Velimir Mladenov, M.Sc.

ta su fenotipski markeri?

Opisi genotipova po alternativnim formama osobina

Prednosti:

jednostavni za primenu

ne zahtevaju struno osoblje

Fenotipske osobine genotipova ispoljavaju se u razliitim oblicima, pa tako svaka osobina predstavlja jedan marker!

Broj fenotipskih osobina varira u zavisnosti od biljnevrste

usaglaeni su prirunici na meunarodnom nivou za fenotipsko mapiranje. Zato?

izabrane su kljune osobine jedne vrste (20-50) i definisane su njihove alternativne sorte, koje su numerikioznaene.

prirunici se nazivaju deskriptori vrsta. Oni sadre uputstva za fenotipsko markiranje

Postoji nekoliko prirunika, ali najvie korieni suUPOV deskriptori

ta je UPOV?

Meunarodna Unija za Zatitu Novih Sorti Biljaka

International Union for the Protection of New Varietesof Plants

Primer peniceUPOV deskriptor penice sadri 26 osobina

Br Osobina Oblik osobine Numerikaoznaka

10 Stabljika: ispunjenost

preseka

NeznatnaSrednjaZnatna

357

11 Klas:Oblik profila

PiramidalanParalelnostranianPolu-skverhedni

SkverhedniVretenast

1 2345

16 Klas:Boja

BeoObojen

12

21 Donja pleva:Oblik vrha

PravBlago kriv

Srednje krivJako kriv

Prelomljen

13579

Oblici osobina po UPOV deskriptorima prikazuju sei grafiki

Kvalitativne Kvantitativne

Sve bioloke osobine mogu se podeliti u dve grupe

U kvantitativne osobine spadaju one koje su merljive i kojekontinuirano variraju.

One imaju agronomski i oplemenjivaki znaaj!

Neke od njih su: duina, irina semena, visina biljke, koliina/gustina hraniva...

Kvalitativne osobine variraju diskontinuirano, toje pogodno za davanje ocena.

U praksi ocenjivanje jednog materijala po fenotipskim markerima traje 2-3 godine, radi sigurnosti!

Da bi ocena bila to pouzdanija u deskriptorima su definisani STANDARDI (poreenje)

Za ta slue fenotipski markeri?

zatita autorskih prava nad novim genotipovima

eliminacija duplikatnih uzoraka iz kolekcija

procena sortnog identiteta

istoa semenskih useva

Fenotipski markeri zahtevaju da se individue gaje i prate od prve do poslednje razvojne faze, to zahtevapuno vremena

Ovakav nain mapiranja je istorijski najstariji nain ocene genotipova. Omoguava ljudima da stvoreosnovnu sliku o nekom genotipu.

Koristi se u praksi kad god je to mogue!

U kolekcijama gen banki uvaju se razliiti genotipovi mikroorganizama, biljaka i ivotinja.

Pravilan rad sa kolekcionim materijalom zahteva da se svaki uzorak u kolekciji opie prema vrednosti osobina, apogotovu osobina iz deskriptora.

Osobina Ljiljana Dragana Pobeda Pesma

10 3 3 2 1

11 2 1 3 1

14 1 2 1 1

16 1 1 1 2

21 1 1 1 1

Oigledno je da se ispitivane sorte razlikuju po posmatranim osobinama.

Ocenjivanjem po svih 26 fenotipskih markera mogao bih se pouzdano okarakterisati ogroman broj genotipova.

Statistika metoda koja odreuje fenotipsku razliitost

Ljiljana

Pobeda

Renesansa

Dragana

Znaaj statistike...

Analiza grupa (Cluster Analysis)

Zasniva se na razlikama u odgovoru genotipa na razliite efekte eko-sredine

Na ovaj nain se izdvajaju lokakiteti u kojima pojedinigenotipovi reaguju slino, kao i genotipovi koji slinoreaguju u razliitim ekolokim uslovima.

Omoguava izdvajanje stabilnih genotipova i smanjenje broja lokaliteta na kojima se testiraju odabranigenotipovi.

Provera sortnog identiteta

stvaranje sorte...

registracija kod nadlene dravne institucije

provera na polju skrining materijala pomou fenotipskih markera

Metode biotehnologije su veoma znaajne u procesu oplemenjivanja biljaka i u semenarstvu, poev od prouavanja oplemenjivakog materijala, utvrivanja varijabilnosti, genetske distance, stvaranje genetski modifikovanih organizama, pa sve do stvaranja novih sorti.

Genetiki

DNA/RNK

BiohemijskiUH, proteini, lipidi...

rad sa molekularnim markerima zahteva skupu opremu,dobre laboratorije i obrazovane strunjake

Prednosti:

postoji ogroman broj markera

brzo se dobija rezultat

sigurnost je 100 %

nije potrebno pratiti fenotip

Rad sa molekularnim markerima se odvija tako to seispitivani materijal uporeuje sa STANDARDOM

Svaki molekularni marker dobija naziv prema nazivu metode (PCR-marker, HPLC-marker...)

Osnovni koraci kodkorienja EF i PCR-a

uzorak

DNK izolacija

PCR reakcije

elektroforeza

rezultati

...prajmeri, temperatura...

Metoda za otkrivanje genetike varijabilnosti u populacijama na osnovu izoenzima i rezervnih proteina je elektroforeza.

Elektroforeza predstavlja proces kretanja koloidnih esticamakromolekula u elektrinom polju na odreenoj podlozi.Kao podloga se mogu koristiti skrobni gel, poliakrilamid,agar, celulozni gel...Elektroforetski se mogu razdvajati naelektrisani molekuli PROTEINA, RNK i DNK.

Za elektroforetsko ispitivanje neophodno je obezbeditiodreenu disosovanost i pokretljivost molekula. Pokretljivost molekula elektroforeze zavisi od:

naelektrisanja molekula

molekulske mase

oblika molekula

Nakon zavretka elektroforeze, gel se boji pri emu se dobijaju obojene trake na gelu, koje ukazuju na regione enzimske aktivnosti. Sve to ini zimogram, a ako je vreno i razdvajanje proteina elektroforegram.

Razlikujemo dve metode elektroforeze:

vertikalna na poliakrilamidnom gelu

horizontalna na skrobnom gelu

GENETSKI MODIFIKOVANE BILJNE VRSTE U SEMENARSTVU

Genetski modifikovane (GM) biljne vrste su postale sastavnideo poljoprivredne proizvodnje. Od pojave prve komercijalnodostupne GM biljne vrste (genetski izmenjen paradajz) uUSA 1992. godine i u Evropi 1996. godine, do danas njihovbroj je znatno porastao.

Od 18 zemalja u svetu u kojima se gaje GM usevi , 11 zemaljaje u razvoju, a samo 7 je razvijeno. Na prvom mestu popovrinama pod GM usevima je USA (63%) od ukupnihsvetskih povrina), zatim Argentina (21%), Kanada i Brazil,Kina, zemlje June Afrike...

Dve glavne biljne vrste koje se gaje su herbicid tolerantna soja,gajena u 7 zemalja i Bt kukuruz, gajen u 9 zemalja.

U periodu od 1996. do 2003. godine povrine u svetu, na kojimase gaje GM usevi, su poveane ak 40 puta, od 1,7 miliona hau 1996-oj godini, do ak 67,7 miliona ha u 2003.godini. Uoavase trend poveanja povrina u zemljama u razvoju. Skorotreina ukupnih povrina pod GM usevima, oko 20 mil ha senalazi u zemljama u razvoju.

I pored podeljene javnosti i debata koje se vode u Evropskoj Uniji, povrine pod GM usevima e nastaviti da rastu narednih godina. Oekuje se da e povrine doi i do 100 mil. ha.

STVARANJE GM BILJAKA

Zajednika struktura DNK i univerzalnost genetikog koda omoguava kombinovanje gena i njihovu ekspresiju u ivojeliji. Tehnike koje se koriste u procesu unoenja ili ubacivanjagena iz jednog organizma u DNK drugog organizma su

poznate kao genetski inenjering ili tehnologija rekombinantneDNK. Na taj nain se i izmenjena DNK i zove rekombinovanaDNK. Termin genetski modifikovane biljke se odnosi na biljkeu koje je unesen gen iz nesrodnih vrsta metodama genetskoginenjeringa.

Proces stvaranja genetski izmenjenih biljaka obuhvata sledeefaze: lociranje organizma sa specifinim svojstvom, ekstrakcija

DNK, isecanje gena od interesa kloniranje gena u vektor za prenos i unos vektora u bakterije gajenje bakterija u selektivnim medijumima i odabiranje

onih koji nose eljeni vektor dizajniranje gena da se eksprimira na odreeni nain transformacija-ubacivanje vektora u elije biljaka gajenje u polju transformisanih biljaka

TIPOVI GENETSKE MODIFIKOVANOSTI BILJAKA

U oplemenjivanju biljaka glavni cilj je stvoriti sorte koje e imati poboljane osobine u odnosu na postojee. Kao pomo klasinim metodama oplemenjivanja koriste se metode biotehnologije. Do sada su genetikim ininjeringom stvorene biljne vrste koje su: tolerantne na herbicide, otporne na insekte,izmenjenog sastava skroba, izmenjene kompozicije ulja,otporne na antibiotike, sa kontrolom fertilnosti...

Tolerantnost na herbicide

Stvaranje biljaka tolerantnih na odreene totalne herbicidedozvoljava proizvoaima prskanje useva herbicidom kojie unititi korove, a nee uticati na gajene biljke.Naravno mogui su rizici od ostajanja GM biljaka u usevu, alipovean je prinos i bolja je zatita.

Otpornost na insekte

Uvoenjem gena koji kodiraju proizvodnju toksina (npr. Bt toksiniz Bacillus thuringiensis), insekti koji se hrane ovim biljkamauginu zbog dejstva toksina. Potencijalna korist je u tome to sesmanjuje upoteba insekticida i poveava prinos, a negativna strana je to vremenom insekti postanu otporni, zatim prenos GM u srodne divlje vrste...

Promene u sastavu ulja

Uljane biljne vrste proizvode ulje koje se razlikuje u sastavu masnih kiselina. Ulje iz palme ima vie laurinske i palmitinskekiseline nego ulje iz repice, zato se ono koristi u proizvodnji sapuna...Potencijalne koristi u stvaranju GM biljnih vrsta, koje eimati poeljnije odnose masnih kiselina, su to e izvori uljabiti jeftiniji, kao i u smanjivanju trans-masnih kiselina u proizvodimaza ishranu, to bi bilo dobro sa stanovita zdravlja.

Meutim zemlje u razvoju e na taj nain izgubiti veliko trite,jer su neke od njih najvei svetski izvoznici palminog ulja i kakao butera.

Otpornost na bolesti

GM biljne vrste otporne na viruse najee sadre gene izsamih virusa. Mehanizam imunizacije biljke protiv infekcije nijeu potpunosti razjanjen. Otpornost na bakterije ukljuuje odnosgena iz drugih biljaka koji kodiraju antimikrobne proteine.Naravno prednosti brojne...mane prenos u divlje srodnike......stvaranje otpornosti...

UZORKOVANJE I PRIPREMA UZORKA ZA GMO TEST

Uzorkovanje i priprema je najvaniji deo u procesu GMO analize.Uzorak treba da je reprezentativan, da veliina uzetog uzorka i nain uzorkovanja zadovolje zahteve u pogledu homogenostii postavljene granice detekcije genetske modifikacije.

Reprezentativnost uzoraka se mora ouvati i u daljem postupkuredukcije u laboratoriji, odnosno za analizu se priprema radni uzorak. Stepen heterogenosti uzorka i postavljena granicadetekcije , prihvatljivosti genetske modifikacije je 1 %.

Prema proceduri za uzorkovanje semena izdatoj od MinistarstvaAmerike, veliina uzorka se rauna prema formuli:

N=log (1-(G/100)/log (1-(P/100))gde je n-veliina uzorka, G-nivo pouzdanosti, P-procenat GM

VRSTE GMO TESTOVA

Biotestovi su zasnovani na oceni fenotipskih osobina. Koriste se za otkrivanje prisustva gena tolerantnosti ili otpornosti na herbicide. Na raspolaganju su dva laboratorijska testa:

brzi test naklijavanja semena na podlozi u prisustvu herbicida, koji traje 7 dana

test u staklari, koji traje oko tri i po nedelje, Interakcija herbicid-biljka, koja je ukljuena u ovaj test je slina poljskom testu.

Prednosti brzog testa tolerancije na herbicid su da se testirajupojedinana semena, utvruje se prisustvo stranog gena, veomaje precizan i nije skup. Simptomi toksinosti koji se javljaju na poniku nemodifikovanesoje, koja je tretirana herbicidom su veoma uoljivi.

gene

tski

nem

odifi

kova

na s

oja

genetski nemodifikovana soja

Proteinski testovi

Utvrivanje genetske modifikovanosti zasnovano na identifikacijiproteina koji je kodiran transgenom, zahteva proteine sa intaktnom tercijarnom ili kvartarnom strukturom, odnosnoogranieno je na sveu nepreraenu hranu.

U svim genetski modifikovanim biljnim organizmima nije uvek prisutan novi protein ili prisutna koliina proteina nije dovoljnada bi se otkrila nekim od raspoloivih testova.

Proteinski testovi su uglavnom imunoloki, dostupni u razliitimformama: mikrotitar ploa, traka ili tube.

Princip testa traka

Test traka se moe koristiti za analizu sveeg biljnog materijalaili semena. Pogodan je za testiranje u polju, jer za 15-tak minuta daje rezultat. Ovaj test je veoma ekonomian, pogodanza poetno testiranje, komercijalno dostupan.

Na test traci su imobilisana antitela specifina za transgeni protein i vezana za obojeni reaktant. Kada se traka stavi u tubu sa GM uzorkom dolazi do stvaranja sendvia izmeu antitela i antigena. Tako nastali kompleks putuje kroz traku,kroz porozne membrane koje imaju dve zone, jednu specifinuza sendvi, a drugu za nevezana antitela. Prisustvo samojedne obojene linije znai da je uzorak negativan, a dve linije ukazuju na pozitivan rezultat.

PROTEINSKI TESTOVI

1 2 3 4 5

6 7 8 9

semenarstvosemenarstvo--vevebebe

Analiza DNK-PCR test

U osnovi ovog testa je reakcija lananog umnoavanja DNK.To je in vitro metoda za sintezu nukleinskih kiselina, u kojojse specifino umnoava tano odreeni segment DNK korienjem prajmera koji se hibridizuju na suprotnim lancimaciljne sekvence. Ponavljanjem ciklusa denaturacije DNK,hibridizacije prajmera za komplementarne sekvence u DNK i ekstenzije, male koliine specifinih fragmenata mogu se umnoiti milion puta.

Razlikujemo dve vrste PCR testa:

kvalitativan- umnoavanje transgenih sekvenci kvantitativan- Real Time testovi