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Aula de Bioquímica Avançada

Tema:

Fosforilação OxidativaCadeia transportadora de elétrons

Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM

Instituto de Química de São Carlos – IQSCUniversidade de São Paulo – USP

E-mail: [email protected]

Fosforilação oxidativa

Representa o fim das rotas metabólicas de produção de energia em organismos aeróbicos

- Representa o estágio 3 do processo Acoplamento da oxidação de NADH e FADH2 e síntese de

ATP- É o principal sítio de produção de ATP em organismos

aeróbicos não fotossintetizantes - Envolve o consumo de O2 e formação de H20

Envolve a teoria Quimiosmótica proposta por Peter Mitchel 1961

Amplamente amparada experimentalmente

Nobel Prize Winner, 1978, Chemistry

Teoria Quimiosmótica- Fluxo de elétrons por carreadores criam um gradiente de concentração de prótons na

membrana mitocondrial- A quebra deste gradiente está acoplada com a síntese de ATP

Fosforilação oxidativa

Matriz mitocondrial- Local de oxidações- Ciclo de Krebs- β-oxidação de lipídeos- Oxidação de Aminoácidos

LOCAL: MITOCÔNDRIA

- Organela de eucariotos Possui duas membranas

Membrana Mitocondrial externa - MME- Permeável a pequenas moléculas

Membrana Mitocondrial interna - MMI- Impermeável a maioria das moléculas

- Inclusive H+

- Necessidade de transportadores de membrana

Espaço intermembranal-Cristas membranais

MitocôndriaOs carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI

A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela CTE

Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana

Fosforilação oxidativaLOCAL: MITOCÔNDRIA

A MMI contém proteínas que acoplam processos:Fluxo de elétrons (favorável) com o fluxo de prótons (desfavorável);Fluxo de prótons (favorável) a fosforilação oxidativa (desfavorável);

Os elétrons passam por uma série de carreadores

MMI-~ 75% de proteínas: mais rica em proteínas do que a

MME

-É permeável a O2, CO2 e H2O

- Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos,

como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o fosfato

A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite a formação de um gradiente de íons

através dessa barreiraResulta na compartimentalização das funções

metabólicas entre o citosol e a mitocôndria

Fosforilação oxidativaLOCAL: MITOCÔNDRIA

Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS OU CADEIA RESPIRATÓRIA

Os carreadores que transportam os elétrons do NADH e FADH2 até O2 estão na MMI- A oxidação de NADH e FADH2 é promovida pela cadeia de transporte de elétrons

- Alguns desses centros redox são móveis ou proteínas integrais de membrana- Dependem dos grupos protéticos associados

A sequência de carreadores de elétrons reflete seus potenciais de redução relativos O processo é exergônico

Transporte de e’1) 1 e’ Fe3+ para Fe2+

2) 1 e’ + 1 H+

3) 2 e’ na forma de :H-


'0E

Potencial de transferência de elétrons

= potencial de redução= potencial redox= potencial de oxidorredução

Forma oxidada (oxidante) →Par redox

Forma reduzida (redutor) →

X−

XH+ : H2

Potencial de redução = 0 V

Potencial de redução ˂ 0A forma oxidada tem menor afinidade por elétrons que o H2

Potencial de redução ˃ 0A forma oxidada tem maior afinidade por elétrons que o H2

Um agente redutor forte (como o NADH) tem a tendência de doar elétrons (E’0 < 0); um agente oxidante forte (como o O2) está pronto para aceitar elétrons (E’0 > 0)

A força impulsora da fosforilação oxidativa é o potencial de transferência de elétrons de NADH e FADH2 em relação ao do O2


Os carreadores de e’ NAD(P)H

São carreadores de elétrons solúveis em água, que se associam reversivelmente a

desidrogenasesSubstrato reduzido + NAD(P)+ ↔ Substrato oxidado + NAD(P)H + H+

**Desidrogenases remoção de 2 átomos de H do substrato

:H- → NAD+

H+ → Liberado do meio

NADH → carreador de elétrons das vias catabólicas até a porta de entrada na CTE

NADPH → geralmente supre elétrons para reações anabólicas

][][

+NADNADH

][][

+NADPNADPH

NADPHRazão alta Poder redutor a reações

anabólicas

NADHRazão baixa carreador de e- no

catabolismo

Nas células


Os carreadores de e´

FlavoproteínasContêm um nucleotídeo de flavina (FMN ou FAD) → parte do sítio ativo da

flavoproteína

Pode aceitar 1 elétron → semiquinona ou 2 elétrons → FADH2 FMNH2

A forma oxidada (FMN) reage com um próton e um elétron, convertendo-se na forma semiquinona (FMNH●); a incorporação de mais um próton e um elétron resulta na forma totalmente reduzida (FMNH2).

Flavoproteínas podem participar da transferência de 1 ou 2 e- → intermediários entre reações onde 2e-

são doados (desidrogenações) e onde 1 e- é doado (redução de uma quinona a hidroquinona).


Os carreadores de e´

Ocorrem 3 tipos de transferência de elétrons na CTE① Transferência direta como na redução de Fe3+ a Fe2+

② Transferência na forma de um átomo de hidrogênio (H+ + e-)

③ Transferência como íon hidreto (:H+) que tem 2 elétrons

+ 3 tipos de moléculas carreadoras de elétrons atuam na CTE:

① Ubiquinona (quinona hidrofóbica)

② Citocromos

③ Proteínas ferro- enxofreProteínas (diferentes) que contêm ferro

Carreadores não podem atravessar a MMI, MAS os equivalentes redutores podem ser lançados através da membrana indiretamente

Equivalentes redutores termo geral para um elétron ou equivalente de elétron na forma de um átomo de hidrogênio ou de um íon hidreto.

Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS

Os carreadores de elétrons na mitocôndria COENZIMA UBIQUINONA (Q)- Pequena e Lipossolúvel

Quinona → composto benzênico com duas funções cetona

Constituída de unidades isoprenóides (cada uma com 5C)

A coenzima Q10 é a mais comum em mamíferos (10

unidades de isopreno)

Fácil de desprotonar, formando um radical

aniônico de semiquinona

Forma que fixa mais firmemente seus prótons

Aceita 1 elétron

Aceita 2 elétrons

Lipossolúvel→ se difunde livremente no espaçointermembranas→ Capaz de fazer a junção entre o doadorde 2e- e um aceptor de 1e- (como asflavoproteínas)→ Carrega tanto elétrons como prótons** acopla fluxo de e- com o movimento de

prótons


Os carreadores de elétrons na mitocôndria

PROTEÍNAS COM CENTROS DE FERRO-ENXOFRE- Estrutura variável simples a complexas- O íon Fe sofre reações de óxido-redução

Os átomos de ferro estão ligados a átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre

em resíduos de cisteína ou com ambos

Podem ter de 1 a 4 átomos de ferro

*** Proteínas ferro-enxofre de Rieske1 Fe está associado com dois resíduos de His ao

invés de Cys


Os carreadores de elétrons na mitocôndria Citocromos a, b e c

Seus grupos prostéticos – grupos HemeCitocromo c solúvel no espaço intermembrana

Podem interagir com a MMI


O fluxo de elétrons pelos carreadores vai daquele com menor potencial para o maior potencial

- Potencial Redox diferentes aos das moléculas livres devido a interação com proteínas

NADH Q Cit b Cit c1 Cit c Cit a Cit a3 O2


Os carreadores de elétrons na MMI: 4 complexos

Complexo I é do NADH para formar UbiquinolNADH:Ubiquinona-oxidoreductase ou NADH-desidrogenase

Complexo II é do FADH2 para formar UbiquinolSuccinato-desidrogenase

Complexo III é do Ubiquinol para o Citocromo cUbiquinona:Citocromo c-oxidoreductase

Complexo IV é do Citocromo c para o O2Citocromo c-oxidase

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO I: NADH:UBIQUINONA-OXIDOREDUTASE OU NADH-DESIDOGENASE

Porta de entrada dos e’ do NADH produzidos dentro da mitocôndria

-O Complexo catalisa 2 processos simultâneos e acoplados1) NADH + H+ + Q NAD+ + QH2

Exergônico2) Transferência de 4 H+ para o espaço intermembrana

Endergônica

Grupos prostéticos: FMN e Fe-S

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO II: SUCCINATO-DESIDOGENASE

Porta de entrada dos e’ do FADH2 produzidos no ciclo do ácido cítrico

Canaliza diretamente os e’ do succinatopara a cadeia transportadora de e’

FADH2 + Q FAD + QH2

Exergônico

Sem transferência de H+ para o espaço intermembrana

QH2: Porta de entrada de parte dos e’ do NADH produzidos no citoplasma

Porta de entrada de e’ de outras vias oxidativas

- β-oxidação de ácidos graxos

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO I E COMPLEXO II

Vias de entrada de e’ para a

ubiquinona:

1) NADH mitocondrial,

2) Succinato do ciclo do ácido

cítrico,

3) e’ da β-oxidação de ácidos

graxos via Acil-CoA-desidrogenase

e do glicerol dos triacilglicerois

4) NADH citosólico via glicerol 3-

fosfato

1)

2) 3)

4)

A ubiquinona é o ponto de convergência dos e- (Fontes 1 a 4)

O ubiquinol de todas essas reações (pool de QH2) é oxidado no Complexo III

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE

Canaliza os 2 e’ do Ubiquinol (QH2) para o Citocromo C com a transferência de H+ da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana

- possui duas unidades de Citocromo b enterrados em 1 fenda na membranaQH2 + 2 Citc1 (Oxi) + 2 H+

N Q + 2 Citc1 (Red) + 4 H+P

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO III: UBIQUINONA:CITOCROMO C-OXIDOREDUTASE

2 e’ do Ubiquinol são afunilados no Citc carreador de 1 e’ 2 ciclos de redução do Citc com a formação da Semiquinona (.Q-)

1º Ciclo -1 e’ do QH2 é passado para o

Citc no primeiro ciclo e o outro e’ (via citocromo b) para

a Q formando Semiquinona

- 2 H+ transportados para o espaço intermembrana

2º Ciclo-1 e’ do QH2 é passado para o

Citc e o outro e’ (via citocromob) para a Semiquinonaformando outra QH2

- 2 H+ transportados para o espaço intermembrana

- 2 outros H+ são retirados da matriz

1º Ciclo 2º Ciclo

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE

Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2

4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 4 Citc (Oxi) + 4 H+

P + 2 H2O

Os e- do citocromo c são entregues ao O2 (reduzindo-o a H2O)

Composto por 13 subunidades aparentemente 3 são essenciais

Sub. II: 2 Cu ligados a resíduos de Cys (centro binuclear CuA)

Sub. I: 2 grupos heme (a e a3) e outro íon Cu (CuB)

Heme a3 e CuB forma outro centro binuclear

Fosforilação oxidativaCOMPLEXO IV: CITOCROMO OXIDASE

Os e’ do Citocromo c são entregues ao O2

4 Citc (Red) + 8 H+N + O2 4 Citc (Oxi) + 4 H+

P + 2 H2O

Envolve a participação de:Ion CuA

Citocromo aCitocromo a3-CuB (Centro Fe-Cu)

O2

4 ciclos são necessários para reduzir 1 O2 a 2 H2O

4 H+ transportados para o Espaço intermembranas

4 outros H+ são retirados da matriz para formar as 2 H2O

2 H+ por par de e-

Fosforilação oxidativaO RESPIROSSOMO

Canalização de substratos na membrana mitocondrial interna- Dados cinéticos e estruturais indicam a associam dos complexos da CTE na MMI

- Complexo III pode ser extraído juntamente com o Complexo I ou complexo IV

Complexo III Vermelho

Complexo IV Verde

Imagens de micrografia eletrônica


Resumo do processo

Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeiaNADH + 11 H+

N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P + 1 H2O

FADH2 + 6 H+N + ½ O2 FAD + 6 H+

P + 1 H2O

- O ∆E0‘ representa o potencial de redução padrão nas condições padrões para bioquímica

- Um Valor positivo para o ∆E (potencial de redução ou força eletromotiva) sugere espontaneidade da reação

- um valor positivo para o ∆E representa um valor negativo para o ∆G


NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + 1 H2O

A ΔG da reação pode ser medida a partir da diferença de voltagem entre meias células

- Se referente ao trabalho elétrico realizado a pressão e volume constante-Se o onde f é a constante de Faraday (96.485 Cmol-1) e

- n é o número de e’/mol portanto:

+←+ + →+ noxredred

nox BABA

+∆=∆ +

+

nred

nox

noxred

BABARTGG

]][[]][[ln'0

elwwG −=−=∆ '

Enfwel ∆=

EnfG ∆−=∆

−∆=∆ +

+

nred

nox

noxred

BABA

nfRTEE

]][[]][[ln'0 Equação

de Nernst Reorganizando

Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS TEÓRICO

NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + 1 H2O

NADH/NAD+ E0’ = + 0,320 V O2/H2O E0’ = +0,816 V

Succinato + ½ O2 Fumarato + 1 H2O

A razão da [NADH]/[NAD+] >1 o que sugere que a ΔG é mais negativa do que -220 kJ/mol!

ΔE0’= E0’Red + E0’

oxi = + 1,14 V

)(/22014,1)./5,96(2'0'0 deNADHmolkJVmolVkJEnfG −=−=∆−=∆

)(/150785,0)../5,96(2'0'0 odeSuccinatmolkJVmolVkJEnfG −=−=∆−=∆

E energia liberada é usada para gerar um gradiente de prótons que é então utilizado para a síntese de ATP e para o transporte de metabólitos pela

membrana mitocondrial

Fosforilação oxidativaCADEIA TRANSPORTADORA DE ELÉTRONS EFETIVO

A energia da transferência de e’ é eficientemente conservada em um gradiente

- Gradiente de prótons - Gradiente eletroquímicoFORÇA PROTON-MOTRIZ ENERGIA ELETROQÍMICA

A ΔG associada ao processo de criação dos 2 gradientes é:

C2 = H+pLado positivo da MMI Espaço intermembrana

C1 = H+nLado negativo da MMI Matriz mitocondrial

Z = valor absoluta da carga elétrica 1 para 1 H+

ΔΨ = Diferença do potencial transmembrana

ψzfCCRTG ∆+=∆ )

12ln(

]log[ +−= HpHpHpHpHHHCC

pnnp ∆=−=−= ++ 3,2)(3,2)]log[](log[3,212ln

ψmolkJpHmolkJψzfpHRTG ∆+∆=∆+∆=∆ )./6,95()./7,5(3,2


A ΔpH da MMI é de 0,75 unidades de pH A ΔΨ da MMI é de 0,15-0,20 V

A ΔG associada à oxidação de 1 mol de NADH é:

molkJmolkJmolkJG /1915,0)./6,95(75,0)./7,5( =+=∆

Equação Vetorial do transporte de Prótons pela cadeiaNADH + 11 H+

N + ½ O2 NAD+ + 10 H+P + 1 H2O

Logo ΔG = 19 kJ/mol*10 = ~190 kJ/molΔG0’ = 220 kJ/mol

Fosforilação oxidativa“VAZAMENTO DE E’ DA CTE)

A formação de EROs: Espécies Reativas de Oxigênio: Radicais LivresÍon superóxido O2

- 0,1-4%

Superóxido dismutase

Glutationa-peroxidase

- Ação dependente de:Glutationa

NADPH

Fosforilação oxidativaSISTEMAS DE TRANSPORTE MITOCONDRIAL

Espaço intermembrana: entre a MME e MMI- equivalente ao citosol no que se refere às concentrações em metabólitos e íons

A MMI é composta por cerca de 75% de proteínas mais rica em proteínas MME- A MMI é permeável a O2, CO2 e H2O

- Contém proteínas de transporte que controlam a passagem de metabólitos, como ATP, ADP, o piruvato, o Ca2+ e o

fosfato

A impermeabilidade da MMI para a maioria dos íons e metabólitos permite

a formação de um gradiente de íons através dessa barreira

Resulta na compartimentalização das funções metabólicas entre o citosol e a

mitocôndria


Transporte seletivo de elétrons produzidos no citoplasma para a mitocôndria- O NADH produzido no citosol pela glicólise deve ter acesso à cadeia transportadora de

elétrons para a oxidação aeróbica Fígado, rim e coração

- Não há uma proteína transportadora de NADH

na MMI

- Somente os elétrons do NADH citosólico são transportados para a

mitocôndria por um dos vários sistemas de

transporte

LANÇADEIRA DE MALATO-ASPARTATO


LANÇADEIRA DE GLICEROL-3-P Músculo esquelético e encéfalo

A glicerol-3-fosfato desidrogenase catalisa a oxidação

do NADH citosólico pela DHAP para produzir NAD+, o qual

retorna à glicólise

Os elétrons do glicerol-3-fosfato são transferidos para a

Flavoproteína-desidrogenase da MMI, formando FADH2

O FADH2 fornece elétrons diretamente para Cadeia

Transportadora de Elétrons QH2


A MMI contém um translocador de ADP-ATP (ou adenina-nucleotídeo translocase)

- Transporta o ATP para fora da matriz mitocondrial acoplado à importação de ADP e Pi

produzidos no citoplasma a partir de ATP- Sistema antiporte

- Mantém balanço eletrolítico pelo gasto de energia quimiosmótica

TRANSLOCADOR DE ATP/ADP-PI

A maior parte do ATP gerado na matriz mitocondrial pela fosforilação oxidativa é

utilizado no citosol

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