Clonage bactérien

Plan

IntroductionDéfinitions Outils Technique Exemples d’utilisation

Conclusion

Introduction

Introduction

Le clonage désigne principalement deux processus:

la multiplication naturelle ou artificielle à l'identique d'un être vivant c'est-à-dire avec conservation exacte du même génome pour tous les descendants (les clones). C'est donc un synonyme de certaines formes de multiplication asexuée telles que le bouturage.

C'est aussi la multiplication provoquée d'un fragment d'ADN par l'intermédiaire d'un micro-organisme.

Définitions

LE clonage c’est :

• Une technique de biologie moléculaire qui consiste à isoler un fragment d'ADN et à le multiplier à l'identique en l'« insérant » dans une molécule d'ADN « porteuse » appelée vecteur permettant son amplification.

• Cette technique de biologie moléculaire peut-être utilisée pour un clonage partiel, ne portant que sur un fragment de matériel génétique (ADN), mais aussi pour le clonage d'un gène entier permettant la production de la protéine recombinante correspondante.

• L'« insertion » est souvent réalisée à l'aide d'un vecteur, le plus communément utilisé étant une molécule d'ADN appelée plasmide .

Outils

Enzymes

Vecteurs

Cellules

Enzymes:

Outils

o Couper de l ’ADN • DNase • Nucléase S1

o Ligaturer de l ’ADN • Ligase phage T4

o Eliminer ou ajouter de groupement phosphate • Phosphatase • Polynucléotide kinase

o Copier de l ’ADN en ADN • ADN polymérase Fragment de klenow

o Copier de l ’ARN en ADN • Transcriptase inverse

o Copier de l ’ADN en ARN • ARN polymérase spécifiques

Vecteurs:

Outils

PLASMIDES PHAGES

COSMIDES

YACPAC

BAC

Structure et rôle des PLASMIDES

Structure d ’un plasmide – Elément génétique dans le cytoplasme de la bactérie – ADN double brin circulaire - linéaire possible – Taille 1 à 1000 kb – En moyenne 0,2 à 4% de la taille du chromosome – Forme super-enroulée dans la cellule

Observation par microscopie électronique

Des milliers de plasmides différents

dans la nature – Isolement de 300 plasmides

naturels chez E. coli

Rôle des plasmides – Transfert de matériel génétique – Construction de diploïdes

partiels – Véhicule de clonage

Structure et rôle des PLASMIDES

PlasmideChromosome

Caractéristiques des PLASMIDES

Résistance • Antibiotiques • Métaux lourds (Cadmium, Cobalt, Mercure, Nickel,

Zinc)

Virulence Production de bactériocines Besoin de plasmides

• Facilement manipulables • Non self transmissibles • Nombre de résistance limité

Propriétés pour être un bon vecteur de clonage Origine de réplication indépendante de celle du chromosome Petite taille ADN circulaire Nombre de copies élevé

Réplication relâchée (relaxed)

Réplication stricte (stringent) Présence de marqueurs sélectionnables

Gènes de résistance aux antibiotiques Présence de sites uniques de coupure par des enzymes de restriction Transfert contrôlable vers l ’hôte

Modification pour empêcher le transfert naturel

Transfert par transformation choc thermique ou par électroporation

Caractéristiques des PLASMIDES

Quelques exemples des PLASMIDES

Quelques exemples des PLASMIDES

Cellules

Toute bactérie capable d’accepter notre vecteur de clonage et de le multiplier tout en permettant de

l’identifier facilement sans gêner notre marqueur sur le quel on va se baser pour sélectionner les bactéries

transformées.

Outils

Techniques

Extraction et purification de l’ADN génomique

Après extraction et purification il faut isoler le gène :

Techniques

Préparation du vecteur de clonage

Techniques

Transformation des Bactéries:

Techniques

Ligation:

Insert

ADN Plasmidique

Plasmide recombinant

Plasmide non recombinant

Techniques

Transformation des Bactéries:

Cette étape se fait selon 2 processus:Choc électrique ou électro-porationChoc thermique

Techniques

électroporateur

Criblage:

Il y as deux types de criblage :Un criblage négatifUn criblage positif

Techniques

Criblage:

Un criblage négatif

Techniques

Techniques

Un criblage positif

Criblage:

Techniques

Techniques

Criblage:

Un criblage positif

Techniques

Criblage:

Un criblage positif

Techniques

Exemple d’utilisation

Les bactéries méthanogènes, responsables de la méthanisation.

Elles se nourrissent de molécules organiques présentes dans leur environnement et transforment le gaz carbonique et l’hydrogène contenus dans ces molécules en méthane et en oxygène.

C’est donc grâce aux bactéries productrices du biogaz que nous sommes là aujourd’hui, puisque c’est à elles que nous devons l’apparition de l’oxygène sur Terre.

Méthanisation:

Exemple d’utilisation

En dehors de la production du biogaz, la méthanisation des déchets organiques va améliorer les caractéristiques des effluents résidus. La valorisation du biogaz en carburant permet de réduire l’émission de méthane dans l’atmosphère, phénomène particulièrement important au niveau des élevages.

le biogaz est avant tout une énergie renouvelable qui peut sensiblement diminuer les besoins en énergies fossiles.

Les avantages de la méthanisation:

Exemple d’utilisation

Méthanisation:

Exemple d’utilisation

Les enzymes qui viennent du froid:

Ces protéines qui catalysent les réactions biochimiques à la base du fonctionnement de toute cellule vivante, sont largement employées par l'industrie dans des applications aussi diverses que :

la préparation d'aliments, la formulation de lessives ou la détection de polluants par des biosenseurs. La plupart des organismes dont sont originaires les enzymes actuellement utilisées vivent dans des environnements compris entre 30 et 40°C et leur efficacité est très sensible à la température

Exemple d’utilisation

Les enzymes qui viennent du froid:

Quelques unes des activités enzymatiques étudiées dans le cadre de Coldzyme et leurs domaines possibles d'application

ALPHA-AMYLASE boulangerie, textile, brasserie, détergents

CELLULASE nettoyage des pierres, biopolissage

BÉTA-GALACTOSIDASE

élimination du lactose du lait

LIPASES additifs de détergents, aromes

PROTÉASES additifs de détergents, attendrissement des viandes

XYLANASES boulangerie

Conclusion

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