aspectos da resposta imune humoral e celular de
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ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CELULAR DE
BOVINOS NATURALMENTE INFECTADOS COM
MYCOBACTERIUM BOVIS E AVALIAO DE VACINA DE
SUBUNIDADE PROTICA PARA TUBERCULOSE EM
CAMUNDONGOS
Ediane Batista da Silva Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
GOINIA 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS ESCOLA DE VETERINRIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL
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EDIANE BATISTA DA SILVA
ASPECTOS DA RESPOSTA IMUNE HUMORAL E CELULAR DE
BOVINOS NATURALMENTE INFECTADOS COM
MYCOBACTERIUM BOVIS E AVALIAO DE VACINA DE
SUBUNIDADE PROTICA PARA TUBERCULOSE EM
CAMUNDONGOS
Tese apresentada para obteno do grau de Doutor em Cincia Animal junto Escola de Veterinria da Universidade Federal de Gois
rea de concentrao: Patologia, Clnica e Cirurgia Animal
Orientador: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
IPTSP/UFG
Comit de Orientao: Prof. Dr. Andr Kipnis - IPTSP/UFG
GOINIA 2008
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DEDICATRIA
Aos meus pais que sempre deram asas aos meus sonhos, permitindo-me voar. Pelo
amor e apoio incondicional dedico.
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O sbio l livros mas l tambm a vida. O universo um grande livro, e a vida uma grande escola (Lin Yutang)
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AGRADECIMENTOS
Sempre acreditei que no importa o ponto de chegada, mas o caminho percorrido. Sendo
assim, considero essa conquista uma longa trajetria, que seria praticamente impossvel, caso no
tivesse o apoio de algumas pessoas e instituies ao longo do rduo e maravilhoso mundo da cincia.
Em primeiro lugar agradeo ao PAI criador pela vida, pelos amigos, pelas dificuldades, pela
f, pela perseverana e por me fazer acreditar que seria capaz de romper os limites scio-econmicos e
chegar ao doutorado. Agradeo por todas as coisas boas que tenho recebido e pela sabedoria para
entender o que momentaneamente foi ruim, mas que fizeram parte do aprendizado.
Agradeo minha maravilhosa, compreensiva e grande famlia. Especialmente aos meus
avs, pelo cuidado de sempre. Aos pais e irmos pelo amor incondicional.
minha querida orientadora, Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis, uma das pessoas
mais incrveis e inteligentes que j conheci. Agradeo profundamente por compartilhar to
generosamente o seu conhecimento e a sua amizade. Obrigada pela oportunidade de aprendizado
dirio da pura cincia com tica e sabedoria. Sou eternamente grata por cada incentivo nos vrios
momentos difceis e pela proeza de me fazer acreditar que estava no caminho certo, alm das chances
de nos deixar tentar errar e acertar. Suas distintas qualidades a minha fonte de respeito e
admirao.
Ao co-orientador Prof. Dr. Andr Kipnis, pelas sugestes neste trabalho, pela disposio e
boa vontade em ajudar sempre que solicitado.
Aos amigos do laboratrio de imunopatologia das doenas infecciosas: Eduardo, Rafael,
Arioldo, Joo, Hidelbrando, Hrica, Michelle, Cristina, Loanda, Cinthya, Mayara e Rogrio, pelas
crticas e agradvel convivncia durante esses anos de doutorado. Agradeo especialmente a
acadmica de Biomedicina Bruna Daniella da Silva Souza, a pequena grande cientista, pelo prazer
em trabalharmos juntas e dividir as coisas boas e as que no saiam como o esperado durante a
realizao de experimento.
minha amiga Karyne Oliveira Coelho, que desde sempre me incentivou e me fez enxergar
possibilidades onde aparentemente ningum as notavam. No poderia deixar de agradec-la pelo
carinho, crticas construtivas e pelos vrios momentos que somente ela poderia me resgatar da
introspeco e trazer um pouco de conforto para a alma. Foi muito importante o seu apoio na minha
jornada acadmica e portanto para a construo dessa tese.
companheira, quase irm, Liliana Borges de Menezes pela amizade desde o inicio da
minha vida acadmica, quando nem pensava na possibilidade de fazer cincia. Pela presena em todo
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os momentos de alegria e tristeza, pela compreenso e opinies sensatas e por sempre estar disposta a
auxiliar em qualquer circunstncia ou situao.
Aos mestres que foram fonte de admirao e motivo de superao de cada dificuldade e aos
professores que fizeram parte da banca de qualificao. Profa. Dra. Andrea Caetano da Silva, Prof.
Dr. Adilson Donizeti Damasceno, Profa. Dra. Mara Silva Carvalhares e Profa. Dra. Wilia Marta
Elsner D. Brito pelas criticas e sugestes oportunas.
Rosana Rezende Moraes in memorian pela primeira oportunidade dada no
acompanhamento de uma pesquisa. A English Teachear Linne pela perseverana no ensinamento do
ingls, que foi de suma importncia em algumas conquistas da minha vida. A amiga Beatriz Kipnis
pela assistncia na fala e escrita em Ingls.
Aos amigos que embora no participaram ativamente da elaborao desse trabalho, mas me
deram apoio moral, estando do meu lado em qualquer ocasio: Vernica, Elcimar, Vitria, Mara e
Eduardo.
Ivete Moura, Alline de Paula Reis e Marco Silva e que ajudaram na coleta.
AGRODEFESA, na pessoa dos mdicos veterinrios William Vilela e Carla Geovanna
Nunes de F. L. Coelho, pela parceria no Programa de Controle e Erradicao da Brucelose e
Tuberculose, sem os quais seria impossvel o desenvolvimento deste trabalho. Aos proprietrios que
permitiram a coleta de sangue e acompanhamento do abate de seus animais.
universidade Federal de Gois e ao Programa de Ps Graduao em Cincia Animal da
Escola de Veterinria. CAPES pela bolsa de doutorado e pelo projeto CAPES-MS-CUBA que
viabilizou a concluso desse projeto.
A todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao desse trabalho, muito
obrigada.
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SUMRIO
CAPTULO 1- CONSIDERAES GERAIS ...................................................... 1
1 INTRODUO ................................................................................................ 1
2 Aspectos gerais sobre tuberculose bovina ...................................................... 2
3 Aspectos gerais da resposta imune em tuberculose bovina............................ 4
4 Resposta imune inata infeco por Mycobacterium bovis ............................ 6
5 Resposta imune efetora infeco por Mycobacterium bovis ........................ 7
5.1 Subpopulaes de clulas T envolvidas na tuberculose bovina ................... 9
5.1.1 Linfcitos TCD4+ ....................................................................................... 9
5.1.2 Linfcitos TCD8 ....................................................................................... 10
5.1.3 Linfcitos T ........................................................................................... 11
5.2 Principais citocinas e outras clulas envolvidas na resposta imune ao M.
bovis ................................................................................................................. 12
5.2.1 IFN- ........................................................................................................ 12
5.2.2 TNF- ...................................................................................................... 14
5.2.3 Interleucina-2 (IL-2) ................................................................................. 14
5.2.4 Interleucina-4 (IL-4) ................................................................................. 15
5.2.5 Interleucina-12 (IL-12) ............................................................................. 15
5.2.6 Macrfagos .............................................................................................. 15
5.2.7 Natural Killer (NK) ................................................................................... 16
6 Formao de granulomas.............................................................................. 17
7 Principais antgenos de Mycobacterium bovis reconhecidos na resposta
imune ............................................................................................................... 19
8 Mtodos de diagnstico para tuberculose bovina ......................................... 21
8.1 Identificao do agente .............................................................................. 24
8.1.2 Diagnstico molecular ............................................................................. 25
8.1.2.1 Reconhecimento de cido nuclico ...................................................... 25
8.1.3 Diagnsticos imunolgicos ..................................................................... 27
8.1.3.1 Reao de Hipersensibilidade .............................................................. 27
8.1.3.2 Testes laboratoriais baseados nos componentes do sangue (clulas,
molculas e soro) ............................................................................................. 30
9 Vacinas contra Mycobacterium tuberculosis ................................................ 33
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9.1 Vacinas com microrganismos vivos (BCG, M. tuberculosis) ...................... 34
9.2 Vacinas de DNA e subunidades ................................................................. 35
9.3 Vacinas com vetores vivos ......................................................................... 38
10 Objetivo ....................................................................................................... 38
10. Referncias Bibliogrficas .......................................................................... 39
CAPTULO 2- The use of MPT-51, BCG and Ag85 as antigen in an ELISA for
the diagnosis of bovine tuberculosis ................................................................. 68
CAPTULO 3- Bovinos tuberculosos, naturalmente infectados, apresentam
clulas TCD4+IL-4+ especficas preservando a produo de xido ntrico pelos
macrfagos....................................................................................................... 86
CAPTULO 4- Eficcia do antgeno MPT-51 recombinante na vacinao contra
Mycobacterium tuberculosis ........................................................................... 106
CAPTULO 5- CONSIDERAES FINAIS .................................................... 132
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LISTA DE ABREVIATURAS
Gama-Delta
72F Protena de fuso de 72 kDa
Ag85 Antgeno 85
BAAR Bacilo lcool cido Resistente
BCG Bacilo de Calmette e Gurin
CD Domnios de diferenciao cellular
CFP10 (Rv3874) Protena do filtrado de cultura de 10 kDa
CpG DNA cido desoxiribonuclico contendo citidina fosfato guanosina
CTLs Linfcito T CD8 citotxico
DNA cido desoxiribonucleico
DOT Tratamento diretamente observado
ELISA Ensaio Imunoenzimtico
GroES Rv3418c Malato Sintetase do Mycobacterium tuberculosis
ESAT-6, Antgeno de secreo primria de 6 kda
TNF- Fator de necrose tumoral-alfa
HIV Virus da Imunodeficincia Humana
HPLC Cromatografia lquida de alta performace
HSP Protena do choque trmico
IFN- Interferon-gama
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
IL Interleucina
IS 610 e 1087 Seqncia de insero IS6110 e IS1081,
KDa Kilodalton
LPS Lipopolissacardeo
LTB Enterotoxina lbil da Escherichia coli
MDR Multi Droga Resistente
MHC Molcula de Histocompatibilidade Principal
MPB64 Protena de M bovis de 64 kDa
MPB70 Protena de M bovis de 70 kDa
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MPB83 Protena de M bovis de 83 kDa
MPT-51 (Rv3803c) Protena de M tuberculosis 51
MPT64 Antgeno de M. tuberculosis
Mtb drrC Genes presentes no M. tuberculosis que codificam peptdeos
similares ao transportadores ABC
NK Natural killer
NO xido ntrico
NOS2 xido ntrico sintetase 2
O.D. Densidade ptica
OIE Organizao Internacional de Epizootias
OMS Organizao Mundial de Sade
PBMC Clulas mononucleares do sangue perifrico
PBS Salina Tamponada com Fosfato
PCR Reao da Polimerase em Cadeia
PPD-A Derivado de protena purificada de Mycobacterium avium
PPD-M Derivado de protena purificada de Mycobacterium bovis
RD-1 Regio de Diferena 1
rRNA cido Ribonuclico Ribossmico
SPSS Pacote de Anlise Estatstica para Cincias Sociais
TB MDR Tuberculose multi droga resistente
TB PNA FISH Fluorescncia de hibridizao in situ de peptdeo de cidos
nucleicos de M. tuberculosis
TB10.4 Antgeno de M. tuberculosis de 10.4 kDa
TB27.4 Antgeno de M. tuberculosis de 27.4 kDa
TCD4+ Linfcito T com marcador de superfcie CD4
TCD8+ Linfcito T com marcador de superfcie CD8
TCR Receptor de clula T
TGF- Fator transformador-beta de crescimento
Th Linfcito T helper
TPX Tireodoxine peroxidase
TTI Teste de Tuberculina Intradrmico
UFC Unidade formadora de colnia
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xi
TB XDR Tuberculose super droga resistente
WHO Organizao Mundial de Sade
http://www.euro.who.int/
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RESUMO
Nesta tese foram avaliados vrios aspectos da tuberculose bovina e do
Mycobacterium bovis. Primeiro caracterizou-se a imunogenicidade do MPT-51,
Ag 85 e BCG em ensaio imunoenzimtico, onde foram utilizadas 208 amostras
de soro de animais TTI positivo e 54 amostras de bovinos negativos. O BCG-M.
bovis e o Ag 85 foram fortemente reconhecidos pelos anticorpos dos bovinos
naturalmente infectados. Segundo correlaciounou-se o estado clnico do animal
positividade ao teste intradrmico, com a produo especfica de IL-4 por
linfcitos TCD4+ e TCD8+ e a produo de xido ntrico por macrfagos do
sangue perifrico de bovinos naturalmente infectados com tuberculose. Foi
observado que os bovinos TTI positivos apresentaram clulas CD4+IL-4+
especficas para extrato protico de M. bovis-BCG. Observaram-se altos nveis
basais de linfcitos TCD8+IL-4+ independente de estmulos nos animais
reatores. Quando as culturas foram estimuladas com extrato protico de BCG,
no houve diferena quanto produo de NO. Os bovinos tuberculosos,
naturalmente infectados, apresentaram clulas TCD4+IL4+ especficas para M.
bovis-BCG, preservando a produo de NO pelos macrfagos. Finalmente, a
imunogenicidade do MPT-51 como vacina de sub-unidade protica foi avaliada
em camundongos BALB/c, testando o MPT-51 com dois adjuvantes, o
incompleto de Freund e o CpG DNA. Os camundongos foram imunizados e
posteriormente desafiados com M. tuberculosis. No pulmo, a imunizao com
antgeno rMPT-51 a 20g/ml + adjuvantes de Freund Incompleto e CpG DNA
induziu aumento da migrao de clulas TCD5+IFN- + especficas para o MPT-
51 para o local da infeco, quando comparados com o controle (p
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ABSTRACT
Several aspects of the bovine tuberculosis were analyzed in this study. The
immunogenicity of recombinant MPT-51 (rMPT-51), Ag-85 and M. bovis-BCG
were characterized in an immunosorbent assay, where 208 serum samples
from positive intradermal tuberculin test (ITT) animals and 54 serum samples
from ITT negative animals where analyzed. M. bovis-BCG and Ag-85 were
strongly recognized by antibodies from naturally infected cattle. Additionally, the
clinical status of the animals were correlated with the ITT positivity, with the
specific production of IL-4 by TCD4 and TCD8 positive lymphocytes, and with
nitric oxide (NO) production by macrophages from naturally tuberculosis
infected bovine peripheral blood. ITT positive animals showed TCD4+IL4+ cells
specific to M. bovis-BCG extract. High background levels of TCD8+IL-4+
lymphocytes were observed in ITT positive animals independent of the stimuli.
When cell cultures where stimulated with M. bovis-BCG protein extract, there
was no observed difference in NO production between the groups. Naturally
tuberculosis infected bovine presented TCD4+IL4+ cells specific for M. bovis-
BCG and a preserved NO production. Finnally, the immunogenicity of rMPT-51
use as a proteic sub-unit vaccine was evaluated in BALB/c mice, with two
different adjuvants, incomplete Freund and CpG DNA. For this, mice were
immunized and challenged with M. tuberculosis. Immunization with rMPT-51
antigen and either adjuvant induced, in the lungs, a migration increase of
TCD5+IFN + cells specific for rMPT-51, when compared to controls (P
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CAPTULO 1- CONSIDERAES GERAIS
1 INTRODUO
A tuberculose uma das mais antigas enfermidades conhecidas e
at os dias atuais continua ameaando a sade do homem e dos animais.
Sabe-se que um tero da populao mundial est infectada pelo Micobacterium
tuberculosis e estima-se que a cada ano ocorre oito milhes de novos casos,
causando 3 milhes de mortes em humanos e infeco de 300 milhes de
bovinos.
Para controle e erradicao dessa enfermidade dos rebanhos
bovinos mundiais e diminuio do risco potencial sade humana, so
necessrios diagnsticos e mtodos preventivos eficazes alm de abate dos
animais reagentes. Nesse sentido, requer-se um amplo conhecimento da
resposta imunolgica ao Mycobacterium bovis, pois, a forma pela qual a
resposta imune est envolvida no progresso da doena crucial para a
compreenso da tuberculose bovina.
A partir do estudo da resposta imune tuberculose e principalmente
devido falta de praticidade e elevado nmero de resultados falso-positivo e
falso-negativo do teste intradrmico de tuberculina (TTI), pesquisamos um teste
baseado na resposta imune humoral. O ensaio imunoenzimtico utilizou trs
antgenos para aplicao no diagnstico da tuberculose bovina.
Uma vez que a proteo infeco realizada principalmente pela
resposta imune celular, estudou-se tambm as clulas TCD4+IL-4+ e TCD8+IL-
4+ e a produo de xido ntrico pelas clulas mononucleares para
compreenso da funo dessas clulas e molculas durante a enfermidade.
Entendendo-se a necessidade de controlar a tuberculose antes da
sua instalao nos indivduos realizou-se um protocolo de vacinao utilizando-
se uma subunidade protica, o MPT-51, adicionada a dois adjuvantes com o
propsito de avaliar o controle da infeco quando os camundongos eram
desafiados com Mycobacterium tuberculosis e com perspectivas de aplicar
esse protocolo de imunizao em bovinos e humanos no combate da
tuberculose nos animais e em humanos.
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2 Aspectos gerais sobre tuberculose bovina
A tuberculose bovina (TB bovina) uma enfermidade crnica
caracterizada por leses granulomatosas, associadas principalmente ao trato
respiratrio e aos linfonodos (NEILL et al., 1994).
A doena causada por Mycobacterium bovis (M. bovis) e possui
distribuio mundial, ocorrendo principalmente em pases em desenvolvimento
e em criaes intensivas, como em rebanho leiteiro. BELCHIOR (2001)
encontraram prevalncia geral de 5% de rebanhos positivos e 0,8% de animais
positivos para tuberculose bovina no estado de Minas Gerais. A maior
freqncia de casos de tuberculose bovina concentra-se na Amrica do Sul,
que tambm detm a maior populao bovina. Na Amrica Latina e Caribe
existem aproximadamente 300 milhes desses animais, dos quais 73,7% esto
alojados em reas com prevalncia de tuberculose maior do que 1%. Estima-se
que o Brasil e a Argentina juntos possuam 3,5 milhes de bovinos infectados
pelo bacilo da tuberculose, espalhados por todo o territrio, o que representa
quase 2% da populao existente nesta rea (KANTOR & RITACCO, 1994).
Atualmente j se encontra em execuo o Programa Nacional de
Controle e Erradicao de Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), cujo objetivo
diminuir o impacto negativo dessa zoonose e promover a competitividade da
pecuria nacional. J que de acordo com as notificaes oficiais, o pas ainda
mantm uma prevalncia mdia nacional de 1,3% (no perodo de 1989 a 1998).
No existem dados oficiais acerca da prevalncia da tuberculose em dias
atuais no Estado de Gois (LAGE et al., 2006).
Ao avaliar os principais fatores de risco associados tuberculose
bovina, GONALVES (1998) citou o confinamento de animais por longos
perodos e o intenso trnsito de bovinos para a compra e venda desses
animais.
O diagnstico dessa enfermidade pode ser feito in vivo pelo exame
clnico e o teste tuberculnico intradrmico; ou post-mortem por exames
histopatolgico e bacteriolgico, que incluem isolamento do agente por tcnicas
padres e avanadas (HAAGSMA, 1995). At o presente, segundo o Manual
Tcnico do PNCEBT (2006) o diagnstico padro para a tuberculose bovina o
TTI, cujo princpio avaliar a resposta de hipersensibilidade tardia mediada por
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linfcitos T sensibilizados, em animais previamente expostos ao bacilo da
tuberculose.
A principal via de infeco dos bovinos adultos atravs da inalao
de partculas de aerosol e a via digestiva o principal mecanismo de
contaminao dos bezerros (LAGE et al., 2006), no entanto, o processo da
exposio ao bacilo e o desenvolvimento da doena no esto totalmente
esclarecidos (POLLOCK, et al., 2006).
Quando a via de infeco ocorre pelo trato respiratrio, por meio de
aerossis, o pulmo o rgo primeiramente atingido, assim como os
linfonodos regionais. Na primo infeco pulmonar os bacilos se alojam no
tecido, promovendo uma reao inflamatria, denominada pneumonia. A
doena se instala basicamente nos pulmes, formando ndulos caseosos, de
tamanhos variados, atingindo todo o parnquima pulmonar e formando leses
cavitrias. Quando a resistncia orgnica do animal baixa ocorre
disseminao do agente pelo parnquima pulmonar, por via area ou pela via
hematgena, alcanando os linfonodos regionais e formando metstases em
outros rgos. No foco inicial ocorre infiltrao celular, necrose de caseificao
e circunscrio da leso, que pode evoluir para resoluo e calcificao. J
quando a penetrao do bacilo pela via digestiva, a leso inicial se d no stio
de entrada, principalmente nos linfonodos farngeos e mesentricos.
Entretanto, pode atingir praticamente todos os rgos quando ocorre a
generalizao do processo (PRITCHARD, 1988; OREILLY & DABORN, 1995).
Aps a infeco por M. bovis observa-se na leso uma infiltrao de
clulas mononucleares, incluindo macrfagos e linfcitos (CASSIDY et al
2001). Sendo que os macrfagos so as primeiras clulas onde ocorre o
crescimento intracelular de M. bovis, seguido pela deposio do bacilo na
superfcie respiratria, posteriormente outras clulas do sistema imune inato e
adquirido so envolvidas (NEILL et al., 2001).
Quanto associao da resposta imune e o desenvolvimento da
enfermidade, o comeo da resposta imune celular est associado com o
desenvolvimento de leses visveis. A progresso de leso est associada com
o elevado potencial de transmisso da doena (CASSIDY et al., 1998;
McCORRY et al., 2005).
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3 Aspectos gerais da resposta imune em tuberculose bovina
A resposta imune ao M. bovis uma complexa interao entre
patgeno-hospedeiro e o conhecimento detalhado dessa interao, nos
bovinos naturalmente infectados, limitado. Alguns estudos da resposta imune
tm sido realizados em modelos experimentais (BOOM, 1996; POLLOCK et al.,
2001).
Estudos imunohistolgicos de leses granulomatosas em bovinos,
causados pela infeco experimental de M. bovis, indicam que as clulas T so
as primeiras clulas envolvidas nessa reao (CASSIDY et al., 2001).
POLLOCK et al. (2001) afirmaram que a resposta imune mediada por clulas
importante tanto nos animais natural quanto nos experimentalmente infectados.
Segundo POLLOCK et al. (1996), todos os tipos de linfcitos T ( ,
CD4 e CD8) esto envolvidos na resposta imune anti-micobacteriana nos
bovinos. Os autores acrescentaram ainda que a importncia da defesa contra
patgenos intracelulares estabelecida na resposta imune Th1 que
caracterizada pela produo de IFN- , cuja presena essencial para a
ativao da funo microbicida de macrfagos.
Nos bovinos infectados com M. bovis, as clulas TCD4+ de memria
so a populao celular dominante na produo de IFN- , que levam ativao
de macrfagos com capacidade anti-microbiana. As clulas TCD8+ de memria
tambm tm sido identificadas como importantes produtoras de IFN- (HOPE et
al., 2000; SMYTH et al., 2001), alm de estarem envolvidas na lise de clulas
infectadas (LIBANA et al., 2000; SKINNER et al., 2003). Segundo SMYTH et
al. (2001), as clulas T so tambm fonte potencial de IFN- , apesar de
menor liberao quando comparadas aos linfcitos TCD4+. Entretanto h
evidncias de que os linfcitos T faam uma ligao entre o sistema imune
inato e o adaptativo (KENNEDY et al., 2002). Segundo POLLOCK et al. (1996)
e CASSIDY et al. (2001), os linfcitos T- esto presentes no estgio inicial da
infeco e no incio da formao da leso granulomatosa.
Apesar do predomnio da resposta imune celular, existem pesquisas
importantes quanto participao da resposta imune humoral (FIFIS et al.,
1994; LYASHCHENKO et al., 1998). Segundo LYASHCHENKO et al. (1998), a
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resposta imune humoral de bovinos experimentalmente infectados, envolve
mltiplos antgenos que so reconhecidos pelos animais em diferentes estgios
da doena.
As citocinas exercem papel importante na determinao da resposta
imune infeco. MOSMANN & COFFMAN (1989) afirmaram existir o
paradigma da resposta Th1/Th2. Segundo os autores, a diferena no perfil das
citocinas deve-se induo de diferentes aspectos do sistema imune. Nesse
sentido, tem sido postulado que durante os estgios iniciais de infeces
micobacterianas, h a predominncia da resposta imune mediada por clulas;
no entanto, com o progresso da doena pode ser observada uma alterao da
relao Th1/Th2, que se associa a uma fase onde a produo de anticorpos
predominante (Figura 1) (RITACCO et al., 1991).
Figura 1: Representao dinmica da resposta imune de bovinos ao
M. bovis. A resposta imune mediada por clulas desenvolve-se inicialmente e a humoral apresenta-se com o aumento da carga bacilar.
Fonte: Adaptado de POLOCK & NEILL (2002).
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4 Resposta imune inata infeco por Mycobacterium bovis
Aps o bacilo entrar e ultrapassar as barreiras fsicas do trato
respiratrio, os macrfagos alveolares fagocitam as micobactrias e
geralmente as destroem, dependendo da capacidade microbicida intrnseca
dos fagcitos do hospedeiro e ainda dos fatores de virulncia dos bacilos
ingeridos. As micobactrias que escapam da destruio intracelular se
multiplicaro, causando a ruptura dos macrfagos. Esse evento culminar com
a infiltrao de clulas inflamatrias no tecido pulmonar e crescimento de
bacilos nos moncitos (FLINN et al., 2001; VAN CREVEL et al., 2002).
A endocitose dos bacilos da tuberculose envolve muitos receptores
que podem se ligar a micobactria no opsonizada ou reconhecer opsoninas
na superfcie do bacilo (SCHLESINGER, 1993; HIRSCH et al., 1994; ADEREM
& UNDERHILL, 1999)
Os receptores Toll-like so mediadores da imunidade inata
filogeneticamente conservados essenciais para o reconhecimento
micobacteriano em macrfagos e clulas dendrticas, que tem funo de
ativao dos fagcitos. Entretanto, a interao entre Mycobacterium sp. e
macrfagos complexa (FLYNN et al., 2001). Estudos in vitro usando TLR2
e/ou TLR4 expressos em macrfagos, relataram evidncias de que as clulas
so ativadas via tais receptores independente da CD14 (MEANS et al., 1999).
Vrios componentes micobacterianos, incluindo AraLAM (complexo
micolilarabinogalactan-peptidioglicano) e lipidio total de micobacteria podem
ativar macrfagos a produzirem TNF- dependente de TLR2 (ADEREM &
UNDERHILL et al., 1999).
Os macrfagos e clulas dendrticas so clulas envolvidas na
resposta imune inata micobactria. Essas so as clulas responsveis pela
apresentao do antgeno e assim para o incio da imunidade adaptativa. As
primeiras molculas de MHC II apresentam a protena micobacteriana para a
clula TCD4+ antgeno especfica. A molcula de MHC I apresenta para os
linfcitos TCD8+ antgeno especfica (MAZZACCARO et al.,1996; GELUK et al.,
2000; CHO et al., 2000).
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5 Resposta imune efetora infeco por Mycobacterium bovis
A resposta ao patgeno bacteriano intracelular, tal como ocorre com
o Mycobacterium sp. denominada de hipersensibilidade tardia ou
hipesensibilidade do tipo IV (DANNENBERG, 1993).
Os macrfagos interagem com a bactria e se ativam produzindo
quimiocinas e citocinas, as quais tm potencial para controlar infeces
micobacterianas. A partir dessa interao o bacilo pode ser destrudo e
eliminado do hospedeiro ou ainda tornar-se quiescente. Nesse caso, poder
levar ao desenvolvimento de tuberculose ativa ou ser reativado da dormncia
em estgios futuros oportunos (WELSH et al., 2005).
As clulas T respondem aos antgenos micobacterianos com
expanso clonal, levando ao desenvolvimento de populaes celulares de
memria (MONAGAHAN et al., 1994). A partir dessa etapa ocorre a liberao
de citocinas tais como interleucina-2 (IL-2), TNF- , interleucina-12 (IL-12) e
IFN- que so responsveis pela ativao de macrfagos (WOOD et al., 1991;
ONULLAIN et al., 1997).
Acreditava-se que somente os peptdeos derivados de protenas de
Mycobacterium sp, eram apresentados s clulas T, em molculas de
complexo de histocopatibilidade principal de classe I ou II (MHC I ou II).
Entretanto, tem-se demonstrado que estruturas no proticas como lipdeos
micobacterianos, podem ser reconhecidos pelas clulas T de humanos em
molculas de MHC no polimrficas como CD1 (PORCELLI et al., 1992;
ROSAT et al., 1999). Essa via diferente para apresentao de antgenos
micobacterianos, ainda necessita de maiores estudos nos bovinos.
A imunidade mediada por clulas de grande importncia no
controle de patgenos intracelulares. Na tuberculose, a funo de proteo tem
sido atribuda s clulas TCD4+, TCD8+ e T (FLYNN & CHAN, 2001). Esse
papel tem sido comprovado a partir de experimentos em camundongos, nos
quais se observou que animais em que linfcitos TCD4+ e TCD8+ eram
ausentes apresentam maior susceptveis infeco por M. tuberculosis
(BEHAR et al., 1999; CARUSO et al., 1999; FLYNN & CHAN, 2001).
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8
Quanto cintica dos linfcitos na resposta imune celular ao M.
bovis, em animais experimentalmente infectados, existe o envolvimento, a
princpio de clulas T , posteriormente linfcitos TCD4+ e nas infeces
crnicas h participao proeminente do linfcito TCD8+ (POLLOCK et al.,
1996). Em camundongos, uma semana aps a infeco com M. tuberculosis, o
nmero de linfcitos TCD4+ e TCD8+ aumenta nos linfonodos associados ao
pulmo, demonstrando que as duas clulas envolvidas devem atuar nas fases
iniciais da infeco (FLYNN & CHAN, 2001).
JOARDAR et al. (2002) estudaram a dinmica da resposta immune
mediada por clulas tuberculose bovina e observaram que a resposta maior
entre a 9, e 20, semanas ps-infeco. A presena inicial das clulas T foi
seguida pela predominncia de TCD4+ e finalmente pelas TCD8+. A atividade
efetora dos linfcitos foi observada durante a 9 e 20 semanas. J a resposta
citotxica foi evidente na 12 semana ps-infeco. A cintica das citocinas
liberadas quando avaliadas in vitro tais como a IL-2 e IFN- elevaram-se entre
a 9 e 20 semanas ps-infeco.
Quanto a quantidade de bacilos necessria para causar leso,
McCORRY et al. (2005) estudaram dois grupos de bovinos, sendo um grupo de
bezerros infectado com elevada dose (106 CFU) e outro grupo com baixa dose
(104CFU) de M. bovis. Decorridos 6 meses aps a infeco, os animais foram
sacrificados e submetidos ao exame post-mortem. Para cada animal foi
atribudo um escore, baseado na existncia das alteraes patolgicas. Os
animais infectados com altas doses tiveram maior escore e desses, 18% foram
positivos para M. bovis quando realizou-se swab nasal e posterior isolamento
do microorganismo.
A caracterizao do desenvolvimento de alteraes patolgicas nos
bovinos foi estudada por CASSIDY et al. (1999), infectando bovinos jovens
experimentalmente com M. bovis. Vrios parmetros de desenvolvimento da
resposta imune celular em diferentes estgios da doena foram observados.
Segundo os autores, a produo do IFN- foi anterior ao desenvolvimento da
resposta proliferativa dos linfcitos e a primeira leso granulomatosa foi
evidente aps a resposta proliferativa dos linfcitos.
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5.1 Subpopulaes de clulas T envolvidas na tuberculose bovina
Estudos direcionados tuberculose humana e em modelos murinos
de infeco tm indicado que diversas subpopulaes de clulas T apresentam
funes importantes, na resposta imune anti-micobacteriana (POLLOCK et al.,
2001). As clulas TCD4+, MHC II restritas, tem sido consideradas clulas chave
na resposta imune micobacteriana. Entretanto, as clulas TCD8+ e MHC I
restritas, tambm apresentaram funo protetora contra esse tipo de
microorganismos (BEHAR et al., 1999). Os linfcitos TCD4+ e TCD8+
expressam receptores de antgenos (KUNG, 1987). Nenhuma dessas
subpopulaes de linfcitos T poder repor a funo anti-micobacteriana de
outras (CARUSO et al., 1999).
Nos bovinos, tem sido designada uma terceira subpopulao de
linfcitos, o T , que desempenha importante funo de proteo contra
agentes mycobacterianos (VESOSKI et al., 2004). Esses linfcitos so CD3+ e
expressam TCR (BRENNER et al., 1986; KUNG, 1987).
5.1.1 Linfcitos TCD4+
Segundo LIBANA et al. (1999), as clulas TCD4+ de bovinos
infectados por M. bovis proliferam na presena de antgenos micobacterianos.
Essas clulas produzem citocinas, que ativam macrfagos infectados para
destruir a bactria intracelular.
Outra possvel funo dos linfcitos TCD4+ a sua atividade citoltica
contra moncitos infectados com micobactrias, sendo esta j observada em
humanos e em camundongos (TAN et al., 1997). Contudo, esse mecanismo
efetor ainda no conclusivo com dados obtidos a partir de estudo nos bovinos
(LIBANA et al., 2000). SKINNER et al. (2003) avaliaram a atividade citoltica
dos linfcitos T na defesa contra infeco na tuberculose bovina. Os autores
observaram que as clulas citolticas possuem habilidade especfica para lisar
macrfagos infectados com M. bovis, entretanto, os principais linfcitos com tal
atividade foram os TCD8+.
Quanto avaliao da ativao de clulas TCD4+ em infeco
tuberculosa, sabe-se que em camundongos, as clulas TCD4+ que esto
presentes no local da infeco por M. tuberculosis, possuem um fentipo
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ativado, definido pelo aumento da expresso de CD25, CD44 e CD69 e
diminuio da expresso de CD62L (ANDERSEN & SMELEGAARD, 2000
JUNQUEIRA-KIPNIS et al., 2005). Nos bovinos, em resposta ao derivado de
protena purificada (PPD), clulas TCD4+ infectadas por M. bovis apresentam
tambm CD25 e CD44 e diminuem a expresso de CD62L.
5.1.2 Linfcitos TCD8+
Assim como os linfcitos TCD4+, os TCD8+ de bovinos infectados
por M. bovis proliferam significativamente na presena de antgenos
micobacterianos, entretanto, essas clulas respondem no apenas ao M. bovis
intacto, mas tambm ao seu antgeno solvel (LIBANA et al., 1999).
A principal funo efetora dos linfcitos TCD8+ a lise de clulas
infectadas, o que resulta na liberao do patgeno no ambiente extra-celular.
Posteriormente, a bactria poder ser apreendida e destruda por macrfagos
recm ativados (KAUFMANN, 1998).
Estudos realizados por VILLARREAL-RAMOS et al. (2003)
demonstraram que as clulas TCD8+ desempenham relevante funo na
resposta ao M. bovis, na secreo de IFN- . Essa citocina crucial na ativao
de macrfagos e este por sua vez tem ao importante no desfecho da
tuberculose, ou seja, na formao do granuloma e no controle do crescimento
micobacteriano (VILLARREAL-RAMOS et al., 2003).
Estudos realizados por DELIBERO et al. (1988) demonstraram que
as clulas T CD8+ podem induzir atividade tuberculosttica nos macrfagos da
medula ssea. O papel funcional dos CTLs na imunidade contra infeces
intracelulares o de matar as clulas infectadas via granulo-exocitose, que
pode liberar uma ou mais molculas efetoras com a capacidade de matar
diretamente o patgeno microbiano intracelular (STENGER & MODLIN, 1999);
ou seja, as clulas TCD8+ liberam granulosimas dentro dos macrfagos
infectados seguido de perforina, que poder destruir a clula hospedeira e
posteriormente matar a micobactria (STENGER et al., 1998). Entretanto,
durante este mecanismo, mais macrfagos so ativados, induzindo maior
atividade ltica do T CD8+. Nesse aspecto, VILLARREAL-RAMOS et al. (2003)
alertaram quanto ao efeito deletrio dessas clulas, pois o aumento da carga
bacteriana poder levar destruio tecidual.
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5.1.3 Linfcitos T
Os linfcitos T so proporcionalmente os mais numerosos dentre
as clulas mononucleares do sangue perifrico dos ruminantes (SMYTH et al.,
2001). Constituem aproximadamente 75% da populao circulante em animais
jovens e 40% nos animais adultos (MACKAY & HEIN, 1989). Em humanos
essas clulas T se constituem apenas 7% e nos camundongos 2 a 3% da
papulao total (ITOHARA et al., 1989).
Uma caracterstica importante desse TCR ( ) em ruminantes que
a maioria desses receptores expressa apenas uma molcula de superfcie,
identificada como WC1 (MORRISON & DAVIS, 1991; WJINGAARD et al.,
1992) a qual no expressa em linfcitos T de humanos e camundongos
(SMYTH et al., 2001). Segundo MACHUGH et al. (1997) quando alguns
linfcitos T so WC1 negativos, expressam CD2 e CD8 e apresentam o
fentipo WC12CD21CD81/2. A poro extracelular dessa molcula possui 11
domnios ricos em cistena (WJINGAARD et al., 1992).
H indcios de que WC1 esteja envolvido no recrutamento de clulas
para a formao do granuloma em tuberculose (LIBANA et al., 1999;
POLLOCK et al., 2001). Apesar da precisa funo do WC1 e at mesmo dos
linfcitos T ainda no estarem totalmente estudados, sabe-se que
desempenham funo citotxica em resposta a mitgenos, parasitas, antgenos
bacterianos e virais (CHIODINI & DAVIS, 1992; AMADORI et al., 1995;
COLLINS et al, 1996), dentre essas funes, inclui-se a defesa contra M. bovis
(POLLOCK et al., 1996; SMYTH et al., 2001).
Estudo realizado por SMYTH et al., (2001), comparou a resposta in
vitro de linfcitos T e T ao M. bovis. Neste, observou-se que 24 horas aps
a exposio de antgenos de M. bovis, a maioria das clulas T de animais
infectados tornou-se altamente ativada, comparado a baixa proporo de
ativao da populao de linfcitos T . No estudo da cintica dessa resposta,
as clulas T estiveram ativadas durante os sete dias de cultivo, enquanto os
T declinaram durante esse perodo. Alm disso, em comparao com o que
foi encontrado para as clulas T CD4+, observou-se que os antgenos de M.
bovis induzem proliferao celular, mas relativamente pouca liberao de
IFN- pelas clulas T WC11 purificadas.
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RHODES et al. (2001) descreveram a resposta proliferativa e o
efeito imunomodulatrio do linfcito T a antgenos proticos de M. bovis.
Segundo os autores, a proliferao de clulas T na presena de antgenos
como PPD-A M, PPD-M, ESAT-6, 6 kDa, Ag85, lipoprotena glicosilada 38
kDa, MPB64, MPB70, MPB83, HSP16.1, HSP65, HSP70, produziu elevados
nveis de IFN- e TGF- , entretanto, no produziu IL-2. Os autores
acrescentaram ainda que ocorra supresso do efeito do T quando h
resposta simultnea de outras clulas como o linfcito T pois, com a
depleo do T houve aumento da proliferao antgeno-especfico em um
quarto dos animais testados.
Para comprovar a funo das clulas T WC1+ na infeco
micobacteriana de bovinos, KENNEDY et al. (2002) descreveram um modelo
de tuberculose bovina in vivo, onde depletaram essas clulas tanto do sangue
circulante, quanto do trato respiratrio. Apesar das clulas T WC1+ tornarem-
se significativamente ativadas (CD25) na circulao, no foi observado efeito
sobre a progresso da doena. Alm disso, essas clulas podem iniciar a
resposta immune ao M. bovis, contribuindo direta e indiretamente para a
resposta imune em Th1. POLLOCK et al. (1996) infectaram bovinos com M.
bovis e avaliaram a cintica do T WC1+. Os autores observaram que aps a
infeco, o nmero dessas clulas aumentou proporcionalmente dentre os
subtipos de linfcitos T. Somente aps a mudana inicial dos T WC1+ houve
evidncias do envolvimento das clulas T , devido a mudana na razo de
clulas CD4:CD8.
5.2 Principais citocinas e outras clulas envolvidas na resposta imune ao
M. bovis
5.2.1 IFN-
Na resposta celular ao M. bovis, as clulas apresentadoras de
antgenos especficos liberam citocinas (DANDREA et al., 1992) as quais
induzem as clulas NK e linfcitos T a produzir IFN- (TRINCHIERI, 1993). A
presena dessas citocinas direcionam a diferenciao dos linfcitos TCD4+ com
fentipo Th0 em clulas Th1, inibindo a diferenciao e funo efetora de Th2,
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ou seja, direciona a resposta dominante em Th1 (MAGGI et al., 1992) e
aumenta a atividade bactericida dos fagcitos (FLESCH & KAUFMANN 1987).
Os linfcitos TCD4+-Th1, TCD8+, T contribuem para a produo de
IFN , que requerido no processo de ativao de macrfagos (FLYNN &
CHAN, 2001). O IFN- um componente indispensvel na resposta
antimicrobiana uma vez que camundongos com deleo gnica para o IFN- ,
ou para os seus receptores so altamente susceptveis a infeces
micobacterianas (COOPER et al., 1993; OTTENHOF et al., 1998).
DAZ et al. (1999) testaram a habilidade de protenas antignicas, de
M. bovis em estimular a produo de IFN- pelas clulas mononucleares do
sangue perifrico de bovinos, apresentando infeco tuberculosa. Os autores
concluram que a induo da produo dessa citocina aumenta com o
progresso da doena, coincidindo com a alta reatividade de PPD no TTI. Outra
caracterstica importante quanto produo do IFN- na tuberculose bovina foi
que a citocina antgeno independente no estgio anrgico da doena.
AMENI & TIBBO (2002) avaliaram a cintica do IFN- em resposta
vacinao com o BCG e observaram que essa citocina apresenta uma fase de
ascenso imediatamente aps a vacinao, seguida de declnio nas semanas
seguintes vacinao para apresentar posterior equilbrio. Essa mudana na
concentrao deve ser atribuda funo de proteo contra infeco com o M.
bovis em bovinos.
DENIS & BUDDLE (2005) avaliaram o impacto do IFN- sobre a
interao entre M. bovis e macrfagos bovinos. Os autores observaram que os
macrfagos secretaram pouco xido ntrico (NO), TNF-alfa, IL-1 beta e IL-12,
quando infectados com o BCG. Quando os macrfagos previamente tratados
com M. bovis virulento foram infectados, houve liberao de elevados nveis de
mediadores pr-inflamatrios, mas no houve modificao na replicao
bacterina. Esse fato s foi observado quando os macrfagos foram
previamente tratados com IFN- e lipopolissacarideo (LPS). A virulncia da
micobactria um fator determinante na liberao de citocinas pelos
macrfagos, o IFN- amplifica a liberao de citocinas pelos macrfagos e a
induo da apoptose depende da liberao de TNF- .
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5.2.2 TNF-
O TNF- tem mltiplas funes na resposta imune tuberculose,
sendo requerido no controle da mesma. Essa citocina um importante
componente para ativao de macrfagos. O TNF- juntamente com o IFN-
induz a expresso de xido ntrico sintetase induzvel (NOS2) (FLESCH &
KAUFMANN, 1990).
Estudos realizados por MOHAN et al. (2001) demonstraram o papel
dessa citocina na formao do granuloma da tuberculose e outras doenas
micobacterianas. Utilizando modelos de tuberculose em camundongos, os
autores constataram que na ausncia do receptor para TNF- , a formao do
granuloma ocorreu de forma desorganizada e com poucos macrfagos
epiteliides ativados. Os autores concluram que essa citocina afeta a migrao
celular para o local da leso e exerce influncia na expresso de adeso
molecular, o que afeta a formao funcional de granulomas no tecido infectado.
Entretanto os autores no explicaram os mecanismos pelos quais o TNF-
promove a formao e manuteno do granuloma.
Quanto ao efeito inflamatrio deletrio dessa citocina, estudo
realizado por BEKKER et al. (2000) utilizando BCG recombinante, indicou que
elevados nveis de TNF- causam inflamao destrutiva. Entretanto,
experimentos realizados em camundongos mostram que a presena do TNF-
era necessrio para limitar a enfermidade no pulmo. O exame histolgico
mostrou que o pulmo dos camundongos TNF- neutralizados exibiu leso
severa com granulomas desorganizados e inflitrao celular difusa. Portanto,
essa citocina contribuiu para limitar a resposta patolgica.
5.2.3 Interleucina-2 (IL-2)
A interleucina-2 uma citocina secretada pelas clulas T auxiliares
ativadas. Essa citocina modula a proliferao de clulas T auxiliares, T
citotxicas, clulas B ativadas e NK (SAPAROV et al., 1999), e exerce o papel
de fator de crescimento para clula T, o que implica numa estimulao agonista
da resposta immune. A manuteno da tolerncia perifrica pela sobrevivncia
e funo reguladora das clulas T CD25+CD4+ tambm funo desta citocina
(FEHERVARI et al., 2006).
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Na resposta tuberculose bovina, a IL-2 exerce uma importante
funo. Segundo estudos realizados por ALDWELL et al. (1997) demonstrou-se
que essa citocina secretada em bovinos experimentalmente infectados.
YOUNG et al. (2002) demonstraram que a sua secreo biologicamente
ativada por BCG recombinante aumentou a sua capacidade em induzir e
manter resposta immune do tipo 1 em camundongos BALB/c.
5.2.4 Interleucina-4 (IL-4)
Diferentes tipos de clulas podem secretar IL-4, tais como: clulas T,
eosinfilos, basfilos, NK e clulas apresentadoras de antgenos. Tem-se
demonstrado que a IL-4 est envolvida no direcionamento da resposta Th2
(MIETHKE et al., 1988). Na tuberculose, h possibilidade dessa citocina ter
funo reguladora ou anti-inflamatria, juntamente com a IL-10 e TGF- . Na
infeco de bovinos com M. bovis, h aumento dos nveis de IFN- e de IL-4
(SEDDON & MASON, 1999). Existe uma correlao positiva quanto a extenso
da leso pulmonar e a produo de IL-4 pelas PBMC estimuladas com PPD
(WEDLOCK et al., 2003).
5.2.5 Interleucina-12 (IL-12)
Acredita-se que a IL-12 tenha um importante papel na imunidade
mediada por clulas. A citocina age principalmente em infeces intracelulares
primrias pela ao sobre as clulas T e NK, direcionando a resposta imune
Th1, por meio da produo de IFN- (SANO et al., 1999).
XING & SANTOSUOSSO (2000) avaliaram a funo da IL-12, em
um modelo de infeco celular in vitro, na sua capacidade de induzir TNF- e
NO pelos macrfagos. Segundo os autores a IL-12 sozinha induz pouca
secreo de TNF- e NO. Entretanto, a IL-12 quando associada micobactria
causa a induo de um aumento sinrgico da liberao de TNF e NO. Portanto,
a IL-12 pode ativar macrfagos durante a infeco intracelular.
5.2.6 Macrfagos
A funo do macrfago na tuberculose complexa, pois, ao mesmo
tempo em que essas clulas so as preferidas pelas micobactrias
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intracelulares, eles tambm so as clulas efetoras no controle e destruio
desses patgenos (POLLOCK & NEILL, 2002).
M. bovis pode crescer relativamente livre dentro do macrfago
bovino (ALDWELL et al., 1996; LIBANA et al., 2000). Especialmente em
tuberculose humana, consideram-se tambm que os bacilos so eliminados por
meio de uma resposta inata, ou seja, resposta que envolve mecanismos como
pH do lisossomo, hidrolases lisossomial, peptdeos bactericidas e superxido
dos macrfagos (RUSSEL, 1999).
Segundo ARMSTRONG & HART (1975), o vacolo fagoctico
contendo micobactria metabolicamente ativa escapa da fuso com o
lisossomo, sendo essa caracterstica um mecanismo de evaso e
sobrevivncia desse organismo. Os autores acrescentam ainda que a interao
macrfago-micobactria define os eventos subseqentes da resposta ao M.
bovis.
As clulas mononucleares produzem xido ntrico (NO), uma
molcula efetora do sistema imune inato, que um dos componentes de
defesa contra a tuberculose, inibindo a replicao do bacilo Mycobacterium sp.
(MacMICKING et al., 1997; NATHAN, 1992; NATHAN & SHILOH, 2000). O
xido ntrico um radical livre, gasoso, inorgnico, incolor, que possui sete
eltrons de nitrognio e oito de oxignio, tendo um eltron desemparelhado
(BECKMAN & KOPPENOL, 1996). O estmulo da produo de NO por
macrfagos e subseqente gerao de nitrognio reativo so mecanismos
potentes para a morte micobacteriana (DENIS, 1991; FLESCH et al., 1991;
CHAN et al., 1995; MacMICKING et al., 1997, HIBBS, 1988).
Aps os mecanismos efetores da resposta imune inata, M. bovis
torna-se estvel dentro do macrfago, produzem e secretam antgenos, os
quais podem ser apresentados s clulas T.
5.2.7 Natural Killer
Apesar do papel fundamental dos macrfagos, outras clulas, tais
como as natural killer e neutrfilos, podem estar envolvidas na resposta imune,
principalmente na fase inicial da infeco por M. bovis (POLLOCK & NEILL,
2002).
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A clula NK um tipo de linfcito, grande e granular do sistema
imune inato. Essas clulas esto envolvidas na resposta inicial a uma
variedade patgenos intracelulares, produzindo IFN- , bem como, lisando
clulas alvo especficas, na ausncia do antgeno (HAMERMAN et al., 2005).
Essas clulas podem produzir IFN- e lisar clulas alvos infectadas
com micobactria (YONEDA & ELLNER, 1998; JUNQUEIRA KIPNIS et al.,
2004). Entretanto, so escassos os conhecimentos acerca do envolvimento
dessas clulas na tuberculose bovina. Estudos recentes realizados por
ENDSLEY et al. (2006) demonstraram que as clulas CD3--CD8--CD11B- do
sangue perifrico de bovinos tiveram a atividade celular NK. Alm disso,
quando as clulas NK purificadas de bovinos so ativadas pela IL-12 e
cultivadas com macrfagos autlogos, infectados com BCG, a replicao
bacteriana foi reduzida.
DENIS et al. (2006) estudaram o impacto das clulas NK sobre a
resistncia da tuberculose bovina. Segundo os autores, a habilidade de NK em
reduzir o crescimento bacteriano independe da liberao de IFN- . Os
autores observaram tambm que a NK aumenta a produo de interleucina-12
e de xido ntrico pelos macrfagos infectados com M. bovis. Outro aspecto
relevante que os autores constataram foi quanto dependncia do contato
direto entre NK e macrfagos infectados na reduo do crescimento
micobacteriano.
6 Formao de granulomas
A resposta imume mediada por clulas na tuberculose bovina
desencadeia a formao de granuloma, que considerado um indicativo de
tuberculose (WANGOO et al., 2005).
O mecanismo que desencadeia a formao do granuloma ocorre da
seguinte forma: na resposta imune ao M. bovis, aps exposio ao antgeno,
o TNF- pr-estocado, liberado pelos mastcitos, recruta neutrfilos e
moncitos circulantes. Ao mesmo tempo, o IFN- produzido pela NK e T ,
ativam macrfagos e clulas dendrticas. Essas clulas liberam quimiocinas e
mais TNF, os quais alteram a microcirculao local e facilitam o trfego celular
para o tecido. Aps um perodo ainda no determinado as clulas dendrticas
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carregadas com antgenos migram para o linfonodo iniciando a resposta
linfoctica. Essas clulas dendrticas produzem interleucina-12 (IL-12) e
apresentam o antgeno para as clulas TCD4+ virgens. Sobre a influncia da
IL-12 as TCD4+ virgens diferenciam-se em Th1. Estas por sua vez, secretam
IL-2, que leva a expanso clonal da clula Th1 antgeno especfica. Cerca de
10 a 20 dias aps a exposio ao antgeno do M. bovis as clulas TCD4+
ativadas vo para o local onde ocorreu a alterao da microcirculao. Caso a
fonte do antgeno no tenha sido erradicada, a inflamao persiste. A interao
entre TH1CD4+ e macrfagos ativados leva produo de IFN- e TNF que
resulta na maturao de mais macrfagos, formando uma leso endurecida e
tumefeita, o granuloma ou tubrculo (WANGOO et al., 2005).
O influxo de moncito/macrfago e clulas T est associado ao
mecanismo de morte ou inibio da micobactria. Em muitos casos a
progresso da doena retida neste estgio, no entanto, o bacilo presente no
tubrculo pode no ser completamente eliminado (STEAD, 1967; VAN
CREVEL et al., 2002).
Quando a formao desse granuloma progride, o seu centro torna-
se necrtico, devido falta de irrigao sangunea e diminuio da oxigenao.
Esse processo classificado como hipersensibilidade do tipo tardia, sendo
associado ao incio efetivo no controle do crescimento da micobactria
(DANNENBERG, 1991).
PALMER et al. (1999) analisaram as clulas presentes nos
granulomas de bovinos experimentalmente infectados por M. bovis e
observaram um agregado de macrfagos com poucos neutrfilos, quatro
semanas aps a inoculao. Decorridas seis a oito semanas, encontrou-se
necrose da rea central do granuloma, presena de fibrose, numerosos
macrfagos, plasmcitos, clulas gigantes multinucleadas e neutrfilos.
CHAVEZ et al. (2001) encontraram elevado nvel da expresso da protena
NRAMP1, que est relacionada com a exploso oxidativa dos fagcitos, alm
da presena de macrfagos epiteliides e clulas gigantes multinucleadas no
granuloma de bovinos infectados por M. bovis.
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Figura 2 - Principais tipos celulares que formam o granuloma da tuberculose.
Fonte: Adaptado de GOLDSBY et al. (2000)
7 Principais antgenos de Mycobacterium bovis reconhecidos na resposta
imune
A purificao e caracterizao de protenas antignicas so
essenciais para a compreenso dos mecanismos patognicos e a resposta
imune contra a M. bovis (ALITO et al., 2003).
O BCG foi obtido a partir de uma cepa patognica de
Mycobacterium bovis, aps 230 passagens seriadas em laboratrio. Devido
baixa virulncia dessa cepa, tem-se utilizado por longo perodo como vacina
contra a tuberculose em humanos (DOHERTY & ANDERSEN, 2002; SKEIKY &
SADOFF, 2006) e experimentalmente em animais (BUDDLE et al., 1995).
As protenas do complexo 85 so produzidas por M. tuberculosis em
abundncia. Tem sido demonstrado que proporcionam imunogenicidade em
coelhos infectados com M. tuberculosis. A importncia e relevncia destas
protenas se devem, provavelmente, ao seu papel na sntese da parede celular
da micobactria. Esta sntese deve-se a sua atividade micolil transferase. De
-
20
modo igual, demonstrou-se que quando os moncitos humanos so infectados
por M. tuberculosis, estas micobactrias secretam o complexo 85, isto poderia
ser vantajoso para desenvolver uma vacina, visto que a liberao destas
protenas de suma importncia para o processamento intracelular deste
patgeno via MHCII (WHO, 2004; HAUEBNER, 1994; VORDERMEIER et al.,
2006; SABLE et al., 2007). Em bovinos esse antgeno recombinante tem sido
estudado com o propsito de aplicao no diagnstico (LILENBAUM et al.,
2001).
O MPT-51 (Rv3803c) um antgeno recombinante de 27 KDa
codificado na regio FbpC1 adjacente ao gene FbpA do M. tuberculosis
tambm denominado como Ag85 D ou MPB 51 (NAGAI et al., 1991;
RAMBUKKANA et al., 1993). Apesar de possuir 40% de homologia ao
complexo Ag 85, o antgeno MPT-51 no possui atividade micolil transferase
(RINKE de WIT et al., 1993; WILSON et al., 2003). O MPT51 um antgeno
protico, tambm expresso em outras micobactrias como M. leprae (RINKE
de WIT et al., 1993), M. avium (OHARA et al. 1997a) e M. bovis BCG (OHARA
et al. 1997b). Ele se liga fibronectina podendo estar envolvido na virulncia
do bacilo (KITAURA et al., 2000).
Outros antgenos proticos de M. bovis (12, 19, 22a, 22b, 24, 25,
30, 32, 39 e 70 kDa) foram avaliados quanto capacidade de estimular a
resposta imune celular, por meio da proliferao celular e secreo de IFN-
Observando esta resposta nos bovinos infectados por 36 meses, notou-se
que todos os antgenos foram reconhecidos pela resposta imune celular, mas a
magnitude dessa resposta variou entre os animais (FIFIS et al.,1994).
Algumas protenas como ESAT-6, CFP10, 85B, MPB70 e novos
antgenos, tais como o TPX e TRB-B, foram obtidas atravs de cromatografia
de troca inica e identificadas por meio de eletroforese em gel bidimensional,
sendo considerados antgenos dominantes do M. bovis, pois foram
reconhecidas pelo sistema imune celular dos bovinos. As protenas de baixo
peso molecular como a ESAT-6 e CFP10 desempenham importante papel na
resposta imune celular. As fraes proticas com elevada atividade
linfoproliferativa podem ser caracterizadas e associadas tanto a antgenos j
identificados quanto a novos antgenos proticos presentes no M. bovis (ALITO
et al., 2003).
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21
RHODES et al. (2000) estudaram a cintica da clula T em resposta
a um painel de antgenos micobacterianos do M. bovis (PPD-M, PPD-A, ESAT-
6, Ag85, 38kD, MPB64, MPB70, MPB83, hsp16.1, hsp65, e hsp70). Os autores
observaram aumento da proliferao de linfcitos antgeno-especfico, bem
como aumento na secreo de IFN- e IL-2. A resposta ao PPD-M e ESAT-6 foi
mais expressiva durante o perodo estudado, entretanto a resposta a todos os
outros antgenos foi mais varivel, sugerindo que o coquetel de antgenos
mais aplicvel do que um antgeno individual para o imunodiagnstico.
Com o objetivo de diferenciar bovinos infectados por M. bovis e os
vacinados com BCG, BUDDLE et al. (1999) avaliaram a secreo de IFN- ,
estimulado pelas protenas antigncias MPB59, MPB64, MPB70 e ESAT-6. A
resposta ao MPB59, MPB64 e MPB70 foi significativamente maior em ambos
os grupos, portanto esses antgenos no so capazes de discriminar animais
vacinados de tuberculosos. Dentre todos os antgenos testados, apenas o
ESAT-6 diferenciou BCG vacinados dos bovinos infectados com M. bovis.
POLLOCK et al. (2003) realizou o teste intradrmico bovino para diagnstico de
tuberculose, utilizando o ESAT-6. Esse antgeno foi reconhecido pelas clulas
T e estimulou alta produo de IFN- . Apesar da resposta do ESAT-6 ao teste
intradrmico ter sido detectada tardiamente (96 h), esse antgeno demonstrou
sensibilidade de 86% e especificidade de 100%, sendo, portanto, um antgeno
em potencial para diagnstico in vivo para tuberculose bovina.
8 Mtodos de diagnstico para tuberculose bovina
O principal mtodo de diagnstico nos animais baseado na reao
de hipersensibilidade, por meio do derivado de protena purificada (PPD), cuja
reao avaliada por meio de teste de tuberculina intradrmico. Apesar desse
teste ser adotado em muitos pases como mtodo padro na identificao da
tuberculose animal, muitos estudos tm apontado falhas, pois so relatados
tanto resultados falso negativos como falso positivos. Portanto, novos testes
que permitam discriminar os animais infectados so necessrios.
Em alguns pases que implementaram o programa de controle e
erradicao da tuberculose bovina, os animais foram classificados em
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22
reagentes ou no reagentes, utilizando algumas das variantes do teste de
tuberculina intradrmica (ANON, 2004). Esse teste preconizado pela
Organizao Internacional de Epizootias (OIE) para o comrcio internacional de
bovinos.
Segundo RUA-DOMENECH et al. (2006), devido a alguns fatores
como a dinmica da transmisso da tuberculose entre os animais, o tamanho
das leses que inicialmente so microscpicas e o tempo que o animal leva
para montar uma resposta imune detectvel, nenhum mtodo totalmente
eficaz para detectar todos os animais infectados. Conseqentemente, tem-se
desenvolvidos testes com fins de diagnsticos, tais como a dosagem do IFN-
produzido especificamente antgenos micobacterianos, avaliao da
proliferao de linfcitos e polarizao florescente. Tambm a deteco do M.
bovis nas leses dos animais abatidos facilitariam a confirmao do diagnstico
obtido pelo TTI (COUSINS & FLORESSON, 2005).
Existem diversas tcnicas de diagnstico aplicadas para detectar a
tuberculose. O diagnstico pr-clnico pode ser realizado por meio de uso de
testes da imunidade celular e humoral, alm de tecnologias moleculares (RUA-
DOMENECH, 2006). Para avaliao do melhor mtodo a ser aplicado na
deteco da tuberculose bovina, WATRELOT-VIRIEUX et al (2006) utilizaram
trs mtodos: a colorao Ziehl-Neelsen, fluorescncia com auramina e imuno-
histoquimica, usando anticorpo policlonal anti-M. bovis. A tcnica de imuno-
histoquimica foi mais sensvel ao detectar maior nmero de bovinos positivos.
Apesar de existir diversas pesquisas acerca de vrios mtodos de
diagnstico da tuberculose, o melhor mtodo a ser aplicado depender de
vrios fatores, dentre eles o tipo de tuberculose, a fase da enfermidade, alm
da situao endmica de cada regio. No quadro 1 so apresentados algumas
espcies animais que so infectadas por tuberculose e os testes mais
usualmente aplicados.
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QUADRO 1- Testes para diagnstico de tuberculose causada por M. bovis em algumas espcies animais e no homem.
Espcie animal Teste Sensibilidade Especificidade
Bovinos Teste simples de tuberculina Intradrmico
68%-95% 96%-99%
Teste comparativo de tuberculina intradrmico
No estimado >99%
IFN- BOVIGAM 76%-93,6% 92,2%-98,1%
Exame ps-morte No estimado No estimado
Cultura bacteriolgica No estimado No estimado
ELISA (Ag: ESAT-6, MTSA-10, MPTS1, MPT63, MPB59, MPB64, MPB70, MPB83
57,1% No estimado
ELISA (Ag: ESAT-6, MPB70) 98,6% ESAT-6 96,8% MPB70
98,5% ESAT-6 90,1% MPB70
Imunocromatografia (Ag MPB70) 83% 99,4%
Polarizao fluorescente 79% 99,8%
Bfalos Comparativo com tuberculina intradrmico na prega caudal
No estimado No estimado
Tuberculina intradrmico 95,3% 97,7%
IFN- BOVIGAM No estimado No estimado
Camelos Simples com tuberculina intradrmico
100% 100%
Comparativo com tuberculina intradrmico
87,5% 100%
ELISA (PPD bovino e avirio) 100% 100%
Ces Teste de tuberculina simples No estimado No estimado
Elefantes Teste de tuberculina intradrmico Pouca Pouca
Imunoblot (Ag de sonicado de M. bovis)
No estimado No estimado
IFN- No estimado No estimado
ELISA (multiantgenos) No estimado No estimado
Caprinos Teste simples de tuberculina intradrmico
100% 100%
Teste comparativo de tuberculina intradrmico
83,7% 100%
IFN- No estimado No estimado
ELISA (Ag de PPD bovino) 54,9% 88%
Humanos Teste de tuberculina intradrmico 75%-90% 70%-100%
IFN- (Quantiferon) 82%-89% No estimado
Sunos Teste comparativo de tuberculina intradrmico
100% 100%
IFN- No estimado No estimado
Fonte: Adaptado de COUSINS & FLORISSON (2005)
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24
8.1 Identificao do agente
Para a identificao do M. bovis so necessrios cuidados
especficos com as amostras. No transporte dos espcimes clnicos para o
laboratrio deve-se tomar algumas precaues, tais como uso de recipientes
plsticos selados, para prevenir o vazamento desse material para o meio
exterior, preservar o material e evitar contaminao. A associao de
transporte areo internacional possui um regulamento para embarcao de
espcimes de carter zoontico. Os epcimes clnicos devem ser refrigerados
ou congelados para retardar o crescimento do Mycobacterium sp. Em
condies onde o uso da refrigerao no for possvel, pode-se adicionar o
cido brico, na concentrao de 0,5%, como um agente bacteriosttico,
entretanto, essa substncia garante a preservao por perodos limitados de
apenas uma semana (OIE, 2004).
A presena do Mycobacterium sp. em espcimes clnicos e ps-
morte dos animais pode ser demonstrada por meio de esfregaos e posterior
colorao, cultivo e isolamento do microorganismo. Para o cultivo desse
bacilo, deve-se utilizar todo material devidamente esterilizado, pois o uso de
recipientes contendo micobactria ambiental pode resultar na falha no
processo de identificao, devido ao rpido crescimento das micobactrias
ambientais (CHIODINI et al., 1984).
Uma diferenciao importante quanto ao crescimento do M. bovis e
do M. tuberculosis quanto restrio do glicerol, cujo componente
necessrio para o M. tuberculosis, mas pode retardar o crescimento do M.
bovis. Portanto no preparo do meio para esta micobacteria deve-se substituir o
glicerol por piruvato (MOTA et al., 2001).
Os bacilos M. bovis podem ser demonstrados microscopicamente
por meio de esfregaos diretos de espcimes clnicos e preparados de
materiais teciduais. Quanto colorao pode-se aplicar a clssica Ziehl-
Neelsen e o cido fluorescente alm da tcnica de imunoperoxidase que tem
dado resultados satisfatrios (SELVAKUMAR et al., 2006).
O perodo mdio para o crescimento do M. bovis de trs a seis
semanas. As caractersticas do crescimento e a morfologia colonial podem
-
25
demonstrar um diagnstico presuntivo, entretanto a confirmao obtida por
meio de avaliao bioqumica (MILLER et al., 1997).
8.1.2 Diagnstico molecular
Atualmente, as tcnicas moleculares permitem a identificao das
espcies de micobactrias nas amostras cujos mtodos tradicionais de
identificao foram negativos (BARRN et al., 2006).
Dentre as tcnicas da biologia molecular encontra-se: a amplificao
e deteco de segmentos genticos espcie-especficos pelo PCR, o
sequenciamento gentico por PCR, pela tcnica de microarranjos do cido
desoxiribonucleico (DNA), tcnica da PCR aplicada para a deteco de
protena hsp65 (AGRANOFF et al., 2006).
Um teste j comercializado, mas ainda sob observao o TB PNA
FISH, que baseado na utilizao de sondas de peptdeos do cido nuclico,
que devido s suas caractersticas hidrofbicas, penetram a parede
micobacteriana e podem se ligar a regies selecionadas do 16S rRNA,
permitindo a diferenciao entre M. tuberculosis e outras micobacterias
(DALCOMO et al., 2004).
A tcnica de HPLC (Cromatografia Lquida de Alta performance) se
baseia no fato de que cada espcie de micobactria sintetiza um nico padro
de cidos miclicos na composio de sua parede celular (THIBERT &
LAPIERRE (1993). Entretanto, essa tcnica no diferencia M. tuberculosis de
M. bovis, apesar de diferenciar M. bovis BCG do complexo M. tuberculosis
(FLOYD et al., 1992).
8.1.2.1 Reconhecimento de cido nuclico
A reao da polimerase em cadeia (PCR) tem sido amplamente
empregada para a deteco do complexo M. tuberculosis em espcimes
clnicos, especialmente escarro, em pacientes humanos e mais recentemente
tem sido aplicada tambm no diagnstico da tuberculose nos animais
(ARAJO et al., 2005). A tcnica se baseia na habilidade de replicar ou
amplificar DNA sem proliferao biolgica do organismo portador de tal
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26
genoma. A reao da PCR pode ser realizada atravs da tcnica caseira ou
atravs de kits comerciais (KRITSKI et al., 2005).
J existe um nmero considervel de kits que podem ser utilizados
para deteco de bactrias do complexo M tuberculosis a fresco e em tecidos
fixados. Vrios oligonucleotideos indicadores tm sido usados, incluindo os que
amplificam seqncias de rRNA 16S-23S, seqncia de insero IS6110 e
IS1081, genes codificadores de protenas especficas para o complexo de M
tuberculosis, tal como MPB70, hsp65 e antgeno de 38 kDa. Os produtos
amplificados tm sido analisados por meio de hibridizao com sonda ou com
eletroforese em gel de agarose (NOREDHOEK et al., 1996).
Resultados falso-positivo e falso-negativo, particularmente em
espcimes contendo baixo nmero de bacilos, tm reduzido a acurcia do
PCR. Esse fato pode ser atribudo ao baixo nmero de cpias da seqncia no
genoma dos bacilos, combinado ainda pela baixa quantidade destes bacilos. A
variabilidade tem sido tambm atribuda ao mtodo de descontaminao, o
procedimento da extrao de DNA, tcnicas para a eliminao de enzimas
inibidoras da polimerase, controle interno e externo e procedimentos para a
preveno de contaminaes cruzadas (MILLER et al.2002; MILLER et al.,
1997).
Segundo ESPINOSA et al. (1998), as tcnicas de anlises de DNA
promovem uma avaliao mais rpida e com melhor acurcia quando
comparados aos mtodos bioqumicos, no processo de diferenciao das
micobacterioses. No entanto, ZANINI et al. (1998) afirmaram existir algumas
dificuldades na extrao de DNA cromossmico, que seriam responsveis
pelos entraves observados na aplicao dos mtodos moleculares para a
deteco de Mycobacterium sp., ressaltando a excessiva resistncia da parede
celular das micobactrias lise ou rompimentos por agentes externos.
CEDENO et al. (2005) extraram o DNA de 60 amostras de muco
nasal de bovinos, coletaram de trs diferentes propriedades no Panam,
localizadas em uma rea endmica para M. bovis. Os autores encontraram
65% das amostras positivas para a micobactria por meio da PCR.
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27
8.1.3 Diagnsticos imunolgicos
8.1.3.1 Reao de Hipersensibilidade
O extrato de glicerol de cultura lquida pura de bacilos foi descoberto
por Robert Koch em 1890. Sofreu refinamento ao longo de vrios anos, sendo
desenvolvido um derivado de protena purificada (PPD). O organismo
cultivado em meio lquido sinttico, tratado pelo calor, filtrado, concentrado por
precipitao, lavado e posteriormente redissolvido dentro de uma preparao
estril, livre de micobactria (MONAGHAN et al., 1994).
A tuberculina bovina similar a tuberculina aviria e humana, as
quais so obtidas de bacilos de M. avium supesp. Avium e M. bovis AN5,
respectivamente. Quando a tuberculina bovina injetada na pele do animal no
sensibilizado no ocorre resposta inflamatria no local da aplicao. Entretanto,
se a tuberculina injetada em animal cujo sistema imune j foi sensibilizado
por meio de uma infeco por micobactria, ou pela exposio a outros
patgenos micobacterianos, haver a formao de uma reao inflamatria no
local, onde nota-se maior intensidade entre 48-72 horas aps a injeo (LAGE
et al., 2006; POLLOCK et al., 2003). Essa reao de hipersensibilidade tardia
mediada pela populao de clulas T sensibilizadas (THORNS & MORRIS,
1983).
O teste de tuberculina realizado por meio de injeo intradrmica
de PPD de M. bovis e a subseqente deteco de reao de hipersensibilidade
tardia (ANON, 2004). Esse tipo de reao o mtodo de escolha para os
programas de controle e erradicao da tuberculose bovina, em vrios pases
(MONAGHAN et al., 1994). H basicamente duas formas de aplicao do teste
intradrmico nos animais: o teste intradrmico simples ou nico e o teste de
tuberculina comparado, que realiza a comparao entre a reao tuberculina
aviria e a reao tuberculina bovina (RUA-DOMENECH et al., 2006).
O teste intradrmico simples pode ser aplicado na regio cervical
mdia ou na prega caudal (ANON, 2004). O princpio do teste intradrmico
simples para bovinos similar ao teste cutneo para diagnstico de
tuberculose nos humanos (SNIDER, 1982).
-
28
O teste comparativo intradrmico requer mais tempo para a
aplicao do que o simples, pois ele se aplica injeo simultnea de tuberculina
bovina e aviria, uma ao lado da outra, na regio cervical. A interpretao
desse teste baseada na observao da maior resposta tuberculina bovina,
nos animais infectados pelo M. bovis, por outro lado, animais infectados com
outras micobactrias desenvolvem maior reao a tuberculina aviria
(POLLOCK et al., 2003). No Brasil, a positividade do teste estabelecida
quando a diferena do aumento da dobra da pele provocada pela inoculao
da tuberculina PPD bovina e da tuberculina PPD aviria, aps 72 h da
aplicao maior ou igual a 4 mm (LAGE et al., 2006).
O teste de tuberculina o nico teste para a tuberculose bovina
prescrito pela OIE, alm disso, ele utilizado em diferentes pases. Por
exemplo, na Austrlia utiliza-se com maior freqncia o teste na prega caudal
usando dose elevada de tuberculina, ao passo que o teste de tuberculina
comparativo raramente usado. Situao contrria ocorre em pases
europeus, onde o simples teste de tuberculina usando PPD bovino raramente
usado e na Repblica da Irlanda e Gr Bretanha o teste de tuberculina
comparativo, aplicado no pescoo do animal usado rotineiramente. Portanto,
cada pas estabelece seu prprio protocolo para uso e interpretao do teste
de tuberculina, baseado nas circunstncias locais e requerimento de
programas.
Segundo WATRELOT-VIRIEUX et al. (2006), a cintica de
desenvolvimento da reao de hipersensibilidade tardia em bovinos infectados
pode ser identificada a partir de trs semanas ps-infeco, nesse perodo,
poder ser correlacionada com a deteco da resposta do IFN- antgeno
especfico.
SNIDER (1982) cita alguns fatores que podem influenciar em
resultados falso-negativos e falso-positivos no teste de tuberculina em bovinos,
dentre esses fatores destacam-se: os relacionados ao prprio animal, tais
como a aplicao do teste logo aps um prvio teste de tuberculina, aplicao
do teste logo aps a infeco pela tuberculose, anergia, co-infeco com
micobacterioses ambientais, vacinao contra M. avium sp., Paratuberculosis,
infeco concomitante por vrus, stress de transporte e nutricional; os advindos
da tuberculina utilizada, sobretudo quanto ao uso de produtos sub-potentes e
-
29
finalmente aqueles relacionados ao mtodo de administrao, principalmente
quanto aos erros devido inexperincia e falta de ateno do aplicador,
dificuldades durante a aplicao e pobre qualidade do equipamento usado para
a aplicao da tuberculina nos animais.
Em algumas situaes, os animais so reagentes, porm no se
encontram leses visveis. RUA-DOMENECH et al. (2006) relataram que este
fenmeno pode ocorrer quando os animais encontram-se nos estgios iniciais
da infeco pelo M. bovis ou quando os animais foram infectados pelo M.
bovis, porm sem manifestao da doena, principalmente quando os bacilos
esto latentes; ou at mesmo animais no infectados expostos a antgenos
micobacterianos ambientais que induzem a reao cruzada com a tuberculina
bovina ou a outros antgenos de M. bovis.
Outro mtodo de avaliao da reao de hipersensibilidade tardia
nos animais portadores de tuberculose o uso do antgeno ESAT-6. Esse
antgeno oferece a vantagem de possuir distribuio limitada entre as espcies
de micobacteria, conseqentemente, possui pouca ou nenhuma reao
cruzada (POLLOCK & ANDERSEN, 1997). POLLOCK et al. (2003) realizaram
o teste intradrico bovino para diagnstico de tuberculose, utilizando o ESAT-6.
Apesar da resposta do ESAT-6 ao teste intradrmico ter sido detectada
tardiamente (96 h) e necessitar de dose maior, comparada ao PPD, esse
antgeno demonstrou sensibilidade de 86% e especificidade de 100%, sendo,
portanto um antgeno em potencial para diagnstico in vivo para tuberculose
bovina. AAGAARD et al. (2006) testaram antgenos como o ESAT-6, CFP10,
PE13, PE5, MPB70, TB10.4 e TB27.4 com potencial de diagnstico nos
rebanhos de bovinos da Irlanda do Norte, Mxico e Argentina. Em todos os
pases testados, o ESAT-6 e o CFP10 foram superiores no diagnstico da
tuberculose. A maior sensibilidade do teste intradrmico do grupo reagente,
combinada com a maior especificidade do grupo livre de tuberculose, indicou
que 85 % dos animais infectados e no infectados podem ser diagnosticados,
baseado na resposta a estes dois antgenos.
-
30
8.1.3.2 Testes laboratoriais baseados nos componentes do sangue (clulas,
molculas e soro)
a) Proliferao de linfcitos e produo de citocinas
Devido funo desempenhada por essas subpopulaes de
linfcitos durante a infeco de tuberculose, as mesmas podem ser usadas
como parmetro de avaliao da resposta imune a essa enfermidade e
conseqentemente como um meio de diagnstico, nos animais e no homem.
Dois aspectos so importantes na responsividade das clulas T na infeco de
tuberculose. O primeiro seria a descoberta do antgeno dominante, ou seja, o
que capaz de ativar maior quantidade de clulas T e discriminao dentre as
populaes desses linfcitos (POLLOCK et al., 2001). Pesquisas tem
apontados alguns antgenos presentes no M. bovis, e que so capazes de
causar maior responsividade nos linfcitos T, sendo, portanto molculas
candidatas a diagnstico, tais como o MPB70, MPB64 (LIGHTBODY et al.,
1998), ESAT-6 e CFP10 (FIFIS et al., 1994).
Quando um animal infectado por M. bovis, as clulas T
respondem aos antgenos micobacterianos, sob expanso clonal levando ao
desenvolvimento de clulas de memria (POLOCK et al., 2001). Segundo
LIBANA et al., (1999) as clulas TCD4+ e TCD8+ de bovinos infectados por M.
bovis proliferam-se significativamente na presena de antgenos
micobacterianos.
O IFN- uma citocina predominantemente liberada pelas clulas T
aps estimulao antignica. Alm disso, essa molcula est envolvida na
imunidade a infeces micobacterianas (POLLOCK et al., 2005; BAROJA &
CEUPPENS, 1987). Essas caractersticas do IFN- fizeram com que WOOD et
al. (1990) avaliassem experimentalmente o IFN- , por meio da incubao do
sangue fresco com PPD de M. bovis. Assim como o teste intradrmico, o
princpio do teste a deteco da resposta imune mediada por clulas do
hospedeiro contra a infeco causada pelo M. bovis (POLOCK et al., (2005).
Outra caracterstica similar de ambos os testes, que comparam a resposta
imune celular pela estimulao com antgenos de M. bovis e M avium. A partir
-
31
de uma a quatro semanas de infeco, as clulas T do sangue perifrico de
bovinos liberam in vitro quantidades mensurveis de IFN- , quando estimulado
por tuberculina bovina ou antgenos similar ao M. bovis. Caso o animal esteja
infectado por M avium ou outra micobactria ambiental, a produo dessa
citocina ser maior quando for incubada com a tuberculina aviria (WOOD &
JONES, 2001).
O teste do IFN- realizado in vitro em dois estgios. No primeiro o
sangue heparinizado distribuido em duplicatas. As amostras so incubadas
por 28h a 37C na presena de antgenos, principalmente PPD bovino ou o
avirio, alm do controle negativo. Aps 16 a 24 horas de incubao, retira-se
o sobrenadante. No segundo estgio, quantifica-se a produo do IFN- por
meio de ELISA de captura, utilizando um kit comercial (RUA-DOMENECH et
al., 2006). Este teste utiliza como antgenos tuberculina bovina e aviria. O kit
patentiado com o nome comercial de BOVIGAM. Tem-se utilizado kit similar
para o diagnstico de tuberculose em cabras, ovelhas, bfalo africano e
teoricamente pode ser aplicado em toda famlia bovidae. O teste do
BOVIGAM no diretamente aplicado a outros mamferos, mas o princpio
deste teste pode ser adaptado para o diagnstico da tuberculose em humanos
(QuantiFERON -TB, Cellestis Ltd, Austrlia) (CONNELL et al., 2006;
BRITTON et al., 2005).
O estudo em larga escala da avaliao do IFN- foi conduzido na
Austrlia por WOOD et al. (1991). Os autores testaram 6000 bovinos e bfalos
de rebanhos infectados por M. bovis e observaram 125 animais positivos para
M. bovis na cultura de materiais de bipsia. Destes animais 93,6% foram
tambm positivos quando analisados pela tcnica do IFN- , comparado com
65,6% pelo teste intradrmico de tuberculina. Os resultados apresentaram
sensibilidade de 95,2% e especificidade de 96,3%, provando que essa tcnica
mais sensvel do que o teste de tuberculina intradrmico para o diagnstico
da tuberculose bovina.
A avaliao do IFN- tem sido testada mundialmente, a partir dos
estudos realizados na Austrlia. Na Irlanda 87,7% dos animais com culturas
positivas para M. bovis tiveram resultados positivos para o IFN- (MONAGHAN
et al., 1997). Nos Estados Unidos WHIIPPLE et al. (1995) relataram que a
-
32
sensibilidade do teste intradrmico de 80,4-84,4% e do IFN- variou entre
55,4-94,7%. Na Itlia, BUONAVOGLIA et al. (1995) demonstraram que a
avaliao da citocina mais sensvel do que o teste intradrmico nos animais
com leso sugestiva de tuberculose. Em estudo subseqente realizado por
DONDO et al. (1996) relataram que a sensibilidade e especificidade do IFN-
foi de 96,6% e 98%, respectivamente.
A partir de estudo experimental realizado por BUDDLE et al. (1995)
foi concludo que o IFN- capaz de detectar infeco por M. bovis 14 dias
aps a inoculao da micobactria nos animais. LILENBAUM et al. (1999)
observaram que o IFN- pode detectar mais precocemente os animais
tuberculosos em mdia 60 a 120 dias do que o teste de tuberculina. Segundo
WOOD & JONES (2001) isso deve ser a explicao para o aumento aparente
da sensibilidade, comparado com o teste intradrmico e a relativa maior
proporo de IFN- positivo e intradrmico negativo em animais infectados pelo
M. bovis.
No Brasil, LILENBAUM et al. (1999) realizaram uma comparao
entre o teste intradrmico de tuberculina e a avaliao do IFN- de bovinos. Um
total de 1632 de animais foram avaliados pelo teste intradrmico cervical.
Dentre esses animais 220 foram selecionados por representar grupo de alto
risco e testados com o teste de IFN- , sendo que 207 apresentaram reao
significativa para o teste. Nesse grupo selecionado 126 animais (57,3%) foram
reativos ao IFN- , e 106 (48.2%) apresentaram reao positiva para
tuberculina. SOPP et al. (2006) afirmaram que a avaliao do IFN- pode
discriminar bovinos vacinados por BCG de infectados por M. bovis.
b) Anticorpos
A resposta tuberculose nos animais no incio da infeco
predominantemente celular. Com o progresso da doena, h maior resposta
imune humoral (WATERS et al., 2006; POLOCK et al., 2005; WELSH et al.,
2005; POLLOCK & NEILL, 2002). Uma das desvantagens do diagnstico por
meio da tuberculina intradrmica nos estgios avanados da doena que os
animais falham em responder, sendo chamados de anrgicos ao TTI. Esses
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animais, entretanto, mantm os bacilos circulando nos rebanhos. Os animais
anrgicos podem ser detectados por meio sorolgico, mais especificamente
pela tcnica de ELISA (YEARSLEY et al., 1998).
Os testes para deteco de anticorpos especficos para a
tuberculose so semelhantes para os animais e os humanos (FIFIS et al.
1992). Especialmente para bovinos, a incluso de antgenos soro dominantes
como o MPB70 e MPB83 tem aumentado a especificidade, mas no resulta em
maior sensibilidade. Estudos realizados por THOM et al. (2004) mostraram que
a resposta dos animais anrgicos maior em relao aos anticorpos
especficos do que pelo teste intradrmico. Esse aumento correlacionado
com a severidade da doena, sendo que animais com a doena mais
generalizada apresentam maior ttulo de anticorpos (LYASHCHENKO et al.,
2004).
WATERS et al. (2006) avaliaram o soro de bovinos infectados por M.
bovis por sororeatividade a antgenos micobacterianos. A resposta ao MPB83
foi detectada em todos os animais, quatro semanas aps a inoculao. Outros
antgenos como o ESAT-6, CFP-10, e MPB70 foram menos reconhecidos. A
deteco da IgM especfica para MPB83 ocorreu antes da IgG.
Os testes para deteco de anticorpos so simples e no onerosos,
oferecendo uma alternativa para detectar animais que foram negativos ao TTI e
ao IFN- . Conseqentemente, os pases em desenvolvimento podem adotar os
testes sorolgicos nos programas de erradicao da tuberculose como uma
alternativa barata para deteco e remoo de animais em estados avanados
da doena de seus rebanhos (POLLOCK et al., 2005).
9 Vacinas contra Mycobacterium tuberculosis
Considerando a baixa eficcia da BCG na proteo da tuberculose
pulmonar em adolescentes e adultos h necessidade de nova vacina contra a
tuberculose, especialmente nos pases onde a prevalncia da enfermidade
elevada.
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9.1 Vacinas com microrganismos vivos (BCG, M.tuberculosis)
As vacinas compostas de microrganismos vivos so alternativas em
potencial, pois induzem resposta imunolgica celular e humoral. Alm disso,
no necessitam de adio de