artrosis: activación de autofagia para prevenir el daño articular

Artrosis: Activación de Autofagia para

prevenir el daño articular

Beatriz Caramés

Grupo de Biología del Cartílago, Reumatología-INIBIC

Cátedra Bioibérica de Ingenieria Tisular y Terapia Celular, 18 de Noviembre 2015 1

Ideas para recordar…

La artrosis (OA) es una patología de la articulación, caracterizada

por la destrucción del cartílago articular, la inflamación de la

membrana sinovial y el daño en el hueso subcondral=

discapacidad.

El envejecimiento es uno de los factores de riesgo más

importantes en la OA, por lo que retrasar su aparición podría

reducir la aparición de esta patología.

Un fallo en los mecanismos de homeostasis celular (balance

síntesis/degradación) es el evento más temprano que precede a la

degeneración del cartílago articular en la OA.

No existen fármacos modificadores de la enfermedad.


Defecto autofagia= Proteínas dañadas/

acumulación organelas

Estrés oxidativo (producción ROS)

Disfunción Mitocondrial

Senescencia celular y muerte

Autofagia

Degradación / Síntesis MEC

Degradación del Cartílago

Artrosis (OA) Husa et al., Nature 2010 (with modifications)

La autofagia es esencial para el mantenimiento

de la homeostasis del cartílago

Envejecimiento

Factores Mecánicos

Factores Metabólicos

Inflamación


Autofagia: Mecanismo de reciclaje celular

Sistema de reciclaje para mantener la

función celular y la supervivencia.

Mecanismo de degradación celular

más importante a través de enzimas

lisosomales.

Se activa cuando hay estrés celular

(ayuno, organelas dañadas, proteínas

mutadas).

Las consecuencias de un defecto de

autofagia: Patologías relacionadas

con el envejecimiento.

Barranco, Nat Rev Rheumatol 2015

Mizushima and Komatsu, Cell 2011

Spilman et al, Plos One 2010

Inuzuka et al, Circulation 2009


Autofagia: Señalización y Regulación

Lotz and Caramés, Nat Rev Rheumatol, 2011

Atg genes

LC3-II

Atg genes

LC3I


Autofagia: Morfología

Autofagosomas

Autolisosomas

Mizushima at al., Cell 2010 Mouse embryonic fibroblasts (EM)


Normal OA

Be

cli

n1

L

C3

Aging

UL

K1

Sa

fra

nin

O

Normal OA

LC3-II

Beclin1

GAPDH

LC3-I

ULK1

GAPDH

Aging

ULK1: Autophagy initiator

Beclin1: Autophagy regulator

LC3: Autophagy executer Human cartilage

Human chondrocytes

La autofagia disminuye en el cartílago OA y envejecido


Disminución de autofagia en un modelo de OA B

ecli

n1

Sa

fra

nin

O

Sham 8 Weeks after surgery

UL

K1

Mouse knee joints (C57BL6/J)

2 months old (MMTL+MCL)


La autofagia basal está disminuida con la edad

Ratones transgénicos GFP-LC3 (C57Bl6/J)-Análisis confocal

6 meses/edad 28 meses/edad


9 mo-12 mo

La autofagia basal está disminuida con la edad


El daño en la articulación es posterior al defecto de autofagia


Disminución de autofagia: 9 mo-12 mo

La pérdida de función de autofagia regula dianas

relacionadas con el envejecimiento

Tabla 1. Proteínas moduladas (siAtg5 vs siCtrl)-iTRAQ-Condrocitos humanos


El daño mecánico disminuye la autofagia

Control Injury Control Injury Control Injury

24 hours 48 hours 96 hours

LC3-I

LC3-II

β-actin

ULK1 LC3 Beclin1

Co

ntr

ol

Inju

ry 4

8 h

ou

rs

Mature Bovine Explants (14-30 months, 8 mm diameter)

Injury Conditions: 40% Strain; 2 min preload; 0.5 seconds load


24 hours 48 hours 96 hours

Co

ntr

ol

Inju

ry

Rap

a 1

μM

Inju

ry+

Ra

pa

¿Tiene la activación farmacológica de autofagia un

efecto beneficioso sobre la OA?


La indución de autofagia previene el daño articular

Surgically-induced OA (MMTL+MCL; Glasson et al., Osteoarthritis Cartilage 2007)

Vehicle (DMSO); Rapamycin (1 mg/kg weight/day); Daily, intraperitoneal (i.p)-10 weeks

Safranin O staining; Histological Scoring System (Glasson et al., Osteoarthritis Cartilage 2010)

OA-Vehicle Control-Vehicle (10x)

Control-Rapa OA-Rapa

OA-Vehicle (40x)

OA-Rapa


Población heterogénea de ratones: diferentes cepas de ratones

BALB/CByJ x C57BL/6J F1 (CB6F1) females x CH3/HeJ x DBA/2J F1 (C3D2F1) males

Dosis de Rapamicina: 2.24 mg rapa/Kg peso/dia

Estudio Multicéntrico

Cohorte de estudio: 1960 ratones

Harrison et al. Nature, 2009


Normal OA leve

OA moderada OA Severa

Población heterogénea de ratones: Patología articular


La rapamicina reduce el daño articular

* p > 0.01

Control Rapamicina

15 ratones Control/ 15 ratones Rapamicina


National Institute of Aging Intervention Testing Program (NIA-ITP)

Objetivos:

Encontrar agentes que puedan incrementar la supervivencia/retrasar el

envejecimiento en ratones:

1. Para entender los mecanismos que controlan el envejecimiento.

2. Para desarrollar farmacos que retrasen el envejecimiento y las enfermedades

relacionadas con el envejecimiento en humanos.

Compound Results

Aspirin Increased Lifespan

Nitroflurbiprofen Increased Lifespan

Nordihydroguaiaretic acid

Caffeic acid phenethyl ester

Enalapril

Rapamycin Increased Lifespan

Simvastatin No increased lifespan

Resveratrol No increased lifespan

Oxaloacetic acid


La diabetes provoca daño articular que se previene

inhibiendo mTOR con Rapamicina


Glucosamina activa autofagia en condrocitos

LC3-II

Control GlcN 0.1 GlcN 1 GlcN 2.5 GlcN 5 GlcN 10

24 hours

mM

LC3-I

GADPH

8 hours 24 hours

Control 9.82 ± 1.95 11.82 ± 2.32

GlcN 10 mM 40.91 ± 3.02* 46.87 ± 2.40*


Glucosamine Hydrochloride

* p < 0.01

GlcN 250 mg/kg weight/day

(ip/gavage administration) - 7 days

GFP-LC3 mice (6 mo)

** p < 0.05

Glucosamina activa autofagia en cartílago


Glucosamina induce autofagia a través de la

inhibición de Akt/FoxO y mTOR

p-FoxO3

p-rbS6

p-Akt

GAPDH

GAPDH

GAPDH

Control GlcN 10 mM

24 h

Condrocitos humanos

Protein of interest Control GlcN 10 mM

p-Akt 0.263 ± 0.046 0.098 ± 0.014*

pFoxO3 0.066 ± 0.019 0.010 ± 0.002*

prbS6 1.029 ± 0.180 0.277± 0.060*

GlcN Akt FoxO (active form)

p-mTOR

p-rbS6

p-FoxO (inactive form)

* p < 0.05


Identificación de nuevas moléculas

mediante cribado de alto rendimiento (HTS)

Alteración de la homeostasis del cartílago articular:

- Incremento envejecimiento articular: moléculas anti-senescentes

- Disminución autofagia: moléculas pro-autofágicas

Colaboración Grupo BioFarma (USC)

HTS

Condrocitos

Humanos

Inducción

senescencia

Disminución

autofagia


BioFarma Chemical Libraries

Caramés et al, Arthritis Rheum, 2010, 2012, 2013, 2015

Caramés et al, Annals Rheum Dis, 2012

López de Figueroa et al, Arthritis Rheum, 2015

Ribeiro et al, Osteoarthritis Cartilage, 2015

López de Figueroa et al (In preparation)

Ribeiro et al (In preparation)

OA

Terapéutica

La autofagia es esencial para el mantenimiento

de la homeostasis del cartílago

Defecto autofagia= Proteínas dañadas/

acumulación organelas

Estrés oxidativo (producción ROS)

Disfunción Mitocondrial

Senescencia celular y muerte

Autofagia

Síntesis / Degradación MEC


Envejecimiento

Factores Mecánicos

Factores Metabólicos

Inflamación

Dra. Beatriz Caramés

Paloma López de Figueroa

Madalena Ribeiro Uxía Nogueira

División de Reumatología

INIBIC-Hospital Universitario de A Coruña

Colaboradores Grupo de Biología del Cartílago

Agradecimientos

Dr. Francisco J. Blanco

Dr. Martin Lotz Dra. María Isabel Loza

Dr. Mohit Kapoor Dr. Carlos López Otín

Dr. Ron Heeren

INIBIC:

Plataforma Histomorfología Plataforma Proteómica

Plataforma Cultivos


Artrosis: Activación de Autofagia para

prevenir el daño articular

Beatriz Caramés

Grupo de Biología del Cartílago, Reumatología-INIBIC


artrosis: activación de autofagia para prevenir el daño articular

Health & Medicine