biotecnologie in ortopedia e traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere
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Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere. B asi biologiche dell’uso delle MSCs Dr Eugenio Boux Dr Alberto Siclari P.O. Di Biella ASLBI. Mesenchymal stem cell MSC. CELLULE STAMINALI. Indifferenziate - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze
cliniche alle nuove frontiere
Basi biologiche dell’uso delle MSCs
Dr Eugenio Boux Dr Alberto SiclariP.O. Di Biella ASLBI
Mesenchymal stem cell MSC
CELLULE STAMINALICELLULE STAMINALI
• Indifferenziate• Capaci di autorigenerarsi ( self-
renewal)• Capaci di differenziarsi in tipi
cellulari specifici• Capaci di ripopolare un dato
tessuto in vivo
EMBRIONALI ADULTE
CELLULE STAMINALI
• TOTIPOTENTI: capaci di dar luogo a tipi cellulari embrionali e non.
• PLURIPOTENTI: capaci di dar luogo a tutti i tipi cellulari derivati dai tre foglietti embrionali (cellule isolate da un embrione a sei settimane, cellule isolate da feto a termine, da placenta, da sangue cordonale e da tessuti adulti).
• MULTIPOTENTI: capaci di dar luogo a cellule appartenenti a diversi lineages (cellule staminali dei tessuti adulti, hematopoietic stem cells).
• OLIGOPOTENTI: capaci di dar luogo a un ristretto subset di lineage cellulari (neural stem cells, hair bulge stem cells).
• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare (spermatogonial stem cells).
CELLULE STAMINALI ADULTECELLULE STAMINALI ADULTE
Cellule NON DIFFERENZIATE di organi o
tessuti adulti, capaci di AUTORIGENERARSI e di DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari
del tessuto o organo preso in
considerazione
Le cellule mesenchimali staminali
• Sono conosciute anche come:
• colony forming fibroblastic cells
• stromal fibroblasts• marrow stromal stem cells• mesenchymal progenitor
cells
• Le cellule mesenchimali sono cellule non-emopoietiche stromali che hanno la capacità di differenziarsi in diverse linee
.• Condroblasti• Osteoblasti • Adipociti • Cellule neurali • Miociti
• E’ possibile guidare le MSCs in uno specifico tipo anche in laboratorio usando adatti fattori di crescita o specifiche sostanze
• ( ad esempio il blu di toluidina le differenzia in condroblasti )
MF Pittinger et al.Multilineage potential of adult human MSCs Science 1999; 284 :143-7
Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. (2002) Stem Cells; 20:205-214
CARATTERIZZAZIONE CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSCIMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC
Nome marcatore Tipo cellulare Funzione
CD45 Leucociti Non espresso sulle MSC.Proteina di superficie dei progenitori dei leucociti.
Glicoforina Eritrociti Non espresso sulle MSC.
CD14 Monociti e macrofagi Non espresso sulle MSC.Recettore del lipopolisaccaride
CD50 Cellule staminali ematopoietiche (HSC)
Non espresso sulle MSC.ICAM 3
CD34 HSC, cellule satelliti, progenitori endoteliali
Non espresso sulle MSC.Sialomucina
CD44 Cellule mesenchimali Molecola di adesione e recettore dell’acido ialuronico e dell’osteopontina
ScaI HSC, MSC Stem cell antigen
CD29 MSC VLA-β chain
Sono cellule mobili?
Le MSCs hanno la capacità di muoversi e rispondono alla chemiotassi .
WR Otto Tomorrow’s skeleton staff MSC and the repair of bone and cartilage Cell Prolif 2004 ; 37: 97-110
Dopo le microfratture si ritrovano nell’articolazione
J. Kramer et al. “In vivo matrix-guided human mesenchymal stem cells” Cellular and molecular life sciences 2006,vol 63 n°5 pp. 616-626
Le funzioni delle MSCs
• Supportare l’ematopoiesi• Attrarre le HSC (hematopoietic
stem cells) circolanti nel midollo (homing)
• Immunosoppressione• Riserva di cellule • Produzione di sostanze bioattive
( magazzino!)
supportare l’ematopoiesisupportare l’ematopoiesi
Le MSC supportano l’ematopoiesiattraverso interazioni cellula- cellula.
attrarre le HSC nel midollo attrarre le HSC nel midollo (homing)(homing)
effetto effetto immunosoppressivoimmunosoppressivo
Le MSC hanno un ruolo importante nella
maturazione dei linfociti T, B e NK e delle cellule dendritiche.
Riserva di cellule
• Costituiscono una popolazione residente nel midollo osseo capace di differenziare in cellule del tessuto adiposo, del tessuto cartilagineo, del tessuto osseo e nello stroma che supporta l’ematopoiesi.
Differenziamento Differenziamento osteogenicoosteogenico
Acido ascorbicoDesametasoneΒ Glicerofosfato
MSCsOsteoblasti
Differenziamento Differenziamento condrogenicocondrogenico
Acido ascorbicoInsulinahTGFβ1Poli- lisina
MSCsCondrociti
Sostenze bio-attive
• Sostanze anti-apoptosi / citoprotettive
• Antifibrotiche• Angiogenetiche
• Mitotiche• ?????
Dove sono le MSCs ?
• Tessuto adiposo Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage
cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228. • Periostio• De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP: Human periosteum-derived cells maintain phenotypic
stability and chondrogenic potential throughout expansion regardless of donor age. Arthritis Rheum 2001, 44:85-95.
• Membrana sinoviale • De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P, Luyten FP: Multipotent mesenchymal stem cells
from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum 2001, 44:1928-1942. • Muscoli• Bosch P, Musgrave DS, Lee JY, Cummins J, Shuler T, Ghivizzani TC, Evans T, Robbins TD,
Huard J: Osteoprogenitor cells within skeletal muscle. J Orthop Res 2000, 18:933-944. ,• Derma • Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards C, Cuzzourt
J, Duenzl M, Lucas PA, Black AC: Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec 2001, 264:51-62.
• Midollo osseo • Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig
S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284:143-147.
• Le prime evidenze validanti l’esistenza di una popolazione staminale mesenchimale nel midollo risalgono al 1970. Friedstein mise in coltura campioni di midollo osseo umano e dopo 4 ore allontanò le cellule non aderenti.
• Si erano formati piccoli foci di cellule aderenti composti da 3-4 cellule; queste cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi cominciavano a proliferare. Dopo alcuni passaggi in coltura queste cellule tendevano a diventare più omogenee e dalla forma affusolata.
MSC dal sangue periferico
• La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico (PB-MSC) è ancora molto dibattuta.
• La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa, tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue in diverse condizioni patologiche, il numero di queste cellule aumenta.
• • Non è chiaro la loro origine né la loro funzione
in vivo; è noto che le MSC possono ritornare dagli organi periferici al midollo ma non è chiaro se possano persistere nel sangue e costituire una popolazione staminale residente.
Aspirato midollare
• Il midollo osseo contiene tre tipi principali di cellule : endoteliali 0,1 %ematopoietiche 99,5% MSC 0,4%.
Concentrazione dell’aspirato midollare
• centrifugazione • filtrazione selettiva
• concentrare la componente cellulare e portare il volume a 6-10 cc con un numero di cellule fino a 9 volte superiore rispetto all’aspirato midollare
• ......ma da dove partiamo prima della concentrazione ?
Il numero delle cellule
• Il fattore piu’ importante !
• Quante sono le MSC presenti nel bacino del
nostro paziente?
Variabili
• 1) Variabilità individuale Evento valutabile solo a
posteriori dopo il prelievo• 2) Sede del prelievo in uno stesso
individuo Bacino
Variabili • 3) Traumi recenti nella sede del prelievo • “ consumo “ delle cellule 4) Malattie endocrine carenza estrogeni 5) Tabacco L’uso di tabacco influenza sicuramente la vitalità
delle cellule mesenchimali e quindi il rischio di ottenere meno cellule deve essere tenuto
presente . Non esistono al momento studi che mettano in rapporto il numero di sigarette fumate e il numero di MSCs
Variabili • 6) Farmaci che influiscono sulla fisiologia del midollo
osseo. Chemioterapici 7) Tumori in fase attiva In particolari per le neoplasie che elettivamente
metastatizzano alle ossa. E´ noto come le cellule stromali mesenchimali tumorali (TDMC) che crescono accanto e frammiste alle CT in molte neoplasie possano essere parzialmente responsabili del loro sviluppo. L´interazione reciproca tra CT e lo stroma mesenchimale circostante è stata dimostrata nei tumori primari e nelle loro sedi metastatiche ed in particolare nelle ossa. Le TDMC forniscono un ambiente ottimale per la proliferazione delle TC grazie al reciproco scambio di molecole solubili e della matrice extracellulare, anche coinvolgendo cellule endoteliali e cellule della risposta immune. Il rischio di reclutare TDMC controindica questa procedura
Variabili
• 8) Abuso di alcool• 9) Età e sesso • Sono le variabili piu’ studiate .• E’ stata analizzata la popolazione di
cellule mononucleate e dei progenitori degli osteoblasti presenti nel midollo osseo di individui di età differenti, suddivisi in maschi e femmine per studiare se il sesso e l’età possano influenzare la concentrazione cellulare.
Variabili
Numero delle MSC s
maschi : decresce da 38 106
(30 aa) a 25.5 106 cells/ ml ( 70 aa)
femmine : decresce da 56 106 (30 aa) a 19.5 106 cells/ml (70 aa).
Muschler GF, Nitto H, Boehm C, Easley K. Age- and gender-related changes in the cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25
E la funzione varia?
La partita è finita ........ Grazie a tutti !!