—— 3 ——

Capitolul I. Formarea N-nitrozoaminelor în apă

I.1. Procese de nitrozare a aminelor

I.1.1. Nitrozarea aminelor secundare

N-nitrozocompuşii sunt substanţe puternic cancerigene şi mutagenice formate la

interacţiunea dintre diferiţi nucleofili (amine, amide) şi acidul azotos. Răspândirea

largă a acestei grupe de compuşi în mediul ambiant, proprietatea evidenţiată de a pro-

voca tumori în diferite organe, efectele cancerigen, mutagen, transplacentar şi alte par-

ticularităţi de acest gen indică la pericolul N-nitrozocompuşilor (NNC) pentru animale

şi om. Principala primejdie a NNC, comparativ cu alţi cancerigeni (hidrocarburile aro-

matice policiclice, aflatoxinele, bifenilii policloruraţi), este proprietatea de a se forma

uşor din predecesori în organisme vii şi în mediul ambiant.

N-nitrozocompuşii cancerigeni derivă de la diferiţi compuşi, ce includ majoritatea

aminelor secundare (R2NH) şi terţiare (R3N), amidelor secundare (RCO.NHR1O) şi terţiare

(RCO.NR1R2), N-substituenţii ureei (R1HNCO.NH2), guanidinele (R1HNC(=NH)NH2)

şi uretanii (RR1N.COR). Cei mai răspândiţi NNC derivă de la aminele secundare

(RR1NH) sau de la derivaţii lor N-alchilaţi [1].

Principalele procese de nitrificare şi denitrificare sunt foarte bine adaptate în eco-sistem, dar acţiunea antropogenă asupra mediului nu doar că introduce schimbări, dar

în unele cazuri manifestă un impact negativ asupra naturii. Introducerea excesivă a îngrăşămintelor minerale de azot (săruri de amoniu, nitraţi, uree), poluarea mediului

cu oxizi de azot formaţi în industrie şi transport influenţează asupra ciclurilor naturale ale azotului; astfel, în biosferă se creează exces de predecesori ai NNC din care se

formează aceşti cancerigeni.

Timp de peste patru decenii s-a studiat chimia procesului de N-nitrozare in vitro

(Challis, Rid, Mirvish şi Williams). Soluţiile apoase acide de săruri ale nitriţilor la

pH< 5 sunt cele mai cunoscute medii de nitrozare care au fost pe larg investigate.

Studiile efectuate demonstrează că acidul azotos şi ionii nitriţi nu reacţionează

direct cu aminosubstratul. Agentul de nitrozare efectiv (Y-NO) se formează în rezulta-

tul interacţiunii catalizatorului nucleofil (Y-, care este, de exemplu: NO2

-, Cl

-, SCN

-)

cu acidul azotos, protonat într-o fază rapidă cu instaurarea următoarelor echilibre

(I.1.1, I.1.2 şi I.1.3) [1].

NO2- + H3O

+ →HNO2 + H2O (I.1.1)

HNO2 + H3O+

→ H2O + NO+ (I.1.2)

H2O + NO+ + Y

- → Y-NO + H2O (I.1.3)

R2NH2+ + H2O → R2NH + H3O

+ (I.1.4)

R2NH + Y-NO → R2NNO + HY (I.1.5)

S-a constatat că doar aminosubstratul neprotonat, care este în echilibru cu acidul

lui conjugat (ec. I.1.4), reacţionează cu Y-NO după ecuaţia (I.1.5) [5]. Astfel, în şirul

echilibrelor prezentate, direcţia procesului va depinde de pH, bazicitatea aminosub-

stratului şi prezenţa catalizatorilor anionici (Y-). În absenţa altor nucleofili, ionul nitrit

—— 4 ——

acţionează în calitate de catalizator, Y- , şi în acest caz speciile reactive sunt oxidul de

azot N2O3, format în reacţia chimică:

2HNO2 N2O3 + H2O (I.1.6)

Nitrozarea aminelor secundare este studiată destul de larg, iar mecanismul gene-

ral de nitrozare este sumarizat prin ecuaţia I.1.7 [2]:

Este cunoscut că aminele au un caracter bazic datorită electronilor neparticipanţi

de la azot; astfel, în soluţii apoase se instaurează un echilibru (ec. I.1.8), iar constanta

de echilibru reprezintă constanta de bazicitate (kb):

R- NH2 + H2O R- NH3+ + HO

- (I.1.8)

Bazicitatea aminei este unul dintre factorii care exercită influenţă decisivă asupra

vitezei de nitrozare a diferitelor substraturi. Cu cât mai scăzută este bazicitatea aminei, cu atât se reduce posibilitatea ei de a fi ionizată şi astfel creşte viteza de nitrozare. Bazicitatea aminelor este influenţată de structura lor şi de densitatea electronică la atomul de azot.

Aminele alifatice sunt baze mai tari decât amoniacul datorită grupelor alchil, cu

efect respingător de electroni (+Is), efect ce măreşte bazicitatea. Aminele secundare

sunt baze mai tari decât aminele primare, deoarece conţin două grupări alchil cu efect

(+Is), dar aminele terţiare sunt baze mai slabe datorită unui efect de influenţă sterică,

produs de cele trei grupe alchil. Aminele aromatice sunt baze mai slabe decât

amoniacul. Bazicitatea mai scăzută a aminelor aromatice se datorează implicării

electronilor neparticipanţi de la atomul de azot într-o conjugare cu electronii ai

nucleului benzenic. Pentru aminele studiate în prezenta lucrare scăderea bazicităţii şi

creşterea vitezei reacţiei de nitrozare are loc conform şirului din Figura I.1.1.

Din investigaţiile ştiinţifice se constată că

pentru aminele secundare care au pKa > 5

vitezele reacţiilor de formare a N-

nitrozoaminelor, calculate după consumul total

de amine şi ioni nitriţi, au o dependenţă

caracteristică de pH, atingând maximum pentru

amine la pH ~ 3,4, iar pentru aminoacizi ~ 2,5

[3].

Această dependenţă reflectă influenţa

acidităţii mediului reactant asupra concen-

traţiilor de oxid de azot (III) şi amine

neprotonate. Totuşi, mărimea vitezelor de nitrozare în funcţie de pH depinde de

bazicitatea aminei (pKa), care determină partea de amină neprotonată ce participă în

reacţie.

Fig. I.1.1. Dependenţa vitezei de nitrozare de bazicitatea aminelor.

(I.1.7)

—— 5 ——

În intervalul de pH2-5, în absenţa catalizatorilor (de ex., ioni de tiocianat, Cl-, I

-),

reacţia de nitrozare aproape cu toate alchilaminele secundare are loc prin intermediul

oxidului de azot (III) şi nu depinde de natura soluţiei-tampon.

Aminocompuşii slab bazici (de ex., amidele, derivaţii ureei) nu se nitrozează atât

de activ prin intermediul N2O3. Viteza de nitrozare pentru aceşti compuşi creşte cu

micşorarea pH-ului, datorită formării altui agent de nitrozare NO+ sau H2O

+ NO; astfel,

nitrozarea acestor substraturi are loc prin interacţiunea lor cu ionul de nitrozoniu hidra-

tat sau nehidratat după următoarea ecuaţie:

W = k9 [R(R1)NH][HNO2][H3O+] (I.1.9)

Viteza de nitrozare pentru majoritatea aminelor secundare este proporţională cu

pătratul concentraţiei ionilor nitriţi şi manifestă, după cum s-a menţionat mai sus, o

valoare maximă la pH 3-3,4.

W = k10 [R(R1)NH][HNO2]2

(I.1.10)

Viteza de nitrozare a N-alchilureelor, N-alchilcarbamaţilor, amidelor este propor-

ţională cu concentraţia ionilor nitriţi şi a ionilor de hidrogen (ec. I.1.9); astfel, viteza

de nitrozare nu manifestă un maxim în funcţie de pH, dar creşte cu scăderea pH-ului.

Se poate constata că, în general, aminele secundare slab bazice, N-alchilureele,

N-alchilamidele simple şi guanidinele sunt nitrozate mai rapid. Aminele primare,

terţiare şi cuaternare de obicei se nitrozează cu mult mai încet, cu excepţia compusului

aminoterţiar aminopiridina, care este nitrozată extrem de rapid. Viteza de nitrozare

depinde de pH-ul mediului şi de concentraţia ionilor nitriţi.

I.1.2. Formarea agenţilor de nitrozare

Formarea agenţilor de nitrozare are loc în rezultatul interacţiunii ionilor nitriţi cu

protonii (H+ sau H3O

+) cu formarea acidului azotos (HONO). În soluţii apoase se stabi-

leşte un echilibru între acidul azotos şi oxidul de azot (III), conform ecuaţiei (I.1.6) [5].

Valoarea constantei de echilibru a fost determinată conductometric la 25ºC, iar

mai târziu, prin metoda potenţiometrică, spectrofotometrică şi cinetică, de către Marko-

vits şi col., a cărei valoare este de 3,0·10-3

l·mol-1

.

Reacţia (I.1.6) este o cale importantă de formare a agenţilor de nitrozare atât

in vivo, cât şi in vitro, în particular în mediul ambiant, produse alimentare şi în stomac.

Protonarea ionilor nitriţi este doar una în şirul mare de reacţii ce au loc, deoarece în

afară de N2O3 se formează şi alţi agenţi de nitrozare, ca ionul acidului azotos (H2O+

NO), tetraoxidul de azot (N2O4) şi al. Proporţiile relative ale fiecărei specii depind de

aciditatea mediului, însă la o aciditate moderată (pH2-5) ei sunt toţi prezenţi şi pot fi

detectaţi spectrofotometric (Fig. I.1.2) [7].

—— 6 ——

Fig. I.1.2. Formarea agenţilor de nitrozare la interacţiunea nitriţilor cu protonii.

La pH≤2 este important cationul H2O+NO, care este predominant în reacţia de

nitrozare. Ionul de nitrozoniu NO+ este instabil în mediul bazic (ec. I.1.11):

NO+ + OH‾

→ HNO2 → NO2

‾ + H

+ (I.1.11)

În mediul acid echilibrul (I.1.12) este deplasat în dreapta şi N2O3 se transformă în

ionul de nitrozoniu:

N2O3 + 2H+ → 2NO

+ + H2O (I.1.12)

Acest echilibru a fost determinat în baza studierii absorbţiei în UV a ionului nitrit

la diferite pH-uri. La valori ale pH<7 în soluţia de ioni nitriţi în regiunea UV = 225 nm

absorb doar moleculele de HNO2 şi cu micşorarea valorii pH-ului până la pH 2

absorbţia HNO2 scade, deoarece are loc formarea N2O3, care nu absoarbe în regiunea

dată. Iar la micşorarea ulterioară a pH-ului (pH<2) absorbţia creşte, fapt cauzat de

apariţia în sistem a NO+, care absoarbe în regiunea dată a spectrului. În acelaşi timp,

apariţia NO+ a fost depistată în sistem deja de la pH 3,0. Pentru reacţiile ce decurg la

pH moderat (pH 3), N2O3 apare ca reagent principal în procesul de nitrozare. Oxidul de

azot (III) este instabil şi se descompune, la încălzire, la un amestec de oxid de azot (II)

şi oxid de azot (IV) (Fig. 1.I.2, etapa VI) [8].

Acidul azotos poate fi oxidat până la ion nitrat (ec. I.1.13) în rezultatul diferitelor

procese chimice, sau redus la oxid de azot (II) (I.1.14) [1]:

HNO2 + H2O → NO3‾ + 3H+ + 2 e‾ (E = -0,94 V) (I.1.13)

HNO2 + H+ + e‾ → NO + H2O (E = -1,0 V) (I.1.14)

Oxidarea acidului azotos necesită reagenţi relativ puternici ca dioxidul de mangan

sau clorul, iar oxidanţii mai slabi sunt efectivi în mediul alcalin:

NO2 - + 2OH‾ → NO3‾ + H2O + 2 e‾ (E =0,01 V) (I.1.15)

Acidul azotos poate fi uşor redus până la oxid de azot (II) cu ajutorul reducăto-

rilor anorganici, aşa cum sunt ionii de cupru (Cu+), fier (Fe

2+), (I‾) şi bisulfit (HSO3‾),

şi al compuşilor organici, ca acidul ascorbic, polifenolii, tiolii şi al. Comportarea

acidului azotos în prezenţa agenţilor reducători depinde de natura reducătorilor, pH-ul

mediului şi temperatură. Astfel, în reacţia dintre ionul nitrit şi hidrogenul sulfurat se

produce NO şi sulfură, în soluţii acide – amoniac şi sulfură, în soluţie-tampon de

bicarbonat şi amoniac – sulfură şi tiosulfat [8].

—— 7 ——

Mai mult ca atât, acidul azotos poate fi redus până la azot liber în prezenţa amo-

niacului, aminelor primare (RNH2), amidelor (RCONH2), hidrazinei (H2NNH2), ureei

(H2NCONH2), acidului sulfamic (NH2SO3H) sau a hidroxilaminei (NH2OH) (ec. I.1.16):

XNH2 + HNO2 → N2 + H2O + XOH (I.1.16)

Soluţiile apoase ale nitriţilor metalelor alcaline de asemenea sunt reduse prin pro-

cesul de fotoliză sau radioliză; în rezultat, obţinem amestec de NO• şi NO2

• , care în

continuare este în echilibru cu N2O3 [8]: h sau

2 2NO NO NO 2 3N O (I.1.17)

Oxidul de azot (III), generat din acidul azotos, atacă substratul (S) conform reac-

ţiei (I.1.18), iar viteza reacţiei este determinată cu ajutorul formulei (I.1.19), unde K

este constanta de echilibru:

N2O3 + S k S+

- NO + NO2‾ (I.1.18)

W = k [N2O3] [S] = k K [HNO2]2 [S] (I.1.19)

Pentru concentraţii mari ale substratului (S), viteza reacţiei I.1.18 este cu mult

mai mare decât viteza de hidroliză a N2O3.

Astfel, etapa limită devine formarea N2O3 în reacţia (I.1.10), unde expresia vitezei

va include concentraţia acidului azotos de ordinul doi. Pentru concentraţia substratului –

de ordinul zero [5,10]:

W = k′ [HNO2]2 (I.1.20)

Constanta k′ a fost calculată pentru diferite substraturi: N-metilanilină, 1,2-dime-

tilindol, acid ascorbic, hidroxilamină. Valoarea k′ este aproximativ constantă şi egală

cu 91 l∙mol-1

∙s-1

la 25ºC şi cu 0,81 l∙mol-1

∙s-1

la 0ºC [11].

Mecanismul de formare a N2O3 reprezintă o succesiune a etapelor de protonare a

acidului azotos, care, la rândul său, reacţionează rapid cu anionul B- formând BNO, iar

ultimul, la interacţiunea cu ionul nitrit, duce la formarea N2O3 [11].

2 3HNO H O repede 2 2 2H NO H O (I.1.21)

2 2H NO B repede 2BNO H O (I.1.22)

2BNO NO lent 2 3N O B (I.1.23)

O schemă similară poate fi prezentată şi în cazul când este implicat ionul de nitri-zoniu.

I.1.3. Formarea N-nitrozoalchilaminelor secundare alifatice

Dialchilnitrozoaminele sunt cancerigeni puternici şi induc tumori la diferite specii

de animale, şobolani, şoareci, epuri, păsări, peşti în diferite organe, precum vezica

urinară, rinichi, ficat, esofag sau stomac [9,12,13]. N-alchilnitrozoaminele pot induce

tumori tot atât de uşor şi în organismul uman. În primul rând, expunerea la N-alchil-

nitrozoamine este bine asociată cu creşterea riscului de cancer al sistemului gastric,

colon, vizicei urinare [14-16]. În al doilea rând, biotransformarea şi activitatea biolo-

gică a acestor NNC la animale este similară celei din organismul uman [17]. Agenţia

Internaţională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat la N-nitrozoamine din

—— 8 ——

grupa 2A (probabili cancerigeni la om) astfel de NNA ca NDMA şi NDEA, şi aşa

cancerigeni ca N-nitrozodietanolamina la grupa 2B (posibili cancerigeni pentru om).

Cercetările epidemiologice şi riscul pentru cancer al NNC se studiază permanent [19].

În acest context, legităţile proceselor de formare a NNC şi factorii fizico-chimici ce

influenţează asupra acestor procese sunt de o importanţă deosebită. Studiul procesului

de nitrozare a DMA a fost iniţiat în 1972 de către Taylor şi Price, dar a fost studiată

mai întâi descompunerea NDMA, însă dependenţa vitezei procesului de nitrozare de

pH nu a fost studiată. Cinetica procesului de nitrozare a dimetilaminei (DMA) a fost

studiată de Mirvish [10] la pH 3,4, t = 25ºC în prezenţa soluţiei-tampon, după formarea

NDMA. Viteza reacţiei de nitrozare a DMA este proporţională cu concentraţia N2O3,

sau cu pătratul concentraţiei HNO2 liber şi concentraţia speciilor neionizate de substrat:

W = k ∙ [DMA] ∙ [HNO2]2 , (I.1.24)

unde constanta de viteză (k) este independentă de pH, însă concentraţia DMA şi HNO2

trebuie calculată pentru fiecare valoare a pH-ului. Concentraţia de NaNO2 utilizată în

sistem a fost variată în intervalul 0,02 – 0,125M, iar concentraţia DMA – 0,02M.

Pentru a simplifica calculele, viteza procesului a fost determinată după concen-

traţia totală a aminei şi ionului nitrit la pH constant, când raportul între amină şi HNO2

ionizat şi neionizat nu variază:

W = k ∙ [Total DMA] ∙ [Total nitrit]2 (I.1.25)

În acest caz, valoarea constantei stoechiometrice a vitezei (k) în ecuaţia (I.1.25) va-

riază odată cu variaţia pH-ului [10]. Valoarea k a fost calculată utilizând ecuaţia (I.1.26): 2

2

[Total DMA] [Total nitrit]k k

[MeNH] [HNO ]

(I.1.26)

Produsul mediu de NDMA format în condiţii standard la pH 3,4 este de 15,8%,

iar valoarea k este 9,9 ∙ 10-2

mol-2

min-1

l2 [10].

Populaţia poate fi expusă la N-alchilnitrozamine pe două căi: calea exogenă şi

calea endogenă [20-22]. Expunerea exogenă poate avea loc în rezultatul consumului

alimentelor, inhalării fumului de tutun (0-140 ng/ţigară), utilizării articolelor din cau-

ciuc, a produselor cosmetice, acţiunii mediului ambiant (aer, apă) [23-26]. Expunerea

endogenă rezultă din nitrozarea precursorilor N-nitrozoaminelor în organismul uman

cu formarea lor în condiţii acide, care prevalează în special în stomac [16,27].

Modelarea matematică [28] şi studiul in vivo al formării N-nitrozoprolinei (NPRO)

indică la faptul că expunerea endogenă este mult mai importantă decât expunerea

exogenă [29].

N-nitrozodimetilamina este prezentă în alimente (în special bere) [30], peşte şi în

produse din peşte, în produse din carne [31], pesticide (190-640 mg/l), în apa potabilă

clorurată (0,02-0,82 μg/l) [32] şi se formează la poluarea industrială. Concentraţia

NDMA în produse alimentare variază în intervalul 0-85 μg/kg. La fel, NDMA a fost

detectată în medicamente, ce sunt formate cu aminopirină, de la 10 până la 371 μg/kg.

—— 9 ——

(I.1.27)

Aminele secundare sunt constituenţi normali în urină, care derivă din degradarea

proteinelor, aminoacizilor, fosfolipidelor şi a altor substanţe bazice, sub influenţa enzi-

melor proteolitice şi a bacteriilor intestinale.

Dimetilamina, care este principala amină secundară detectată în urină, este pre-

zentă în condiţii normale în jur de 0,5 mM. Ionul nitrit este depistat în urină, de ase-

menea, în concentraţii variabile, dependente de dietă şi concentraţia lui în apa potabilă.

Astfel, prezenţa NDMA în urină este determinată de dezvoltarea diferitelor bacterii

coliforme (Proteus, Escherichia coli), care transformă ionul nitrat în nitrit, formând în

rezultat diferiţi agenţi de nitrozare ce nitrozează DMA.

Au fost supuse cercetării procesele ce au loc la clorinarea apelor reziduale şi a

apelor naturale şi s-a constatat că în procesul de potabilizare se pot produce potenţiali

cancerigeni – NDMA (ec. I.1.27) şi NDEA în concentraţii de aproximativ 100 şi 10 ng/l,

respectiv [32].

La acest pH, fracţia de HNO2 produsă din concentraţia totală de ioni nitriţi este de 0,48, iar concentraţia de HN(CH3)2 neionizată este de 4,79 x 10

-8 (calculat din valoarea

pka 3,37 şi 10,72, respectiv). Utilizând aceste date, a fost calculată valoarea constantei de viteză (k), egală cu 8,94 x 10

6 mol

-2min

-1l2, care nu se deosebeşte cu mult de valoa-

rea k calculată de Ridd, egală cu 2,4 x 107 mol

-2min

-1l2 [11].

Lijinsky şi Singer [37] au studiat nitrozarea dimetilaminei la 100ºC. În aceste

condiţii, la incubare prelungită şi pH scăzut, ionul nitrit este instabil, iar viteza maximă

de nitrozare nu este la pH 3,4, ci la pH 4,5. Procesul de nitrozare al diferiţilor compuşi

depinde de structura substratului de nitrozare şi de pH-ul mediului. Procesul de nitro-

zare in vivo şi in vitro duce la formarea N-nitrozocompuşilor, care se caracterizează

prin proprietăţi mutagene şi cancerigene. În acest context, studiul legităţilor cinetice

ale procesului de formare şi de inhibiţie a NNC prezintă un mare interes.

I.1.4. Cinetica proceselor de nitrozare a aminelor secundare alifatice

Reactivi chimici. La efectuarea cercetărilor au fost folosite următoarele N-nitro-

zoamine: N-nitrozodimetilamină – compania SIGMA, No 7756, puritatea 99,8%;

N-nitrozodietilamină – compania SIGMA, No 0756, puritatea 99,6%.

Inhibitori: acid dihidroxifumaric – Sigma-Aldrich, Germania; rezveratrol – Fluka;

(+)-catehina – Fluka; cvercetina – Sigma-Aldrich, Germania; ester dimetilic al acidului

dihidroxifumaric (EDMD), acid ascorbic – importator S.R.L. Ecochimie, Moldova,

—— 10 ——

extracte din seminţe de struguri oxidate obţinute la Institutul de Chimie al AŞM [49],

dihidroxifumarat de sodiu – sintetizat în Centrul Chimie Aplicată şi Ecologică. Pentru

analiza ionilor nitriţi s-a utilizat α-naftilamină, acid sulfanilic, acid acetic glacial –

importator S.R.L. Ecochimie, Moldova; reagent Griess – Fluka, Germania.

S-a utilizat analizatorul de energie termică Model 610 (Thermedics Detection

Inc., SUA), spectrofotometrul SF-46, spectofotometrul UV/VIS, pH-metrul Cecher,

lonomerul 120-2 (Gomel, Bielorusia),Termostatul U-190 (Germania).

Metodica experimentului. Procesul de nitrozare a fost efectuat într-o celula cu

termostatare. Conţinutul celulei a fost agitat cu amestecătorul magnetic. Soluţiile sub-

stanţelor iniţiale au fost pregătite separat şi amestecate după termostatare la tempera-

tura necesară cu stabilizarea pH-ului la valoarea respectivă prin utilizarea soluţiei-

tampon citrat-fosfat. Probele necesare pentru studiul cineticii procesului au fost sepa-

rate din sistemul de reacţie peste anumite perioade de timp. La determinarea NNA

procesul de nitrozare în partea-alicotă folosită a fost stopat prin adăugarea (1:10) a

amestecului de 500 mM sulfamat de amoniu în l00 mM soluţie-tampon borat (pH 9).

Partea-alicotă utilizată pentru analiza ionilor nitriţi a fost analizată imediat.

Determinarea N-nitrozocompuşilor s-a efectuat prin metoda lui Walter, care

include tratarea NNC cu HBr [6]. În rezultatul procesului de denitrozare a NNC se

formează NO, care reacţionează cu ozonul, formând NO2* în stare excitată, şi apoi se

descompune prin emanarea unui foton. Emisia chemiluminescentă este detectată de un

fotomultiplicator instalat în analizatorul de energie termică (AET):

R1R2NNO HBr R1R2NH + NOBr (I.1.28)

NOBr → Br2 + NO (I.1.29)

NO + O3 → NO2* + O2 (I.1.30)

NO2* → NO2 + hν (I.1.31)

Limita de detecţie este de 100 pmol. Sistemul analitic pentru determinarea conţi-

nutului de NNC este alcătuit dintr-un sistem de detecţie unit cu analizatorul de energie

termică (model 610 sau model 402 Thermedics, Waltham, MA) şi un integrator

(Hewlett-Packard, Avondale, PA). Vasul de reacţie este un balon cu fundul rotund de

500 ml cu trei gâturi 24/40, un gât No7 („Ace-thred”), pentru introducerea probei, fiind

plasat într-o manta de încălzire (Fig. I.1.3) [6]. Unul din gâturile 24/40 a fost conectat

la un tub de sticlă de admisie a gazului de la o butelie cu argon, în al doilea se intro-

duce un termometru pentru determinarea temperaturii lichidului de extracţie şi în al

treilea se introduce un frigider (condensator) cu reflux, răcit cu o pompă imersabilă în

circulaţie. Gâtul Nr.7 este dotat cu un septum din teflon (schimbat după fiecare experi-

ment). Partea superioară a condensatorului duce printr-un adaptor Claisen la un robinet

de admisie a aerului şi la un tub de înlăturare a gazului (NO). Gazul NO trece prin

şapte vase de spălare, dintre care în primele 1-4 se conţin câte 60 ml de 1,5 N NaOH,

5 N NaOH, 99% NaOH (solid) şi 99% NaOH granulat anhidru. Vasele de spălare 5

(cu 20 ml EtOAc), 6 (cu 20 ml de acetonă) şi 7 (gol) sunt plasate într-un congelator la

-30ºC (Cryfridge, Baxter, McGraw Park, IL).

—— 11 ——

Metoda analizei NNC cu HBr. În vasul de reacţie se adaugă 160 ml de etilacetat.

Se stabileşte fluxul de oxigen pentru ATE (25 ml/min) şi fluxul de argon (40 ml/min).

Atunci când vidul în ATE atinge 0,5 mm, se introduce mantaua de încălzire pentru a

da o viteză de reflux de 1 pic/sec şi o temperatură de 28°C pentru vasul de reacţie.

Se injectează cu seringa HCl concentrat/acid acetic glacial (5:95, 15 mL), iar mai

târziu 7,5 ml de HBr în acid acetic glacial (33%) şi se lasă pe 15-30 min. după fiecare

adaos, pentru ca răspunsul ATE să se întoarcă la linia de bază. Mostrele de analizat

(de obicei, 100 µL) sunt injectate cu seringa în gâtul Nr.7; atunci când răspunsul inte-

gratorului cade aproape de linia de bază (fiecare 7-10 min.), obţinem picuri ascuţite.

Standardele de N-nitrozoprolină se prepară zilnic (0,1 nmol, 100 µL de 1,0 µM NPRO)

şi sunt injectate la începutul, mijlocul şi la sfârşitul fiecărei serii a experimentului.

Pentru înlăturarea ionilor nitriţi din proba selectată (după incubarea aminelor

secundare cu NO2-) se introduce acid sulfamic (AS) proaspăt pregătit (soluţie saturată)

şi HCl de 2N [35].

Fig. I.1.3. Schema metodei grup-selective pentru determinarea

conţinutului total de NNC [6].

Pentru analiza conţinutului total de NNC se iau 400 µL probă, se adaugă 50 µL

AS saturat şi 50 µL HCl de 1N, se agită şi după 15 min. se analizează, introducând, de

regulă, 100 µL de probă din acest amestec în vasul pentru extracţia NNC în EtOAc şi

descompunerea lor cu HBr (I.1.28-I.1.29). Această metodă de analiză a NNC este de o

selectivitate înaltă (coeficientul de variaţie a trei măsurări este de 5-10%), sensibilă

(detecţia limită este de 0,01 µmol/L şi poate fi utilizată fără extracţie prealabilă).

Legătura N – NO în N-nitrozoaminele volatile este foarte slabă şi energia ei poate fi

determinată reieşind din căldura standard de ardere a substanţelor iniţiale, precum şi

din căldura standard de formare a produşilor de reacţie. Pentru N-nirozodimetilamină:

—— 12 ——

D[(CH3)2N – NO] = ΔHf0[NO] + ΔHf

0[(CH3)2N] – ΔHf

0[(CH3)2N – NO] (I.1.32)

(CH3)2N – NO → (CH3)2N· + ·NO

(I.1.33)

D[(CH3)2N – NO] = 52.1 kcal·mol-1

(I.1.34)

Fragmentul organic obţinut nu duce la formarea radicalului nitrozil şi, prin urmare,

nu poate servi ca sursă de interferenţă.

Nitrozarea DMA şi DEA

Din studiile bibliografice s-a constatat că în cercetări procesul de nitrozare a DMA

şi DEA s-a urmărit după viteza de formare a NNC. În lucrarea dată cinetica nitrozării

alchilaminelor secundare s-a studiat după viteza de consum a predecesorilor NNC, adică

după variaţia nitritului, aminelor şi după formarea NNC. Nitrozarea aminelor s-a stu-

diat în diferite sisteme-model şi sisteme reale, în condiţiile când concentraţia NO2- este

cu mult mai mică (1•10-5

- 5•10-4

M) decât cea studiată în literatură (0,02-0,2M), concen-

traţia substratului fiind de ordinul mM [26,35], iar raportul [NO2-]:[Amină]1. Aceste

studii s-au efectuat reieşind din intervalul de concentraţii ce se găsesc în sisteme reale.

Nitrozarea DMA

Peştele conţine o cantitate mare de DMA, care în continuare poate fi nitrozată.

Această amină este cea mai răspândită în produsele alimentare. Astfel, studiul pro-

cesului de nitrozare a DMA are o importanţă deosebită. În sistemele reale (produse

alimentare, apă, sistem gastrointestinal) concentraţiile agenţilor de nitrozare sunt cu

mult mai mici; de exemplu, în apă sunt de ordinul 10-5

-10-3

M. Reieşind din aceste con-

siderente, procesul de nitrozare a DMA cu nitriţi a fost studiat în soluţii apoase ce con-

ţineau DMA (1∙10-3

M), NaNO2 (0,05∙10-3

-1∙10-3

M), şi în soluţie-tampon citrat-fosfat;

procesul a fost studiat la 37ºC. Viteza reacţiei s-a determinat după variaţia concentraţiei

ionilor nitriţi, NDMA şi DMA în sistem în funcţie de diferiţi parametri [54,55]. Cinetica procesului de nitrozare a DMA, studiată după variaţia concentraţiei ionu-

lui nitrit în sistem în funcţie de [NO2-]0, este prezentată în Tabelul I.1.1.

Tabelul I.1.1

Dependenţa vitezei iniţiale de consum a NO2- la nitrozarea DMA în funcţie de [NO2

-]0;

pH 2,6, t = 37ºC, [DMA]0 = 1· 10-3

M

[NaNO2]0 . Winiţ.10

7 [NO2

-]10

5M % de NO2

-

105M M/s la 30 min. reacţionat

0,5 0,5 0,09 82

1,0 1,2 0,39 61

5,0 7,5 1,32 73

10,0 8,9 4,60 55

Din rezultatele experimentale obţinute în Tabelul I.1.1 constatăm că viteza pro-

cesului de nitrozare a DMA creşte odată cu creşterea concentraţiei ionilor nitriţi.

—— 13 ——

Raportul [NO2-]0 / [DMA]o în sistemul-model este mai mic de 1. Au fost utilizate

concentraţii mici de ioni nitriţi comparativ cu substratul de nitrozare.

În cazul concentraţiilor mici de ioni nitriţi ordinul de reacţie după [NO2-]0 este

doi, la fel cum se prezintă în literatură [35,36], pentru intervalul concentraţiilor mari.

Excesul de amină faţă de concentraţia ionului nitrit este mai mare de 10-100 ori

(pentru intervalul studiat de NO2-). Astfel, ecuaţia vitezei va fi prezentată la pH con-

stant în felul următor:

221 3 2 2

d[NO ]k [(CH ) NH] [HNO ]

dt

(I.1.35)

Constanta k1 nu depinde de pH-ul mediului, dar [DMA] şi [HNO2] trebuie calcu-

lată pentru fiecare valoare de pH. În toate cazurile, viteza reacţiei depinde de concen-

traţia aminei neionizate. Oxidul de azot (III) se formează reversibil din două molecule

de HNO2. În cazul dat, conform ordinului doi, după [NO2-]0 la nitrozare participă N2O3

în calitate de agent de nitrozare.

Dacă utilizăm în ecuaţia vitezei concentraţiile totale ale reactanţilor, atunci con-

stanta de viteză k2 din ecuaţia vitezei va depinde de pH:

222

d[NO ]k [DMA] [nitrit]

dt

(I.1.36)

Din curbele cinetice de consum ale nitriţilor în f(pH) în sistemul-model

(CH3)2NH-NaNO2 s-a constatat că viteza trece prin maximum la pH 3,4 (Fig. I.1.4) ce

corespunde constantei de disociere a HNO2 (pKa = 3,37). La pH <3,4 ionul nitrit se

transformă aproape totalmente în HNO2 (ec. I.1.1). Astfel, am constatat că pentru

intervalul de concentraţii mici ale reactanţilor în procesul de nitrozare maximul vitezei

în funcţie de pH este situat la pH 3,4, la fel ca pentru intervale de concentraţii de ~100

de ori mai mari [38].

Fig. I.1.4. Dependenţa vitezei de consum a nitriţilor şi a [NO2-] remanente

de valoarea pH; [NO2-]0 = 1·10

-4M, [DMA]0 = 1·10

-3M, t = 37ºC.

—— 14 ——

În procesul de nitrozare, concentraţia aminosubstratului neprotonat, care este în

echilibru cu acidul lui conjugat (ec. I.1.37), este dependentă de pH-ul mediului (pentru

DMA pKa = 10,72) [35].

(CH3)2NH2+

+ H2O 4k

(CH3)2NH + H3O+ (I.1.37)

Astfel, viteza reacţiei de nitrozare este dependentă de pH-ul mediului şi bazici-

tatea substratului, care determină proporţia de amină neprotonată. Cu cât mai mic este

pH-ul, cu atât mai mare este concentraţia aminei protonate, iar cu cât mai mare este

pH-ul cu atât mai mică este concentraţia agentului de nitrozare.

Pentru viteza de formare a NDMA, studiată după concentraţia produsului format

şi calculată din concentraţiile totale ale aminei şi nitritului de sodiu (ec. I.1.36), s-a

obţinut o dependenţă caracteristică de pH, atingând maximul la pH aproximativ 3,4.

Tabelul I.1.2

Influenţa pH-ului asupra procesului de nitrozare a DMA;

[NO2-]0

= 1∙10

-4M, [DMA]0 = 1∙ 10

-3M, t = 37ºC

Nitrozarea DMA în funcţie de pH

După variaţia [NO2-] După variaţia [NDMA]

pH Winiţ. [NO2-]10

5M % [NO2

-] pH Winiţ. [NDMA]10

4M [NDMA]

107 la 30 min. react. 30 min. 10

8 la 90 min. la 90 min.,

M/s MS-1

%

1,5 2,5 6,0 40 1,68 5,0 1,4 14

2,0 4,5 4,0 60 3,56 18,3 1,8 18

2,5 5,3 3,0 70 4,01 13,3 1,6 16

3,0 7,8 2,0 80 6,86 8,3 1,5 15

3,5 8,7 1,0 90

4,0 6,3 1,5 85

Nitrozarea DEA

N-nitrozodietilamina se formează în diferite produse alimentare: în produse vege-

tale marinate – 0,69 µg/kg şi în moare – 4,9 µg/kg [39], în bere – în medie 0,22 µg/l,

maximum – 2,2 µg/l [40], în carne [41].

La fel, NDEA a fost depistată în produse de cauciuc (92 µg/kg), produse cosme-

tice (1,5-5 µg/kg) [42], aer poluat cu fum de ţigări (0,01-0,1 ng/m3) [43], apă deioni-

zată (0,03-0,34 µg/l) [44] şi în ape reziduale (până la 5 µg/l) [45].

Cinetica procesului de formare a NDEA a fost studiată în funcţie de diferiţi para-

metri (pH, [NO2-]0, [DEA]0) după creşterea concentraţiei de NDEA, determinată prin

metoda extracţională-spectrofotometrică [46], după variaţia concentraţiei de nitriţi şi

variaţia [DEA] [53-55]. Rezultatele experimentale sunt prezentate în Tabelul I.1.3.

—— 15 ——

Tabelul I.1.3

Viteza iniţială de nitrozare a DEA în dependenţă de pH, [NO2-]0 şi [DEA]0;

[NO2-]0 = 1·10

-4M, DEA]0 = 1·10

-3, pH 3,5, t = 37ºC

Nitrozarea DEA

În f (pH) În f [NO2-]0 În f [DEA]0

pH Winiţ. 108 M s

-1 [NO2

-]0 Winiţ. 10

8 M s

-1 [DEA]0 Winiţ. 10

8 M s

-1

după variaţia: 104M după variaţia: 10

4M după variaţia:

[NO2-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA] [NO2

-] [NDEA]

1,68 40 1,3 0,1 35 2,1 0,1 5,0 0,01

2,6 45 2,9 0,5 40 2,8 0,3 2,0 2,0

3,56 50 6,4 1,0 50 6,2 1,0 12,0 3,6

4,01 45 5,5 5,0 61 7,1 5,0 22,0 5,0

6,86 11 4,7 10,0 72 8,0 10,0 52,0 6,3

S-a stabilit că cu creşterea concentraţiei reactanţilor viteza reacţiei de nitrozare a

DMA creşte. Astfel, variaţia concentraţiei ionului nitrit în intervalul 1·10-5

- 1·10-

3mol/l duce la creşterea vitezei de formare a NDEA de la 2,1·10

-8 M s

-1 până la 8,0·10

-

8 M s

-1 , iar viteza de consum a ionului nitrit în acest interval variază de la 3,5·10

-7

mol/l·s până la 7,2·10-7

mol/l·s.

Cota-parte calculată de NDEA formată în funcţie de [NO2-] variază în limitele

2,2-8,9 % (Fig. I.1.5a). Calculele cinetice efectuate după consumul [NO2-] pentru dife-

rite concentraţii de DEA (0,1-10,0) ·10-4

mol/l indică (Tab. I.1.3) creşterea vitezei de

nitrozare în intervalul (5-52) ·10-8

mol/l·s. Dacă raportul dintre amină şi ioni nitriţi

creşte, pentru intervalul dat de concentraţii, cota-parte de NDEA formată (la concen-

traţia constantă a ionului nitrit) scade (Fig. I.1.5a). Astfel, în sistemul NO2-

– DEA

cota-parte de NDEA formată din DEA variază în intervalul 7,8-40,0% pentru intervalul

0,1·10-4

- 1·10-3

mol/l de DEA.

Fig. I.1.5. Cota-parte de NDEA formată în funcţie de (-lg [NO2

-]0) şi (-lg [DEA]0) (a)

şi în funcţie de pH (b). [NO2-]0 = 1x10

-4M, [DEA]0 = 1x10

-3M, t = 37ºC

—— 16 ——

Pentru raportul [DEA]0/[NO2]0 = 1 în sistemul de reacţie concentraţia NDEA alcă-

tuieşte aproximativ jumătate din concentraţia substratului de nitrozare, deoarece ra-

portul stoechiometric între NO2- şi DEA este de 2:1. Astfel, constatăm că ordinul după

concentraţia NO2- este doi.

Viteza procesului de nitrozare a DEA în f(pH), atât după variaţia [NO2-]0, cât şi

după formarea NDEA0, trece prin maximum la pH 3,4 (Fig. I.1.5b) [33,34]. În toate

cazurile viteza de consum a nitritului este cu mult mai mare decât viteza de formare a

NDEA (Tab. I.1.3), deoarece ionii nitriţi nu participă direct la sinteza NNC, dar suferă

o serie de transformări (ec. I.1.1, I.1.2, I.1.3) ce duc la formarea agenţilor de nitrozare,

care, la rândul lor, participă în procesul de nitrozare.

Dacă comparăm vitezele procesului de nitrozare a DMA şi DEA, constatăm că

formarea NDMA are loc cu o viteză cu mult mai mare [53,55].

Delocalizarea electronilor necuplaţi de la azot depinde de structura aminei; astfel,

pentru DEA delocalizarea electronilor este mai mare comparativ cu DMA. În rezultat,

DEA are proprietăţi bazice mai puternice decât DMA şi forma protonată este mai sta-

bilă. Însă, aminele protonate nu se supun nitrozării; astfel, viteza procesului de nitro-

zare a DEA este mai mică decât a DMA.