UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS SUBDIRECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO

Anteproyecto de tesis que presenta la Q.B.P. Martha Patricia Rodrguez Magaa como requisito para obtener el grado de Maestra en Ciencias con acentuacin en Qumica de Productos Naturales

TITULO PROVISIONAL Actividad antimicobacteriana de extractos de Juglans regia y Juglans mollis contra Mycobacterium tuberculosis intracelular

DIRECTOR Dra. Mara Azucena Oranday Crdenas

DISCIPLINA Y CAMPO DE INVESTIGACIN Aislamiento y caracterizacin de compuestos derivados de plantas de la familia Juglandaceae con efecto antimicrobiano sobre Mycobacterium tuberculosis.

LUGAR DE TRABAJO Laboratorio de Fitoqumica, Facultad de Ciencias Biolgicas, UANL Laboratorio de Qumica Analtica, Facultad de Medicina, UANL Centro Regional de Control de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Medicina, UANL

FECHA DE INICIO. Febrero de 2009

DURACION PROBABLE. 3 aos

RESUMEN

La tuberculosis, declarada una enfermedad de emergencia global desde 1993 por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), produce aproximadamente dos millones de defunciones al ao. Mycobacterium tuberculosis, principal causante de la enfermedad, es un organismo intracelular facultativo, una vez dentro de las clulas, puede encontrar un medio adecuado para su crecimiento evadiendo los mecanismos inmunes antimicrobianos, por lo que es importante que en el desarrollo de nuevos agentes antituberculosos se analice la efectividad de estos contra M. tuberculosis intracelular. Esto induce a la bsqueda de nuevos compuestos con acciones antibacterianas. Dentro de la familia Juglandaceae se encuentran algunas especies como encuentran algunas especies como Juglans regia y Juglans mollis, las cuales constituyen una alternativa en el combate contra microorganismos de importancia mdica, ya que estas plantas adems de que poseen diversas caractersticas tiles para el hombre, son consideradas efectivas en medicina tradicional para tratar otros padecimientos infecciosos de origen bacteriano por poseer metabolitos que pueden actuar como agentes bactericidas. Por lo tanto, si se asla, purifica y demuestra la actividad antimicrobiana de los compuestos presentes en las plantas de Nogal en estudio, sera de mucha utilidad para contribuir en la solucin de infecciones y complicaciones por este patgeno.

INTRODUCCIN

La medicina tradicional es una importante fuente de informacin etnobotnica, en la bsqueda de compuestos con actividad biolgica y farmacolgica. De las 265 mil especies de plantas que se calcula habitan el planeta, nicamente se han estudiado cientficamente entre 5 y 10 % en busca de actividad farmacolgica. Mxico es uno de los pases que presenta una mayor diversidad biolgica en el mundo, con aproximadamente 30,000 especies de plantas, lo cual representa un 10 % de la flora mundial. De las espcies de plantas presentes en Mxico, menos de 5,000 especies han sido estudiadas fitoqumicamente, en 3,000 especies se han encontrado propiedades medicinales y a un nmero an menor se le ha realizado estudios biolgicos o farmacolgicos (CONABIO, 2002). Recientemente, la medicina tradicional ha sido aceptada como forma alternativa en el cuidado de la salud as como para el descubrimiento y desarrollo de nuevos compuestos para el tratamiento de infecciones causadas por microorganismos con resistencia a los antibiticos. Lo anterior ha llevado a muchos investigadores a la bsqueda de actividad antimicrobiana en plantas medicinales (Nostro, et al., 2000). Las plantas medicinales y sus productos han sido utilizados a lo largo de la historia contra la tuberculosis, enfermedad infecciosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis. La tuberculosis es considerada como una enfermedad infecciosa re-emergente y un problema de salud pblica mundial, se estima que es la enfermedad que causa ms muertes que cualquier otra enfermedad infecciosa curable y fue declarada una emergencia global desde 1993 por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) (WHO, 2003). En la actualidad la OMS seala algunas prioridades para el control de la tuberculosis, en la que sobresale, la bsqueda y el desarrollo de nuevos

frmacos, mejorar los esquemas de tratamiento, acortar la duracin total de los mismos, as como ofrecer tratamiento contra cepas MDR-TB (WHO, 2003). Como M. tuberculosis crece como un organismo intracelular que sobrevive y se multiplica dentro de macrfagos y otras clulas del sistema reticulo endotelial de pacientes infectados. Dentro de estas clulas, los bacilos pueden encontrar un medio adecuado para su crecimiento evadiendo los mecanismos inmunes antimicrobianos, por lo que es importante encontrar futuros agentes antituberculosos que sean efectivos contra M. tuberculosis intracelular, y que presenten baja citotoxicidad.

DEFINICIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN

En las ltimas dcadas se han incrementado los reportes de cepas de M. tuberculosis resistentes a los frmacos utilizados actualmente como tratamiento, por lo que se han buscado otras alternativas para el tratamiento de la enfermedad . Una de las opciones es la bsqueda de extractos o compuestos de origen vegetal, que muestren actividad antituberculosa. En estudios previos se probaron los extractos de Juglans regia y Juglans mollis mostrando una actividad inhibitoria del crecimiento sobre M. tuberculosis en cultivos in vitro De acuerdo a stos resultados se pretende probar la actividad de los extractos de Juglans regia y Juglans mollis contra M. tuberculosis intracelular, que es como se encuentra en el organismo en la fase de infeccin latente o en la fase activa, en sta ltima fase, la micobacteria tiene la capacidad de multiplicarse dentro de los macrfagos, por lo que se pretende encontrar una inhibicin del crecimiento o encontrar una actividad antituberculosa de los extractos en estas fases de infeccin.

OBJETIVO GENERAL Determinar in vitro la actividad antimicobacteriana de extractos de Juglans regia y Juglans mollis contra M. tuberculosis intracelular.

OBJETIVOS PARTICULARES 1. Obtener el extracto etanlico de J. mollis 2. Obtener los extractos metanlicos de J. mollis. 3. Obtener los extractos hexnicos de J. mollis y J. regia 4. Identificar parcialmente los grupos qumicos presentes en cada extracto mediante pruebas coloridas. 5. Determinar la citotoxicidad de los extractos de J. mollis y J. regia sobre la lnea celular THP-1 monocitos/macrfagos. Determinar la actividad antimicobacteriana in vitro del extracto etanlico de J. mollis, el extracto metanlico de J. mollis, y los extractos hexnicos de J. mollis y J. regia contra M. tuberculosis intracelular mediante el conteo de UFC/ml. 6. Identificar parcialmente los compuestos presentes en los extractos probados.

HIPTESISLos extractos de J. mollis y J. regia y presentan actividad antimicobacteriana contra M. tuberculosis intracelular

ANTECEDENTESRoberto Koch en 1882 describi a M. tuberculosis como el agente causal de la tuberculosis. M. tuberculosis, es una bacteria resistente a cidos y lcalis por la compleja estructura hidrofbica presente en su pared. Su morfologa caracterstica suele ser bacilar, ligeramente curvos, son inmviles, no esporulados, y miden de 1 a 10 m de longitud y 0.2 a 0.6 m de ancho (figura 1).

fig. 1 Mycobacterium tuberculosis Es un patgeno intracelular facultativo que tiene la habilidad de persistir dentro de los macrfagos y otras clulas del sistema retculo endotelial (SER). M. tuberculosis al igual que los miembros de ste gnero presentan una estructura de la pared poco comn. El complejo de la pared celular consta de tres capas: 1) capa interna, constituida por el peptidoglicano, 2) capa media, compuesta por el arabinogalactano, en cuyos extremos distales estn esterificados los cidos miclicos, de tamao y estructura nica para las micobacterias, y 3) capa externa, a la cual se le atribuye una estructura glucolpida sulfatada. La membrana plasmtica aparece en secciones ultra finas como una membrana trilaminar clsica, con dos capas electrodensas separadas por una capa transparente,

presentando

algunos

componentes

distintivos

como

lipopolisacridos,

lipoarabinomanano (LAM) lipomananos y fosfatidil inositol-monosidos. Por esta razn sus clulas presentan una superficie crea externa que le confiere propiedades importantes como resistencia a muchos antibiticos y proteccin contra ambientes adversos. M. tuberculosis tiene crecimiento lento, observndose desarrollo de colonias entre 3 y 5 semanas. El bacilo de la tuberculosis es aerobio estricto y su crecimiento es favorecido con una atmsfera del 5-10 % de CO2, con una temperatura ptima de 37C (Wayne, 1994; Brennan, et al., 1994).

PATOGENIA

fig 2 M. tuberculosis se transmite de persona a persona mediante la inhalacin de microgotas, partculas de 1 a 5 m en dimetro que contienen al bacilo, las cuales son diseminadas en el ambiente cuando una persona enferma tose, estornuda, canta o incluso cuando respira (figura 2) (Edwards, et al., 1986; Bloom, 1994) . Una persona infectada puede permanecer as por muchos aos, sin desarrollar la enfermedad y la nica evidencia de un contacto previo con el bacilo o de infeccin, es la prueba positiva a la tuberculina. La infectividad est relacionada a ciertas caractersticas de la persona, y a los factores ambientales especficos tales como una pobre circulacin de aire, as como tambin el nmero de microorganismos requeridos para infectar a una persona, el cual se ha estimado en menos de diez bacilos (Bloom, 1994). El bacilo inhalado llega al rbol bronquial y se implantan en los bronquiolos respiratorios o en el alveolo, y en una primera etapa, un macrfago alveolar (MA) ingiere el bacilo inhalado y a menudo lo destruye (Figura 3) (Kaufmann, et al., 2002). M. tuberculosis es

capaz de sobrevivir dentro de los macrfagos, debido a que el bacilo inhibe la fusin de los lisosomas con las vacuolas fagocticas, adems de inhibir directamente los genes que codifican para el IFN-, ocasionando que los macrfagos no se activen, logrando as su supervivencia y multiplicacin dentro de los macrfagos (Ting LM et al., 1999). Posteriormente, los bacilos son ingeridos por otros MA y por macrfagos provenientes de la sangre, desarrollndose as la segunda etapa, en la que ni los macrfagos del hospedero, ni los bacilos se causan dao (Fenton, et al., 1996). Despus de 6 a 8 semanas de la infeccin, se afectan los ganglios regionales y se activan las clulas TCD 4+, secretando IFN-, que activa a los macrfagos y aumenta su capacidad para matar a las bacterias fagocitadas. (Robbins, 2004). El factor de necrosis totoral (TNF) producido por las clulas T y los macrfagos, atrae a los monocitos de la circulacin, activndolos y diferencindolos hacia los histiocitos epitelioides, caractersticos de la respuesta granulomatosa, adems de producir la activacin de macrfagos. (Abbas, 1999; Robbins, 2004).

fig. 3 Macrfago Alveolar La necrosis caseosa se inicia a travs de una reaccin de hipersensibilidad de tipo tardo (HTT), el cual es un mecanismo mediante el cual se destruyen los macrfagos no activados cargados de bacilos, y elimina un ambiente favorable para el crecimiento del bacilo, pero ocurre a costo del tejido del hospedero, correspondiendo a una tercera etapa (Rossman, et al, 1996, Robbins, 2004). Mientras se lleva a cabo la HTT, el organismo desarrolla la inmunidad mediada por clulas (IMC), la cual se caracteriza por la produccin de citocinas que atraen a los monocitos/macrfagos hacia la lesin y activndolos. Los macrfagos activados liberan productos intermediarios de O2 y N2, enzimas lisosomales y otros factores que matan y digieren a los bacilos tuberculosos. Durante la necrosis caseosa, los bacilos sobreviven sin poderse multiplicar, debido a las condiciones hostiles que prevalece en los focos caseosos (Smith, 2003).

fig 4 La cuarta etapa se caracteriza, en personas no inmunocompetentes, por una lisis de la protena semislida coagulada, debido a la presencia de enzimas hidrolticas, niveles altos de tuberculina reactiva y a la HTT licuando el tejido (Rook, et al., 1996). Esta sustancia licuada es evacuada por los bronquios y es eliminada como esputo, siendo txico a los tejidos por la presencia de la HTT, diseminndose a otras zonas del pulmn y al ambiente (Bloom, 1994). La quinta etapa puede presentarse, al vaciarse el absceso caseoso, producindose la caverna tuberculosa pulmonar (Figura 4). En esta caverna los macrfagos no sobreviven debido a cidos grasos txicos de las clulas del hospedero, o de algunos componentes de los bacilos, siendo los macrfagos ineficaces para controlar la multiplicacin extracelular de los bacilos que se encuentran en la caverna (Dannenberg,et al., 1994).

PLANTAS QUE HAN SIDO UTILIZADAS CONTRA M. tuberculosis Esteroles de Ruprechtia triflora y diterpenos de Calceolaria pinnifolia tuvieron un efecto inhibitorio en el crecimiento de M. tuberculosis, encontrando para los esteroles de R. triflora valores de CMI en el rango de 2-128 g/ml y para los diterpenos de C. pinnifolia valores de CMI de 4 g/ml y triterpenos de C. pinnifolia mostrando una CMI entre 8 y 16 g/ml. (Woldemichael, et al, 2003). Suksamrarn, et al., (2003) report que el extracto obtenido con cloroformo de Limnophila geoffrayi mostr actividad contra M. tuberculosis. Jimnez-Arellanes (2003) report que los extractos hexnicos de Artemisia ludoviciana, Chamaedora tepejilote, Lantana hispida, Juniperus communis y Malva parviflora, y extractos metanlicos de Artemisia ludoviciana y Juniperus communis inhibieron el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis. Salinas Gonzlez (2004), report que extractos hexnicos de la corteza de Carya illinoensis, Juglans mollis y Juglans regia presentaron actividad antimicobacteriana, mostrando una CMI de 31.25, 50 y 100 g/ml respectivamente, as como el extracto etanlico de J. mollis con una CMI de 100 g/ml, adems el extracto metanlico de C. illinoensis y J. mollis presentaron una CMI de 125 g/ml. Indicando que la actividad de los extractos hexnicos de la corteza de stas plantas, se debe probablemente al contenido de compuestos no polares, quinonas y a la presencia de triterpenos. Gu, et al., (2004) reportaron que los extractos obtenidos con diclorometano de Quinchamalium mayus presentaron actividad antituberculosa sobre M. tuberculosis. As mismo, encontraron que los extractos obtenidos con diclorometano de Senecio chionophilus y extractos hexnicos de Valeriana laxiflora exhiban tambin actividad contra M. tuberculosis.

Fracciones de extractos de Chrysanthemum morifolium identificadas como triterpenoides revelaron actividad contra M. tuberculosis mostrando una concentracin mnima inhibitoria (CMI) en el rango de 4-64 g/ml (Akihisa, et al., 2005). Por otra parte, en estudios recientes se han encontrado que algunas plantas no presentan una actividad directa sobre la bacteria, sino que se debe a una inmunoestimulacin, favoreciendo con ello el control del crecimiento y desarrollo intracelular del agente. A extractos metanlicos de Plantago major se le asoci con el aumento de la produccin de xido ntrico, as como la produccin de TNF- en macrfagos peritoneales de ratn (Gmez-Flores, et al., 2000). Kolodziej, et al., (2003) analizaron la planta Pelargonium sidoides, y encontr actividad antimicobacterial y actividad inmunoestimuladora, mediante una estimulacin de iNOS y TNF- en macrfagos de mdula sea de ratn. Rosales Hernndez (2004) report que los extractos hexnicos y metanlico de las hojas de Bocconia frutescens presentaron actividad directa contra M. tuberculosis mostrando una CMI de 125 g/ml, y mediante ensayos de RTPCR encontr que los extractos hexnicos y metanlico de las hojas de B. frutescens indujeron la expresin de IL-1 y la produccin de la enzima xido ntrico sintetasa inducible (iNOS) en macrfagos medulares de ratones BALB/c, pero no indujeron la expresin de IL-10, sugiriendo que tienen una actividad inmunoestimuladora. El extracto metanlico de Carpobrotus edulis inhibi el crecimiento de M. tuberculosis una vez que estaban fagocitadas por monocitos derivados a macrfagos humanos (Martins, et al., 2005).

MATERIAL Y MTODOS MATERIAL BIOLGICO Juglans regia L. En los libros de herbolaria y comnmente se le conoce como nogal de castilla, nogal de persa, nuez criolla, nuez de castilla. Clasificacin botnica Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta Superdivisin: Spermatophyta Divisin: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Hamamelidae Orden: Juglandales Familia: Juglandaceae Gnero: Juglans L Especie: Juglans regia L. Descripcin botnica Es un rbol que mide de ocho a quince metros de altura, con hojas de tres a cuatro centmetros de largo de color verde claro y lisas por el anverso, y en el reverso con pelos suaves (Martnez, 1979). Los frutos se encuentran en pares y la semilla en una bellota con forma ovoide. Es originaria del sureste de Europa, oeste de Asia. J. regia vive en clima templado entre los 1600 a los 2,750 m sobre el nivel del mar. Asociada a bosque mixto de pino-encino y de junperos. De las hojas se han identificado los monoterpenos borneol, betafarneseno, limoneno, linalol, miraceno, y ocimeno, y pireno y sabineno y los sesquiterpenos cariofileno, frneseno y germacreno, y la juglona. En las

hojas y pericarpio del fruto se han encontrado los componentes cidos cafico, clorognico, cumrico, ferlico y sinpico. El fruto contiene las quinonas juglona y 1,4-naftaquinona. En la corteza la juglona y regiona, los triterpenosbetulina y cido botulnico; sitosterol; el alcaloide berberina; el flavonoide catequina; y el cido cafico. La raz contiene las quinonas juglona, 3,3-bis-juglona y ciclo-trijuglona; y sitosterol. (INI, 1989) (Figuras 5 y 6).

Juglans mollis Clasificacin botnica Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta Superdivisin: Spermatophyta Divisin: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Hamamelidae Orden: Juglandales Familia: Juglandaceae Gnero: Juglans L Especie: Juglans mollis Nombres comunes: Nogal de nuez meca, nogal encarcelado, nuez corriente, Tih ti (mixteco), Tutiki (mixteco), Cuartololote.

Descripcin

Es un nogal silvestre que crece en reas cercanas a ros y arroyos, alcanza a medir hasta 18 m. de altura. Hojas compuestas de 5 a 9 hojuelas afelpadas. Las nueces no comestibles, de 3 a 4 cm., de la forma, color y tamao de un limn. Se localiza en Nuevo Len y en el Norte de San Luis Potos (Martnez, 1987) (Figuras 7 y 8).

PREPARACIN DEL MATERIAL VEGETAL. Se colectar y clasificar el material, se cortar en trozos pequeos y se secar en una estufa o a temperatura ambiente a peso constante, posteriormente se pesar cada planta por separado (ya seca) para realizar la extraccin por maceracin con un agitador a temperatura ambiente. EXTRACCIN DEL MATERIAL VEGETAL Se realizar una extraccin con solvente polar por la tcnica de maceracin a temperatura ambiente con agitacin, se depositar en un matraz 30 g del material vegetal en 250 ml de metanol y se sellar bien para posteriormente colocarlos en un agitador Dual Action Shaker Lab Line, por un periodo de 4 das, transcurrido este tiempo se separar el solvente del extracto por filtracin y utilizando el mtodo de evaporacin se eliminar el solvente. A continuacin el extracto obtenido se utilizar para la realizacin de la siguiente prueba microbiolgica.

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD BACTERICIDA Microorganismos: Mycobacterium tuberculosis (cepa H37Rv) Activacin de la cepa. Se utilizarn frascos de cultivo con medio Middlebrook 7H9 con Tween 80 y suplementado con cido oleico, albmina dextrosa y catalasa (OADC). Se colocar la cepa en estudio aislada para despus ser llevadas a la incubadora con agitacin continua por 7 das a 37 C .

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD TXICA Se preparar una solucin con 40 g de sal de mar por litro de agua y se filtrar, el agua se colocar en un recipiente pequeo, se agregarn las larvas de Artemia salina en uno de los lados del recipiente y se cubrirn de la luz. Se colocar una lmpara sobre el otro lado para atraer a las larvas ms fuertes a la parte no expuesta a la luz, por medio de una comunicacin en la parte inferior del recipiente. Para cada extracto se prepararn soluciones de 1000, 100 y 10 g/ml de cada extracto, al igual que el control (agua de mar) se realizar por triplicado. Despus de 24 horas cuando las larvas alcancen un tamao de aproximadamente 3 mm, se succionarn larvas con una pipeta Pasteur y se depositarn 10 en cada uno de los vasos, estos se aforarn a 5ml de agua de mar.

MTODOS CROMATOGRFICOS. En general la cromatografa es un proceso de migracin diferencial en el cual los componentes de una mezcla son transportados por una fase mvil que puede ser un lquido o un gas y son retenidos selectivamente por la fase estacionaria que tambin puede ser un liquido o un slido. La idea bsica es la separacin de los componentes de una mezcla, hacindola pasar a travs de un sistema que consta de una fase mvil y una fase estacionaria. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separaran en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente.

Cromatografa en capa fina Este mtodo es usado para la identificacin y aislamiento de los compuestos. Las placas cromatogrficas se prepararn, utilizando silica gel 60G y agua biodestilada en proporcin de 1:3 respectivamente, se aplicar sobre las placas, se dejarn secar por un periodo de una hora en la estufa a 100C. En la placa seca se colocar la muestra por medio de un capilar, la placa se introducir a una cmara de vidrio de boca ancha con el eluente de diferente polaridad y mezclas de los mismos en diversas proporciones. Para calcular el Rf se mide la distancia del punto de aplicacin de la muestra hasta la mitad de la mancha detectada y se divide este valor entre la distancia del punto de aplicacin y el frente del eluente. Forma de aplicar la muestra: una gota de la muestra se coloca en la fase estacionaria (con tubos capilares), se deja secar y se remarcan las gotas varias veces asegurndose de colocarlas exactamente en la misma posicin. Desarrollo cromatogrfico: la placa en la cual se coloca la muestra a separar, se introduce en un recipiente que contenga el solvente. Los compuestos se separan en base a las diferencias de absorcin con la silica gel y en la diferente interaccin que tiene cada uno con el solvente.

CROMATOGRAFA PREPARATIVA EN CAPA FINA Este mtodo se utilizar para la separacin y purificacin de los

componentes de mezclas difciles de separar. Para ellos se emplean placas de cromatografa de capa delgada de mayores dimensiones, en las que el espesor de la capa absorbente es mayor. Se utilizan placas de 20cm x 5 mm de espesor. La mezcla se aplica en forma continua a todo lo ancho de la placa y se eluye en la mezcla de solventes. Despus de eluda se deja secar perfectamente, se localizan la o las bandas deseadas por medio de luz

ultravioleta, se separan las bandas del gel de silica que contienen los compuestos deseados y se extraen con metanol. Agentes cromognicos: Para observar el cromatograma y localizar los componentes, que no son perceptibles en el espectro visible, se utiliza la lmpara de luz ultravioleta.

LOCALIZACIN DE LOS COMPUESTOS ACTIVOS Bioautografa: La bioautografa se basa en la tcnica de difusin en placa, en donde el compuesto bactericida es transferido de la placa cromatografca a una capa de agar inoculado con el microorganismo en estudio. Las zonas de inhibicin se visualizan despus de un periodo de incubacin de 18-24 horas a 37 C En el presente trabajo se utilizar una tcnica de bioautografa modificada, la cual puede detectar concentraciones mnimas del compuesto responsable de la actividad biolgica y se observar a simple vista la zona de inhibicin. Para esto se realizarn cromatgramas en capa fina utilizando placas de vidrio de 2.5 x 7.5 cm. con las manchas ya localizadas; se colocan en una caja petri estril; despus de esto bajo el mechero se le coloca un trozo largo, angosto y de unos 3 mm de espesor de medio slido (se coloca un algodn para recolectar la humedad del medio). Posteriormente se sembrar con el microorganismo con una micropipeta distribuyndolo uniformemente con un asa bacteriolgica. Se incuba durante el tiempo necesario para el microorganismo y se observa el rea sin crecimiento microbiano. Se determinarn los valores promedio de los ensayos de MIC; se obtendrn las desviaciones estndar de la actividad biolgica sobre bacterias y las diferencias se determinarn por ANOVA de un factor con nivel de significancia de 0.05 con el programa estadstico SPSS versin 11.0. Para la determinacin de la

letalidad en A. salina se utilizar el Anlisis PROBIT para determinar la DL50. Aislamiento de compuestos activos: A las fracciones que presenten actividad biolgica, se purificarn y determinar su naturaleza qumica. PRUEBAS QUMICAS Los extractos que presenten mayor actividad biolgica se sometern a pruebas qumicas con el fin de conocer sus grupos funcionales al igual que sus metabolitos secundarios que estos poseen. Pruebas para grupos Funcionales. Prueba de Salkowski: La muestra (1-2 mg) se colocar en 1.0 ml de cloroformo en contacto con 1 ml de cido sulfrico, desarrollando colores amarillo o rojo, para esteroles y metilesteroles. Prueba de Shinoda: Para compuestos de tipo flavonoides; 1.0 mg de la muestra se disolver en etanol y se le agregarn unas limaduras de magnesio, se le aplicar calor (60 C) y despus unas gotas de HCl por las paredes. Se considera positiva con la aparicin de colores naranja-rojo, rosa, azul o violeta.

Prueba de cido Sulfrico: Para flavonoides; una pequea cantidad de muestra se disolver en cido sulfrico concentrado y se considera positiva si se observan coloraciones amarillo para flavonas y flavonoides, naranja-guinda para flavonas; rojoazulosos, para chalconas.

Prueba de Baljet: Para sesquiterpenlactonas; se utilizan 2 soluciones que se mezclan en volmenes iguales antes de usarse, la solucin A) un gramo de cido pcrico en 100 ml de etanol; solucin B) 10 gramos de hidrxido de sodio en 100 ml de agua. La prueba se considera positiva si se forma una coloracin naranja o rojo oscuro.

Prueba de Dragendorff: Modificacin de Munier y Machelobuf. Para alcaloides. Solucin A: Se disuelven 0.85 g de nitrato de bismuto, en una mezcla de 10 ml de cido actico glacial y 40 ml de agua.

Solucin B: Se disuelven 8 gramos de yoduro de potasio en 20 ml de agua. El reactivo se preparar mezclando 5 ml de solucin A, 4 ml de solucin B y 100 ml de agua. La prueba se considera positiva para alcaloides al dar la placa coloraciones rojas o naranjas, persistentes por 24 horas. Prueba de Permanganato de potasio: Para dobles enlaces, se preparar una solucin de permanganato de potasio al 2% en agua, se disolvern 0.2 mg de muestra en agua, acetona o metanol y se le agregar la solucin de permanganato de potasio. La prueba se considera positiva al producir la decoloracin del reactivo. Prueba de cloruro frrico. Para oxhidrilos fenlicos una pequea cantidad de muestra en etanol y se aade una gota de solucin de cloruro frrico en agua (2.5%), la aparicin de una coloracin o precipitado rojo, azul, violeta o verde se considera positiva.

Prueba de 2,4-Dinitrofenilhidracina: Para grupo carbonilo; en un tubo de ensaye se disolvern 50 mg de 2,4dinitrofenilhidracina en 1 ml de etanol caliente. Se agregarn 50 mg del compuesto carbonlico y se calienta a bao Maria por 10-15 minutos; se deja en reposo y luego se enfra a bao de hielo, la aparicin de un precipitado naranja indica la presencia de un grupo carbonilo. Prueba de Molisch: Para azucares; en un tubo de ensaye se colocar la muestra, se le aadir el reactivo de Molisch, (3 gotas) y se agitar. Despus se inclinar el tubo y se depositar por la pared 2 ml de cido sulfrico concentrado. La prueba se considera positiva si se forma un anillo coloreado en la interfase. El reactivo se prepara disolviendo 1 gramo de -naftol en 100 ml de etanol al 95%.

DISEO EXPERIMENTALExtractos de diferente polaridad de 3 plantas y fracciones

Actividad Antibacterial

Ensayo de Letalidad

4 repeticiones, diluciones seriadas y control positivo y negativo, n=4

5 repeticiones, 5 concentraciones y control positivo y negativo, n=5

ANOVA Nivel de significancia 0.05

DL50 PROBIT

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ACTIVIDAD Elaboracin anteproyecto y bsqueda bibliogrfica Cursar materias de especialidad Colecta de material vegetal Clasificacin Taxonmica Preparacin de material vegetal Preparacin de material vegetal Cursar materias de especialidad Revisin bibliogrfica Obtencin de extractos con solventes no polares Obtencin de extractos con solventes polares Concentracin de extractos Evaluar actividad antimicrobiana Evaluar actividad antimicrobiana (CMI) Evaluar actividad antimicrobiana (CMI) Evaluar citotoxicidad en A. salina Evaluar citotoxicidad en A. salina MARZO 2010 ABRIL 2010 MAYO 2010 Obtencin de la CMI de los extractos activos MARZO 2009 ABRIL 2009 MAYO 2009 JUNIO 2009 JULIO 2009 AGOSTO 2009 SEPTIEMBRE 2009 OCTUBRE 2009 NOVIEMBRE 2009 DICIEMBRE 2009 ENERO 2010 FEBRERO 2010 Material vegetal seco y pulverizado Aprobar cursos Actualizacin en Tcnicas Fotoqumicas Extracto hexnico y clorofrmico Extracto metanlico Por ciento de rendimiento de extractos Obtencin de extractos activos Plantas recolectadas Identificacin y depsito en Herbario UANL MES FEBRERO 2009 RESULTADOS ESPERADOS Anteproyecto de Maestra Aprobar cursos

Obtencin de la DL50

Separacin por cromatografa de los extractos activos Separacin por cromatografa de los extractos activos Bioautografa con bacteria CCF preparativa de extractos activos CCF preparativa de extractos activos Purificacin de compuestos activos Purificacin de compuestos activos Purificacin de compuestos activos Citotoxicidad de compuestos activos Identificacin parcial de compuestos activos Anlisis espectroscpico por RMN, IR y EM Anlisis espectroscpico por RMN, IR y EM Anlisis de resultados de espectros Anlisis estadstico de resultados Preparacin de artculo en revista indexada Preparacin de artculo en revista indexada Escritura de Tesis

JUNIO 2010

JULIO 2010

Separacin preliminar de fracciones de extractos activos Identificacin de las fracciones activas

AGOSTO 2010 SEPTIEMBRE 2010 OCTUBRE 2010 NOVIEMBRE 2010 DICIEMBRE 2010 ENERO 2011 FEBRERO 2011 MARZO 2011 ABRIL 2011 MAYO 2010

Fracciones activas

Compuestos activos puros DL50 de compuestos puros Metabolitos presentes

Obtencin de espectros

JUNIO 2011 JULIO 2011 AGOSTO 2011 SEPTIEMBRE 2011 OCTUBRE 2011 NOVIEMBRE 2011 DICIEMBRE 2011

Elucidacin de estructuras Validacin de resultados

Artculo cientfico

Tesis de Maestra Aprobada Obtencin de Grado

Presentacin de examen

de grado

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COMIT DE TESIS:

Dra. Azucena Oranday Crdenas

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Dra. Catalina Rivas Morales

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Dra. Mara Julia Verde Star

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Dra. Elvira Garza Gonzlez

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Dra. Noem Waksman de Torres

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ALUMNA: QBP Martha Patricia Rodrguez Magaa ______________________