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AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS E CITOTÓXICAS
DE MEMBRANAS DE GELATINA/QUITOSANA COM HIDROXIAPATITA OBTIDAS
POR PRECIPITAÇÃO IN SITU
Rigo, E.C.S., Habitzreuter, F.
nanoBIODEV, Nanotechnology, Biomaterials and Devices Group,
Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de
Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga, BRASIL
RESUMO
Membranas de gelatina (G) e quitosana (QS) são utilizadas em Regeneração
Tecidual Guiada (RTG) devido às suas propriedades de biodegradabilidade e
elevada adesão celular. A incorporação de hidroxiapatita (HA) induz a osteogênese,
além de conferir resistência mecânica aos compósitos formados. As membranas
foram produzidas por precipitação in situ da HA em uma solução contendo gelatina,
seguido de adição de solução de QS e foram reticuladas com tripolifosfato de sódio
(TPP) e glutaraldeído (GTA). Os compósitos foram caracterizados por
espectroscopia no infravermelho (IV), difração de raios X (DRX), ensaios de
intumescimento e de citotoxicidade. Os espectros de IV indicam concordância entre
as membranas e nos DRX identificaram-se picos de HA e -TCP. A reticulação com
GTA conferiu maior resistência ao meio aquoso, porém diminuiu a viabilidade
celular. Portanto, a precipitação in situ foi eficiente para formação das membranas e,
quando reticuladas com TPP, apresentaram resultados satisfatórios de viabilidade
celular, possibilitando seu uso em RTG.
Palavras-chave: Quitosana, Gelatina, Hidroxiapatita, precipitação in situ,
Congresso Brasileiro de Cerâmica
60º Congresso Brasileiro de Cerâmica15 a 18 de maio de 2016, Águas de Lindóia, SP
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INTRODUÇÃO As doenças periodontais, juntamente com as cáries, são o tipo mais comum de
doenças infecciosas da região bucal e a principal causa da perda dentária em
humanos, afetando cerca de 5 a 20% da população mundial(1,2) e cerca de 80% de
cães(3). O tratamento da doença periodontal é realizado por duas principais técnicas:
enxertos ósseos e regeneração tecidual guiada (RTG). O conceito de
compartimentalização dos tecidos periodontais (sua divisão em gengiva, cemento,
osso alveolar e ligamento periodontal) permitiu o desenvolvimento da técnica de
RTG com uso de barreiras físicas em forma de membrana(4). Esta técnica associada
a tratamentos endodônticos obtém sucesso superior a 90% na recuperação da
doença periodontal(5) e em casos de perda dentária, o uso de RTG aumenta o
sucesso de implantação em cerca de 90 a 100% dos casos(6).
Barreiras à base de materiais não-absorvíveis permanecem no local do
implante sem reações negativas (como rejeição) pelo tecido ósseo hospedeiro.
Dentre os materiais que possuem essa característica pode-se incluir o
politetrafluoretileno (PTFE)(7) e malhas de titânio(8). No entanto, estes materiais não-
absorvíveis apresentam desvantagens, como memória (tendem a retornar à
conformação inicial, dificultando sua adaptação aos defeitos ósseos), alto custo
financeiro e possibilidade de exposição da região tratada aos tecidos adjacentes,
muitas vezes causando infecções no local(9). Além disso, é necessário um segundo
ato cirúrgico para a remoção das membranas após o tratamento(10).
As membranas absorvíveis, por outro lado, devem propiciar a regeneração
óssea à medida que são reabsorvidas, e tanto o material como seus produtos de
degradação devem ser tolerados adequadamente pelo organismo. Esta
característica elimina a necessidade de uma segunda intervenção cirúrgica(11). Estas
membranas são normalmente formadas por polímeros, como por exemplo,
colágeno, gelatina, ácidos polilático e poliglicólico e quitina/quitosana. As vantagens
no uso desses polímeros incluem a facilidade de manipulação e manutenção pós-
operatória, no entanto, também apresentam desvantagens como reabsorção rápida,
reações alérgicas e colapso em defeitos intra-ósseos. Além disso, a adição de
fosfatos de cálcio em tais membranas ajuda a promover regeneração óssea.(10).
A utilização de gelatina (G) e quitosana (QS) como biomateriais é bastante
encorajada, pois além de serem materiais baratos e abundantes, apresentam
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elevada biocompatibilidade(12). Biomateriais à base de quitosana causam pouca ou
nenhuma reação de encapsulação fibrosa (como ocorre com materiais metálicos)
(13), pois a quitosana é responsável pelas interações com glicosaminoglicanos
(GAGs) (componentes fundamentais das matrizes extracelulares(14). Esta interação é
de grande importância, pois diversos fatores de crescimento celular estão
relacionados com os GAGs. A gelatina apresenta as mesmas propriedades(15, 16).
As blendas de G/QS apresentam melhor flexibilidade e melhor capacidade de
absorção de água em comparação com os hidrogéis formados somente por
gelatina(17). Além disso, em contato com soluções de tampão fosfato e enzimas
estes hidrogéis apresentaram elevada biodegradabilidade, e as blendas de G/QS
apresentam máxima resistência mecânica quando úmidas na proporção de 50:50
em massa(18), além de ser ideal para crescimento celular(19). Diversos trabalhos na
literatura utilizam blendas de G/QS para uso como biomateriais(15, 20).
A hidroxiapatita (HA) também é amplamente utilizada como biomaterial, sendo
aplicada para tratamento de defeitos ósseos tanto como implantes diretos ou como
recobrimento de outros materiais cerâmicos e até metálicos(21). Além disso, a HA
possui uma grande similaridade com as apatitas biológicas com relação à sua
estequiometria e cristalinidade tornando-a um material osteocondutor(22). A
precipitação da HA diretamente no meio polimérico é encorajada, pois forma
materiais mais homogêneos, diminuindo riscos de inflamação e rejeição pós-
implante(23). Assim, a formação de materiais à base de G/QS/HA é importante para
aplicação em RTG, tendo em vista as propriedades biológicas dos polímeros
associado à capacidade de osteocondução da hidroxiapatita.
MATERIAIS E MÉTODOS
A gelatina, do tipo suína, foi obtida comercialmente da Gelnex Indústria e
Comércio, bloom de 270 e granulometria de 40 Mesh. A quitosana, extraída do
caranguejo (mínimo de 85% de quitina desacetilada), foi adquirida da Polymar
Ciência e Nutrição.
Preparo das membranas de G/QS
Inicialmente, a gelatina foi solubilizada em água destilada a 40ºC, com
quantidade de gelatina suficiente para formação de uma solução 4% (m/v). Em
seguida, uma solução aquosa previamente filtrada de QS com ácido acético (1% v/v)
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e 2% (m/m) de QS foi adicionada à gelatina. Por fim, foram adicionados 0,5% v/v de
glicerina à mistura de G/QS, como plastificante.
Para a formação das membranas, foram vertidas alíquotas de 25 mL da
mistura em placas de Petri, que por sua vez foram secas em estufa de recirculação
de ar a 30ºC por 48h.
Preparo das membranas de G/QS/HA
Após a solubilização da gelatina (4% m/v) a 40ºC, foram adicionados os
precursores da HA (Ca(OH)2 e H3PO4). O Ca(OH)2 foi adicionado diretamente à
gelatina e uma solução de H3PO4 foi gotejada lentamente à mistura. As quantidades
de Ca(OH)2 e H3PO4 foram equivalentes para formação de uma mistura com 0,3 M
de HA. Após a adição, a mistura foi envelhecida por 6h sob agitação constante e a
40ºC. Após este período, a quitosana foi adicionada conforme o método de preparo
descrito na seção anterior. Por último, foram adicionados 0,5% (v/v) de glicerina.
Todas as amostras passaram por uma etapa de neutralização através da
imersão em solução 0,1M de NaOH em etanol por 30min, lavadas com etanol e
secas à temperatura ambiente.
Ensaio de intumescimento
O ensaio de intumescimento tem por objetivo analisar o comportamento das
membranas em meio aquoso, verificando o grau de intumescimento através da sua
imersão em uma solução de PBS (Phosphate Buffer Saline). O grau de
intumescimento é obtido de acordo com a Equação (A)(24):
)(100s
su
M
MMGI
Equação (A)
Onde GI é o grau de intumescimento, Mu e Ms correspondem à massa em
gramas das membranas úmidas e das membranas secas, respectivamente.
As membranas foram imersas em PBS e colocadas em estufa incubadora a
37ºC. As massas foram medidas antes da imersão e em períodos de tempo
subsequentes. Os dados foram tratados com o software Microcal Origin 9.
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Reticulação As membranas foram reticuladas por tripolifosfato de sódio (TPP) e
glutaraldeído (GTA), de acordo com metodologia adotada por Oliveira(25). Os
processos de reticulação ocorreram de duas formas: por imersão e a vapor. No
método de imersão, as membranas foram colocadas em placas de Petri e imersas
em soluções aquosas de TPP ou GTA, na concentração de 1% v/v em água por 30
min e em seguida foram secas em temperatura ambiente.
O processo a vapor foi realizado somente utilizando GTA. Uma solução aquosa
de GTA com 10% v/v foi colocada em uma placa de Petri no fundo de um
dessecador. Sobre a placa porosa do dessecador, foram colocadas as membranas
em placas de Petri. Em seguida, com auxílio de uma bomba de vácuo, o ar foi
retirado, permitindo a evaporação do glutaraldeído, promovendo a reação de
reticulação. As amostras foram deixadas por 5 dias no dessecador e em seguida
secas em temperatura ambiente.
A Tabela 1 indica as nomenclaturas adotadas para cada membrana obtida:
Tabela 1. Nomenclaturas para as membranas confeccionadas
GQS Gelatina / Quitosana 50:50 v/v
GQSHA Gelatina / Quitosana 50:50 v/v / HA
GQSHA GTA1% Reticulada por imersão em solução 1% de GTA
GQSHA TPP1% Reticulada por imersão em solução 1% de TPP
GQSHA GTA10% Reticulada por vapor de solução 10% de GTA
Caracterizações
As membranas secas foram caracterizadas por ensaios físico-químicos e in
vitro. As caracterizações físico-químicas foram realizadas utilizando espectroscopia
no infravermelho com transformada de Fourier (IV) em um espectrômetro Spectrum
One da Perkin Elmer através da técnica de Reflectância Total Atenuada, localizado
no Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA/ZEA). Para cada membrana foram
realizadas 32 varreduras entre 4000 a 650 cm-1. Além disso, duas amostras de HA
foram analisadas: uma proveniente da calcinação a 600ºC da membrana GQSHA,
nomeada HAmemb e outra precipitada em laboratório a partir do gotejamento de
solução aquosa de H3PO4 em suspensão de Ca(OH)2 (HAprec)(26). Essas amostras
foram analisadas com pastilha de KBr com 32 varreduras de 4000 a 450 cm-1 a fim
de identificar presença de HA no compósito, e comparado com o IV de HA obtida em
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laboratório. Também foram realizadas análises de difração de raios X (DRX) das
membranas com e sem HA, bem como da amostra HAmemb em um difratômetro
Miniflex 600 da Rigaku com ângulos (2) de 10º a 60º e velocidade de varredura de
1º/min localizado no Laboratório Multiusuário de Caracterização de Materiais
(MultMat/ZEB). Além dos ensaios físico-químicos as membranas foram analisadas
pelo ensaio de intumescimento e a citotoxicidade foi avaliada mediante ensaio de
viabilidade celular in vitro através da técnica de incorporação de Vermelho Neutro,
baseado na norma ISO 10993-5 de 2009.
RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1 apresenta os espectros de infravermelho das amostras obtidas.
Notam-se bandas características da gelatina, como amida I na região de 1640 cm-1 e
amida II em 1560 cm-1. Também estão presentes bandas referentes à QS, como
bandas das ligações C-O que formam os grupos sacarídeos na região de 1030 e
1080 cm-1. Além disso, estiramento –OH é encontrado na região de 3300 cm-1 e os
estiramentos das ligações –CH2 e –CH3 na região de 2910 e 2865 cm-1.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Tra
nsm
itân
cia
Número de Onda (cm-1)
GQS
GQSHA
GQSHA GTA1%
GQSHA TPP1%
GQSHA GTA10%
Figura 1. Espectros de Infravermelho das amostras obtidas.
As bandas intensas na região de 1020 cm-1 para as amostras reticuladas com
GTA indicam presença de grupos carbonila (C=O), confirmando presença de GTA
não reagido. A formação de ligações imina (C=N), características da reação com
GTA encontra-se na região de 1640 cm-1 e coincide com as bandas da amida I. Além
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das bandas mencionadas, temos também bandas de fosfato na região de 1060 cm-1
e carbonato em 880 cm-1 na amostra GQSHA TPP1%(20,27).
Com intuito de distinguir a presença de bandas mais características de grupos
fosfato da hidroxiapatita, a amostra GQSHA foi calcinada a 600ºC e o pó resultante
foi comparado com HA obtida em laboratório através do mesmo método.
Na Figura 2, são apresentados os resultados de infravermelho destas
amostras, e notamos presença de grupos fosfato em 1040, 600 e 560 cm-1 e
estiramento da hidroxila em 3400 cm-1(30).
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Número de onda (cm-1)
HAmemb
HAprec
Tra
nsm
itância
Figura 2. Comparação dos espectros de IV das hidroxiapatitas.
Além disso, foram identificadas bandas referentes à grupos carbonato, como
em 1640 e 1420 cm-1, e 870 cm-1 para a amostra precipitada. Assim, confirmamos
presença de HA carbonatada nas membranas confeccionadas pelo método de
precipitação in situ. Esses resultados estão de acordo com encontrados na
literatura(21,22,26,28).
Outra análise importante para identificar a presença de hidroxiapatita nas
amostras é a técnica de difração de raios X. Esta análise permite identificar fases
cristalinas das amostras, e na Figura 3 são comparados difratogramas das amostras
GQS, GQSHA e HAmemb. A região em torno de 22º é referente à quitosana para as
amostras GQS e GQSHA. Os picos em 26º (deslocado para 25,5º na amostra com
polímero), 32º, 34º e 39,7º (deslocado para 39,1º na amostra com polímero) são
referentes à fase HA e em 27,9º, 31º e 32,8º referentes à fase β-TCP. Esses
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resultados estão de acordo com as fichas 9-432 e 9-169 do JCPDS e dados da
literatura(26, 28).
15 20 25 30 35 40
2
GQS
GQSHA
HAmemb
HA
-TCP
Figura 3. Difração de raios X das membranas e de HA obtida por precipitação.
Em seguida, foram realizados ensaios de intumescimento das amostras em
tampão fosfato (PBS) (Figura 4). As amostras GQS e GQSHA ficaram quebradiças,
respectivamente, após 2h e 45min em contato com a solução. A presença de HA
diminui o grau de intumescimento, e também diminui o tempo em que ela resiste ao
meio aquoso.
15min 30min 45min 1h 2h 1d 2d
20
30
40
50
60
70
80
90
% Intu
mescim
ento
Tempo
GQS
GQSHA
GQSHA GTA1%
GQSHA TPP1%
GQSHA GTA10%
Figura 4. Ensaios de intumescimento.
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A amostra GQSHA GTA1% quebrou após um dia, visto que o processo de
reticulação por imersão com GTA a tornou bastante quebradiça. Além disso, ela teve
um intumescimento próximo à amostra GQSHA TPP1%. Por outro lado, a amostra
GQSHA GTA10% apresentou baixo intumescimento, indicando que o processo de
reticulação foi mais completo, diminuindo a movimentação das cadeias poliméricas,
levando a menor absorção de água.
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
Via
bili
dade C
elu
lar
(%)
Concentração do extrato (%)
CN (Al2O3)
CP (Fenol 0,2%)
GQS
GQSHA
GQSHA 1%GTA
GQSHA 1% TPP
GQSHA 10%GTA
Figura 5. Ensaios de viabilidade celular das amostras.
Os resultados dos ensaios de viabilidade celular in vitro estão expressos na
Figura 5. Nota-se que as amostras GQS e GQSHA TPP1% apresentam boa
viabilidade celular (acompanhando o controle negativo, Al2O3), enquanto que as
amostras GQSHA e GQSHA GTA1% mostraram citotoxicidade em concentrações de
extrato a partir de 100% e 25% respectivamente. Por fim, a amostra GQSHA
GTA10% mostrou-se menos citotóxica em comparação ao processo de reticulação
por imersão com GTA, mas ainda assim apresentou resultados de viabilidade celular
abaixo do esperado, com viabilidade celular abaixo de 50% para concentração de
100% de extrato.
CONCLUSÕES
O método de precipitação in situ proposto foi eficaz para preparação de
membranas de gelatina/quitosana e hidroxiapatita. Através dos ensaios de
intumescimento, fica evidente que o processo de reticulação com glutaraldeído
diminui a capacidade de absorção de água das membranas, entretanto os ensaios
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de citotoxicidade mostram que as membranas reticuladas com TPP obtiveram
melhor viabilidade celular, tornando-as mais atraentes para uso em RTG. A
reticulação em vapor de GTA aumenta a biocompatibilidade das membranas e deve
ser mais investigada.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao CNPq pelo apoio financeiro.
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EVALUATION OF THE PHYSICAL-CHEMICAL AND CYTOTOXIC
CHARACTERISTICS OF GELATIN/CHITOSAN MEMBRANES WITH
HYDROHYAPATITE OBTAINED BY IN SITU PRECIPITATION
ABSTRACT
Gelatin (G) and chitosan (QS) membranes are used with Guided Tissue
Regeneration (RTG) due to its biodegradability and high cell adhesion. The
incorporation of hydroxyapatite (HA) induces osteogenesis and grants mechanical
resistance to the formed composites. The membranes were produced by in situ
precipitation of HA in a solution containing gelatin, followed by QS addition.
Crosslinking with sodium tripolyphosphate (TPP) and glutaraldehyde (GTA) were
carried out. The composites were characterized by infrared spectroscopy (IV), X-ray
diffraction (DRX), swelling and cytotoxicity assays. The IV spectra indicate
agreement among the membranes, and through DRX HA and -TCP peaks were
identified. The crosslinking with GTA bestowed higher resistance to aqueous
medium, but it lowered the cell viability. Therefore, the in situ precipitation method
was effective to form the membranes, and after crosslinking with TPP, they showed
good results concerning cell viability, indicating that these membranes are promising
to be used with RTG.
Keywords: Gelatin, Chitosan, Hydroxyapatite, in situ precipitation
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