antracnosis causada por colletotrichum acutatum simmonds ......la antracnosis en el cultivo de la...

504

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

Antracnosis causada por Colletotrichum acutatumSimmonds en frutos de fresa en los estados

Lara y Trujillo, Venezuela

Antracnosis caused by Colletotrichum acutatum Simmondsin strawberry fruit in Lara and Trujillo states, Venezuela

L. Urdaneta1, M.E. Sanabria2, D. Rodríguez2 y M. Pérez de Camacaro2

1Departamento Fitosanitario. Facultad de Agronomía. Universidaddel Zulia. Maracaibo, estado Zulia.2Postgrados de Agronomía, Universidad Centroccidental LisandroAlvarado, Barquisimeto, estado Lara.

Resumen

La antracnosis es la enfermedad de mayor importancia económica en elcultivo de la fresa en Venezuela, y es causada por un complejo de especies deColletotrichum (C. acutatum, C. gloeosporioides y C. fragarie). Con la finalidadde identificar la o las especies de éste género presentes en las zonas productorasde los estados Lara y Trujillo, se realizó la caracterización morfológica de cuaren-ta y siete aislamientos monospóricos de hojas, peciolos, sépalos, pedúnculos ypredominantemente de frutos. Cada uno de aislamientos del hongo fueronreactivados en agar agua acidificado a 25-27°C y 12 horas luz-oscuridad paracomprobar la formación de clamidosporas y en papa dextrosa agar acidificado(PDAA) bajo las mismas condiciones, para establecer sus características cultura-les y morfológicas. Las colonias en PDAA presentaron un micelio grisáceo cubier-to de masas de conidios de color salmón y en base a la forma predominante deéstas estructuras (fusiformes), su tamaño promedio (13,35 x 3,60 µm), la ausen-cia de setas en los acérvulos desarrollados sobre los frutos y a la formación declamidosporas marrones, en todos los aislamientos se identificó la especie C.acutatum. Frutos fisiológicamente maduros se inocularon, por inmersión en unasuspensión de 1.106 conidios.mL-1, presentándose en estos órganos síntomas ysignos similares a los observados en el campo, y de todos fue aislado e identificadoconsistentemente C. acutatum, lo que constituye el primer reporte del hongocausando la antracnosis de la fresa en los estados Lara y Trujillo de Venezuela.Palabras clave: morfología, hongos, frutos, necrosis, Fragaria x ananassa Duch.

Recibido el 25-7-2012 Aceptado el 27-9-2013Autor de correspondencia e-mail: [email protected]

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

505

Abstract

Anthracnose is a mayor disease of cultivated strawberry and is caused bycomplex species of Colletotrichum (C. acutatum, C. gloeosporioides and C.fragariae). In order to identify the species of this genus presented in the productionzones of Lara and Trujillo states, the morphological characterization was performedin forty-seven monosporic isolate leaves, petioles, sepals, peduncles and fruitsmainly. Each of fungal isolates were reactivated in acidified water agar at 25-27°C and 12 h light-dark to see the formation of chlamydospores and potatodextrose agar acidified (PDAA) under the same conditions, to establish theircultural and morphological characteristics. The colonies of PDAA had a grayishmycelium covered with salmon conidial masses and based on the predominantform of these structures (fusiform), their average size (13.35 x 3.60 µm), theabsence of setae on the acervuli developed on the fruits and the formation ofbrown chlamydospores on all isolates and were identified as C. acutatum.Physiologically mature fruits were inoculated by immersion in a suspension of1.106 conidia.mL-1, occurring in these organs symptoms and signs similar tothose observed in the field, and in all cases was isolated and identified consistentlyas C. acutatum, which is the first report of the fungus causing strawberryanthracnose in Lara and Trujillo states.Key words: morphology, fungus, fruits, necrosis, Fragaria x ananassa Duch

Introducción

La antracnosis en el cultivo dela fresa (Fragaria x ananassa Duch)produce daños en todos los órganos dela planta y es causada por tres espe-cies de Colletotrichum: C. fragariae A.N. Brooks; C. acutatum J. H.Simmonds y C. gloeosporioides (Penz.)Penz. & Sacc (Smith, 2008; Xie et al.,2010), éstos hongos pueden infectarlas hojas, pecíolos, flores y pedúnculos,donde se presentan manchas oscuras,circulares, inicialmente pequeñas, peroque pueden coalescer y formar lesio-nes de mayor tamaño (Ivanoviæ et al.,2007). De acuerdo a Smith (2007), C.fragariae y C. acutatum ocasionannecrosis que afectan rápidamente lasflores y parte de los pedúnculos, loscuales se tornan oscuros, secos y que-bradizos.

Introduction

Antracnosis in the strawberrycrop (Fragaria x ananassa Duch) pro-duces damages in the organs of theplant and is caused by three species ofColletotrichum: C. fragariae A. N.Brooks; C. acutatum J. H. Simmondsand C. gloeosporioides (Penz.) Penz.& Sacc (Smith, 2008; Xie et al., 2010),these fungi might infect the leaves,petioles, flowers and peduncles, wheredark, circular and initially small dotsare seen, but that may coalescence andform lesions of a higher size (Ivanoviæet al., 2007). According to Smith(2007), C. fragariae and C. acutatumcause necrosis that affect rapidly theflowers and the parts of the peduncles,which turn dark, dry and fragile.

The three species ofColletotrichum might infect the

Urdaneta et al.

506

Las tres especies deColletotrichum pueden infectar los fru-tos de la fresa, pero C. acutatum es lamás frecuentemente asociada a laantracnosis de éstos órganos, observán-dose sobre los frutos maduros, lesio-nes circulares, inicialmente son ma-rrón claro y acuosas, que se tornanoscuras, secas y hundidas. Puedenpresentarse de una a varias manchasy sobre éstas se aprecian masas deconidios rosadas, y en el caso de losfrutos verdes las áreas necróticas sonindividuales y permanecen pequeñasy negras, hasta que éstos maduran(Smith, 2007), según Farrera et al.(2007) éstas áreas son pardas o negras,presentándose inicialmente en la re-gión apical y luego se extienden hastacubrirlos y momificarlos.

La taxonomía del géneroColletotrichum se ha basado en supatogenicidad y en ciertas caracterís-ticas morfológicas como el color de lacolonia en medio de cultivo, forma ytamaño de los conidios, formación declamidosporas, presencia o ausencia delas setas en los acérvulos y del estadoperfecto o teleomórfico (Freeman yKatan, 1997).

En Venezuela, la antracnosis esde importancia económica ya que inci-de negativamente en los rendimientosdel cultivo, por afectar a los frutos;además puede ocasionar la muerte dela planta. De acuerdo a Farrera et al.(2007), la enfermedad ocasiona pérdi-das entre el 60-75%, pudiendo serlimitante para el cultivo de la fresa,debido a su naturaleza devastadora, lasusceptibilidad de los cultivares y labaja efectividad de medidas para con-trolarla.

strawberry fruits, but C. acutatum isthe one related with more frequencyto the antracnosis of these organs,observing on the mature fruits circledlesions, which are initially light brownand aqueous, and then turn dark, dryand deep. One to several dots canappear and on these are seen themasses of pink conidials, and in thecase of the green fruits, the necroticareas are individual and remain smalland are black, until they mature(Smith, 2007), according to Farrera etal. (2007) these areas are brownish orblack, presenting initially in the apicalregion and later extending untilcovering of mummified them.

The taxonomy of the genusColletotrichum is based on itspathogenicity and in somemorphological characteristics, such asthe color of the colony in a crop culture,shape and size of the conidial,formation of the chlamydospore,presence or absence of setae in theacervuli and the perfect phase of orteleomorphic (Freeman and Katan,1997).

In Venezuela, the antracnosishas a great economic importance, sinceit has a negative influence in the yieldsof the crops, by affecting the fruits;also, it can cause the death of the plant.According to Farrera et al. (2007), thedisease causes losses from 60-75%, andthis can become into a limitation forthe crop of the strawberry due to itsdevastating nature, the sensitivity ofthe cultivars and the low effectivenessof measures to control it.

The first report of the antracnosisin strawberry fruits in the country wascarried out by Cedeño and Carrero

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

507

El primer reporte de laantracnosis en frutos de fresa, en elpaís, fue realizado por Cedeño y Ca-rrero (1997), en el municipio Bolívardel estado Mérida, quienes identifica-ron a Colletotrichum acutatum comoel agente causal de la enfermedad.Posteriormente, Guevara et al. (2004)señalaron a C. gloeosporioides comoel responsable de la enfermedad en losmunicipios Tovar (estado Aragua) y ElJarillo (estado Miranda). Farrera et al.(2007) señalaron nuevamente la pre-sencia de la especie C. acutatum, estavez en el estado Táchira.

La presente investigación seplanteó con la finalidad de determinarlas especies de Colletotrichum que cau-san la antracnosis de la fresa en losestados Lara y Trujillo, Venezuela.

Materiales y métodos

Se colectaron cuarenta y sietemuestras provenientes de dos fincasubicadas en la localidad HumocaroAlto, municipio Moran y una finca enLas Lajitas, municipio Torres del es-tado Lara; y tres fincas de la localidadCabimbu y una finca en La Lagunita,municipio San Rafael de Carvajal delestado Trujillo, las mismas consistie-ron de hojas, peciolos, sépalos, frutosy pedúnculos de las plantas de fresaque presentaron los síntomas caracte-rísticos de la antracnosis. El muestreose realizó durante los meses de mayo,junio y julio del 2008.

Los órganos fueron lavados conjabón líquido (Mas® acido sulfonico15%) y enjuagados con agua corrien-te. Del margen de las lesiones, se cor-taron segmentos de 0,25 cm2, los cua-

(1997), in Bolívar county, Mérida state,they identified Colletotrichumacutatum such as the agent causingthe disease. Consequently, Guevara etal. (2004) mentioned C. gloeosporioidesas the responsable of the disease in thecounties Tovar (Aragaua states) andEl Jarillo (Miranda state). Farrera etal. (2007) also mentioned the presenceof C. acutatum but this time in Táchirastate.

The objective of this research isto determine the species ofColletotrichum that cause theantracnosis on the strawberry, in Laraand Trujillo states, Venezuela.

Materials and methods

Forty seven samples werecollected from two farms located onHumocaro Alto, Moran county, and afarm located on Las Lajitas, Torrescounty, Lara state; and three farmson La Lagunita, San Rafael de Carva-jal county, Trujillo state. The samplesconsisted on leaves, petioles, sepals,fruits and peduncles of the strawberryplants that presented thecharacteristics symptoms of theantracnosis. The sampling was doneduring May, June and July of 2008.

The organs were washed withliquid soap (Mas® sulphonic acid 15%)and rinsed with running water. In themargin of the lesions, segments of 0.25cm2, were cut, which were disinfectedfor 2 min with isopropyl alcohol (70%),and were washed 3 times in steriledistilled water (ADE), were dried insterile absorbent paper and taken toPetri plates with acidified water-agar(AAA) with 10 drops of lactic acid (88%)

Urdaneta et al.

508

les se desinfectaron durante 2 min conalcohol isopropílico (70%), se lavaron3 veces en agua destilada estéril (ADE),se secaron en papel absorbente estéril,se transfirieron a platos Petri con agar-agua-acidificado (AAA) con 10 gotasde ácido láctico (88%) por cada 250 mLde medio y se incubaron a 25-27°C, bajoun régimen de 12h de luz blanca fluo-rescente/12h de oscuridad, hasta quese observó el desarrollo micelial delhongo (French y Hebert, 1980; Casta-ño, 1998). Las colonias desarrolladasfueron subcultivadas en papa-dextro-sa-agar-acidificado (PDAA). Los platosse incubaron bajo las mismas condi-ciones de luz y temperatura antes des-critas, hasta que se observó laesporulación característica deColletotrichum en el medio de cultivo.

Los aislamientos del hongo secodificaron, de acuerdo al estado deprocedencia, finca, órgano de la plan-ta donde fueron obtenidos y número deplanta muestreada; de cada uno de ellosse realizaron dos cultivos monospóricossiguiendo la metodología propuesta porFrench y Hebert (1980), los cuales sepreservaron en tubos de ensayo conPDAA a 8±2ºC.

Caracterización cultural delos aislamientos deColletotrichum sp.

Cada uno de los cultivosmonospóricos preservados deColletotrichum se reactivaron enPDAA, se incubaron a 25-27°C, bajocondiciones de 12h luz blanca fluores-cente y 12h de oscuridad. Una vez ob-servada la coloración naranja caracte-rística de la esporulación (7-15 días deedad) se realizó la caracterización delcrecimiento en PDAA, considerando elcolor y aspecto de la colonia (algodonosa

for each 250 mL of the medium, and wereincubated at 25-27ºC, with a regimen of12h of fluorescent white light/12 h ofdark, until was observed the myceliumdevelopment of the fungi (French andHebert, 1980; Castaño, 1998). Thecolonies developed were sub-cultivated inacidified-potato-dextrose-agar (PDAA).The plates were incubated under thesame light conditions and temperaturedescribed before, until observing thecharacteristic sporulation ofColletotrichum in the culture medium.

The isolations of the fungus werecodified according to the origin, farm,and organ of the plant where thesewere obtained, as long as the numberof the sampled plant; two monosporiccultures were performed on each ofthese, following the methodologyproposed by French and Hebert (1980),which were preserved in assay tubeswith PDAA at 8±2ºC.

Cultural characterization ofthe isolations of Colletotrichum sp.

Each of the preserved monosporiccultures of Colletotrichum activated inPDAA, were incubated at 25-27ºC,under conditions of 12h of fluorescentwhite light and 12h of dark. Onceobserved the characteristic orangecoloring of the sporulation (7-15 daysold) the growth characterization inPDAA was performed, considering thecolor and the aspect of the colony(cottony or dusty), the presence ofconcentric rings and the coloring ofconidial masses in both the surface asin the reverse of the colonies (Smith,2008; Xie et al., 2010).

Determination of the shapeand size of the conidial

5 semi-permanent preparationswere prepared with phenol lact through

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

509

o polvorienta), la presencia de anillosconcéntricos y la coloración de lasmasas de conidios, tanto en la superfi-cie como en el reverso de las colonias(Smith, 2008; Xie et al., 2010).

Determinación de la forma ytamaño de los conidios

Se realizaron 5 preparacionessemipermanentes con lactofenol poraislamiento (French y Hebert, 1980) yse observaron los conidios con un mi-croscopio óptico Olympus, modeloCH20 (400X), a través del ocular setomaron de 2-3 fotografías·lámina conuna cámara fotográfica Cyber-shotDSC-W70 de 7,2 megapíxeles y con unzoom de 2,3, para un total de 10-15fotografías.aislamiento-1. Utilizando elsoftware ImageJ® (ImageJ, 2009), sedeterminó el largo y ancho de 100conidios por aislamiento, los resulta-dos fueron expresados en pixeles por elprograma ImageJ (ImageJ, 2009) y setransformaron en micrómetros (µm).Simultáneamente, a partir de las foto-grafías se estableció la forma de cadauno de los conidios medidos en base ala terminación de sus puntas (ambosextremos ahusados, ambos redondea-dos o uno ahusado y el otro redondea-do) y se calculó el porcentaje de cadauna de las formas presentadas, paraasí establecer la predominante, si-guiendo la metodología propuesta porOliveira et al. (2005).

Formación de clamidosporasde Colletotrichum sp.

Los cultivos monospóricos deColletotrichum se reactivaron en AAA(2%), se incubaron a 25-27ºC, bajo con-diciones de 12h luz blanca fluorescen-te y 12h de oscuridad, durante 25-30días (Cedeño y Carrero, 1997). Utili-zando los equipos y procedimientos ya

isolation (French and Hebert, 1980)and the conidial were observed withan optical microscope Olympus, modelCH20 (400X), 2-3 photographs-laminawere taken using the ocular, with aphotograph camera Cyber-shot DSC-W70 of 7.2 megapixels and a 2.3 zoom,for a total of 10-15photographs.isolations. Using the soft-ware ImageJ®(ImageJ, 2009), thelength and width of 100 conidials weredetermined by isolations, the resultswere expressed in pixels using theprogram ImageJ® (ImageJ, 2009), andwere transformed in micrometers(µm). Simultaneously, after thephotographs the shape of each of themeasured conidials were established inbase of the termination of their spikes(both extremes tapered, both roundedor one tapered and the other rounded),and the percentage of each of thepresented shapes was calculated, toestablish the predominant andfollowing the methodology proposed byOliveira et al. (2005).

Chlamydospore formation ofColletotrichum sp.

The monosporic cultures ofColletotrichum were reactivated inAAA (2%), were incubated at 25-27ºC,under conditions of 12 h of fluorescentwhite light and 12 h of darkness for25-30 days (Cedeño and Carrerp, 1997).Using the equipments and proceduresdescribed before, the width and lengthwere measured in 25 chlamydosporesby isolation of the fungus.

Pathogenicity test in fruitsA suspension of 1x106

conidials.mL-1 was prepared from eachof the 47 isolations obtained from thefungus, which were reactivated inPDAA (7 days old).

Urdaneta et al.

510

descritos, se midió el ancho y largo de25 clamidosporas por aislamiento delhongo.

Prueba de patogenicidad enfrutos

De cada uno de los 47 aislamien-tos obtenidos del hongo, los cuales fue-ron reactivados en PDAA (7 días deedad), se preparó una suspensión de1x106 conidios.mL-1.

Los frutos de fresa utilizados fue-ron adquiridos en mercados informa-les de la ciudad de Cabudare, estadoLara, todos presentaban el mismo gra-do de madurez (estado 9) recomendadopor Smith (2007), para garantizar lamayor uniformidad en su susceptibili-dad a la infección por el patógeno.

Los frutos fueron lavados con ja-bón líquido (Mas® acido sulfonico 15%)y enjuagados con agua corriente, des-infectados durante 3 min conhipoclorito de sodio al 1,5%, lavados 3veces en ADE y secados con papel ab-sorbente estéril, finalmente fueroninoculados por inmersión durante 2min en la suspensión de conidios, seinocularon 5 frutos por cada aisla-miento y 5 se sumergieron en ADEsolamente, como tratamiento testigo.Luego fueron colocados en bandejasplásticas transparentes, con tapas decierre hermético, de 10 x 8,5 x 5 cm,las cuales contenían mallas metáli-cas colocadas sobre papel absorbentehumedecido con ADE. Las bandejas,fueron colocadas en una cámara de cre-cimiento con luz fluorescente (22,6 -26,9 µ mol S-1m2, por períodos de 12hde luz y 12 de oscuridad) a 18-20°C,utilizando para ello un aire acondicio-nado de 11.500 Btu.h-1, se mantuvie-ron cerradas herméticamente duran-te 48h (incubación) y se realizaron ob-

The strawberry fruits wereacquired in informal markets ofCabudare, Lara state, all the fruitspresented the same maturity degree(phase 9) recommended by Smith(2007) to guarantee the highestuniformity on its susceptibility towardsthe infection by the pathogen.

The fruits were washed withliquid soap (Mas® sulphonic acid 15%)and rinsed with running water,disinfected for 3 min with sodiumhypochlorite at 1.5%, washed 3 timesin ADE and dried with sterileabsorbent paper, finally wereinoculated by immersion for 2 min inthe suspension of the conidials, 5 fruitsper each isolation were inoculated and5 were only immersed in ADE, aswitness treatment. Later, were put onclear plastic trays, with hermetic lidsof 10 x 8.5 x 5 cm, which has metallicmesh put on wet absorbent paper withADE. The trays were put on a growthchamber with fluorescent light (22.6-26.9 µ mol S-1m2, for periods of 12 h oflight and 12 of darkness) at 18-20°C,using for it an air conditioning of11.500 Btu.h-1, were kept hermeticallyclosed for 48 h (incubation) and dailyobservations were done until thecharacteristics symptoms of theantracnosis appeared on the fruits (3-5 days)

Two inoculated fruits perisolation were selected, examiningtheir surfaces with a stereoscopicmagnifier Olympus, model SZ51 (10X),to determine the presence of acervuli,which were taken with a steriledissection needle to perform 5 semi-permanent preparations with phenollact by isolation. In these, it was alsodetermined the shape and size (length

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

511

servaciones diarias, hasta que los sín-tomas característicos de laantracnosis aparecieron sobre los fru-tos (3-5 días).

Se seleccionaron dos frutos ino-culados por aislamiento, examinandosus superficies con una lupaestereoscópica Olympus, modelo SZ51(10X) para determinar la presencia delos acérvulos, los cuales fueron toma-dos con una aguja de disección estérilpara realizar 5 preparacionessemipermanente con lactofenol por ais-lamiento. En las mismas también sedeterminó la forma y tamaño (largo yancho) de 100 conidios a través del pro-grama ImageJ (ImageJ, 2009), segúnel procedimiento antes descrito.

El reaislamiento del hongo de losfrutos de fresa inoculados se realizósiguiendo el mismo procedimiento se-ñalado para los órganos vegetales co-lectados en campo. Las colonias desa-rrolladas a partir de los segmentos deéste órgano fueron subcultivadas en elmedio PDAA, los platos se incubaronbajo las mismas condiciones de luz ytemperatura antes descritas, hastaapreciar la esporulación característi-ca de Colletotrichum en el medio, serealizaron cinco preparacionessemipermanentes con lactofenol poraislamiento para definir nuevamentela forma y tamaño de 100 conidios poraislamiento, a través del programaImageJ (ImageJ, 2009).

Se utilizó un diseño de bloquesal azar para el análisis del tamaño delos conidios considerando como bloquelas condiciones experimentales dondeel hongo los formó (procedencia): 1)reactivación en PDAA de los cultivosmonospóricos de los aislamientos deórganos vegetales, 2) frutos inocula-

and width) of 100 conidials using thesoftware (ImageJ, 2009), following theprocedure described before.

The fungus re-isolation of theinoculated strawberry fruits was donefollowing the same procedurementioned for the vegetal organscollected in the field in the culturePDAA, the plates were incubatedunder the same light conditions andtemperature described before, untilappreciating the characteristicsporulation of Colletotrichum in themedium; five semi-permanentpreparations with phenol lact wereprepared to define one more time thesize and shape of 100 conidials perisolation, using the program ImageJ(ImageJ, 2009).

A completely split-plotrandomized design was used for theanalysis of the conidials considering asplots the experimental conditionswhere the fungus formed (origin): 1)reactivation in PDAA of themonosporic cultures of the isolationsof vegetal organs, 2) inoculated fruitsin the pathogenicity and 3) developedcolonies after the segments ofinoculated fruits and sub-cultivated inPDAA, with 100 replications(conidials) by isolation and plot(100x47x3=14.100 conidialsmeasured), the variance analysis andthe mean comparison were performed(Tukey test, P

Urdaneta et al.

512

dos en la prueba de patogenicidad y3) colonias desarrolladas a partir delos segmentos de frutos inoculados ysubcultivadas en PDAA, con 100 re-peticiones (conidios) por aislamientoy por bloque (100x47x3= 14.100conidios medidos), se realizaron aná-lisis de varianza y comparación demedias (prueba de Tukey, P

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

513

blancas, con el centro gris oscuro yanillos concéntricos color naranjatanto en el centro como en los már-genes.

Características y forma delos conidios

Los conidios observados en todoslos casos (monospóricos, frutos inocu-lados y reaislamientos) fueron hialinos,unicelulares y rectos (figura 1), ademáséstos presentaron tres formas, por loque se clasificaron en tres categorías:1) mixtos, con un extremo redondeadoy otro ahusado (R-A), 2) con ambos ex-tremos ahusados (A-A) y 3) con ambosredondeados (R-R), además, se determi-nó la frecuencia de cada una de éstasformas (cuadro 1). Se presentaronmayoritariamente conidios fusiformes,

Figura 1. Conidios de Colletotrichum acutatum sp. predominantes enlos aislamientos, con ambos extremos ahusados (400X).Bar=10 µm.

Figure 1. Colletotrichum acutatum sp. conidials predominant on theisolations with both extremes tapered (400X). Bar=10 µm.

monosporic cultures, from 47 to 100%(87%) on the inoculated fruits, andfrom 63 to 100% (89.3%) after the re-isolation of the fruits, only themonosporic of L1F1, L1F5, L1Pd3 andTr1F4 presented the lowest percentageof these structures (table 1). Accordingto Smith (1990), C. acutatum produ-ces conidials with the three types oftermination (rounded-tapered, tapered-tapered and rounded-rounded) butwith a predominance on the taperedextremes, and also mentioning thatthis was observed in nine isolations ofthis pathogen (87% average), likewise,Denoyes and Baudry (1995)determined that the isolations of C.acutatum presented a dominance ofthe fusiforms.

Urdaneta et al.

514

Cu

adro

1. N

úm

ero

de c

onid

ios

con

ext

rem

os r

edon

dead

os y

ah

usa

dos

(R-A

), ex

trem

os a

hu

sado

s (A

-A) y

extr

emos

red

onde

ados

(R

-R)

de c

uar

enta

y s

iete

ais

lam

ien

tos

(Ais

lam

.) de

Col

leto

tric

hu

mac

utat

um d

e fr

uto

s (F

) de

fre

sa (

Fra

gari

a x

anan

assa

Du

ch.),

ped

ún

culo

s (P

d), s

épal

os (

S),

hoj

as (

H),

pecí

olos

(P

c), o

bser

vado

s en

la r

eact

ivac

ión

de

los

cult

ivos

mon

ospó

rico

s, f

ruto

sin

ocul

ados

y r

eais

lam

ient

os d

e fr

utos

, col

ecta

dos

en tr

es fi

ncas

del

est

ado

Lar

a (L

1,2,

3) y

cua

tro

fin

cas

en e

l est

ado

Tru

jill

o (T

r 1,2

,3,4).

Tab

le 1

. Nu

mbe

r of

con

idia

ls w

ith

tap

ered

an

d ro

un

ded

extr

emes

(R

-A),

tape

red

extr

emes

(A

-A)

and

rou

nde

d ex

trem

es (

R-R

) of

for

ty s

even

iso

lati

ons

(Ais

lam

.) o

f C

olle

totr

ich

um

acu

tatu

m o

fst

raw

berr

y fr

uits

(F) (

Fra

gari

a x

anan

assa

Duc

h.),

pedu

ncle

s (P

d), s

epal

s (S

), le

aves

(H),

peti

oles

,ob

serv

ed i

n t

he

reac

tiva

tion

of

mon

ospo

ric

cult

ure

s, i

noc

ula

ted

fru

its

and

isol

atio

ns

of t

he

fru

its

coll

ecte

d in

thre

e fa

rms

of L

ara

stat

e (L

1,2,

3) an

d fo

ur

farm

s in

Tru

jill

o st

ate.

(Tr 1

,2,3

,4).

Mon

ospó

rico

sFr

utos

Rea

isla

mie

ntos

N°

Ais

lam

.R-

AA-

AR-

RTo

tal

R-A

A-A

R-R

Tota

lR-

AA-

AR-

RTo

tal

1L

1F1

4654

010

011

890

100

1878

410

02

L1F

211

890

100

1783

010

06

940

100

3L

1F3

2166

1310

014

860

100

2080

010

04

L1F

427

721

100

2179

010

013

852

100

5L

1F5

4554

110

013

843

100

1385

210

06

L 1Pd

112

862

100

694

010

013

852

100

7L 1

Pd2

2273

510

08

920

100

1090

010

08

L 1Pd

333

589

100

1090

010

019

801

100

9L 1

Pd4

2673

110

04

960

100

1089

110

010

L 1S 1

2571

410

015

850

100

1385

210

011

L 1H

121

718

100

1090

010

011

890

100

12L

1Pc 1

1584

110

06

940

100

1683

110

013

L2F

113

7611

100

793

010

010

900

100

14L

2F2

1378

910

05

950

100

1581

410

015

L2F

310

7713

100

496

010

010

837

100

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

515

Cu

adro

1. N

úm

ero

de c

onid

ios

con

ext

rem

os r

edon

dead

os y

ah

usa

dos

(R-A

), ex

trem

os a

hu

sado

s (A

-A) y

extr

emos

red

onde

ados

(R

-R)

de c

uar

enta

y s

iete

ais

lam

ien

tos

(Ais

lam

.) de

Col

leto

tric

hu

mac

utat

um d

e fr

uto

s (F

) de

fre

sa (

Fra

gari

a x

anan

assa

Du

ch.),

ped

ún

culo

s (P

d), s

épal

os (

S),

hoj

as (

H),

pecí

olos

(P

c), o

bser

vado

s en

la r

eact

ivac

ión

de

los

cult

ivos

mon

ospó

rico

s, f

ruto

sin

ocul

ados

y r

eais

lam

ient

os d

e fr

utos

, col

ecta

dos

en tr

es fi

ncas

del

est

ado

Lar

a (L

1,2,

3) y

cua

tro

fin

cas

en e

l est

ado

Tru

jill

o (T

r 1,2

,3,4) (

Con

tinu

ació

n).

Tab

le 1

. Nu

mbe

r of

con

idia

ls w

ith

tap

ered

an

d ro

un

ded

extr

emes

(R

-A),

tape

red

extr

emes

(A

-A)

and

rou

nde

d ex

trem

es (

R-R

) of

for

ty s

even

iso

lati

ons

(Ais

lam

.) o

f C

olle

totr

ich

um

acu

tatu

m o

fst

raw

berr

y fr

uits

(F) (

Fra

gari

a x

anan

assa

Duc

h.),

pedu

ncle

s (P

d), s

epal

s (S

), le

aves

(H),

peti

oles

,ob

serv

ed i

n t

he

reac

tiva

tion

of

mon

ospo

ric

cult

ure

s, i

noc

ula

ted

fru

its

and

isol

atio

ns

of t

he

fru

its

coll

ecte

d in

th

ree

farm

s of

Lar

a st

ate

(L1,

2,3)

an

d fo

ur

farm

s in

Tru

jill

o st

ate.

(T

r 1,2

,3,4)

(Con

tinu

atio

n). M

onos

póri

cos

Frut

osR

eais

lam

ient

os

N°

Ais

lam

.R-

AA-

AR-

RTo

tal

R-A

A-A

R-R

Tota

lR-

AA-

AR-

RTo

tal

16L

2F4

1276

1210

07

930

100

2472

410

017

L2F

514

7214

100

396

110

010

900

100

18L

2F6

2073

710

05

950

100

1377

1010

019

L2P

c 118

7210

100

694

010

02

980

100

20L

2Pc 2

1575

1010

06

940

100

1384

310

021

L2P

c 317

758

100

892

010

014

824

100

22L 2

Pd1

1184

510

06

940

100

1682

210

023

L 2Pd

212

844

100

1090

010

013

843

100

24L 2

Pd3

1973

810

07

930

100

1087

310

025

L3F

116

822

100

1585

010

030

637

100

26Tr

1F1

584

1110

09

910

100

1087

310

027

Tr1F

215

850

100

1386

110

010

882

100

28Tr

1F3

2671

310

04

960

100

010

00

100

29Tr

1F4

3859

310

045

478

100

010

00

100

30Tr

1Pd 1

1781

210

020

782

100

010

00

100

Urdaneta et al.

516

Cua

dro

1. N

úmer

o de

con

idio

s co

n ex

trem

os r

edon

dead

os y

ahu

sado

s (R

-A),

extr

emos

ahu

sado

s (A

-A)

yex

trem

os r

edon

dead

os (

R-R

) de

cua

rent

a y

siet

e ai

slam

ient

os (

Ais

lam

.) de

Col

leto

tric

hum

acut

atum

de

frut

os (

F)

de f

resa

(F

raga

ria

x an

anas

sa D

uch.

), pe

dúnc

ulos

(P

d),

sépa

los

(S),

hoja

s (H

), pe

cíol

os (

Pc)

, ob

serv

ados

en

la r

eact

ivac

ión

de l

os c

ulti

vos

mon

ospó

rico

s, f

ruto

sin

ocul

ados

y r

eais

lam

ient

os d

e fr

utos

, col

ecta

dos

en t

res

finc

as d

el e

stad

o L

ara

(L1,

2,3)

y c

uatr

ofi

ncas

en

el e

stad

o T

ruji

llo (

Tr 1

,2,3

,4)

(Con

tinu

ació

n).

Tab

le 1

. N

umbe

r of

con

idia

ls w

ith

tape

red

and

roun

ded

extr

emes

(R

-A),

tape

red

extr

emes

(A

-A)

and

rou

nde

d ex

trem

es (

R-R

) of

for

ty s

even

iso

lati

ons

(Ais

lam

.) o

f C

olle

totr

ich

um

acu

tatu

m o

fst

raw

berr

y fr

uits

(F) (

Frag

aria

x a

nana

ssa

Duc

h.),

pedu

ncle

s (P

d), s

epal

s (S

), le

aves

(H),

peti

oles

,ob

serv

ed i

n th

e re

acti

vati

on o

f m

onos

pori

c cu

ltur

es,

inoc

ulat

ed f

ruit

s an

d is

olat

ions

of

the

frui

ts c

olle

cted

in

thre

e fa

rms

of L

ara

stat

e (L

1,2,

3) a

nd f

our

farm

s in

Tru

jill

o st

ate.

(T

r 1,2

,3,4)

(Con

tinu

atio

n). M

onos

póri

cos

Frut

osR

eais

lam

ient

os

N°

Ais

lam

.R-

AA-

AR-

RTo

tal

R-A

A-A

R-R

Tota

lR-

AA-

AR-

RTo

tal

31Tr

1Pd 2

1386

110

013

861

100

010

00

100

32Tr

2F1

2473

310

09

892

100

1387

010

033

Tr2F

232

626

100

694

010

00

100

010

034

Tr2F

331

672

100

1682

210

02

980

100

35Tr

3F1

3367

010

011

890

100

010

00

100

36Tr

3F2

2179

010

025

750

100

1089

110

037

Tr3F

310

900

100

010

00

100

010

00

100

38Tr

3F4

3169

010

017

821

100

010

00

100

39Tr

3F5

1288

010

029

683

100

892

010

040

Tr3F

624

760

100

1288

010

00

100

010

041

Tr3P

d 115

823

100

3362

510

015

841

100

42Tr

3Pd 2

2173

610

015

832

100

792

110

043

Tr3S

111

881

100

1385

210

011

881

100

44Tr

4F1

2179

010

029

710

100

010

00

100

45Tr

4F2

1486

010

016

840

100

010

00

100

46Tr

4F3

1782

110

05

950

100

010

00

100

47Tr

4F4

2077

310

020

764

100

397

010

0

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

517

con ambos extremosahusados, la pro-porción de éstos fue de 54 a 90% (86%)en las colonias fúngicas desarrolladasa partir de la reactivación de los culti-vos monospóricos, de 47 a 100% (87%)sobre los frutos inoculados y de 63 a100% (89,3%) a partir del reaislamientode los frutos, solo los monospóricos deL1F1, L1F5, L1Pd3 y Tr1F4 presentaronel menor porcentaje de éstas estructu-ras (cuadro 1). Según Smith (1990), C.acutatum produce conidios con los trestipos de terminación (redondeados-ahusados, ahusados-ahusados y redon-deados-redondeados) pero conpredominancia de los extremosahusados, señalando además que nue-ve aislamientos de este patógeno lospresentaron (87% en promedio), asímismo Denoyes y Baudry (1995) deter-minaron que los aislamientos de C.acutatum presentaban dominancia delos fusiformes.

Por otra parte, Villanueva et al.(2008) encontró que C. fragarie presen-taba conidios con un extremo obtuso yotro ahusado, mientras que en C.gloeosporioides ambos eran obtusos.De la misma manera, Xie et al. (2010)señalaron que en C. fragarie fueronovalados y en C. gloeosporioides, oblon-gos con puntas obtusas, de acuerdo aéste criterio morfológico, todos los ais-lamientos en la presente investigaciónse correspondieron con Colletotrichumacutatum.

Caracteristicas de losconidios durante el proceso degerminación (cultivosmonospóricos)

Los conidios de Colletotrichumsp. al germinar formaron un septo ylos tubos germinativos en uno o am-bos extremos, resultados que coincidie-

On the other hand, Villanueva etal. (2008) found that C. fragariepresented conidials with an obtuse ex-treme and another tapered one;meanwhile, in C. gloeosporioides bothwere obtuse. Likewise, Xie et al. (2010)mentioned that in C. fragarie wereoval and in C. gloeosporioides, oblongswith obtuse spikes, according to thismorphological criterion, all theisolations, in the current research,corresponded to Colletotrichumacutatum.

Conidial characteristicsduring the germination process(monosporic cultures)

Conidials of Colletotrichum sp.when germinated formed a septumand germinative tubes in one or bothextreme, these results agree to thosementioned by Leandro et al. (2001),Sutton (1980) and Cedeño and Carre-ro (1997), the latter authors alsoreported the lateral germination for C.acutatum obtained from strawberrysamples in Venezuela, which was notobserved in this research However,Arroyo et al. (2005) observed that thelateral germination is not a frequentevent, and it only predominates in oneof the two extremes.

Size of the Colletotrichumsp. conidials

Significant differences presentedfor the variables longitude and widthof the conidials, for both the isolationsand the precedence factor (table 2),these presented a higher longitude(13.76 µm) when developed on theinoculated fruits, follow by the onesformed after the re-isolations of theseorgans (13.53 µm), reaching the lowestlongitude (12.78 µm) after themonosporic cultures, this tendency

Urdaneta et al.

518

ron con los señalados por Leandro etal. (2001), Sutton (1980) y Cedeño yCarrero (1997), estos últimos autoresreportaron, además la germinaciónlateral para C. acutatum obtenido demuestras de frutos de fresa en Vene-zuela, la cual no fue observada en éstainvestigación. Sin embargo, Arroyo etal. (2005) observaron que lagerminación lateral es un evento pocofrecuente, predominando sólo en unode los dos extremos.

Tamaño de los conidios deColletotrichum sp.

Se presentaron diferencias signi-ficativas para las variables longitud yancho de los conidios, tanto para losaislamientos como para el factor proce-dencia (cuadro 2), estos presentaron unamayor longitud (13,76 µm) cuando sedesarrollaron sobre los frutos inocula-dos, seguidos por los formados a partirde los reaislamientos de éstos órganos(13,53 µm), alcanzando la menor longi-tud (12,78 µm) a partir de los cultivosmonospóricos, ésta tendencia fue simi-lar para la variable ancho (cuadro 2).Siendo los frutos uno de los sustratosnaturales donde se desarrollaColletotrichum sp. en el patosistemafresa-antracnosis, era de esperarse quesobre éstos, los conidios alcanzaranmayores medidas, además, la pruebade patogenicidad se realizó a 18-20°C,rango de temperatura considerado óp-timo para el crecimiento de éste pató-geno (Smith, 2008).

Los aislamientos de Colletotrichumdel estado Trujillo, que presentaron lamayor y menor longitud fueron Tr3Pd1 yTr1F3 (14,22 y 12,21 µm, respectivamen-te) y para el estado Lara fueron L1Pd2 yL2Pd2 (14,03 y 12,58 µm respectivamen-te). Con relación al ancho L1Pd3 y Tr3Pd1

was similar for the variable width(table 2). Since the fruits are one ofthe natural substrates whereColletotrichum sp. develops in thestrawberry-antracnosis scab, it wasexpected that the conidials reachhigher measures on these; thepathogenicity test was carried out at18-20ºC, which is an optimumtemperature rank for the growing ofthis pathogen (Smith, 2008).

The isolations of Colletotrichumof Trujillo that presented the highestand lowest longitude were Tr3Pd1 andTr1F3 (14.22 and 12.21 µm,respectively) and for Lara were L1Pd2and L2Pd2 (14.03 and 12.58 µmrespectively). In relation to the widthL1Pd3 and Tr3Pd1 (4.06 and 3.63 µm)presented the highest values and,Tr3S1 and L2Pc1 (3.22 and 3.44 µm) thelowest (table 3).

Conidials presented ranks from12.21-14.22 x 3.22-4.06 µm, withaverages of 13.36 x 3.6 µm, which donot correspond to the ones reported byGunnel and Gubler (1992) and Xie etal. (2010) for C. gloeosporioides (15 x4.3 µm and 13.5 x 5.5 µm) and for C.fragariae (18 x 4 µm and 16 x 4.5 µm).According to these results the averagemeasured obtained for the forty sevenisolations are closer to the onesmentioned by these authors for C.acutatum (15.5 x 3.7 µm and 13.5 x4.4 µm).

Chlamydospore formation ofColletotrichum sp.

In the culture media AAA, all theisolations formed chlamydospores inthe hyphae after 25d of incubation,initially were hyalines and later turnedout dark brown, most presented doublewall and were interspersed (figura 2).

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

519

(4,06 y 3,63 µm) presentaron los mayo-res valores, y Tr3S1 y L2Pc1 (3,22 y 3,44µm) los menores (cuadro 3).

Los conidios presentaron rangos de12,21-14,22 x 3,22-4,06 µm, con prome-dios de 13,36 x 3,6 µm, los cuales no secorresponden con los reportados porGunnel y Gubler (1992) y Xie et al. (2010)para C. gloeosporioides(15 x 4,3 µm y13,5 x 5,5 µm) y para C. fragariae(18 x 4µm y 16 x 4,5 µm). De acuerdo a estosresultados las medidas promedios obte-nidas para los cuarenta y siete aislamien-tos se acercan más a las señaladas porestos autores para la especie C. acutatum(15,5 x 3,7 µm y 13,5 x 4,4 µm).

Formación de clamidosporasde Colletotrichum sp.

En el medio de cultivo AAA, to-dos los aislamientos formaron

Cuadro 2. Longitud y ancho (µµµµµm) promedio de conidios de cuarenta ysiete aislamientos de Colletotrichum acutatum de fresa(Fragaria x ananassa Duch.), observados en la reactivaciónde los cultivos monospóricos, frutos inoculados yreaislamiento de frutos.

Table 2. Average longitude and width (µm) of conidials from forty sevenisolations of Colletotrichum acutatum of strawberry (Fragariax ananassa Duch), observed in the reactivation of monosporiccultures, inoculated fruits and re-isolation of fruits.

Procedencia de los conidios Longitud (µm)

Frutos inoculados 13,76aReaislamiento de frutos inoculados 13,53bCultivos monospóricos 12,78c

Procedencia de los conidios Ancho (µm)

Frutos inoculados 3,80aCultivos monospóricos 3,60bReaislamiento de frutos inoculados 3,38c

Valores con la misma letra no difieren estadísticamente, Tukey (P≤0,05).

Cedeño and Carrero (1997) mentionedthat C. acutatum developed theseresistance structures after themycelium immersed in culturesproduced by three weeks in AAA.

The variance analysis done forthe size of the chlamydosporedetermined that there are significantdifferences among the isolations, theone which presented the highest valuefor the longitude was Tr3S1 (12.33 µm),followed by L2Pd1 (11.74 µm), thesmallest were produced by Tr4F2 andTr4F3 (8.59 and 8.92 µm, respectively)(table 4). In relation to the width, thehighest value was Tr3S1 (10.94 µm)and the lowest Tr3F5 (7.08 µm), theisolations of Lara which produced thechlamydospores with higher and lowerwidth were L2Pd1 (10.48 µm) and L2F1

Urdaneta et al.

520

Cuadro 3. Longitud y ancho (ìm) promedio de conidios de cuarenta ysiete aislamientos de Colletotrichum acutatum (AÑADIR) defrutos (F) de fresa (Fragaria x ananassa Duch.), pedúnculos(Pd), sépalos (S), hojas (H), pecíolos (Pc), observados en lareactivación de los cultivos monospóricos, frutos inoculadosy reaislamientos de frutos, colectados en tres fincas delestado Lara (L1,2,3) y cuatro fincas en el estado Trujillo (Tr1,2,3,4).

Table 3. Average longitude and width (µm) of conidials from forty sevenisolations of Colletotrichum acutatum of strawberry fruits(F) (Fragaria x ananassa Duch), peduncles (Pd), sepals (S),leaves (H), petioles (Pc), observed in the reactivation ofmonosporic cultures, inoculated fruits and reisolation of thefruits, collected in three farms of Lara state (L1,2,3) and fourfarms in Trujillo state (Tr1,2,3,4).

Aislamiento Longitud Grupo Ancho Grupo(µm) (µm)

Tr3Pd1 14,22 A 3,63 ATr3F6 14,07 AB 3,49 BL1Pd2 14,03 AB 3,91 BL1Pd3 14,02 AB 4,06 BCTr4F3 13,98 ABC 3,32 BCDL1Pd1 13,96 ABCD 3,85 BCDEL3F1 13,96 ABCD 3,64 BCDEL1Pc1 13,92 ABCDE 3,67 BCDEFL1F1 13,87 ABCDEF 3,68 BCDEFTr3F5 13,87 ABCDEF 3,49 CDEFGTr2F3 13,86 ABCDEFG 3,53 CDEFGTr3F2 13,76 ABCDEFGH 3,55 DEFGHL1Pd4 13,76 ABCDEFGH 3,73 EFGHTr4F2 13,71 ABCDEFGHI 3,49 EFGHITr4F1 13,64 BCDEFGHI 3,32 FGHITr1F4 13,63 BCDEFGHIJ 3,55 FGHIL1F2 13,61 BCDEFGHIJK 3,88 GHIJL1H1 13,60 BCDEFGHIJK 3,76 GHIJKTr3Pd2 13,55 BCDEFGHIJKL 3,53 GHIJKTr2F2 13,53 BCDEFGHIJKLM 3,47 GHIJKLTr3F1 13,43 CDEFGHIJKLMN 3,39 HIJKLL2Pd1 13,43 DEFGHIJKLMNO 3,64 HIJKLTr2F1 13,41 EFGHIJKLMNOP 3,50 IJKLML2F4 13,40 EFGHIJKLMNOP 3,86 JKLMN

Valores con la misma letra no difieren estadísticamente, Tukey (P

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

521

Cuadro 3. Longitud y ancho (ìm) promedio de conidios de cuarenta ysiete aislamientos de Colletotrichum acutatum (AÑADIR) defrutos (F) de fresa (Fragaria x ananassa Duch.), pedúnculos(Pd), sépalos (S), hojas (H), pecíolos (Pc), observados en lareactivación de los cultivos monospóricos, frutos inoculadosy reaislamientos de frutos, colectados en tres fincas delestado Lara (L1,2,3) y cuatro fincas en el estado Trujillo (Tr1,2,3,4)(Continuación).

Table 3. Average longitude and width (µm) of conidials from forty sevenisolations of Colletotrichum acutatum of strawberry fruits(F) (Fragaria x ananassa Duch), peduncles (Pd), sepals (S),leaves (H), petioles (Pc), observed in the reactivation ofmonosporic cultures, inoculated fruits and reisolation of thefruits, collected in three farms of Lara state (L1,2,3) and fourfarms in Trujillo state (Tr1,2,3,4) (Continuation).


Tr1Pd1 13,35 FGHIJKLMNOPQ 3,45 JKLMNL2Pc1 13,32 GHIJKLMNOPQ 3,44 JKLMNL1F5 13,27 HIJKLMNOPQ 3,83 KLMNTr1Pd2 13,22 HIJKLMNOPQ 3,34 KLMNL1F3 13,20 IJKLMNOPQ 3,74 LMNOL1F3 13,20 IJKLMNOPQ 3,74 LMNOL2Pd3 13,19 IJKLMNOPQ 3,63 MNOTr3F4 13,16 IJKLMNOPQR 3,50 MNOL1F4 13,08 JKLMNOPQRS 3,89 MNOTr3F3 13,06 KLMNOPQRS 3,33 NOL2Pc3 13,04 LMNOPQRS 3,61 NOTr4F4 13,00 LMNOPQRS 3,36 NOPL2F5 12,99 MNOPQRS 3,81 NOPL2F1 12,98 MNOPQRS 3,75 NOPL2F2 12,95 NOPQRS 3,75 NOPQL1S1 12,88 OPQRS 3,80 NOPQRL2Pc2 12,88 PQRS 3,47 OPQRL2F6 12,85 QRST 3,65 PQRTr1F2 12,85 QRST 3,48 QRSL2F3 12,63 RSTU 3,69 QRSTr3S1 12,60 STU 3,22 QRSL2Pd2 12,58 STU 3,52 RSTr1F1 12,31 TU 3,56 RSTr1F3 12,21 U 3,34 S


Urdaneta et al.

522

clamidosporas en las hifas, a partir delos 25 d de incubación, inicialmentefueron hialinas y después se tornaronmarrón oscuro, la mayoría presen-taron doble pared y estaban interca-ladas (figura 2). Cedeño y Carrero(1997) señalaron que C. acutatum de-sarrolló éstas estructuras de resisten-cia a partir del micelio inmerso encultivos producidos por tres semanasen AAA.

El análisis de varianza realizadopara el tamaño de las clamidosporasdeterminó que existen diferencias sig-nificativas entre los aislamientos, laque presentó el mayor valor para lalongitud fue Tr3S1 (12,33 µm), seguidade L2Pd1 (11,74 µm), las más peque-ñas fueron producidas por Tr4F2 yTr4F3 (8,59 y 8,92 µm, respectivamen-

Figura 2. Clamidosporas formadas por Colletotrichum acutatum en elmedio agar agua acidificado. A y B. Coloración marrón pálidapresente en las etapas iniciales de formación y presencia dedoble pared celular y C. Clamidospora madura marrónoscuro. Bar=10 µµµµµm.

Figure 2. Chlamydospore formed by Colletotrichum acutatum sp. inacidified water agar. A and B. Pale brownish coloring presenton the initial formation phases and the presence of doublecellular wall and mature C. Chlamydospore dark brown.Bar=10 µm.

(7.27 µm) (table 4). The rank reachedwas of (8.59-12.33 µm) x (7.08-10.94µm), with averages of 10.33 x 8.74 µm;these resistance structures resulted tobe bigger than the ones reported byCedeño and Carrero (1997), whichmeasures were of 5-11 x 4-6 µm.

Pathogenicity testColletotrichum sp. Fungus was

re-isolated consistently from all theinoculated strawberry fruits, on whichthree days after the post-inoculationsome initial symptoms of antracnosiswere observe, such as circular smallareas and slightly tapered with darkcoffee color, these lesions incrementedrapidly after the fifth day. Thesesymptoms agreed to the ones describedby Carrero and Cedeño (1997) andFarrera et al. (2007) in fruits collected

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

523

Cuadro 4. Largo y ancho promedio (ìm) de las clamidosporas de loscuarenta y siete aislamientos de Colletotrichum acutatumde frutos (F) de fresa (Fragaria x ananassa Duch.),pedúnculos (Pd), sépalos (S), hojas (H), pecíolos (Pc),observados en la reactivación de los cultivos monospóricos,frutos inoculados y reaislamientos de frutos, colectados entres fincas del estado Lara (L1,2,3) y cuatro fincas en el estadoTrujillo (Tr1,2,3,4).

Table 4. Average length and width (µm) of chlamydospore from theforty seven isolations of Colletotrichum Acutatum ofstrawberry fruits (F) (Fragaria x ananassa Duch.), peduncles(PD), sepals (S), leaves (H), petioles (Pc), observed in thereactivation of monosporic cultures, inoculated fruits andre-isolation of fruits, collected into three farms of Lara state(L1,2,3) and four farms in Trujillo state (Tr1,2,3,4).


Tr3S1 12,33 A 10,94 AL2Pd1 11,74 AB 10,48 ABL1Pd4 11,64 AB 10,15 ABCTr3F3 11,61 AB 10,22 ABCL1Pd2 11,53 ABC 9,73 ABCDL1Pd3 11,34 ABCD 9,91 ABCDEL2PC2 11,32 ABCD 9,83 ABCDEFL2F3 11,28 ABCD 9,43 ABCDEFGL1F4 11,21 ABCDE 8,84 ABCDEFGHTr2F3 11,16 ABCDE 9,49 ABCDEFGHITr3Pd2 11,15 ABCDE 9,17 ABCDEFGHIL1F5 11,10 ABCDE 9,16 ABCDEFGHITr3F1 11,09 ABCDE 9,34 ABCDEFGHIL1S1 11,01 ABCDE 8,31 ABCDEFGHIJTr3F6 11,00 ABCDE 9,34 ABCDEFGHIJL2Pc3 10,95 ABCDE 8,45 ABCDEFGHIJKTr1F4 10,89 ABCDEF 9,35 ABCDEFGHIJKL1F3 10,84 ABCDEF 9,36 ABCDEFGHIJKL2F5 10,69 ABCDEF 9,08 ABCDEFGHIJKTr3F4 10,66 ABCDEF 8,97 ABCDEFGHIJKL1Pd1 10,60 ABCDEF 8,64 ABCDEFGHIJKL2F2 10,60 ABCDEF 9,23 ABCDEFGHIJKTr1Pd2 10,52 ABCDEF 9,19 BCDEFGHIJKTr1F3 10,44 ABCDEF 8,64 BCDEFGHIJKTr4F4 10,25 ABCDEF 8,96 BCDEFGHIJK


Urdaneta et al.

524

Cuadro 4. Largo y ancho promedio (ìm) de las clamidosporas de loscuarenta y siete aislamientos de Colletotrichum sp. de frutos(F) de fresa (Fragaria x ananassa Duch.), pedúnculos (Pd),sépalos (S), hojas (H), pecíolos (Pc), observados en lareactivación de los cultivos monospóricos, frutos inoculadosy reaislamientos de frutos, colectados en dos localidades delestado Lara (L) y del estado Trujillo (Tr) (Continuación).

Table 4. Average length and width (µm) of chlamydospore from theforty seven isolations of Colletotrichum Acutatum ofstrawberry fruits (F) (Fragaria x ananassa Duch.), peduncles(PD), sepals (S), leaves (H), petioles (Pc), observed in thereactivation of monosporic cultures, inoculated fruits andre-isolation of fruits, collected into three farms of Lara state(L1,2,3) and four farms in Trujillo state (Tr1,2,3,4) (Continuation).


L2F4 10,22 ABCDEF 9,16 BCDEFGHIJKL2Pd3 10,19 ABCDEF 8,85 BCDEFGHIJKL2Pd2 10,15 ABCDEF 8,72 BCDEFGHIJKL2Pc1 10,05 ABCDEF 8,58 BCDEFGHIJKTr2F2 9,89 BCDEF 8,72 BCDEFGHIJKL1H1 9,84 BCDEF 7,76 CDEFGHIJKTr2F1 9,70 BCDEF 8,22 CDEFGHIJKL1Pc1 9,62 BCDEF 7,79 CDEFGHIJKL1F2 9,55 BCDEF 8,25 CDEFGHIJKTr3F2 9,53 BCDEF 8,40 CDEFGHIJKL2F1 9,52 BCDEF 7,27 DEFGHIJKTr1F2 9,48 BCDEF 8,31 DEFGHIJKL3F1 9,46 BCDEF 8,21 EFGHIJKTr4F1 9,25 CDEF 7,38 EFGHIJKTr1F1 9,20 DEF 7,84 EFGHIJKL1F1 9,17 DEF 7,54 FGHIJKTr1Pd1 9,11 DEF 8,02 GHIJKL2F6 9,09 DEF 7,76 GHIJKTr3Pd1 9,08 DEF 7,65 HIJKTr3F5 9,05 DEF 7,08 IJKTr4F3 8,92 EF 7,22 JKTr4F2 8,59 F 7,60 K


Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

525

te) (cuadro 4). Con relación al ancho,el mayor valor fue para Tr3S1 (10,94µm) y el menor para Tr3F5 (7,08 µm),los aislamientos de Lara que produje-ron las clamidosporas con mayor ymenor ancho fueron L2Pd1 (10,48 µm)y L2F1 (7,27 µm) (cuadro 4). El rangoalcanzado fue de (8,59-12,33 µm) x(7,08-10,94 µm), con promedios de10,33 x 8,74 µm; estas estructuras deresistencia resultaron ser más gran-des que las reportadas por Cedeño yCarrero (1997), cuyas medidas fueronde 5-11 x 4-6 µm.

Prueba de patogenicidadEl hongo Colletotrichum sp. fue

reaislado consistentemente de todos losfrutos de fresa inoculados, sobre loscuales, a los tres días postinoculaciónse observaron los síntomas iniciales dela antracnosis, pequeñas áreas circu-lares, ligeramente hundidas de colorcafé oscuro, estas lesiones seincrementaron rápidamente a partirdel quinto día. Estos síntomas coinci-dieron con los descritos por Carrero yCedeño (1997) y Farrera et al. (2007)en frutos colectados en los estadosMérida y Táchira. Con relación al pe-riodo de incubación, este fue similaral señalado por Tanaka y Passos(2002), Ferreira et al. (2009) yStaòková et al. (2011) quienes deter-minaron que las lesiones en frutos ino-culados en campo y en condicionespostcosecha con C. acutatum fueronvisibles también a partir del 3-4 d.

También se observaron masas deconidios de color naranja o salmón so-bre los frutos de fresa, 6 d después dela inoculación, los cuales se formaronen acérvulos constituidos porconidióforos hialinos, que se caracteri-zaron por la ausencia de setas (figura

in Mérida and Táchira. In relation tothe incubation period, this was similarto the one mentioned by Tanaka andPassos (2002) Ferreira et al. (2009) andStaòková et al. (2011) who determinedthat the lesions on the fruits inoculatedin the field and on post-harvestconditions with C. acutatum were alsovisible after days 3-4.

There were also observedconidials with orange or light orangecolor on the strawberry fruits 6 daysafter the inoculations, which wereformed in acervuli constituted byhyaline conidiophores which werecharacterized by the absence of setae(figure 3). Smith (2008) mentioned thatout of the three species that causeantracnosis in the crop of strawberry,only C. gloeosporioides and C. fragariaeformed it, meanwhile, C. acutatumdoes not. Likewise, Zivkoviae et al.(2010) mentioned that the nineisolations of tomato fruits withantracnosis, which were morphologicaland molecular identified as C.acutatumdid not show it either. On the contrary,Xie et al. (2010) mentioned that the threespecies identified causing antracnosisin the strawberry crops in China (C.gloeosporioides, C. fragariae and C.acutatum) did produce it.

Identification of the specieThe cultural characterization of

each of the isolations of the fungus, thechlamysdospore in the AAA media, theabsence of setae in the acervuli formedon the inoculated fruits, thepredominant shape of the conidials andthe size of these allowed determiningthat the isolated and identified speciewas C. acutatum (Sutton, 1980;Smith, 1990; Cedeño y Carrero, 1997;Freeman y Katan, 1997; Oliveira et

Urdaneta et al.

526

3). Smith (2008) señaló que de las tresespecies que causan antracnosis en elcultivo de la fresa, sólo C.gloeosporioides y C. fragariae las for-man, mientras que C. acutatum no.Igualmente, Zivkoviae et al. (2010)señalaron que los nueve aislamientosde frutos de tomate con antracnosis,identificados morfológica ymolecularmente como C. acutatum,tampoco las presentaron. En contras-te con estos autores, Xie et al. (2010)señalaron que las tres especies identi-ficadas causando antracnosis en culti-vos de fresa en China (C.gloeosporioides, C. fragariae y C.acutatum) las produjeron.

Identificación de la especieLa caracterización cultural de

cada uno de los aislamientos del hon-

Figura 3. Estructuras reproductivas producidas por Colletotrichum sp.A. Acérvulos sobre la superficie de frutos de fresa (Fragariax ananassa Duch.) inoculados. B. Detalles de un acérvulo(400X). Bar=10 µm.

Figure 3. Reproductive structures produced by Colletotrichum sp. A.Acervuli on the surface of inoculated strawberry fruits(Fragaria x ananassa Duch.). B. Details of an acervulus (400X).Bar=10 µm.

al., 2005; Farrera et al., 2007; Smith,2008; Zivkoviae et al., 2010; Xie et al.,2010) in the forty seven samplescollected from sepals, peduncles,petioles, foliar lamina and strawberryfruits, in the production units of Laraand Trujillo.

Conclusion

In the states of Venezuela, Lara(Morán and Torres counties,Humocaro Alto and Las Lajitasrespectively) and Trujillo (San Rafaelde Carvajal, Cabimbú and LaLagunita), the antracnosis of thestrawberry crop is caused byColletotrichum acutatum. It was alsoobserved the variability on the size ofthe conidials and the chlamydospore,

Rev. Fac. Agron. (LUZ). 2013, 30: 504-528

527

go, la formación de clamidosporas enel medio AAA, la ausencia de setas enlos acérvulos formados sobre los fru-tos inoculados, la forma predominan-te de los conidios y el tamaño de losmismos, permitieron determinar quela especie aislada e identificada en cua-renta y siete muestras colectadas, desépalos, pedúnculos, pecíolos, láminafoliar y frutos de fresa, en las unida-des de producción de los estados Laray Trujillo, fue C. acutatum (Sutton,1980; Smith, 1990; Cedeño y Carrero,1997; Freeman y Katan, 1997; Oliveiraet al., 2005; Farrera et al., 2007;Smith, 2008; Zivkoviaeet al., 2010; Xieet al., 2010).

Conclusión

En los estados de Venezuela,Lara (municipios Morán y Torres, lo-calidades Humocaro Alto y Las Lajitasrespectivamente) y Trujillo (munici-pio San Rafael de Carvajal, localida-des Cabimbú y La Lagunita), laantracnosis del cultivo de la fresa, esocasionada por Colletotrichumacutatum. Se observó, además, varia-bilidad en el tamaño de los conidios ylas clamidosporas, lo cual no pareceestar relacionado con el lugar de pro-cedencia, ni con el órgano del cual fueaislado.

Literatura citada

Analytical Software. 2003. Statistix forWindows. Versión 8.0.

Arroyo, F., J. Moreno, G. García, B. de losSantos, C. Barrau, M. Porras, C.Blanco y F. Romero. 2005.Ultraestructure of the early stagesof Colletotrichum acutatum infection

of strawberry tissues. Can. J. Bot. 83:491-500.

Castaño, J. 1998. Prácticas de laboratorio defitopatología. 2da edición. Centroeditorial de la Universidad de Caldas.Colombia. 103 p.

Cedeño, L. y C. Carrero. 1997. Antracnosiscausada por Colletotrichumacutatum en frutos de fresa enMérida, Venezuela. Interciencia.22(6):315-319.

Denoyes, B. y A. Baudry. 1995. Speciesidentification and phatogenicity studyof French Colletotrichum strainsisolated frow strawberry usingmorphological and culturalcharacteristics. Phytopathology. 85:53-57.

Farrera, R., A. Zambrano y F. Ortiz. 2007.Identificación de hongos asociados aenfermedades del fruto de la fresaen el municipio Jáuregui del estadoTáchira. Rev. Fac. Agron. (LUZ). 24:269-281.

Ferreira, T., M. Camargo y R. Panizzi. 2009.Efeito de extractos de plantasmedicinais no controle deColletotrichum acutatum,agentecausal da flor preta do morangueiro.Summa Phytopathologica. 35(3): 196-201.

Freeman, S. y T. Katan. 1997. Identificationof Colletotrichum species responsiblefor anthracnose and root necrosis ofstrawberry in Israel.Phytopathology.87:516-521.

French, E. y T. Hebert. 1980. Métodos deinvestigación fitopatológica. InstitutoInteramericano de Cooperación parala Agricultura. San José, Costa Rica.289 p.

Guevara, Y., A. Aponte y A. Maselli. 2004.Enfermedades del cultivo de la fresa

End of english version

which does not seem to be related tothe origin place or the organ fromwhich were isolated.

Urdaneta et al.

528

en dos localidades agrícolas de Araguay Miranda. INIA Divulga 3. 22-24 p.

Gunnell, P. y Gubler D.1992. Taxonomy anmorphology of Colletotrichumspecies pathogenic to strawberry.Mycologia. 84(2):157-165.

ImageJ. 2009. URL:http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html. ImageJ ImageProccessing and Analysis in Java.(Consulta: Septiembre 25, 2009).

Ivanoviæ, M., B. Duduk, M. Ivanoviæ y M.Ivanoviæ. 2007. Antharcnose-a newstrawberry disease in Serbia and itscontrol by fungicides. Proc. Nat. Sci.113: 71-81.

Leandro, L., M. Gleason, F.Nutter, S. Weguloy P. Dixon. 2001. Germination ysporulation of Colletotrichumacutatum on symptomlessstrawberry leaves. Phytophatology.91(7):659-664.

Oliveira, R., J. Moral, K. Bouhmidi y A.Trapero. 2005. Caracterizaciónmorfológica y cultural de aislados deColletotrichum spp. causantes de laantracnosis del olivo. Bol. San. Veg.Plagas. 31: 531-548.

Smith, B. 1990. Morphological, cultural, andpathogenic variation amongColletotrichum species isolated fromstrawberry. Plant Disease. 74: 69-76.

Smith, B. 2007. Developmental stage andtemperatura affect strawberryflower and fruit susceptibility toanthracnose. NASS/NASGAProceedings. 55-57.

Smith, B. 2008. Epidemiology and pathologyof strawberry anthracnose: a North

American perspective. HortScience.43(1):69-73.

Staòková, B., J. Víchová y R. Pokorný. 2011.Virulencia of Colletotrichumacutatum isolates to several hostplants. Acta UniversitatisAgriculturae Et SilviculturaeMendelianae Brunensis. LIX(3): 161-170.

Sutton, B. 1980. The Coelomycetes. Fungiimperfecti with pycnidia, acervuli andstromata. Commowealth MycologicalInstitute. Kew. Surrey, England. 696p.

Tanaka, M. y F. Passos. 2002. Caracterizaçãopatogênica de Colletotrichumacutatum e C. fragariae asociados àantracnose do morangueiro.Fitopatología Brasileira. 27:484-488.

Villanueva, R., M. Yáñez, A. Hernández.2008. Especies de Colletotrichum enchirimoya (Anonna cherimola Mill.).Agrociencia. 42(1):689-701.

Xie, L., J. Zhang, Y. Wan y D. Hu. 2010.Identification of Colletotrichum spp.isolated from strawberry in Zhejiangprovince and Shangai city, China. J.Zhejiang Univ-Sci B (Biomed &Biotecnnol). 11(1):61-70.

Zivkoviæ, S., S. Stojanoviæ, Z. Ivanoviæ, N.Trkulja, N. Dolovac, G. Aleksiæ y J.Bala•. 2010. Morphological andmolecular identification ofColletotrichum acutatum fromtomato fruit. Phytomed. (Belgrade).25(3): 231-239.

antracnosis causada por colletotrichum acutatum simmonds ......la antracnosis en el cultivo de la...

Documents