Thực hành Công nghệ sinh học

Câu hỏi

• Tế bào?

• DNA?

• RNA?

Tế bào động vật

Bài 1: Tách chiết acid nucleic

3 bước cơ bản

• Phá vỡ tế bào• Loại bỏ các thành phần khác của tế bào.• Thu nhận acid nucleic

Phá vỡ tế bào vi khuẩn

• Màng kép phospholipid: CTAB

• EDTA:

– Phá vỡ liên kết hoá trị 2 và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài

– Ức chế DNase

Phá vỡ tế bào thực vật

• Thành tế bào vững chắc => nghiền.

Nghiền mô thực vật

2. Loại bỏ các thành phần khácTách chiết bằng Chloroform-Isoamylalcohol

• Cần loại bỏ protein vì:

– Có nhiều loại protein là các enzyme phân hủy DNA, RNA

– Protein bám DNA gây những ảnh hưởng không tốt đến các

bước TN sau

• Tác dụng của chloroform:

– Gây biến tính protein => protein kết tủa

– Phenol không tan trong nước nên sẽ chia hỗn hợp thành 2 pha

Phenol là chất độc hấp thụ qua da => đeo găng tay bảo vệ.

2. Loại bỏ các thành phần khácTách chiết bằng Chloroform-Isoamylalcohol

3. Cô đặc dịch chiết

• Kết tủa DNA bằng alcohol: Khi có mặt ion dương, alcohol làm thay đổi cấu hình không gian của DNA khiến cho DNA bị vón cục.

– Cồn

– Isopropanol (độc)

• Li tâm thể thu DNA kết tủa.

• Rửa lại bằng cồn 70% để loại muối kết tủa.

3. Cô đặc dịch chiết

Bài 2:

KỸ THUẬT PCR

Là phản ứng tổng hợp một đoạn DNA đặc hiệu trong ống nghiệm

• Ra đời năm 1980• Cách mạng hóa SHPT, hình sự và chẩn đoán

bệnh di truyền• Nobel năm 1993

Các bước

• Biến tính: 940C, 30 giây• Gắn mồi: 600C, 30 giây• Kéo dài: 720C, 1 phút

Sản phẩm được tạo thành sau ba chu kỳ PCR đầu tiên.

Số lượng các đoạn DNA đích có kích thước xác định và không xác định được tạo thành sau 30 chu kỳ phản ứng

Một phản ứng PCR điển hình sẽ bao gồm các thành phần sau

• DNA (0.01 - 0.1 µg)• Mồi xuôi (20 pmol)• Mồi ngược (20 pmol)• Bốn loại deoxynucleotide triphosphate (dNTP) (50 µM mỗi

loại dATP, dCTP, dGTP, dTTP)• DNA polymerase chịu nhiệt (2 đơn vị)• Tổng thể tích phản ứng khoảng 20 – 100 µl

Chương trình PCR

• 950C, 5 phút• 950C, 30 giây• 550C, 30 giây• 720C, 30 giây• 720C, 5 phút• 40C, ∞

25 chu kỳ

Bài 3: Điện di

Điện diElectroforesis

• Là sự dịch chuyển của các thành phần tích điện về hướng các điện cực tích điện trái dấu trong dung dịch dưới tác dụng của điện trường.

• Các axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường chúng sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương.

Dụng cụ và các hoá chất cần thiết

Nguồn điện. Buồng điện di. Khuôn đổ gel. Hệ thống soi chụp ảnh. Dung dịch đệm TAE (tris-acetate-EDTA) Một bản gel Chất nhuộm Ethidium bromide.

Máy chụp ảnh và phân tích gel Máy điện di DNA & RNA

Điện diElectroforesis

Gel agarose

• Agarose là một chất keo tách chiết từ rong biển.

• Agarose tạo thành mạng lưới ma trận, DNA đi xuyên quan mạng lưới.

• Khả năng phân tách của gel agarose được quy định bởi nồng độ.

Tốc độ di chuyển phụ thuộc

• Kích thước phân tử.• Dạng cấu trúc DNA.• Nồng độ agarose trong gel.• Điện thế.

Không có mối liên hệ ngược trực tiếp giữa kích thước của phân tử DNA và khoảng cách di chuyểnKhoảng cách di chuyển tỉ lệ nghịch với giá trị logarit của kích thước phân tử

• Từ 500 đến 1000 bp: Phân tách rõ ràng • Từ 8000 đến 10.000 bp: Nằm rất sát nhau.• Trên 30.000: Không thể phân tách

DNA di chuyển như con rắn xuyên qua các lỗ trong ma trận gel.Sự di chuyển này có thể bị mắc kẹt bởi nhiều lý do. Phân tử DNA càng dài thì khả năng bị mắc kẹt càng lớn.

Ethidium bromide bám vào DNA

KÕt qu¶ t¸ch ADn tæng sè vµ kiÓm

tra b»ng ®iÖn di trªn gel agarose 1% 1 2 3 4 5 6