueron retiradas de los frascos, limpiadas y lavadas eliminando el
agar adherido a las raíces. Se eliminaron las raíces delgadas o muertas que podían ser una vía
de infección para la plántula. Se sumergieron en Benlate (Benomyl) 1.0 g/l por 30 minutos. Se
seleccionaron las plántulas por tamaños: Grandes, medianas y pequeñas, para luego ser
sembradas en el sustrato estéril.
c. Siembra
Se las sembró por grupos (grandes, medianas y pequeñas) en macetas
comunitarias cuyo tercio inferior fue llenado con pedazos pequeños de polypropileno y los dos
tercios superiores restantes con el sustrato estéril (Wright & Tippit, 1994). Ver Fig. 6.
47
Luego de ser sembradas las plántulas se transfirieron a la cámara de aclimatación (Fig.
7) que estaba acondicionada para proporcionarles una alta humedad y evitar su
deshidratación.
Se evaluó el porcentaje de plántulas sobrevivientes luego del procedimiento de
aclimatación. Las plántulas que sobrevivieron a la aclimatación fueron transferidas a un
Tinglado para ser cultivadas con un régimen intensivo de abonamiento, riego y control de
patógenos.
TECNOPO
PLANTULA
SUSTRAT
SIEMBRA DE PLANTULAS -
FIG. 6
48
3.2.5 DISEÑOS ESTADÍSTICOS
a. Propagación por semillas.
Se utilizó el Diseño de Bloques Completos al Azar considerando como
tratamientos los medios de cultivo de Murashige and Skoog y Knudson C, y como bloques las
especies Cattleya rex O’brien, Cattleya maxima Lindley y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel &
Braem. El parámetro que permitió evaluar la eficiencia de ambos medios de cultivo fue el
porcentaje de germinación.
b. Propagación por Yemas de Brote Vegetativo.
Las especies Cattleya rex O’brien y Cattleya maxima Lindley, se propagaron a
partir de brotes vegetativos, utilizándose el Diseño de Bloques Completos al Azar, considerando
como tratamientos las diferentes concentraciones de hormonas, y como bloques las dos especies
probadas.
PLÁSTIC
CÁMARA
TOALLA
CÁMARA DE ACLIMATACIÓN
FIG. 7
49
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 PROPAGACIÓN POR SEMILLAS
4.1.1 SIEMBRA DE SEMILLA PROVENIENTES DE CÁPSULA DEHISCENTE
Las semillas tanto de Cattleya rex O’brien como de Cattleya maxima Lindley se
esterilizaron en soluciones de Hipoclorito de Calcio y de Sodio (lejía comercial) al 2%
obteniéndose una adecuada germinación en ambos casos. Por el contrario, las semillas de
Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem esterilizadas con Hipoclorito de sodio al 2% no
germinaron adecuadamente, utilizándose el Hipoclorito de calcio al 2% como esterilizante con
buenos resultados. Probablemente este fenómeno es consecuencia de el efecto inhibidor de
los iones sodio sobre el crecimiento y desarrollo del embrión (Arditti, 1982) y además del mayor
poder oxidante de este respecto al Hipoclorito de Calcio.
El método de esterilización, ideado en éste laboratorio (confeccionando bolsitas de
papel filtro) en las que las semillas son sumergidas en la solución esterilizante tiene la ventaja
de ser rápido y fácil de realizar en relación con otros métodos como el descrito en la literatura
por Courtis (1978)en el cual se emplea una jeringa hipodérmica y una aguja muy fina para la
esterilización y el enjuague de las semillas. El muy pequeño tamaño de las semillas de
orquídeas hace que se deban tomar precauciones para evitar que las semillas se pierdan
durante la esterilización y el enjuague.
El tiempo de esterilización fue de 20 minutos dependiendo del estado de la semilla.
Este tiempo fue variado de acuerdo al siguiente criterio: Las semillas de una cápsula recién
abierta están menos contaminadas que las semillas que se encuentran a la intemperie en una
cápsula con varios días de dehiscencia en un vivero,. Las semillas colectadas en el hábitat
deben ser esterilizadas con mayor cuidado y con más tiempo de exposición que las semillas
colectadas en viveros.
50
Se encontró evidencia estadística que demuestra la existencia de diferencias
significativas entre los medios de cultivo probados y las tres especies estudiadas (Cuadro Nºro.
7).
Cuadro Nro. 7
CUADRO DE ANALISIS DE VARIANCIA DE LA GERMINACION DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CÁPSULA DEHISCENTE
FUENTES DE
VARIABILIDAD
GRADOS DE LIB.
SUMA DE
CUADRADOS
CUADR MEDIOS
F calc
BLOQUES
2
26.41
13.205
21.6783*
TRATAMIENTOS
1
323.547
323.547
531.159**
ERROR EXPERIM.
2
1.2182
0.609113
TOTAL
5
351.1752
Tratamientos:
T1: Medio M & S (1962) modificado (Cuadro Nro. 3); Y1 = 72.28 (a)*
T2: Medio KC (1946) (Cuadro Nro. 3); Y2 = 86.467 (b) * Letras diferentes indican diferencias significativas para la prueba de Duncan (α = 0.05)
Bloques:
- Cattleya maxima Lindley
- Cattleya rex O’brien
- Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem
Del análisis de variancia se puede observar que existen diferencias significativas en las
respuestas del genotipo, sin embargo es en los dos medios de cultivo probados M & S
modificado y KC donde se observan diferencias altamente significativas
La germinación de las semillas provenientes de frutos dehiscentes fue mayor en el
medio M & S modificado que permite también un mejor crecimiento de los protocormos.
51
Un hecho que cabe destacar es que las semillas de cápsulas dehiscentes pueden ser
almacenadas para siembras posteriores, lo que no puede hacerse con las semillas inmaduras,
que se secan y pierden su viabilidad muy rápidamente.
Sin embargo la siembra de semillas provenientes de cápsulas dehiscentes tiene la
desventaja de que es mayor el riesgo de contaminación de los medios de cultivo sembrados
debido a la presencia de microorganismos contaminantes dentro del embrión que no pueden
ser eliminados con esterilización superficial. Adicionalmente las semillas, al estar sometidas
directamente al esterilizante también son afectadas por este disminuyendo sus porcentajes de
germinación. Se conoce que un tiempo de exposición demasiado largo o una muy alta
concentración de esterilizante puede causar la muerte de todas las semillas.
4.1.2 SIEMBRA DE SEMILLA PROVENIENTES DE CÁPSULA NO DEHISCENTE
(CÁPSULA VERDE).
En este trabajo las cápsulas fueron separadas de la planta madre, lavadas con agua y
detergente, sumergidas unos segundos en alcohol al 75% y esterilizadas con Hipoclorito de
sodio (lejía comercial) al 4% por 25 minutos. Luego se corto la cápsula (Fig. 3) y se realizo la
siembra de las semillas en los medios de cultivo en condiciones asépticas (dentro de la cámara
estéril de flujo laminar).
Siempre que la cápsula esté sana (que no tenga dentro insectos u hongos) se puede
asegurar que las semillas que contiene están estériles y solo es necesaria su esterilización
superficial.
El procedimiento de cultivo utilizando cápsula verde es más sencillo, más rápido y más
seguro que el de siembra de semillas provenientes de cápsula dehiscente, hay menor riesgo
de infección, se pueden utilizar altas concentraciones de Hipoclorito de sodio sin que este
afecte a las semillas y no es necesario el enjuague con agua destilada estéril. Con esta
metodología el tiempo de cosecha de las semillas para la siembra (desde la polinización) se
52
reduce hasta a la mitad. Es el caso del genero Cattleya y sus híbridos, cuyas semillas tardan 12
meses en madurar completamente (desde la polinización hasta la dehiscencia del fruto),
pudiendo sembrarse las semillas de los frutos inmaduros a partir de los 6-7 meses de la
polinización germinando éstas normalmente. (Cuadro Nro. 4).
El análisis estadístico nos indica que hubieron diferencias significativas respecto a la
germinación en los medios de cultivo Knudson C y Murashige & Skoog para las tres especies
estudiadas. Se pudo observar una respuesta favorable en el medio M & S modificado, con un
mejor y más rápido crecimiento, desarrollo y diferenciación de los protocormos que en el medio
Knudson C (Cuadro Nro. 8; Foto Nro. 19).
Cuadro Nro. 8
CUADRO DE ANÁLISIS DE VARIANCIA DE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS PROVENIENTES DE CÁPSULA NO DEHISCENTE (CÁPSULA VERDE)
FUENTES DE VARIABILIDAD
GRADO
S DE
SUMA DE
CUADRADO
CUADR MEDIOS
F calc
BLOQUES
2
86.3145
43.1573
24.7197*
TRATAMIENTOS
1
102.6721
102.6721
58.8086*
ERROR EXPERIM.
2
3.4917
1.7459
TOTAL
5
192.4783
Tratamientos:
T1 : Medio M & S (1962) modificado; Y1 = 73.77 (a)*
T2 : Medio KC (1946) (Cuadro Nro. 3); Y2 = 82.043 (b)
* Letras diferentes indican diferencias significativas para la prueba de Duncan (α = 0.05)
Bloques:
- Cattleya maxima Lindley
- Cattleya rex O’brien
- Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem
53
FOTO Nro. 20: Protocormos formados a partir de una yema.
54
La razón de esta diferencia radica en el más adecuado balance de nutrientes minerales
del medio M & S modificado y por el contenido de tiamina (0.4 mg/l) y ac. nicotínico 0.5 mg/l,
(Cuadros Nro. 1, 2 y 3). vitaminas que favorecen la germinación de las semillas de orquídeas.
El medio M & S contenía además buffer fosfato (Cuadro Nro. 3), que contribuyó a mantener
estable el pH del medio de cultivo, y carbón activo que favoreció la germinación al adsorver
metabolitos y sustancias tóxicas producidas por el embrión
Se pudo notar que la germinación se ve favorecida al utilizar bajas concentraciones de
agente solidificante. Se probaron agar (8.0 gr/l) y 2.0 g/l de Gel-Rite, siendo este último el más
adecuado ya que se obtuvo un gel consistente pero no muy duro que permitió una rápida
germinación y un buen desarrollo de los protocormos. En los medios con concentraciones altas
de agentes solidificantes, el crecimiento y desarrollo de los protocormos y plántulas es lento
(Arditti, 1982) y las raices no crecen adecuadamente.
Tanto en la siembra de semillas provenientes de cápsula dehiscente como de semillas
provenientes de cápsula verde, el embrión pasa por los mismos estadíos. Luego de tres
semanas de la siembra, germina, se hincha y produce clorofila (de color amarillo verdoso).
Continua su desarrollo hasta dar lugar a una estructura demominada protocormo que
posteriormente forma pequeñas hojas y raices, dando lugar a la plántula.
4.2 PROPAGACIÓN POR YEMAS DE BROTE VEGETATIVO
En las especies estudiadas se observó que el tamaño optimo de los brotes donantes
de las yemas de brote vegetativo es de 10-15 cm. Los brotes fueron separados de la planta -
madre haciendo un corte transversal al rizoma, muy cerca de la base del seudobulbo más
próximo incluyendo en algunos casos las raíces nuevas, los cortes más arriba del punto
indicado pueden excluir algunas yemas útiles.
55
Las plantas provenientes de viveros o las colectadas en el campo contienen polvo y
otras fuentes de contaminación como hojas muertas, seudobulbos secos, líquenes y musgo,
por lo cual la limpieza previa del material permite una mejor esterilización del explante. Es
importante además elegir brotes sanos libres de daños por insectos o sin enfermedades
fungosas o bacterianas, puesto que la esterilización superficial no sería efectiva.El doble
proceso de esterilización superficial del brote asegura la eliminacion de microorganismos
contaminantes.
Previo a la esterilización es conveniente un enjuague del brote con alcohol al 75 % por
10 segundos, lo que contribuye a eliminar la capa cérea que dificulta la acción superficial del
Hipoclorito y la adición de Tween-20 permite un mejor contacto del esterilizante con la
superficie del brote.
Se encontró que los brotes de Cattleya maxima Lindley y de Cattleya rex O’brien poseen
dos o tres yemas basales y una yema apical. De ellas se aisló una región meristemática de
aproximadamente 2 mm, que incluye al meristema propiamente dicho con algunas hojas
envolventes y un cubo de tejido basal (Fig. Nro. 8)
SIEMBRA DE MERISTEMA
Medio de
FIG.
56
Es importante anotar que no se realiza el aislamiento y la siembra del meristema
propiamente dicho, sinó de una región meristemática que incluye varias hojas envolventes y
primordios foliares, puesto que en el género Cattleya los explantes muy pequeños tienen muy
bajos porcentajes de sobrevivencia.
Luego del aislamiento el explante fue sembrado en medio de cultivo liquido sin
agitación. Varios cambios fueron notorios luego de la siembra; el explante se hinchó poco a
poco hasta que a las 6-8 semanas aparecieron estructuras muy semejantes a protocormos
(Ver Foto Nro. 20), resultantes de regeneración o de embriogénesis somática. Este protocormo
somático pasa por los mismos estadíos que el protocormo sexual, tiene la misma apariencia,
posee rizoides y da lugar a una plántula semejante a las de semilla.
Se encontraron diferencias significativas en la respuesta de los explantes de las dos
especies incluidas en este experimento (Cattleya maxima Lindley y Cattleya rex O’brien) a las
distintas concentraciones hormonales utilizadas (Cuadro de Análisis de Variancias). Se
encontró que el medio que permitió una mayor obtención de protocormos fue el que contenía
1.0 mg/l de ANA y 1.0 mg/l de KIN (Cuadro Nro. 9).
57
58
Cuadro Nro. 9
CUADRO DE ANALISIS DE VARIANCIA PARA LA SIEMBRA DE Cattleya rex Y Cattleya maxima
FUENTES DE
VARIABILIDAD
GRADOS DE LIB.
SUMA DE
CUADRADOS
CUADR MEDIOS
F calc
BLOQUES
1
4.166
4.166
24.946 *
TRATAMIENTOS
2
73.0
36.5
218.56 *
ERROR EXPERIM.
2
0.334
0.167
TOTAL
5
77.5
Tratamientos:
T1: ANA 1.0 mg/l , KIN 1.0 mg/l; Y1 = 5.32 (a) *
T2: ANA 2.0 mg/l , KIN 2.0 mg/l; Y2 = 1,82 (b)
T3: ANA 2.0 mg/l , KIN 1.0 mg/l; Y3 = 2.91 (c)
* Letras diferentes indican diferencias significativas para la prueba de Duncan (α = 0.05)
Bloques:
- Cattleya maxima Lindley
- Cattleya rex O’brien
Con fines de producción en gran escala es recomendable utilizar un agitador rotatorio
(Arditti,1993). Los bajos porcentajes de formación de protocormos que se obtuvieron se deben
entre otros a la falta de agitación de los medios más que a la baja concentración de hormonas.
Una vez lograda la regeneración de protocormos estos se transfirieron a medio de
proliferación para luego ser tratados como protocormos obtenidos de semillas.
59
4.3 REPLANTES
A la décima semana y obtenidos los protocormos, sea por cultivo de semillas o por
cultivo de yemas, se transfirieron al medio de desarrollo que consistió de un medio M & S
modificado al cual se agregó plátano homogeneizado (M & S + P10, Cuadro Nro. 6), donde
crecieron vegetativamente y desarrollaron un buen sistema radicular. En la semana 20 se
transfirieron nuevamente las plántulas al último medio de cultivo (M & S + P10 ó M & S + C).
Este medio permitió un buen desarrollo de las raíces así como de la parte vegetativa de las
plántulas (Cuadro Nro. 10), preparándolas para el proceso de aclimatación subsiguiente.
Cuadro Nro. 10
RESPUESTA DE LAS PLANTULAS Y PROTOCORMOS A LOS MEDIOS DE REPLANTE
PROTOCORMOS PLANTULAS MEDIO PROLIFER
ACIÓN DIFERENCIA
CIÓN CRECIMIE
NTO VEGETATI
VO
ENRAIZAMIENTO
M & S + ++ + 0
M & S + mio-I +++ 0 +++ 0
M & S + P 10 0 +++ ++ +++
Crecimiento:
0 : Ninguno
+ : Pobre
++ : Bueno
+++ : Muy bueno
El plátano como aditivo fue aplicado a una concentración de 50-100 g/l , previa
homogeneización en una licuadora, es importante anotar que se utilizo plátano poco maduro, el
muy maduro contiene altos niveles de inhibidores del crecimiento tales como etileno.
El plátano y el coco como aditivos tienen un claro efecto promotor del desarrollo y
diferenciación de las plántulas y protocormos (Cuadro Nro. 11), pero no son adecuadas para la
60
germinación de semillas o para el cultivo de protocormos jóvenes, lo que concuerda con las
observaciones de Arditti (1982).
Se observó al igual que Valmayor (1972), que el agua de coco (100 ml/l), es un buen
promotor del crecimiento vegetativo y radicular en plántulas. Es por ello que su aplicación en el
medio del último replante permite una mayor sobrevivencia de las mismas durante el proceso
de aclimatación al favorecer el desarrollo de las raíces y tallos de las plántulas.
Cuadro Nro. 11
INFLUENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE PROTOCORMOS Y PLANTULAS
MEDIO DE CULTIVO*
ETAPA
RESPUESTA
M & S Modificado
Germinación
Germinación rápida
M & S + mio-I
Proliferación
Proliferación de protocormos indiferenciados, mediante formación de Protocormos
adventicios
M & S
Diferenciación Desarrollo y
diferenciación de los protocormos. Formación de plantulas
M & S + P10
Diferenciación
Protocormos indiferenciados o muy jóvenes mueren, solo sobreviven los protoc.
diferenciados
M & S + P10 M & S + C
Crecimiento Vegetativo
(plantulas)
Buen crecimiento radicular. Buen crecimiento vegetativo
M & S + mio-I
Desarrollo (plantulas)
Plantulas con buen crecimiento vegetativo pero sin raíces.
* Medios de Cultivo: - M & S Modificado : Medio Murashigue & Skoog (1962) modificado para cultivo de orquídeas - M & S : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal (sin Hormonas ni aditivos) - M & S + mio-I : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal + mio-Inositol 100 mg/l - M & S + C : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal + Agua de Coco 100 ml/l - M & S + P10 : Medio Murashigue & Skoog (1962) basal + Platano 100 g/l Las formulaciones completas de Medio Murashigue & Skoog se encuentran en el Cuadro Nro. 3
61
Se pudo notar el efecto amortiguador (buffer) de los aditivos usados (plátano y agua de
coco), pues una vez aplicados mantienen el pH del medio de cultivo dentro de los valores
requeridos (pH 5.0 - 5.3), aunque la permanencia de este efecto amortiguador luego de la
esterilización en autoclave no ha sido estudiada.
Dos tipos de agentes solidificantes fueron utilizados para el replante de protocormos y
plántulas: El agar (8.0 g/l) y el Gel-Rite (0.2 g/l); de ellos el más adecuado resulto el Gel-Rite
pues es mucho más económico, con menor cantidad de impurezas que el agar y a las
concentraciones usadas tiene la consistencia adecuada permitiendo un buen desarrollo de
raíces y un rápido crecimiento de las plántulas. Concentraciones elevadas de agente
solidificante causan un crecimiento lento y un pobre desarrollo radicular y vegetativo.
4.4 ACLIMATACIÓN
A partir de la semana 32 de realizada la siembra y luego del segundo replante las
plántulas fueron transferidas a condiciones de “campo” (vivero) para lo cual pasaron por el
proceso de aclimatación. En este proceso las plántulas deben desarrollar un conjunto de
adaptaciones anatómicas y fisiológicas como la capacidad para responder a una baja humedad
ambiental mediante el oportuno cierre de sus estomas, el incremento de la epicuticula cérea
protectora, así como una más intensa actividad fotosintética y una eficiente absorción radicular
de los nutrientes (Fuchigami et. al.,1981; Brainerd, 1981; Grout, 1977).
Lss plántulas sembradas se ubicaron en la cámara de aclimatación (Figs. 6 y 7),
manteniendo una alta humedad los primeros días (cerrándola completamente). Poco a poco se
fue abriendo la cámara de aclimatación para hacer que la humedad disminuya gradualmente
hasta igualarse a la del medio ambiente. Este proceso toma varios días (el tiempo depende de
la planta y del sustrato en que fué sembrada)por lo que es muy importante la observación del
estado de las plántulas . Pasados los 10 días de la transferencia se inició el riego con una
solución de tiamina y ANA (0.01 y 0.04 mg/l respectivamente) para promover la formación de
raíces en las plántulas. Pruebas preliminares realizadas en este Laboratorio nos mostraron el
efecto favorable de la tiamina durante la aclimatación, y Goh (1983) demostró que el ANA
62
favorece el enraizamiento de las orquídeas. Se usa esta auxina sintética pues es mucho más
estable que la auxina natural AIA . Para todos los riegos realizados durante la aclimatación se
utilizó agua destilada. Los porcentajes de sobrevivencia logrados fueron en promedio 87 %
para Cattleya rex O’brien, 81 % para Cattleya maxima Lindley y 83 % para Psychopsis
versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem.
Una vez que las plántulas se adaptaron a la humedad ambiental y no mostraban signos
de deshidratación se transfirieron al vivero.
Cuando las plántulas fueron sembradas en sustrato sin esterilizar o sin aplicárseles
fungicida (Benlate) los porcentajes de mortalidad fueron muy altos, llegando hasta el 100 % en
algunos casos. Ademas de la esterilización del sustrato y la aplicación de fungicida fue
importante cuidar que la temperatura durante la aclimatación no sea muy alta pues deshidrata
a las plántulas y favorece el desarrollo de enfermedades causadas por hongos y bacterias.
Las orquídeas epífitas peruanas pueden propagarse fácilmente utilizando las técnicas
de cultivo in vitro en los medios de cultivo probados. Su introducción in vitro permitirá crear
Bancos de Germoplasma, así como iniciar programas de selección, mejoramiento y
conservación.
63
V. CONCLUSIONES
1. Se encontraron diferencias significativas entre los medios de cultivo Knudson C y M & S
modificado para la germinación de semillas de las especies Cattleya rex O’brien, Cattleya
maxima Lindley y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem. Siendo el más adecuado
el medio M & S modificado.
2. En la utilización de Gel-Rite (2.0 g/l) y agar (8.0 g/l) como agentes solidificantes, se encontró
una mejor respuesta en germinación y establecimiento de las plántulas en los medios
solidificados con Gel Rite, respuesta debida aparentemente a una mejor consistencia del
medio que se alcanza con dicho producto. Adicionalmente este medio tiene la ventaja de
ser más económico.
3. La utilización de sustancias orgánicas complejas como el plátano homogeneizado (100 g/l)
y endosperma líquido de coco (100 ml/l), en la composición de los medios, promueven una
rápida diferenciación del protocormo y el desarrollo vegetativo y radicular de las plántulas.
4. El procedimiento de siembra de semillas provenientes de cápsula no dehiscente (cápsula
verde) es el más recomendable por el menor riesgo de infección de las semillas, por su
rapidez y simplicidad..
5. El tamaño óptimo del brote para realizar el aislamiento y la siembra de la región
meristemática en Cattleya es de 10 a 15 cm.
64
VI. RECOMENDACIONES
1. Se recomienda probar la utilización de nuevos buffers orgánicos con mayor poder
amortiguador, es decir cuyo pKa sea igual o muy cercano al pH requerido, como es el caso
del buffer citrato, para el cultivo de semillas y yemas de orquídeas.
2. Probar la eficiencia de la agitación rotatoria en la propagación de meristemas y yemas,
utilizando el método de siembra descrito.
3. Desarrollar nuevas metodologías de propagación in vitro como la propagación a partir de
ápices radiculares o varas florales, para estas y otras especies peruanas de orquídeas.
4. Reemplazar el Hipoclorito de Sodio por Hipoclorito de Calcio como agente esterilizante,
debido a los efectos fitotóxicos observados en la utilización del Hipoclorito de sodio cuando
es necesaria su utilización a relativamente altas concentraciones o durante tiempos
prolongados de esterilización.
5. Aplicar las técnicas de propagación masiva in vitro de las especies peruanas de orquídeas,
con fines comerciales, de investigación o de conservación, poniendo énfasis en aquellas en
peligro de extinción.
6. Ampliar las técnicas descritas en el presente estudio para la propagación de orquídeas
terrestres peruanas.
7. La aclimatación se llevo a cabo luego del segundo replante, siendo importante en este
estado el adecuado control de las enfermedades fungosas y bacterianas y el control de la
humedad ambiental.
88.. Crear un banco de Germoplasma in vitro y en vivero de nuestras especies nativas de
orquídeas
65
VII. RESUMEN
En el presente estudio se plantea la propagación in vitro como una alternativa para la
conservación, propagación y distribución de germoplasma de orquídeas peruanas frente a los
factores que ponen en peligro su preservación.
Se estandarizaron técnicas de propagación in vitro para 3 especies de orquídeas peruanas:
Cattleya rex O’brien, Cattleya maxima Lindley, y Psychopsis versteegianum (Pulle) Lueckel & Braem
como método alternativo para su conservación, probándose tres alternativas de propagación:
por semillas de cápsula dehiscente (semilla seca), por semillas de cápsula no dehiscente
(cápsula verde), y por cultivo de yemas (esta última solo para las especies del género Cattleya).
Las semillas secas fueron esterilizadas dentro de un pequeño sobre de papel filtro cerrado, con
Hipoclorito de Calcio o de Sodio al 2% con 2 gotas de Tween-20, durante 15-25 minutos. Para las
semillas de cápsula verde se tomaron cápsulas antes de la dehiscencia, a las cuales se
extrajeron los pétalos secos o cualquier posible fuente de contaminación, inmediatamente se
procedió a lavarla con una escobilla suave, agua y detergente. La esterilización superficial se llevó
a cabo con una solución de Hipoclorito de Sodio (lejía comercial concentrada) al 4% con 2 gotas
de Tween-20, el tiempo de esterilización fue de 20-30 minutos.
Para la siembra de yemas se colectaron brotes vegetativos de Cattleya maxima y Cattleya rex de 5
a 15 cm de longitud. Se eliminaron los restos de tejido muerto o necrótico. Los brotes fueron
lavados con una escobilla suave, agua y detergente, para luego ser sumergidos por unos
segundos en alcohol al 75%. Se hicieron dos esterilizaciones superficiales: en la primera los
brotes fueron sumergidos por 20 minutos en Hipoclorito de Sodio al 4%, con 2 gotas de Tween-
20. Luego el brote se ubicó en una placa petri estéril y se eliminaron las hojas envolventes,
poniendo al descubierto las yemas. En la segunda esterilización los brotes se sumergieron por 10
minutos en Hipoclorito de Sodio al 2% con 2 gotas de Tween-20, luego se enjuagaron en 100 ml
de agua destilada estéril y se ubicaron en una placa petri estéril listo para la disección y siembra
de las yemas. En todos los casos, el análisis estadístico de los resultados se hizo utilizando el
Diseño en Bloque Completo al Azar con los medios como tratamientos y las especies de
orquídeas como bloques.
66
Tanto para la siembra de semilla seca como de cápsula verde se probó el medio de Murashige
& Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 0.5 mg/l de Ácido Nicotínico + 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l
de Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar; y el medio de Knudson C (1946) + 2 g/l
de Sucrosa + 2 g/l Carbón Activado y + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar.
Para la siembra de yemas se probó el medio de Murashige & Skoog (1962) + 0.4 mg/l de
Tiamina + 100 mg/l de mio-Inositol + los siguientes tratamientos hormonales: ANA 1.0 mg/l +
Kinetina 1.0 mg/l; ANA 2.0 mg/l + Kinetina 2.0 mg/l; y ANA 2.0 mg/l + Kinetina 1.0 mg/l.
Para el replante de los protocormos y su posterior proliferación se usó el medio de Murashige &
Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 100 mg/l de mio-Inositol + 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l de
Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar.
Para el replante de plántulas y su posterior desarrollo vegetativo y/o enraizamiento se probó el
medio de Murashige & Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 100 g/l de plátano homogenizado
+ 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l de Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de Agar y el medio de
Murashige & Skoog (1962) + 0.4 mg/l de Tiamina + 100 ml/l de endosperma líquido de coco
(agua de coco) + 20 g/l de Sucrosa + 2 g/l de Carbón Activado + 2 g/l de Gel-Rite ó 8 g/l de
Agar. Los tres medios de replante citados fueron luego suplementados con 13 ml/l de Buffer
Fosfato.
Se obtuvo buen resultado en la desinfección de las semillas secas con Hipoclorito de Calcio y
con Hipoclorito de Sodio al 2% para Cattleya rex y Cattleya maxima, pero no para Psychopsis
versteegianum con el Hipoclorito de Sodio.
En la germinación de las semillas secas se encontraron diferencias altamente significativas
entre los medios probados y diferencias significativas en las respuestas de los genotipos.
La siembra de semillas de cápsula verde tuvo mejores resultados que los de semilla seca por
el menor riesgo a la contaminación, y por la reducción del tiempo de cosecha de las semillas.
En la germinación de éstas semillas hubieron diferencias significativas en los medios probados
para las tres especies.
Para las semillas, el medio de Murashige & Skoog (1962) modificado dio mejor resultado que el
de Knudson C. La inclusión de Tiamina y Ácido Nicotínico en el medio favorecieron la
germinación de las semillas, el buffer fosfato ayudó a mantener el pH requerido, y el carbón
67
activado favoreció la germinación al adsorber los metabolitos y sustancias tóxicas producidas
por el embrión. El Gel-Rite fue el mejor gelificante al dar una adecuada consistencia al medio.
El tamaño óptimo de los brotes donantes de las yemas estuvo entre 10 y 15 cm,
encontrándose de 2 a 3 yemas basales y una yema apical en ambas especies de Cattleya.
Hubieron diferencias significativas en la respuesta de las yemas de las especies probadas a las
diferentes concentraciones hormonales (tratamientos), siendo el medio que dio mayor
producción de protocormos el suplementado con 1.0 mg/l de ANA + 1 mg/l de Kinetina. Luego
que pasaron a medio de proliferación fueron tratados como protocormos de semillas.
Los replantes se realizaron a la 10ma y 20va semana en el medio de desarrollo. La aclimatación
se realizó luego del 2do replante (32va semana de siembra) con varias hojas y buen sistema
radicular. El sustrato fue elaborado usando 3 partes de Musgo por 1 de Carbón (trozos
pequeños) esterilizados en estufa a 80°C por 6 horas. Las plantas fueron extraídas de los
frascos in vitro, lavadas, eliminándose las raíces secas. Luego fueron lavadas con Benlate
(Benomyl 1g/l) durante 30 minutos. La siembra se hizo en macetas comunitarias en cuyo tercio
inferior se colocaron trozos de polipropileno y los dos tercios superiores con el sustrato. El
ambiente fue una cámara húmeda para luego pasar al Tinglado. A diez días de la transferencia
el riego fue con agua destilada más Tiamina (0.01 mg/l) y ANA (0.04 mg/l) para promover la
formación de raíces. Se obtuvieron los siguientes porcentajes de sobrevivencia en cámara
húmeda: Cattleya rex 87%, Cattleya maxima 81% y Psychopsis versteegianum 83%. Luego, los que
no mostraron signos de deshidratación se transfirieron a vivero. La sobrevivencia es muy baja
cuando el sustrato no se esteriliza o no se aplica fungicida a las plántulas.
La utilización de sustancias orgánicas complejas como el plátano homogenizado (100 g/l) y
endosperma líquido de coco (100 ml/l), en la composición de los medios, promueven una
rápida diferenciación del protocormo así como del desarrollo vegetativo y radicular de las
plántulas.
Se recomienda: probar la utilización de nuevos buffers orgánicos con mayor poder
amortiguador; probar la eficiencia de la agitación rotatoria en la propagación de meristemas y
yemas, utilizando el método de siembra descrito; crear un banco de Germoplasma in vitro y en
vivero de nuestras especies nativas de orquídeas.
68
VIII. BIBLIOGRAFÍA.
ARDITTI, J. 1967. Factors Affecting the Germination of Orchid Seeds. Bot. Rev. 33, 1-97.
___________. 1977. Clonal Propagation of Orchids by Means of Tissue Culture - A Manual.
Pag.:203-293. En: Arditti (Editor). Orchid Biology: Reviews and Perspectives. Vol. I.
Cornell University Press. Ithaca, New York.
__________. 1979. Aspects of the Physiology of Orchids. 1979. Adv. in Bot. Res. 7, 421-655.
___________. 1982. Orchid Seed Germination and Seedling Culture - A Manual. En: Arditti
(Editor) Orchid Biology: Reviews and Perspectives. Vol. II. Cornell University Press.
Ithaca, New York.
__________. 1984. An History of Orchid Hibridization, Seed Germination and Tissue Culture.
Bot. J. Linn. Soc. 89: 359-381.
__________. 1990. Lewis Knudson: His Science, His times and his legacy .Lindleyana. 5 (1):1-
79.
__________. 1992. Fundamentals of Orchid Biology. John Wiley & Sons. New York.
__________. and R. ERNST. 1993 Micropropagation of orchids. J. Wiley & Sons Inc. New
York.
BALL, E. 1946. Developments in Sterile Culture of Stem Tips and Subjacent Regions
Tropaeolum and Lupinus albus. American Journal of Botany. Vol. 3, Pag.: 301-318.
BERNARD, N. 1909. L’évolution dans la Symbiose, les Orchidées et leur Champignons
Comensaux. Ann. Sci. Nat. Bot. Ser. 9: 1-196.
BOWLING and THOMPSON. 1972. On Storing Orchid Seeds. Orchid Rev. 80: 120-121.
BRAINERD, K. and L. FUCHIGAMI. 1981. Acclimatization of Asepticaly Cultured Apple Plants to
Low Relative Humidity. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 106 (4) 515-518.
69
CAVERO, M.; B. COLLANTES Y C. PATRONI. 1991. Orquídeas de Perú. 1° Parte, CDC-Lima.
CHURCHILL, M.; J. ARDITTI and E. BALL. 1971. Clonal Propagation of Orchids from leaf Tips.
Amer. Orchid Soc. Bull. 40: 109-113.
CLARK, G.; G. HAWLEY and W. HAMOR. 1957. The Encyclopedia of Chemistry. Reinhold,
New York.
COURTIS, W. 1978. Rapid, Contamination - free Sowing of Surface Esterilized Seeds and
Spores. Can. J. Bot. 56: 225-227.
ERNST, R. 1975. Studies in Assimbiotic Cultures of Orchids. Amer. Orchid Soc. Bull. 44: 12
FUCHIGAMI, L.; T. CHENG and A. SOELDNER. 1981. Abaxial Transpiration and Water Lost in
Asepticaly Cultured Plum. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 106 (4): 519-522.
GOH, C. 1983. Aerial Root Production in Aranda Orchids. Ann. Bot. 145-147.
GROUT, B. and M. ASTON. 1977. Transplanting of Cauliflower Plants Regenerated fron
Meristem Culture. I: Water Loss and Water Transfer Related to Changes in Leaf wax and
to Xylem regeneration. Hort. Res. 17: 1-7.
HARRISON, C. 1977. Ultraestructural and Histochemical Changes During germination of
Cattleya aurantiaca (Orchidaceae). Bot. Gaz. 138: 41-45.
HARRISON, C and ARDITTI, J. 1978. Physiological Changes During the Germination of Cattleya
aurantiaca (Orchidaceae). Bot. Gaz. 139: 180-189.
INTUWONG, O.; J. KUNISAKI and SAGAWA. 1972. Vegetative Propagation of Phalaenopsis
by Flower Stem Cuttings. Na Okika O Hawaii-Hawaii Orchid J. 1: 13-18
JASPER, B. 1966. A Method for Meristem Tissue Culture. Amer. Orchid Soc. Bull. 35: 10-11.
KHALIFAH, R. 1966a. Indole-Acetic Acid From the Developing Banana Fruit. Nature 212,
1471-1472.
70
KHALIFAH R. 1966b. Giberelin-like substances from the developing banana fruit. Plant. Phys.
41, 771-773.
KNUDSON, L.. 1921. La Germinación no Simbiótica de las Semillas de Orquídeas. Bol. Soc.
Esp. Hist. Nat. 21: 250-260.
__________. 1922. Non-symbiotic Germination of Orchid Seeds. Bot.Gaz. 73: 1-25.
__________. 1924. Further Observation of Nonsynbiotic Germination of Orchid Seeds. Bot.
Gaz. 77: 212-219.
__________. 1925. Physiological Study of The Asymbiotic Germination of Orchid Seeds.
Bot.Gaz. 79: 345-379.
__________. 1927. Symbiosis and Asymbiosis Relative to Orchids. New Phytol. 26: 328-336.
__________. 1946. A New Nutrient Solution For The Germination of Orchid Seeds. Am. Orch.
Soc. Bull. 15: 214-217.
KOPOWITZ, H. and A. THORNHILL. 1994. Gene Banking and Orchid Seeds. Amer. Orchid
Soc. Bull. 64: 1383-1386.
LAKON, G. 1949. The topografical Tetrazolium Method for Determining the Germination
capacity of Seeds. Plant Physiol. 24, 389-394.
LEON, M. La Comercialización de Orquídeas en el País. Informe presentado al Centro de
Estudios Regionales de la Cultura Amazónica (CERCA). Oct.. 1993.
MOORE, D. 1949. On Growing Orchids from Seeds. Gardener’s Chronicle, 35: 549.
MOREL, G. 1960. Producing Virus-Free Cymbidiums. Amer. Orchid Soc. Bull. 29: 495-497.
_________. 1964. Tissue Culture - A New Means of Clonal Propagation of Orchids. Amer.
Orchid Soc. Bull. 33: 473-478.
_________. 1974. Clonal Multiplication of Orchids. En "The Orchids: Scientific Studies".
C.L.Withner (Editor) Pag.: 169-222. Wiley-Interscience. New York.
71
OSPINA, M. 1968. "La desaparición de valiosas orquídeas nativas de América Latina".
Orquideología, Vol.III, Nro.2. Colombia. Pag: 29-38.
PRIDGEON, A. 1990. En: Lewis Knudson: His Science His Time and His Legacy . (Por
ARDITTI, J.). Lindleyana. Vol. 5, Nro.1, Pag: 1-79
RHODEHAMEL, W. 1994. Green-capsule-culture Harvest Time. Amer. Orchid Soc. Bull.63:
540-541
ROTOR, G. 1949. A Method for Vegetative Propagation of Phalaenopsis Species and Hibrids.
Amer. Orchid Soc. Bull. 18: 738-739.
SAULEDA, R.1976. Harvesting Times of Orchid Seed Capsules for The Green Pod Culture
Process. Amer. Orchid Soc. Bull. Vol. 45, Nro.4, Pag: 305-309.
SCULLY, R. 1966. Stem propagation of Phalaenopsis. Amer. Orchid Soc. Bull. 35: 40-42.
SCULLY, R. 1967. Aspects of meristem culture of the Cattleya alliance. Amer. Orchid Soc.
Bull. 36: 103-108.
SINGH, F. 1981. Differential Staining of Orchid Seeds for Viability Testing. Amer. Orchid Soc.
Bull. 50: 416-418.
STEWARD F. C. and N. W. SIMMONDS 1954. Growth Promoting Substances in the Ovary
and Inmature Fruit of the Banana. Nature 173, 1083-1084.
SNOW, R. 1985. Improvements in Methods for The Germination of Orchid Seeds. AOS. Bull.
Vol: 54 Nro.2, Pag: 179-182.
VALMAYOR, H. 1972. Further Investigation into Nutrient Media. Proc. 7th World Orchid Conf.
Colombia 211-229.
VALMAYOR, H. and G. PRICE. 1970. Banana Fruit Pulp: A good Medium for Growing
Orchids. Agriculture at Los Baños. April-June,1970.
72
VAN STADEN, J. and J. STEWART 1975. Citokinins in Banana Fruit. Z. Pflanzenphysiol. 76,
280-283.
WEATHERHEAD and G. HENSHAW, 1979. Effects of Activated Charcoal as an Additive to
Plant tissue Culture Media: Part 2. Z. Pflanzenphysiol. 89: 399-405
WEATHERHEAD J.; E. BURDON and G. HENSHAW. 1978. Some Effects of Charcoal as an
Additive to Plant Tissue Culture Media. Z. Pflanzenphysiol. 89: 141-147.
WIMBER, D. 1963. Clonal Multiplication of Cymbidium through Tissue culture of the Shoot
Meristem. Amer. Orchid Soc. Bull. 32:105-107.
WIMBER, D. 1965. Aditional Observations on Clonal Multiplication of Cymbidium through
Tissue culture of the Shoot Meristem. Cymbidium Soc. News. 20: 7-10.
WRIGHT, E. and B. TIPPIT. 1994. Seedling Sandwich, Anyone? Amer. Orchid Soc. Bull. 63:
547-548.
YAM, T.; R. ERNST; J. ARDITTI; H. NAIR and M. WEATHERHEAD. 1990. Charcoal in Orchid
Seed Germination and Seedling Culture. Lindleyana 5 (4), 256-265.
73
APÉNDICES
74
PRUEBA DE GERMINACION UTILIZANDO SEMILLA PROVENIENTE DE CAPSULA DEHISCENTE
Porcentajes de germinación por tubo (unidad experimental)
BLOQUE Cattleya maxima Cattleya rex Psychopsis versteegianum
84.5 67.4 64.5 75.3 75.9 68.4 87.6 70.0 62.0 85.4 76.3 65.6
Trat. 1: Knudson C 76.9 71.4 59.2 80.8 68.1 51.4 74.1 73.5 67.5 85.1 77.6 52.1 86.3 72.0 63.9 88.7 69.1 57.8 87.6 80.8 72.9 79.9 78.4 68.8 86.7 75.4 73.4 92.6 78.9 58.6
Trat. 2: M & S 84.7 74.0 59.6 91.3 70.6 64.5 89.7 69.4 63.8 84.6 83.6 67.4 92.7 82.4 69.8 80.7 73.9 60.2
PRUEBA DE GERMINACION
UTILIZANDO SEMILLA PROVENIENTE DE CAPSULA NO DEHISCENTE Porcentajes de germinación por tubo (unidad experimental)
BLOQUE Cattleya maxima Cattleya rex Psychopsis versteegianum
85.2 72.9 73.5 83.5 66.6 65.8 82.6 78.3 60.3 80.5 77.7 67.7
Trat. 1: Knudson C 75.9 70.4 61.5 79.4 69.6 57.0 76.3 68.2 58.9 73.2 74.1 55.1 78.3 75.5 64.2 81.6 76.9 52.4 89.6 71.8 60.9 83.2 83.9 71.9 88.2 69.3 69.7 79.7 78.4 70.8
Trat. 2: M & S 90.8 86.7 62.5 84.4 76.5 55.3 92.4 79.5 68.4 87.3 72.8 63.2 81.7 81.2 66.2 80.6 80.6 73.7
75
PROPAGACION DE BROTES VEGETATIVOS (POR YEMAS) Numero de protocormos formados a las 10 semanas
BLOQUE Cattleya maxima Cattleya rex
7 6 5 5
Trat. 1 6 6 6 4 5 6 3 3 2 2
Trat. 2 3 1 1 2 2 2 1 0
Trat. 3 2 0 1