ann-sofie ryckx...“metabolisme van hif modulatoren d.m.v. in vitro ... ugt...

“Metabolisme van HIF modulatoren d.m.v. in vitro

modellen”

Ann-Sofie Ryckx

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad

van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Dr. Leen Lootens

Co-promotor: Prof. Dr. Ir. Peter Van Eenoo

Begeleider: Lore Geldof

Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en

Immunologie

Academiejaar 2015-2016

Voorwoord

Toen ik vorig jaar vernam dat ik mijn masterproef kon uitvoeren in het DoCoLab, was ik

bijzonder enthousiast en opgetogen. De vreugde was des te groter toen ik na de uitleg van

mijn thesisonderwerp aan vrienden en familieleden eveneens besefte dat zelfs niet-

wetenschappelijke leken zich iets konden voorstellen bij mijn onderzoeksthema.

Graag wil ik enkele mensen bedanken die een belangrijke rol gespeeld hebben bij het tot stand

brengen van deze thesis. Allereerst professor Peter Van Eenoo, bedankt om ons te voorzien

van interessante en uitdagende masterproef onderwerpen. Het was een hele eer om deel te

mogen uitmaken van uw onderzoeksteam. Ook mijn promotor doctor Leen Lootens wil ik

bedanken, vooral om mij in het eerste jaar zo goed op te leiden. Mijn grootste dank gaat uit

naar mij begeleidster Lore Geldof. Zonder jou zou de uitvoering van mijn masterproef nooit

zo vlot verlopen zijn. Je leerde me zoveel bij en maakte altijd tijd voor me vrij, ook al had je

het zelf druk met het schrijven van je doctoraat. Ook bedankt om mijn thesis frequent en

grondig na te lezen en me bij te sturen waar nodig. Je bent een begeleidster uit de duizend!

Verder wil ik ook alle andere medewerkers van het DoCoLab bedanken voor de hulp waar

nodig en voor de aangename sfeer tijdens de pauzes.

Ik wil ook al mijn vrienden bedanken en dan in het bijzonder Lise, ik kan me geen betere

vriendin voorstellen dan jou. We kennen elkaar al lang, maar samen gaan studeren heeft ons

nog zoveel dichter bij elkaar gebracht. Bedankt om er altijd voor me te zijn. Margot, Magalie

en Gamze, bedankt voor de toffe momenten tijdens de lessen. Laurie, bedankt om de tijd in

het labo zo aangenaam te maken. We konden altijd bij elkaar terecht en hebben veel gelachen

doorheen het jaar.

Mijn ouders en grootouders, bedankt voor de onvoorwaardelijke liefde en de nooit aflatende

steun. Bedankt om in mij te blijven geloven en mij volledig te laten ontplooien tot een

zelfstandige vrouw.

Tot slot wil ik mijn grote liefde Jelle bedanken. Al 7 jaar maak je me de gelukkigste vrouw ter

wereld. Ik kijk naar je op en leer nog elke dag bij van je. Mede dankzij jou ben ik de persoon

die ik op vandaag ben. Jouw steun hielp me doorheen de moeilijke momentjes, zonder jou zou

ik mijn opleiding nooit met succes beëindigd hebben. Je zou kunnen zeggen dat je mijn

doping in het leven bent, een geluk dat je niet verboden bent!

Inhoudstafel

Samenvatting .............................................................................................................................. 1

Summary .................................................................................................................................... 2

1. Inleiding .............................................................................................................................. 3

1.1 Doping en sport ........................................................................................................... 3

1.2 Hypoxia inducible factor (HIF) ................................................................................... 5

1.2.1 HIF-stabilisatoren ................................................................................................. 6

1.2.2 HIF-inhibitoren ................................................................................................... 10

1.3 Metabolisme .............................................................................................................. 11

1.4 In vitro proeven: Humane levermicrosomen (HLM) & S9-leverfracties .................. 12

1.4.1 HLM ................................................................................................................... 12

1.4.2 S9-leverfracties ................................................................................................... 13

1.5 Staalvoorbereiding ..................................................................................................... 14

1.6 Chromatografie .......................................................................................................... 15

1.6.1 Vloeistofchromatografie ..................................................................................... 15

1.6.2 Gaschromatografie ............................................................................................. 16

1.7 Massaspectrometrie ................................................................................................... 17

1.8 Doel thesis ................................................................................................................. 21

2. Materialen en Methoden ................................................................................................... 22

2.1 Producten en reagentia ............................................................................................... 22

2.2 Zuiverheidsanalyse van de referentiestandaarden ..................................................... 22

2.3 In vitro incubatie met HLM en S9 ............................................................................. 23

2.4 Staalvoorbereiding ..................................................................................................... 24

2.5 Instrumentatie ............................................................................................................ 25

2.5.1 LC-HRMS .......................................................................................................... 25

2.5.2 GC-MS(/MS) ...................................................................................................... 26

2.6 Methodevalidatie ....................................................................................................... 27

3. Resultaten & bespreking ................................................................................................... 29

3.1 In vitro experimenten ................................................................................................. 29

3.1.1 BAY 87-2243 ..................................................................................................... 29

3.1.2 BAY 85-3934 ..................................................................................................... 34

3.1.3 FG-4592 ............................................................................................................. 38

3.1.4 FG-2216 ............................................................................................................. 42

3.2 Methodevalidatie ....................................................................................................... 46

3.2.1 LOD .................................................................................................................... 46

3.2.2 Matrix effect ....................................................................................................... 46

3.2.3 Specificiteit en selectiviteit ................................................................................ 46

3.2.4 Extractie-rendement ........................................................................................... 47

3.2.5 Carry-over .......................................................................................................... 47

3.3 Retrospectieve studie ................................................................................................. 47

4. Conclusie ........................................................................................................................... 48

5. Referentielijst .................................................................................................................... 49

Lijst met afkortingen

ADME

BAY

absorptie, distributie, metabolisatie, eliminatie

Bayer

CBP cAMP responsibe element binding protein

CI chemical ionization

CKD chronic kidney disease

COE Council of Europe

CYP cytochroom P450

DME drug metabolizing enzyme

DoCoLab dopingcontrolelaboratorium

EI electron ionization

EIC extracted ion chromatogram

EPO erytropoëtine

ESA erytropoëse-stimulerend agens

ESI

FG

electrospray ionization

FibroGen

FIFA Fédération Internationale de Football Association

FIH factor-inhiberend HIF

GC gaschromatografie

HIF hypoxia inducible factor

HPLC high-performance liquid chromatography

HRMS high-resolution mass spectrometry

IAAF International Association of Athletics Federations

IOC Internationaal Olympisch Comité

LC liquid chromatography

LLE liquid liquid extraction

LOD limit of detection

m/z massa tot lading verhouding

MS massaspectrometrie

NADPH nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat

OPO Organ Procurement Organization

PC parent compound

PHD prolyl hydroxylase

ppm parts per million

pVHL von Hippel Lindau proteïne

rhEPO recombinant humaan erytropoëtine

RI replacement index

RT retentietijd

SPE solid phase extraction

TIC total ion chromatogram

UCI Union Cycliste Internationale

UDP uridinedifosfaat

UDPGA uridine 5'-difosfo-glucuronide zuur

UGT UDP-glucuronyltransferase

uPA urokinase-type plasminogen activator

UPLC ultra-performance liquid chromatography

VEGF vascular endothelial growth factor

WADA Wereld Anti-Doping Agentschap

1

Samenvatting

Achtergrond: Hypoxia inducible factor (HIF) is een transcriptiefactor die de transcriptie van

onder andere de erytropoëtine (EPO) genen reguleert bij de reactie van het lichaam op

zuurstoftekort. EPO is een erytropoëse-stimulerend agens (ESA) waarbij een verhoging van

de rode bloedcelmassa waargenomen wordt. Hierdoor kan het lichaam meer zuurstof

transporteren naar de weefsels wat leidt tot een verbeterde prestatie en uithouding. HIF-

stabilisatoren worden momenteel onderzocht omwille van hun mogelijkheid tot het activeren

van het endogeen erytropoëtisch systeem door de condities van hypoxie na te bootsen.

Omwille van deze reden lopen HIF-stabilisatoren het risico misbruikt te worden door atleten.

Het WADA reageerde door de HIF-stabilisatoren op de verboden lijst te plaatsen. Jammer

genoeg vindt misbruik van deze producten nog steeds plaats. Daarom is het belangrijk dat

metabolismestudies uitgevoerd worden, zodat hun aanwezigheid in de toekomst efficiënt kan

nagegaan worden tijdens routine controles.

Methoden: In deze masterproef werd het fase I en fase II metabolisme van drie HIF-

stabilisatoren (BAY 85-3934, FG-4592 en FG-2216) en één HIF-inhibitor (BAY 87-2243)

bestudeerd. In vitro proeven werden uitgevoerd aan de hand van humane levermicrosomen

(HLM) en S9-leverfracties, waarna detectie plaatsvond via LC-HRMS.

Resultaten: Voor BAY 87-2243 werden drie metabolieten teruggevonden (M1-M3). M1

(verlies van cyclopropaan) werd zowel enzymatisch als niet-enzymatisch gevormd, M2

(hydroxylatie van M1) en M3 werden enkel enzymatisch gevormd. Vier metabolieten werden

gedetecteerd voor BAY 85-3934 (A1-A4). A1 (hydroxylatie PC), A2 (hydroxylatie +

ringopening PC) en A4 (glucuronidatie PC) werden enkel enzymatisch gevormd, A3 werd

ook niet-enzymatisch gevormd. Voor FG-4592 konden twee metabolieten gedetecteerd

worden (X1-X2) . Zowel X1 (hydroxylatie PC) als X2 (glucuronidatie PC) werden enkel

enzymatisch gevormd. Als laatste werden voor FG-2216 drie metabolieten teruggevonden

(Y1-Y3). Y1 (hydroxylatie PC) en Y2 (glucuronidatie PC) werden enkel enzymatisch

gevormd, Y3 (hydroxylatie PC + verlies van Cl-) werd ook niet-enzymatisch gevormd. Als

laatste stap werden product ion scan analyses uitgevoerd. Aan de hand van de hierbij

gevormde fragmentionen konden hypothetische structuren voorgesteld worden voor elk van

de metabolieten.

Conclusie: Alle vier de componenten zijn metabolisch redelijk stabiel zijn, aangezien telkens

maar enkele metabolieten gevormd werden.

2

Summary

Background: HIF stabilizers can activate the endogenous erythropoietin system through

mimicking hypoxia. The resulting increased red blood cell levels and therefore improved

oxygen transport, makes these HIF stabilizers attractive for misuse by athletes. Consequently,

WADA added this group of substances to the prohibited list. Despite their efforts, it is still

necessary to perform metabolic studies with these HIF stabilizers to detect misuse by athletes

in the future.

Methods: The metabolism of three HIF stabilizers (BAY 85-3934, FG-4592 and FG-2216)

and one HIF inhibitor (BAY 87-2243) was studied using human liver microsomes (HLM) and

S9 liver fractions. The metabolites were detected by LC-HRMS, their potential structures

were deducted from the fragmentation patterns.

Results: Three metabolites were found for BAY 87-2243: the loss of cyclopropane (M1), a

hydroxylation of M1 (M2) and a loss of C5H6 (M3). For BAY 85-3934 four metabolites were

detected: a hydroxylation (A1), a hydroxylation combined with a ring opening (A2), a loss of

C3HN3O (A3) and a glucuronidation of the parent compound (PC) (A4). For FG-4592 two

metabolites were detected: a hydroxylation (X1) and a glucuronidation (X2) of the PC.

Finally, three metabolites were found for FG-2216: a hydroxylation (Y1) and a

glucuronidation (Y2) and a hydroxylation combined with the loss of chloride (Y3) of the PC.

Conclusion: The metabolism of BAY 87-2243, BAY 85-3934, FG-4592 and FG-2216 was

studied using HLM and S9 liver fractions. All four components showed great metabolic

stability, as only a limited number of metabolites were observed.

3

1. Inleiding

1.1 Doping en sport

Het gebruik van verboden dopeermiddelen komt voor in alle sporten en op elk niveau.

Internationale sportfederaties proberen al tientallen jaren het verspreiden van dit probleem te

voorkomen aan de hand van educatie en testen. Er komen echter steeds nieuwe, nog

ondetecteerbare middelen en technieken op de markt die verspreid worden via een

gespecialiseerd netwerk.1

Prestatie bevorderende middelen zijn niets nieuws. Griekse olympische atleten en Romeinse

gladiatoren maakten rond de 3e eeuw v.Chr. reeds gebruik van paddenstoelen, planten en

mengsels van kruiden en wijn omwille van hun stimulerende effecten inzake snelheid en

uithouding, alsook voor hun pijnstillende effecten.1

Het moderne dopingtijdperk ontstond in het begin van de 20ste eeuw. Toen werden vaak

mengsels van strychnine, heroïne, cocaïne en cafeïne gebruikt door atleten. Dit tot heroïne en

cocaïne enkel nog verkrijgbaar waren op voorschrift in 1920, daarna werd vooral het gebruik

van amfetamines erg populair. Vanaf 1950 werd het gebruik van mannelijke hormonen

(testosteron) populair om de atleten sterker te maken.1,2 In 1928 was de International

Association of Athletics Federations (IAAF) de eerste instantie die het gebruik van doping

verbood. In die tijd waren geschikte testen nog niet beschikbaar, dus ze moesten de atleten op

hun woord geloven wanneer deze beweerden geen verboden middelen te gebruiken.1,3

Toen de negatieve gevolgen van doping op de gezondheid van individuen duidelijk werden,

werd in 1960 de “Council of Europe” (COE) opgericht. Zij publiceerden een initiële lijst met

daarop verschillende verboden dopeermiddelen. Pas in 1966 werden door de FIFA

(Fédération Internationale de Football Association) en de UCI (Union Cycliste Internationale)

de eerste dopingtesten uitgevoerd tijdens hun respectievelijke wereldkampioenschappen. Het

Internationaal Olympisch Comité (IOC) stelde in 1967 een medische commissie samen met

als doel het voorkomen van het gebruik van doping in de sport, bijgevolg dienden ook zij een

lijst bij te houden met daarop alle verboden middelen en de methodes. In 1972 introduceerden

zij algemene dopingtesten tijdens de Olympische Spelen in München.1,3

In de jaren ’70 werden de anabole steroïden steeds populairder en wanneer men hiervoor een

geschikte detectiemethode gevonden had, werden ook deze drugs toegevoegd aan de lijst met

4

verboden middelen van het IOC. Dit had tot gevolg dat veel meer diskwalificaties door

doping plaatsvonden.1,3

Nu de strijd tegen stimulantia en steroïden volop bezig was, verschoof de focus bij de atleten

meer naar bloeddoping. Bij deze vorm van doping werd bloed afgenomen bij de atleet en later

opnieuw toegediend om zo de concentratie aan hemoglobine te verhogen en dus ook het

zuurstoftransport te verbeteren. Pas in 1986 werd bloeddoping verboden door het IOC. Onder

andere de vondst van een groot aantal stalen recombinant humaan erythropoëtine en andere

verboden middelen tijdens de Tour de France in 1998 zorgden voor de oprichting van het

Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA) in 1999. Het WADA wordt tot op vandaag gezien

als een internationaal onafhankelijk en niet-gerechtelijk agentschap dat eenheid moet brengen

in de strijd tegen doping. Ze moeten onder andere de inspanningen van de sportorganisaties en

overheidsinstanties coördineren.1,3

Het WADA voorziet de ‘World Anti-Doping Code’ en publiceert ook jaarlijks de ‘Prohibited

List’. Zoals de naam doet vermoeden beschrijft deze lijst alle middelen en methoden die

verboden zijn in de sport. Het is echter geen gesloten nominatieve lijst, want ook alle

structuuranalogen of gelijkaardige producten zijn verboden.

In deze lijst wordt onderscheid gemaakt tussen middelen en methoden die te allen tijde

verboden zijn (zowel binnen als buiten de competitie) en middelen en methoden die enkel

binnen de competitie verboden zijn.4

In die eerste categorie worden de volgende middelen beschreven: middelen die nog niet

goedgekeurd zijn, anabolen, peptidehormonen, groeifactoren en aanverwante substanties,

mimetica, β-2 agonisten, hormonen en metabolische modulatoren, diuretica en maskerende

middelen. De verboden methoden die onder deze categorie vallen zijn het manipuleren van

bloed en bloedcomponenten, chemische en fysische manipulatie en gendoping. Middelen die

enkel binnen de competitie verboden worden zijn: stimulantia, narcotica, cannabinoïden en

glucocorticoïden. Als laatste worden de substanties vermeld die enkel verboden worden in

bepaalde sporten, zoals de autosport. Hieronder vallen alcohol en β-blockers.4

Het WADA promoot wereldwijd onderzoek op vlak van doping. Aan de hand van onderzoek

hopen ze nieuwe dopeermiddelen en -methoden te kunnen identificeren en detecteren, alsook

nieuwe modellen te ontwikkelen voor een verbeterde detectie.5 Laboratoria die analyses van

dopingcontroles van sporten die onder de World Anti-Doping Code vallen willen uitvoeren,

moeten accreditatie van het WADA verkrijgen en behouden. Wereldwijd zijn er 34

5

geaccrediteerde laboratoria, waaronder ook het DoCoLab (dopingcontrolelaboratorium) te

Zwijnaarde.6

1.2 Hypoxia inducible factor (HIF)

HIF (hypoxia inducible factor) is een transcriptiefactor die zowel lokaal als systemisch een

kritische rol speelt bij de reactie van het lichaam op zuurstoftekort (hypoxie). HIF reguleert de

transcriptie van meer dan 200 genen, waaronder de erytropoëtine (EPO) genen en ‘vascular

endothelial growth factor’ (VEGF).7 EPO is een erytropoëse-stimulerend agens (ESA) waarbij

een verhoging van de rode bloedcelmassa waargenomen wordt. Hierdoor kan het lichaam

meer zuurstof transporteren naar de weefsels wat leidt tot een verbeterde prestatie en

uithouding.8

‘Hypoxia-inducible factors’ zijn zuurstofgevoelige transcriptiefactoren. HIF’s bestaan uit een

zuurstofgevoelige α-subunit (HIF-1α, -2α en -3α) en een β-subunit, HIF-1β. Onder normale

zuurstofomstandigheden (normoxie) zorgt prolyl hydroxylase (PHD) ervoor dat HIF-α

gehydroxyleerd voorkomt (Figuur 1). Samen met het von Hippel Lindau proteïne (pVHL)

vormt het gehydroxyleerd HIF-α een complex. Uiteindelijk wordt het E3 ubiquitine ligase

complex gevormd dat HIF-1α target voor proteolytische degradatie door het proteasoom.

Bij hypoxie wordt HIF-α gestabiliseerd en dimeriseert het met HIF-β in de nucleus met

vorming van het transcriptioneel actieve HIF.

In een normaal ontwikkelde nier komt HIF-1α tot expressie in de meeste celtypes, HIF-2α

daarentegen wordt hoofdzakelijk teruggevonden in renale interstitiële fibroblastachtige cellen

en endotheelcellen. Aangezien de nieren de belangrijkste productiesite voor EPO zijn, is het

voornamelijk HIF-2α die instaat voor de productie ervan. HIF-1α stimuleert dan weer vooral

glycolytische enzymen. De rol van HIF-3α blijft grotendeels onbekend.7–10

6

Figuur 1: HIF-1α degradatie bij normoxie versus HIF-1α stabilisatie bij hypoxie. Normoxie: in aanwezigheid

van zuurstof hydroxyleert PHD HIF-1α dat op zijn beurt bindt met het von Hippel Lindau proteïne. Dit zorgt

voor de poly-ubiquitinatie van HIF-1α door het E3 ubiquitine ligase en bijgevolg degradatie van HIF-1α door het

proteasoom. Hypoxie: zuurstofgebrek voorkomt de hydroxylatie van HIF-1α door PHD, wat zorgt voor de

stabilisatie van HIF-1α. HIF-1α kan dan migreren naar de kern en daar associëren met HIF-1β en de cofactor

p300/CBP (cAMP responsibe element binding protein). Het HIF-1 complex bindt met en induceert de

transcriptie van genen die ‘hyoxia-responsive elements’ (HRE) bevatten met 5’-ACGTG-3’ als sequentie in hun

promoterregio.11

1.2.1 HIF-stabilisatoren

HIF-stabilisatoren behoren tot de groep van farmacologische actieve stoffen die onderzocht

worden voor hun mogelijkheid tot het activeren van het endogeen erytropoëtisch systeem

door de condities van hypoxie na te bootsen (Figuur 2). Het is aangetoond dat de concentratie

hemoglobine in het bloed significant stijgt na de orale administratie van een HIF-stabilisator.

Het gevaar hierbij is dat de bloedviscositeit en de ‘afterload’ van het hart toenemen bij

toenemende hematocrietwaarden, terwijl de bloedstroom naar de hersenen daalt. Dit kan

hartfalen veroorzaken, alsook myocardinfarct en/of embolieën. Tijdens de competitie kan het

risico op deze aandoeningen nog toenemen. De bloedviscositeit stijgt dan namelijk nog meer

door overmatig transpireren en door de relocatie van intravasculair vocht naar het interstitium.

7

Figuur 2: Farmacologische activatie van HIF en de functionele gevolgen ervan. α-Ketoglutaraat competitors (bv.

FG-2216), ijzerchelatoren en divalente kationen inhiberen hydroxylatie en degradatie van HIF-α. Xenon

daarentegen zou HIF-α translatie stimuleren. HIF target de genen die betrokken zijn in o.a. erytropoëse, glucose

metabolisme en bloedvaten. (Aangepaste figuur uit referentie 12)

Aangezien HIF de EPO-genen kan activeren bij hypoxie en dus het aantal rode bloedcellen

kan doen toenemen wordt ze gezien als een interessante target bij de behandeling van onder

andere anemie of bloedarmoede. Experimentele en klinische studies hebben aangetoond dat

deze behandeling mogelijks geen drugresistentie en cardiovasculaire ziekten zou veroorzaken,

wat wel vaak opgemerkt wordt bij andere behandelingsmethoden van anemie.7,13 Bij ‘chronic

kidney disease’ (CKD) bijvoorbeeld veroorzaakt een verminderde expressie van het EPO-gen

anemie. De standaard behandeling voor deze anemie bestaat uit de injectie van humaan

recombinant eytropoëtine (rhEPO). Deze behandeling kan echter leiden tot rhEPO

concentraties die veel hoger liggen dan die van het endogeen EPO en er is bewijs dat dit

hypertensie veroorzaakt bij patiënten met CKD. Mede daardoor worden HIF-stabilisatoren als

een veelbelovend alternatief voor rhEPO beschouwd. Deze kandidaat drug werkt als een

inhibitor van PHD dat instaat voor de zuurstofafhankelijke stabilisatie van de

transcriptiefactor. HIF-stabilisatoren, zoals BAY 85-3934, FG-4592 en FG-2216 worden

daarom ook aangeduid als HIF-PHD-inhibitoren.14,15

Zoals eerder vermeld wordt de expressie van EPO onderdrukt bij normoxie. Dit omdat HIF-

PHD HIF-α hydroxyleert op bepaalde prolyl-residuen wat zorgt voor inactivatie van deze

laatste. De hydroxylatie van de HIF-α eenheid door asparaginyl-hydroxylasen vermindert de

8

transcriptionele activiteit van HIF-α door binding van de co-activators (p300 en CBP) te

voorkomen. Deze hydroxylatie wordt gemedieerd door het factor-inhiberend HIF (FIH).13

Zowel HIF-PHD als FIH katalyseren deze hydroxylaties, van prolyl- en asparaginyl-residuen

respectievelijk, in de aanwezigheid van O2, Fe2+ en 2-oxoglutaraat. HIF-stabilisatoren zijn 2-

oxoglutaraat analogen die de degradatie van HIF-α en de inactivatie van HIF inhiberen door

deze HIF-α prolyl- en asparaginyl-hydroxylasen te inhiberen.8

Onder andere het verhoogde zuurstoftransport dat de HIF-stabilisatoren veroorzaken en hun

mogelijk prestatie bevorderend effect zorgde voor een ongerustheid bij het WADA. Zij

vreesden voor het misbruik van deze middelen in de sportwereld en reageerden door de HIF-

stabilisatoren op de verboden lijst te plaatsen.14 De HIF-stabilisatoren worden in de

‘Prohibited List’ teruggevonden onder groep S2 van de peptidehormonen, groeifactoren,

aanverwante substanties en mimetica. Deze groep behoort op zijn beurt tot de middelen en

methoden die te allen tijde, zowel binnen als buiten de competitie verboden worden.4

De vrees voor misbruik bleek terecht, er werden namelijk al vier positieve gevallen gemeld

voor het misbruik van de HIF-stabilisator “FG-4592” in zowel wetenschappelijke als niet-

wetenschappelijke literatuur.16–18

Naast het feit dat het verboden is voor atleten om HIF-stabilisatoren in te nemen zijn er nog

verschillende redenen waarom de inname ervan niet aan te raden is. Als eerste kan aangehaald

worden dat atleten algemeen als gezond beschouwd worden en dus is het niet aan te raden

onnodige medicatie te gaan innemen. Anderzijds wordt dit geneesmiddel nog niet gebruikt in

de dagelijkse praktijk en dus is er ook nog geen informatie beschikbaar over zijn effecten en

mogelijke bijwerkingen op lange termijn.13,19

BAY 85-3934

In Figuur 3 wordt de structuur van BAY 85-3934 weergegeven. BAY 85-3934, of Molidustat,

is een HIF-PHD-inhibitor of HIF-stabilisator, die ervoor zorgt dat de ‘natuurlijke’ degradatie

van HIF bij normoxie geremd wordt. De chemische brutoformule van deze component is

C13H14N8O2 en de exacte moleculaire massa bedraagt 314,1245 g/mol.

Momenteel lopen meerdere klinische studies met deze component in zijn protocol.19

9

Figuur 3: chemische structuur van BAY 85-3934.

FG-4592

FG-4592, ook wel bekend als Roxadustat, is een HIF-PHD inhibitor (Figuur 4). Net zoals bij

BAY 85-3934 werkt deze component als HIF-stabilisator. De chemische brutoformule van

deze component is C19H16N2O5 en de exacte moleculaire massa bedraagt 352,1065 g/mol.

Momenteel lopen meerdere klinische studies met deze component in zijn protocol.19

Figuur 4: chemische structuur van FG-4592.

FG-2216

Figuur 5 geeft de structuur weer van de component FG-2216. Deze component is eveneens

een HIF-stabilisator met C12H9O4N2Cl als chemische brutoformule en de exacte moleculaire

massa bedraagt 281,0324 g/mol.

De meest recente klinische studie werd in 2007 uitgevoerd en bestudeerde de veiligheid en

doeltreffendheid van deze component.19

10

Figuur 5: Chemische structuur van FG 2216.

1.2.2 HIF-inhibitoren

Tumoren groeien vaak zodanig snel dat hun bloedvoorziening niet mee kan en dus zal

hypoxie optreden in bepaalde delen van de tumor. Voor de overleving en groei van de tumor

is adaptatie aan deze hypoxie noodzakelijk. Dit wordt hoofdzakelijk gemedieerd door

transcriptionele activatie van genen die adaptieve mechanismen op korte termijn faciliteren

(verhoogde vasculaire permeabiliteit, vasodilatatie, glucose transport e.d.) alsook op lange

termijn (angiogenese). Zoals eerder aangehaald wordt de reactie van het lichaam op hypoxie

gemedieerd door HIF. De activatie van HIF-1 speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling

en progressie van een tumor en zijn resistentie tegen chemo- en radiotherapie. De interesse

voor HIF-inhibitoren komt voort uit hun anti-tumoractiviteit.20

HIF-inhibitoren veroorzaken op zich geen verhoogd zuurstoftransport of hebben geen

prestatiebevorderend effect, maar ze worden onterecht op de zwarte markt aangeboden als

dopingmiddel (bijvoorbeeld BAY-87-2243).21 Ze worden niet specifiek vermeld in de

‘Prohibited List’ maar behoren toe aan categorie S0, de groep van de niet-goedgekeurde

stoffen.4

BAY 87-2243

Figuur 6 toont de chemische structuur van BAY 87-2243. Dit is een HIF-1 inhibitor met als

chemische brutoformule C26H26F3N7O2 en 525,2106 g/mol als theoretische moleculaire

massa. Momenteel worden geen klinische studies uitgevoerd met deze component.19,20

11

Figuur 6: chemische structuur van BAY 87-2243.

1.3 Metabolisme

Wanneer een geneesmiddel in het lichaam terecht komt volgen vier verschillende processen:

absorptie, distributie, metabolisatie en eliminatie (ADME).22 Voor de metabolisatiestap ligt de

focus vooral op de lever, dit orgaan wordt immers beschouwd als de belangrijkste site voor de

metabolisatie van geneesmiddelen.23

‘Drug metabolizing enzymes’ (DME’s) spelen een centrale rol in de metabolisatie, eliminatie

en/of detoxificatie van xenobiotica of exogene componenten die in het lichaam opgenomen

worden. DME’s hebben een beschermende functie voor het lichaam en zijn dan ook aanwezig

in de meeste weefsels en organen. Daar worden zowel fase I als fase II metaboliserende

enzymen teruggevonden, alsook fase III transporters die ieder basaal aanwezig zijn en/of

induceerbaar zijn na blootstelling aan bepaalde xenobiotica.24

Metabolische ‘pathways’ worden onderverdeeld in fase I en fase II reacties. Beide fasen

kunnen apart of samen optreden voor een bepaalde component. Bij fase I reacties modificeren

enzymen de ‘parent’ drug via hydrolyse, oxidatie en reductie. Hierdoor stijgt de polariteit van

de component en zo ook de excretie ervan.23 Fase I DME’s bestaan vooral uit microsomale

enzymen van de cytochroom P450 (CYP) superfamilie. Bij de mens bestaan er meerdere

vormen van deze ijzerbevattende mono-oxygenasen die overmatig aanwezig zijn in de lever,

alsook in de gastro-intestinale tractus, longen en nieren.22,24

Bij fase II reacties (conjugatiereacties) vindt conjugatie van de polaire groepen plaats. Dit

zorgt meestal voor de inactivatie van het substraat en bevordert de eliminatie ervan via

urinewegen/spijsverteringstelsel. Echter, soms kan conjugatie met fase II enzymen zorgen

12

voor geactiveerde metabolieten en dus voor een verhoogde toxiciteit. Bij zoogdieren is

glucuronidatie de voornaamste fase II reactie. Andere belangrijke fase II reacties zijn

sulfatatie, acetylatie en conjugatie met aminozuren of glutathion.23,24 De enzymen

verantwoordelijk voor deze fase II reacties zijn afkomstig van meerdere superfamilies van

enzymen, waaronder die van de uridinedifosfaat(UDP)-glucuronyltransferasen (UGT) voor de

glucuronidatie.24

1.4 In vitro proeven: Humane levermicrosomen (HLM) & S9-leverfracties

Aangezien de producten geselecteerd voor deze thesis nog niet goedgekeurd zijn voor klinisch

gebruik en ze verder ook een onnodig risico inhouden wat betreft de gezondheid van de mens,

is het onverantwoord om humane excretiestudies uit te voeren.

In vitro metabolisatiestudies dienen als een adequate screeningsmethode om metabolieten te

detecteren en helpen bij het verloop van de verdere in vivo studies.23 Voor deze in vitro

studies kan gebruik gemaakt worden van verschillende methoden waaronder supersomen,

humane levermicrosomen, S9-leverfracties, lever cellijnen, primaire hepatocyten en

levercoupes.

1.4.1 HLM

Humane levermicrosomen vormen nog steeds het meest populaire in vitro model voor het

bestuderen van het metabolisme van een drug. Dit komt doordat ze goedkoop en gemakkelijk

in gebruik zijn en omdat ze een goede representatie geven van het metabolisch profiel

gevormd door CYP- en UGT-enzymen.25

Microsomen zijn subcellulaire leverfracties die afkomstig zijn van vesikels van het

endoplasmatisch reticulum en die alle CYP-enzymen en UGT-enzymen bevatten. Ze worden

verkregen door gelyseerd leverweefsel te homogeniseren en daarna te centrifugeren op zowel

lage als hoge snelheid (Figuur 7). Bijkomend is er nog NADPH (nicotinamide adenine

dinucleotidefosfaat) nodig om de energie te leveren die de CYP-enzymen vragen. Voor de

activiteit van UGT is toevoeging van UDPGA (uridine 5'-difosfo-glucuronide zuur) en

alamethicine vereist.23,25

De microsomen zijn afkomstig van humaan leverweefsel. Deze levers worden verkregen door

‘Organ Procurement Organizations’ (OPO’s). Ze zijn afkomstig van patiënten die als

13

orgaandonor geregistreerd staan na hun overlijden, maar waarvan de lever niet geschikt is

voor transplantatie.26 Daarnaast kunnen microsomen ook verkregen worden uit

leverpreparaten zoals levercoupes, lever cellijnen en primaire hepatocyten.25

De HLM die voor deze masterproef gebruikt zullen worden zijn commercieel verkrijgbare,

gepoolde HLM afkomstig van 20/30 mannelijke en vrouwelijke donoren. Deze pooling zorgt

voor een betere standaardisatie en controle van je metabole studie, een optimale

representativiteit van de humane lever en een grotere consistentie tussen de verschillende

loten.27

Figuur 7: Isolatie van subcellulaire leverfracties. Leverweefsel bevat bronnen van natuurlijke enzymen die

xenobiotica metaboliseren. Een concentraat van deze enzymen kunnen bekomen worden door leverweefsel te

homogeniseren en centrifugeren.27

Naast voordelen hebben microsomen ook enkele nadelen. Ze zijn bijvoorbeeld wel bruikbaar

voor kwalitatieve maar niet voor kwantitatieve metingen. Ze bevatten wel CYP- en UGT-

enzymen, maar niet de andere enzymen en co-factoren die wel aanwezig zijn in intacte cellen.

Zo kan er geen metabole competitie optreden, wat in vivo wel het geval is. De resultaten

kunnen daardoor ook minder makkelijk gelinkt worden aan de echte in vivo situatie in de

mens.25,28

1.4.2 S9-leverfracties

S9-fracties zijn ook afkomstig van de lever en bevatten zowel microsomale als cytosolische

fracties (Figuur 7). Net als bij microsomen is NADPH ook hier noodzakelijk om energie te

voorzien voor de CYP-enzymen en is toevoeging van UDPGA en alamethicine vereist voor

de activiteit van UGT.

14

S9-leverfracties worden al lang gebruikt, maar niet zo frequent als microsomen. Ze zijn

handig voor humane biotransformatie-studies maar dan best in combinatie met microsomen

en cytosolfracties. Cytosolfracties bevatten drie verschillende fase II-enzymen die oplosbaar

zijn (N-acetyltransferase, sulfotransferase en glutathion S-transferase), de UGT-enzymen die

zich bevinden in het endoplasmatisch reticulum worden hier dus niet teruggevonden. Als het

gebruik van microsomen vergeleken wordt met dat van S9-fracties dan kan gesteld worden

dat S9-fracties een meer volledige weergave geven van de in vivo situatie aangezien ze ook

nog andere enzymen bevatten dan de microsomen. Anderzijds vertonen ze algemeen een

lagere enzymactiviteit dan microsomen en cytosolfracties, wat er kan voor zorgen dat

sommige metabolieten over het hoofd worden gezien.25

1.5 Staalvoorbereiding

Vooraleer een staal kan geanalyseerd worden, dient meestal een gepaste voorbehandeling van

het staal uitgevoerd te worden. De te bestuderen analyt bevindt zich namelijk in een matrix

die bestaat uit meerdere andere componenten die voor interferentie kunnen zorgen wanneer ze

bijvoorbeeld veel abundanter aanwezig zijn dan de analyt van interesse. Om een succesvolle

analyse te verkrijgen dient de analyt van interesse in voldoende hoeveelheid aanwezig te zijn

en in zijn juiste vorm. De meest gebruikte technieken zijn ‘liquid liquid extraction’ (LLE) en

‘solid phase extraction’ (SPE).29

LLE is een scheidingsproces gebaseerd op het verschil in oplosbaarheid van de componenten

in twee verschillende vloeistoffen (polair en apolair). Tijdens het rollen van de stalen wordt

een evenwicht ingesteld tussen de hoeveelheid opgeloste analyt in de polaire vloeistof en het

minder polair solvent.30

Bij SPE zorgt een verschil in affiniteit tussen de stationaire en de mobiele fase ervoor dat de

analyt van interesse in een eerste stap aan de kolom (stationaire fase) blijft hangen terwijl de

ongewenste componenten met de mobiele fase meegaan. De analyt elueert later van de kolom

door gebruik te maken van de juiste mobiele fase.29

Extractie van geglucuronideerde componenten wordt meestal uitgevoerd door een

hydrolysestap toe te voegen voor de eigenlijke LLE, ofwel rechtsreeks door SPE.

Om een snellere verwerking van de stalen te verkrijgen kan directe injectie (‘dilute-and-

shoot’) van urine toegepast worden. Hierbij wordt het staal enkel verdund, de extractiestap

15

voor de analyse via LC wordt overgeslagen. De voordelen van directe injectie zijn een

snellere, gemakkelijkere en goedkopere staalvoorbereiding, alsook een verminderde kans op

staalmanipulatie. Negatief aan deze methode is de verlaagde sensitiviteit en een grotere

invloed van de matrixcomponenten.31

Wanneer componenten via GC zullen geanalyseerd worden dient op het einde van de

staalvoorbereiding een extra derivatisatiestap uitgevoerd te worden. Deze stap dient om de

vluchtigheid, de thermische stabiliteit van de componenten en de chromatografische scheiding

te optimaliseren. Hiervoor wordt veelal gebruik gemaakt van trimethylsilyl-(TMS-)

derivatisatie op basis van een mengsel van N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide

(MSTFA), NH4I en ethaanthiol.32

1.6 Chromatografie

Chromatografie is een scheidingstechniek die veelal gebruikt wordt voor de identificatie en

kwantificatie van componenten in de gas- of vloeistoffase. Het principe steunt op de

concentratie waarbij de component van interesse in evenwicht is tussen twee niet mengbare

fasen (de stationaire fase en de mobiele fase). De stationaire fase is geïmmobiliseerd

aanwezig in een kolom of op een vaste drager, de mobiele fase wordt over de stationaire fase

gebracht. De fasen worden zo gekozen dat de componenten van de oplossing een

verschillende oplosbaarheid hebben in beide fasen. Het verschil in affiniteit van de

componenten voor de fasen zorgt ervoor dat ze allen op een ander tijdstip elueren van de

kolom.29 Er word onderscheid gemaakt tussen twee types chromatografie, namelijk

vloeistofchromatografie (LC) en gaschromatografie (GC).

1.6.1 Vloeistofchromatografie

Bij LC bevinden de te scheiden componenten zich in de vloeistoffase. De kolom is gevuld

met (gecoate) partikels van een bepaalde diameter. Scheiding is gebaseerd op de polariteit, de

lading en de grootte van de te scheiden componenten.33

Er wordt onderscheid gemaakt tussen ‘normal phase’- en ‘reversed phase’ (RP)-LC. Bij RP-

LC is de stationaire fase apolair en de mobiele fase polair, bij ‘normal phase’ is dit net

omgekeerd. RP-LC wordt tegenwoordig meer gebruikt omdat deze techniek een hogere

reproduceerbaarheid heeft en algemeen meer toepasbaar is.33

16

Hoe kleiner de diameter van de partikels van de stationaire fase en hoe langer de kolom, hoe

hoger de nodige druk zal zijn om het staal door de kolom te krijgen. ‘High-performance

Liquid Chromatography’ (HPLC) wordt vaak gebruikt om deze hoge drukken te kunnen halen

(Figuur 8). ‘Ultra-performance Liquid Chromatography’ (UPLC) heeft een nog grotere

sensitiviteit, resolutie en snelheid en werkt onder nog grotere druk.33

Elutie wordt bekomen door de gradiënt van de mobiele fase continu aan te passen. Hierdoor

wordt de mobiele fase steeds minder polair en zullen de componenten op verschillende

tijdstippen van de kolom elueren.33

Figuur 8: Schematische voorstelling van het HPLC systeem.33

1.6.2 Gaschromatografie

Bij GC bevinden de te scheiden componenten zich in de gasfase. De mobiele fase dat de

analyt transporteert doorheen de kolom wordt het draaggas genoemd. Vaste stoffen en

vloeistoffen moeten altijd eerst gevaporiseerd worden alvorens ze gescheiden kunnen worden.

Dit is echter niet altijd even makkelijk aangezien de componenten hiervoor thermostabiel en

vluchtig genoeg dienen te zijn.29 Om de chromatografische eigenschappen van de

componenten te verbeteren, worden de componenten vaak gederivatiseerd.

De gaschromatograaf bestaat uit verschillende onderdelen waaronder de injector, de kolom en

de detector. Deze bevinden zich dan nog eens in een gecontroleerde oven die hoge

temperaturen in de kolom toelaat (Figuur 9). Via een temperatuursprogramma kan de elutie

van de componenten eveneens geoptimaliseerd worden.29

17

Figuur 9: Schematische voorstelling van de GC. Een kleine hoeveelheid staal (vloeibaar of gasvormig) wordt

ingebracht via de injector, die zowel het staal vaporiseert alsook het mengt met de gasstroom in de kop van de

kolom. De kolom is meestal een smalle buis (capillaire kolom) die opgedraaid zit en heeft een lengte die varieert

van 1 tot 100 meter, afhankelijk van de stationaire fase. Op het einde van de kolom stroomt het draaggas

doorheen een detector alvorens vrij te komen in de atmosfeer.29

1.7 Massaspectrometrie

Complexe mengsels van verschillende componenten worden vaak geanalyseerd via

combinatietechnieken waarbij een scheidingsmethode zoals chromatografie gekoppeld wordt

aan een massaspectrometer. Massaspectrometrie (MS) is een analytische methode die

gebaseerd is op de bepaling van moleculaire massa’s van individuele componenten die

aanwezig zijn in een staal.29

De analyse start met de ionisatie van de component. De keuze van de gepaste

ionisatietechniek is afhankelijk van de intrinsieke eigenschappen van de component en in

welke staat hij voorkomt (gas, vloeibaar, vast). Zo worden elektron ionisatie (EI) en

chemische ionisatie (CI) gebruikt in combinatie met GC-MS en electrospray ionisatie (ESI)

bij LC-MS.29 Elektron ionisatie (EI) is een harde ionisatietechniek, waardoor veel

fragmenten gevormd worden, wat op zijn beurt veel structuurinformatie kan geven over de

component. Deze techniek wordt meestal gebruikt bij de analyse van vluchtige componenten.

Neutrale moleculen worden gebombardeerd met elektronen die afkomstig zijn van een

filament, wat leidt tot de vorming van positieve ionen. Negatieve ionen worden ook gevormd,

maar in mindere mate. Een tweede soort ionisatietechniek is Electrospray ionisatie (ESI), dit

is een zachte techniek. Bij deze zachte techniek worden minder fragmenten gevormd en is het

dus moeilijker structuurinformatie over de component te verkrijgen, maar het moleculair ion

kan wel gemakkelijker onderscheiden worden. Bij ESI worden kleine druppels solvent

bevattend analyt gevormd aan het eind van een fijn silica buisje die op een hoge positieve of

negatieve potentiaal wordt gehouden. Dit elektrisch veld zorgt ervoor dat deze druppels een

18

hoge ladingsdensiteit bevatten. Door het solvent te verwijderen (door hitte of drooggas)

verhoogt de ladingsdensiteit verder. Chemische ionisatie (CI) is een derde ionisatietechniek

en is net zoals ESI een zachte techniek. CI gebeurt door de collisie van de moleculen van een

analyt met de deeltjes die verkregen worden uit het bombarderen van een reagensgas met

elektronen. In het DoCoLab wordt gebruik gemaakt van ammoniumgas als reagensgas.29

In het DoCoLab vindt de analyse van de gevormde ionen plaats aan de hand van ofwel

(tandem) MS (MS/MS) waarbij gebruik gemaakt wordt van (triple) quadrupolen, ofwel van

hoge resolutie MS (HRMS) waarbij een ‘ion trap’ (specifieker: orbitrap) gebruikt wordt.

Quadrupolen werken als massafilters en bestaan uit vier metalen staven die als elektroden

dienen en in paren gekoppeld zijn (positief en negatief).29 (Figuur 10) In de quadrupool

worden ionen gescheiden op basis van hun massa tot lading verhouding (m/z) die afhankelijk

is van de elektrische velden die binnenin de quadrupool heersen.34

Figuur 10: Schematische voorstelling van een quadrupool.29

Bij MS/MS worden meerdere analysatoren in serie geplaatst. De eerste quadrupool (Q1) kan

alles scannen of één ion van interesse (het precursor ion) selecteren. Na Q1 komt een

collisiecel die fragmentatie van de geselecteerde ionen kan veroorzaken aan de hand van een

collisiegas, dit proces wordt ‘collision induced dissociation’ (CID) genoemd. Daarna scant

quadrupool 2 (Q2) alle fragment ionen of selecteert een bepaald fragment ion.35 (Figuur 11)

19

Figuur 11: Schematische voorstelling van een triple quadrupool.36

Door de opbouw van de triple quadrupool zijn verschillende scan modi beschikbaar (Figuur

12). Bij de ‘full scan’ modus bereiken alle geïoniseerde moleculen de detector. De collisiecel

en Q2 worden hierbij niet gebruikt. Dit is ook het geval bij ‘selected ion monitoring’ (SIM),

daar wordt Q1 gebruikt om één ion van interesse te selecteren. Bij ‘selected reaction

monitoring’ (SRM) wordt een precursor ion geselecteerd door Q1, fragmentatie vindt plaats in

de collisiecel en een product ion wordt geselecteerd door Q2. De ‘product ion scan’ modus

doet hetzelfde, alleen wordt hier een full scan uitgevoerd in Q2 in plaats van één ion te

selecteren. Bij een ‘precursor ion scan’ scant Q1 alle ionen, de collisiecel fragmenteert al deze

ionen en één ion wordt geselecteerd door Q2. Ten slotte worden bij de ‘neutral loss scan’

zowel bij Q1 als Q2 alle ionen gescand met een vast verschil in m/z. Enkel die analyten die na

fragmentatie een bepaald massaverschil vertonen zullen dus gedetecteerd worden.37

Figuur 12: Schematische weergave van de verschillende scan modi bij MS/MS.

20

Terwijl bij de quadrupool enkel die ionen die een stabiele baan beschrijven worden

gedetecteerd is dit bij de ion trap net omgekeerd. Hier bereiken enkel de ionen die een

onstabiele baan beschrijven de detector. De klassieke ion trap bestaat uit twee end-cap

elektroden en één ringelektrode (Figuur 13). Elektronen voor ionisatie komen de ion trap

binnen via een opening in de eerste end-cap elektrode. Op de ringelektrode wordt een

radiofrequente wisselspanning aangelegd wat een hoogfrequent veld veroorzaakt. Dit

hoogfrequent veld zorgt voor de opslag van ionen. Door het voltage op de ringelektrode

lineair op te drijven worden de banen van de ionen onstabiel wat hen per stijgende m/z ratio

de ion trap doet verlaten via openingen in de tweede end-cap elektrode. Van daaruit vallen ze

in op de detector. Bij de ion trap worden de gevormde ionen dus gedurende enige tijd

opgeslagen alvorens ze gedetecteerd worden. 29

In het DoCoLab wordt bij HRMS gebruik gemaakt van een speciale soort ion trap, namelijk

de orbitrap. Deze heeft een hogere resolutie en een hogere massa-accuraatheid in vergelijking

met een gewone ion trap. Bij de orbitrap wordt een draad gespannen langs de as van de

buitenste cilinder, wanneer een stroom loopt tussen de draad en de cilinder worden ionen

aangetrokken tot de draad. Ionen met voldoende tangentiële snelheid zullen rond de draad

blijven cirkelen.38

Figuur 13: Schematische weergave van een ion trap. Deze wordt opgebouwd uit twee end-cap elektroden (1&3)

en één ringelektrode (2).29

Detectie bij massaspectrometrie is gebaseerd op de meting van de elektrische lading die ionen

dragen. Hiervoor wordt vaak gebruik gemaakt van electron multipliers. De werking ervan is

gebaseerd op secundaire elektronen emissie waarbij elektronen worden vrijgemaakt uit een

bepaald metaaloppervlak dat wordt onderworpen aan een ionenbombardement. Die elektronen

21

kunnen op hun beurt opnieuw inslaan op een tweede oppervlak en zo nog meer elektronen

vrijmaken. Dit proces kan zich een groot aantal keren herhalen en zo zorgen voor een

versterkt signaal.29,34

1.8 Doel thesis

Er zal nagegaan worden tot welke metabolieten de HIF-stabilisatoren/-inhibitoren

metaboliseren, zodat de detectie ervan tijdens routine controles gefaciliteerd kan worden. Dit

zal in vitro onderzocht worden aan de hand van humane levermicrosomen en S9-leverfracties

die de metabolisatie van de componenten zullen nabootsen. De stalen zullen geanalyseerd

worden via LC-MS (vloeistofchromatografie-massaspectrometrie) en/of GC-MS

(gaschromatografie-massaspectrometrie) met als doel het opstellen van een zo correct

mogelijk metabool profiel.

22

2. Materialen en Methoden

2.1 Producten en reagentia

Vier componenten werden aangekocht: BAY 87-2243 werd verkregen via selleckchem.com,

BAY 85-3934 werd aangekocht bij Cayman Chemical Company (Michigan, Verenigde

Staten), FG-4592 en FG-2216 werden verkregen via medchemexpress.com. Het TMS

derivatisatiemengsel bestond uit MSTFA, afkomstig van Karl Bucher (Waldstetten,

Duitsland), NH4I, afkomstig van Merck (Darmstadt, Duitsland) en ethaanthiol, afkomstig van

Acros (Geel, België). Voor de in vitro studies werd 17α-methyltestosteron (inwendige

standaard) aangekocht bij Organon (Oss, Nederland). Ethanol was afkomstig van Biosolve

(Valkenswaard, Nederland). Methandiënone diende als positieve controle en werd aangekocht

bij het National Measurement Institute (NMI, North Ryde, Australië). De fosfaatbuffer (pH

7,4), cofactoren, S9-leverfracties en de HLM werden aangekocht bij Corning (Amsterdam,

Nederland). De methanol die werd gebruikt bij het stopzetten van de reacties was afkomstig

van Fisher Scientific (Loughborough, Verenigd Koninkrijk). De mobiele fasen die gebruikt

werden voor LC bestonden uit water en methanol (J.T. Baker, Deventer, Nederland),

azijnzuur (Merck, Darmstadt, Duitsland) en ammoniumacetaat (Biosolve, Valkenswaard,

Nederland). Voor de extracties werd gebruik gemaakt van β-glucuronidase (Escherichia coli)

en/of arylsulfatase (Helix pomatia) die gekocht werden bij Roche (Mannheim, Duitsland). De

fosfaatbuffer (pH 7) bestond uit een 5:1 mengsel van NaH2PO4*H20 en Na2HPO4*2H20,

afkomstig van Merck (Darmstadt, Duitsland). De carbonaatbuffer (pH 9,5) bestond uit een 2:1

mengsel van NaHCO3 en K2CO3, deze stoffen werden aangekocht bij Merck (Darmstadt,

Duitsland). Het Na2SO4 die diende als droogmiddel werd hier ook aangekocht. Als

extractiemiddel werd diëthylether (Fisher Scientific, Loughborough, Verenigd Koninkrijk) of

methyl tert-butyl ether (Macron Fine Chemicals, Duitsland) gebruikt.

2.2 Zuiverheidsanalyse van de referentiestandaarden

Alvorens de metabolisatiestudies uit te voeren werd van alle componenten eerst de zuiverheid

gecontroleerd. Van zowel BAY 87-2243, BAY 85-3934, FG 4592 als FG 2216 werd een

stockoplossing gemaakt met een concentratie van 100 µg/ml (methanol werd gebruikt als

oplosmiddel). Van deze oplossingen werd telkens 20 µl in een vial gebracht en verdund met

180 µl MeOH/H2O (50/50) voor rechtstreekse analyse via LC-MS. Alle componenten werden

na derivatisatie ook via GC-MS geanalyseerd. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van

trimethylsilyl-(TMS-) derivatisatie op basis van een mengsel van N-methyl-N-trimethylsilyl-

23

trifluoroacetamide (MSTFA), NH4I en ethaanthiol (in een verhouding 500/4/2). De

derivatisatie vindt plaats gedurende 1 uur in een oven bij 80°C.

2.3 In vitro incubatie met HLM en S9

Na het controleren van de zuiverheid van de stalen wordt de eerste metabolisatiefase

uitgevoerd. Hierbij worden vier verschillende stalen ter incubatie voorbereid: een staal die de

te testen component bevat (telkens in tweevoud uitvoeren), een blanco staal of substraat

stabiliteitscontrolestaal, een positieve en een negatieve controle. 100 µl van de component

(100 µg/ml) wordt toegevoegd aan de blanco epjes en aan de teststalen. Deze epjes worden

ingedampt bij 30°C. Bij het staal die als negatieve controle dient wordt de component niet

toegevoegd waardoor er niets valt te metaboliseren door de HLM of S9 fracties. Aan het

positieve controle staal wordt 2,5 µl van een referentiestandaard toegevoegd, namelijk

methandiënone (4 mg/ml), waarvan het metabolisme reeds gekend is. Aan de andere epjes

wordt 2,5 µl ethanol toegevoegd om het oplossen van de component te bevorderen en/of om

gelijke volumes te bekomen. Aan elk van de epjes wordt 226 μl van een 0,1 M fosfaatbuffer

(pH 7,4) toegevoegd. Daarnaast zijn cofactoren vereist voor een optimale werking van de

CYP enzymen, bij fase I metabolisme is NADPH de gewenste cofactor. Er wordt gebruik

gemaakt van een NADPH regenererend systeem (10 mM) dat bestaat uit twee oplossingen.

Oplossing A bevat NADP+, glucose-6-fosfaat en MgCl2, hiervan wordt 12,5 μl toegevoegd

aan elk staal. Oplossing B bevat glucose-6-fosfaat dehydrogenase, hiervan wordt 2,5 μl

toegevoegd aan elk staal. Dit laatste zet in aanwezigheid van zijn substraat (glucose-6-fosfaat)

NADP+ om in NADPH. De stalen worden voor 5 min bij 37°C geïncubeerd om de in vivo

situatie na te bootsen. Aan het blanco staal of de substraat stabiliteitscontrolestalen worden

geen HLM of S9 fracties toegevoegd, hier vindt dus geen metabolisatie plaats. Bijgevolg

kunnen via deze controlestalen niet-enzymatische reacties en de stabiliteit van de te testen

component nagegaan worden. De metabolische reactie wordt geïnitieerd door 6,5 μl van de

HLM of S9 fracties toe te voegen aan alle stalen behalve het substraat stabiliteitscontrolestaal,

hieraan wordt 6,5 μl fosfaatbuffer toegevoegd om gelijke volumes te bekomen. Als laatste

stap worden de stalen onderworpen aan een tweede incubatieperiode van 2/4/6/18 uren.

Naast een fase I metabolisatie kan ook een fase II metabolisatie uitgevoerd worden. Zoals bij

fase I worden hier opnieuw dezelfde vier stalen ter incubatie voorbereid, de component wordt

toegevoegd en de epjes worden ingedampt bij 30°C. Aan het positieve controle staal wordt

opnieuw 2,5 µl methandiënone toegevoegd, aan de andere epjes 2,5 µl ethanol. Aan elk van

24

de epjes wordt 171 μl gedestilleerd water toegevoegd. Bij studie van het fase II metabolisme

wordt een UGT-reactie mix toegevoegd die noodzakelijk is wanneer geglucuronideerde

componenten geanalyseerd willen worden. Oplossing A van deze mix bevat de cofactor

UDPGA (25 mM), hiervan wordt 20 µl toegevoegd aan alle stalen. Oplossing B bevat Tris-

HCl (250 mM), MgCl2 (40 mM) en alamethicine (0,125 mg/ml) die verantwoordelijk is voor

het vormen van poriën in de membraan van de microsomen. Van oplossing B wordt 50 µl

toegevoegd aan elk staal. Vanaf hier verloop alles gelijk als bij fase I: de stalen worden voor 5

min bij 37°C geïncubeerd, de HLM of S9 fracties worden toegevoegd en de stalen worden

gedurende 2 uren geïncubeerd bij 37°C.

Een combinatie van het fase I en fase II metabolisme kan ook worden bestudeerd. Het

protocol hiervoor verloopt nagenoeg gelijk met dat van het fase II metabolisme, alleen

worden hier eerst de cofactoren die noodzakelijk zijn voor het fase I metabolisme toegediend.

Er wordt 12,5 μl van oplossing A van het NADPH regenererend systeem toegevoegd, gevolgd

door 2,5 μl van oplossing B. Daarna wordt 50 μl van oplossing B van de UGT-mix

toegevoegd. Oplossing A van de UGT-mix wordt pas toegevoegd na de eerste twee incubatie-

uren. Hierna volgt nog een incubatie van twee uren bij 37°C.

De metabolisatiereacties worden allen stopgezet door 250 μl ijskoude methanol toe te voegen

aan de stalen. Dit zorgt voor de inactivatie van de enzymen en de precipitatie van de proteïnen

zodat deze niet kunnen interfereren tijdens de analyse van de metabolieten. Vervolgens

worden de stalen voor 15 min in een ijskoude houder geplaatst. Nadat de stalen voor 5 min

gecentrifugeerd worden bij 4°C aan een snelheid van 12000 g kan de bovenste laag van de

incubatiestalen afgenomen worden. Dit is nu klaar voor staalvoorbereiding (2.4).

2.4 Staalvoorbereiding

Om mogelijke fouten tijdens de staalvoorbereiding of retentietijden te corrigeren wordt aan

elk staal 50 μl van een inwendige standaard toegevoegd, namelijk 17α- methyltestosteron.

Indien de stalen geanalyseerd worden via LC (directe injectie) is geen verdere

staalvoorbereiding nodig.

De urinestalen die gebruikt worden voor de methodevalidatie worden onderworpen aan een

‘liquid-liquid’ extractie (LLE). Eerst wordt een enzymatische hydrolyse uitgevoerd aan de

hand van 50 μl β-glucuronidase en/of arylsulfatase. Omdat dit eerste enzym optimaal werkt

25

bij een pH van 7 wordt 1 ml van een fosfaatbuffer (pH 7) toegevoegd. Wanneer β-

glucuronidase samen met arylsulfatase gebruikt wordt, wordt 1 ml van een acetaatbuffer met

pH 5,2 toegevoegd. De inwendige standaard wordt toegevoegd, waarna de stalen voor

anderhalf uur in de oven worden geplaatst bij 56°C. Nadat de stalen afgekoeld zijn tot

kamertemperatuur wordt de eigenlijke extractie uitgevoerd met diëthylether of methyl tert-

butylether als extractiemiddel. 1 ml van een carbonaatbuffer (pH 9,5) wordt toegevoegd,

waardoor de urine basisch wordt. De stalen worden voor 10 à 20 min op de rollen geplaatst

waarna ze voor 5 min gecentrifugeerd worden aan 2500 toeren/min. De organische fase wordt

afgenomen en overgebracht in nieuwe sovirelbuisjes. Eventueel wordt hieraan ongeveer 100

mg Na2SO4 toegevoegd als droogmiddel. De vloeistof wordt dan opnieuw overgebracht in

nieuwe buisjes en deze worden ingedampt bij 40°C onder zuurstofvrije stikstofstroom. De

buisjes kunnen ook rechtstreeks ingedampt worden, zonder Na2SO4 eerst toe te voegen. Als

laatste stap worden de stalen opnieuw opgelost met 200 µl MeOH/H2O (50/50) mobiele fase

of 200 µl van eerder voorbereide epjes die 50 µl van de stalen bevatten, alsook 450 µl

verdunningsvloeistof (H2O met 0.01% HCOOH / acetonitrille met 1mM NH4COOH en 0.01%

HCOOH (95/5)) voor de directe injectie (dilute and shoot). De uiteindelijke inhoud wordt

overgebracht in geschikte vials voor analyse via LC-HRMS.

2.5 Instrumentatie

2.5.1 LC-HRMS

De controle van de zuiverheid van de referentiestalen en de analyse van de incubatiestalen

gebeurde via LC-HRMS. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de Exactive benchtop Orbitrap-

based MS (Thermo Scientific) bij een resolutie van 50 000. Als kolom werd standaard de

SunFire™ C18 kolom (50 x 2,1 mm; partikelgrootte 3,5 µm) van Waters (AH Etten-Leur,

Nederland) gebruikt. Enkel bij de methodevalidatie werd een Agilent SB-C18 kolom gebruikt

(50 x 2,1 mm; partikelgrootte 1,8 µm). De gebruikte mobiele fasen bestonden uit 1 mM

ammoniumacetaat en 0,1% azijnzuur opgelost in water (mobiele fase A) of methanol (mobiele

fase B). Het gradiëntprogramma dat gebruikt werd bij de controle van de zuiverheid van de

referentiestalen van BAY 87-2243, BAY 85-3934 en FG-2216 zag er als volgt uit: 0 min:

70% A, 1,50 min: 70% A, 8 min: 45% A, 15 min: 45% A, 29,50 min: 5% A, 30,50 min: 5%

A, 31 min: 70% A, 35 min: 70% A (programma 1). Het gradiëntprogramma dat gebruikt werd

bij de controle van de zuiverheid van het referentiestaal van FG-4592 en bij de analyse van

26

alle incubatiestalen zag er als volgt uit: 0 min: 90% A, 1,5 min: 90% A, 15 min: 5% A, 17

min: 5% A, 17,10 min: 90% A, 20 min: 90% A (programma 2). Het gradiëntprogramma die

gebruikt werd bij de methodevalidatie verliep als volgt: 0 min: 100% A, 0,50 min: 100% A,

7,50 min: 20% A, 8 min: 0% A, 9,50 min: 0% A, 9,60 min: 100%, 12 min: 100% A

(programma 3). Het injectievolume bedroeg bij alle drie de methoden 20 µl en het debiet 250

µl/min. Als injectiemodus werd bij de referenties en de incubatiestalen “no waste”

geselecteerd, bij de methodevalidatie werd “partial loop” geselecteerd. De massaspectrometer

werd gebruikt in de full-scan modus, zowel negatief als positief, waarbij gescand werd van

100-2000 m/z.

Product ion scans van de parent compounds en hun metabolieten werden uitgevoerd in

positieve en/of negatieve modus op de Q-Exactive MS (Thermo Scientific) bij een resolutie

van 70 000. Dezelfde kolommen, mobiele fasen en injectievolume werden gebruikt als bij de

Exactive. Voor BAY 87-2243 werd het eerste gradiëntprogramma gebruikt, de andere

componenten volgden het tweede gradiëntprogramma. Bij de product ion scans werden de

ge(de)protoneerde massa’s van de PC’s en hun metabolieten telkens geselecteerd als

precursor ion, deze werden onderworpen aan collisie-energieën van 15, 25, 35, 45 en 55 eV.

Een massagebied van m/z 65-975 werd gescand.

2.5.2 GC-MS(/MS)

De controle van de zuiverheid van de referentiestalen gebeurde aanvankelijk ook via GC-

MS(/MS). Voor GC-MS werd gebruik gemaakt van de Agilent 6890 gaschromatograaf en de

Agilent 5973 massaspectrometer. Voor GC-MS/MS werd de Agilent 7890 gaschromatograaf

gebruikt en de Agilent 7000 massaspectrometer. Er werd telkens 1 µl staal geïnjecteerd aan

een split flow van 5,0 ml/min bij een injectortemperatuur van 250°C. Als kolom werd een

J&W ultra 1 capillaire kolom (30 m x 250 µm; filmdikte: 0,25 µm) gebruikt. Bij de full scan

methode werd een gebied van m/z 50-800 gescand.

Bij GC-MS werd elektron ionisatie gebruikt met een elektron energie van 70 eV. Als mobiele

fase werd helium gebruikt aan een debiet van 1,5 ml/min met een druk van 8,80 psi. Het

temperatuurprogramma zag er als volgt uit: 70°C als initiële temperatuur, naar 100°C met

30°C/min, naar 140°C met 25°C/min, naar 200°C met 30°C/min, naar 250°C met 35°C/min

en uiteindelijk met 50°C/min naar de finale temperatuur van 315°C welke 3,5 min werd

aangehouden. De totale analyseduur bedroeg 11,33 minuten.

27

Bij GC-MS/MS werd chemische ionisatie gebruikt met ammoniak als ionisatiegas. Als

mobiele fase werd opnieuw helium gebruikt, deze keer met een debiet van 1,0 ml/min en een

druk van 0,89 psi. Het temperatuursprogramma zag er als volgt uit: 90°C als initiële

temperatuur, naar 125°C met 70°C/min, naar 194°C met 35°C/min, naar 215°C met

10°C/min, naar 250°C met 20°C/min, naar 275°C met 30°C/min en uiteindelijk met 75°C/min

naar de finale temperatuur van 320°C, welke 1.3 min werd aangehouden. De totale

analyseduur bedroeg 9,35 minuten.

2.6 Methodevalidatie

Als eerste werd de Limit of Detection (LOD) bepaald. De oplossingen van de vier

componenten werden allen 50x verdund tot een uiteindelijke concentratie van 2 µg/ml. 10

urinestalen met voldoende variatie in pH (4,85-6,95), dichtheid (1,008-1,034) en geslacht (7

mannen en 3 vrouwen) werden geselecteerd. Initieel werden de vier componenten toegevoegd

aan een concentratie van 2/5/10/20 ng/ml aan 1 ml van de 10 urinestalen. Samen met een

negatief urinestaal en een systeem blanco (1 ml gedestilleerd H2O) ondergingen deze 40

stalen een LLE zoals eerder beschreven.

In een tweede experiment, werden staalvoorbereiding en directe injectie gecombineerd in één

protocol. Er werd gestart met dezelfde tien urinestalen, een negatief urinestaal en een systeem

blanco (gedestilleerd water) werden ook meegenomen in de procedure. Aan 3 ml van de urine

werd 100 ng/ml van FG-2216 en BAY 85-3934 toegevoegd, alsook 20 ng/ml van FG-4592 en

2 ng/ml van BAY 87-2243. 50 µl van de stalen werd overgebracht in een epje, hieraan werd

450 µl verdunningsoplossing (H2O met 0.01% HCOOH / acetonitrille met 1mM NH4COOH

en 0.01% HCOOH (95/5)) toegevoegd. Na centrifugatie werden deze bewaard in de koelkast,

klaar om op het einde de stalen opnieuw op te lossen. Het verloop van de daarop volgende

extractie staat beschreven in 2.4.

Als tweede onderdeel van de methodevalidatie werd het matrix effect bestudeerd. Het matrix

effect wordt bepaald door de resultaten van de referentiestalen (ref) te vergelijken met die van

de stalen die na de LLE geïnjecteerd worden met 20 ng van elke component (*), volgens

volgende formule:

𝑔𝑒𝑚 𝐴𝑈𝐶(∗) − 𝑔𝑒𝑚 𝐴𝑈𝐶 (𝑟𝑒𝑓)

𝑔𝑒𝑚 𝐴𝑈𝐶 (𝑟𝑒𝑓) 𝑥 100

28

Hiervoor werden opnieuw stalen van dezelfde 10 urines genomen en geïnjecteerd met 20

ng/ml van de vier componenten, maar nu pas nadat de LLE werd uitgevoerd. Als referentie

werden 10 proefbuisjes genomen die enkel 20 ng van de component bevatten.

Verder werd ook het carry-over effect onderzocht, hiervoor werd bij de analyse een negatief

staal geplaatst na een staal met de hoogste concentraties aan componenten. Het extractie-

rendement werd bepaald door de resultaten van de urinestalen die geïnjecteerd werden met

de verschillende componenten voor en na de LLE te vergelijken, volgens volgende formule:

𝑔𝑒𝑚 𝐴𝑈𝐶 (𝑣𝑜𝑜𝑟)

𝑔𝑒𝑚 𝐴𝑈𝐶 (𝑛𝑎) 𝑥 100

Als laatste werden de specificiteit en selectiviteit nagegaan. De specificiteit werd

gecontroleerd door tijdens de methodevalidatie te letten op eventuele interferenties op de

verwachte retentietijden van de componenten. De selectiviteit werd nagegaan door een

analyse uit te voeren met deze methode op een kwaliteitscontrolestaal die verschillende

andere doping gerelateerde componenten bevat, zoals corticosteroïden, stimulantia, diuretica

en narcotica.

29

3. Resultaten & bespreking

3.1 In vitro experimenten

3.1.1 BAY 87-2243

Zuiverheid

Als eerste stap werd de zuiverheid van het aangekochte staal gecontroleerd door een full scan

analyse uit te voeren via LC-HRMS. Hieruit bleek dat BAY 87-2243 een retentietijd (RT) van

21,58 min had. Het bijhorende massaspectrum toont duidelijk aan dat de massa van de

geprotoneerde component aanwezig is, alsook de massa’s van zijn Na+- en K+-adduct. (Figuur

14) Vergelijking van de theoretische en de experimentele exacte massa’s toont dat de massa

afwijkingen telkens kleiner dan 3 parts per million (ppm) zijn, wat aanvaardbaar is

(afwijkingen moeten kleiner dan 10 ppm zijn). (Tabel 1) Dit alles wijst er op dat deze

component goed gedetecteerd kan worden via LC-MS.

De component werd ook geanalyseerd via GC-MS na derivatisatie. Echter, door zijn structuur

bleek deze component moeilijk te derivatiseren. Latere detectie via een GC-‘nitrogen

phosphor detector’ (NPD) leverde ook weinig bijkomende informatie op.

Figuur 14: Links boven: ‘total ion chromatogram’ (TIC) en links onder: ‘extracted ion chromatogram’ (EIC)

van BAY 87-2243 in positieve modus op LC-HRMS. Rechts: Full scan massaspectrum in positieve modus van

BAY 87-2243 op LC-HRMS.

30

Tabel 1: LC-HRMS analyse van referentie standaard van BAY 87-2243.

Component RT

(min)

Chemische

formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

BAY87-

2243 21,58 C26H26F3N7O2

[M+H]+ 526,2173 526,2158 2,78

[M+Na]+ 548,1992 548,1978 2,59

[M+K]+ 564,1732 564,1717 2,62

In vitro testen

In vitro incubaties werden initieel uitgevoerd om het fase I metabolisme te bestuderen. Er

werden twee incubatieproeven uitgevoerd met HLM en/of S9-fracties gedurende 2/4/6/18 uur.

Analyse van de geïncubeerde stalen werd uitgevoerd via LC-HRMS.

Aan de hand van de Xcalibur software werd eerst gecontroleerd of de inwendige standaard

overal aanwezig was en of deze op de gekende retentietijd elueerde. Dit werd bevestigd, 17α-

methyltestosteron elueerde na een te verwachten 17,8 min.

Daarna werd gekeken naar de positieve controle stalen. Na opvragen van de massa’s van

methandiënone en zijn gekend metaboliet 6β-hydroxy-methandiënone kon vastgesteld worden

dat beide elueerden na respectievelijk 13,5 min en 8,3 min. De aanwezigheid van deze stoffen

bevestigde dat het metabolisatieproces correct verlopen was.

Daarop volgde de zoektocht naar metabolieten. Informatie over mogelijke modificaties werd

gehaald uit de literatuur39 (bv. oxidaties en reducties) en uit de fragmenten die gevormd

werden wanneer de parent compound met hoge energie gebombardeerd werd in een

collisiecel. Omdat de abundantie van de PC groter is in positieve modus dan in negatieve

modus werd hier vooral geconcentreerd op de positieve modus. In Figuur 15 worden de

resultaten van de 6u incubatie weergegeven, vergelijkbare resultaten werden gezien bij de

incubaties van 2, 4 of 18 uren. Vergelijking van de teststalen met de substraat

stabiliteitscontrolestalen en negatieve controle stalen leidde tot de selectie van drie

metabolieten (M1-M3). Metaboliet M2 en M3 worden enkel enzymatisch gevormd aangezien

deze niet te detecteren zijn bij de substraat stabiliteitscontrolestalen. M1 wordt naast

enzymatisch ook niet-enzymatisch gevormd, maar in mindere mate. De metabolieten waren

niet te detecteren in de negatieve controlestalen.

31

SUBSTRAAT STABILITEITSCONTROLESTAAL HLM

Figuur 15: Weergave van de PC, BAY 87-2243, zijn Na+- en K+-adducten en de drie metabolieten (weergegeven

als [M+H]+). Links: EIC na incubatie van een substraat stabiliteitscontrolestaal zonder HLM/S9-leverfracties

gedurende 6u. Rechts: EIC na incubatie van de ‘parent compound’ (PC) met HLM en S9 fracties gedurende 6u.

De experimentele massa’s van de PC en zijn drie metabolieten worden weergegeven in Tabel

2. De Xcalibur software maakt het mogelijk om de theoretische exacte massa’s van deze

componenten te berekenen. Vergelijking van de theoretische massa met de experimentele

massa laat toe de massa afwijking te bepalen. Afwijkingen tot 10 ppm zijn toegelaten. Alle

afwijkingen zijn hier kleiner dan 5 ppm en dus aanvaardbaar.

Tabel 2: Controleren van de massa afwijking van de metabolieten van BAY 87-2243.

Component RT (min) Chemische

formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

BAY 87-

2243 21,50 C26H26O2F3N7 [M+H]+ 526,2173 526,2156 4,3

M1 13,21 C23H22O2F3N7 [M+H]+ 486,1860 486,1849 2,21

M2 19,85/23,49 C23H22O3F3N7 [M+H]+ 502,1809 502,1798 2,17

M3 11,60 C21H20O2F3N7 [M+H]+ 460,1703 460,1692 2,36

In tweede instantie werden nog in vitro experimenten uitgevoerd om het fase II metabolisme

en een combinatie van het fase I en fase II metabolisme te bestuderen. M2 werd in positieve

modus teruggevonden onder zijn geglucuronideerde vorm met een RT van 14,3 min, zijn

abundantie was echter zeer laag (grootteorde 103).

32

M1 vertoont een daling in massa van 40 Da, dit komt overeen met de afsplitsing van de

cyclopropaan-functie. M2 heeft een massa die 24 Da lager ligt dan die van de PC en 16 Da

hoger dan die van M1, dit komt neer op de afsplitsing van de cyclopropaan-functie en

toevoegen van een hydroxyl-functie. Als laatste heeft M3 een massa die 66 Da lager ligt dan

die van de PC, dit komt neer op een verlies van C5H6.

Vervolgens werd een product ion scan in positieve modus van de referentiestandaard van

BAY 87-2243, alsook van M1, M2 en M3 uitgevoerd op de Q-Exactive (Figuur 16). Idealiter

zou meer structuurinformatie gehaald kunnen worden uit de fragmentatiepatronen van de

verschillende componenten. Hier werden meerdere fragmenten teruggevonden bij alle

metabolieten die ook bij de referentiestandaard van BAY 87-2243 aanwezig waren. Verder

kon geen extra structuurinformatie gehaald worden uit de fragmentatiepatronen. In Figuur 17

worden de belangrijkste gevormde fragmenten weergegeven. Een voorstelling van de

mogelijke structuren van de metabolieten wordt weergegeven in Figuur 18.

Figuur 16: LC-HRMS/MS product ion scan in positieve modus van BAY 87-2243 (bij 45 eV) en van zijn 3

metabolieten (M1-M3) (allen bij 35 eV).

33

Figuur 17: BAY 87-2243: voorstelling van de belangrijkste fragmenten die gevormd worden. (m/z 443:

C21H18O2N6F3+; m/z 241: C13H13ON4

+; m/z 213: C12H13N4+; m/z 121: C7H9N2

+)

Figuur 18: Weergave van de structuur van de PC, BAY 87-2243, en de mogelijke structuren van zijn drie

metabolieten (M1-M3).

34

3.1.2 BAY 85-3934

Zuiverheid

De zuiverheid van het aangekochte staal werd opnieuw gecontroleerd door een full scan

analyse uit te voeren via LC-HRMS. Deze analyse toonde aan dat BAY 85-3934 elueert na

3,09 min. Figuur 19 toont het bijhorende massaspectrum waarin duidelijk de massa van de

geprotoneerde component aanwezig is, alsook de massa’s van zijn Na+- en K+-adduct (K+-

adduct hier niet afgebeeld).

Figuur 19: Links boven: TIC en links onder: EIC van BAY 85-3934 in positieve modus op LC-HRMS. Rechts:

Full scan massaspectrum in positieve modus van BAY 85-3934 op LC-HRMS.

Tabel 3 toont de vergelijking van de theoretische en de experimentele exacte massa’s. De

massa afwijkingen zijn telkens kleiner dan 1 ppm en dus aanvaardbaar. Dit alles wijst er op

dat deze component goed gedetecteerd kan worden via LC-MS. De component werd ook

geanalyseerd via GC-MS na derivatisatie. Echter, door zijn structuur bleek deze component

moeilijk te derivatiseren.

Tabel 3: LC-HRMS analyse van referentie standaard van BAY 85-3934.

Component RT

(min)

Chemische

formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

BAY 85-

3934 3,09 C13H14O2N8

[M+H]+ 315,1312 315,1311 0,56

[M+Na]+ 337,1132 337,1130 0,54

[M+K]+ 353,0871 353,0869 0,62

35

In vitro testen

In vitro incubaties werden uitgevoerd om het fase I metabolisme, fase II metabolisme en een

combinatie van beide metabolisatiefasen te bestuderen. Alle incubatieproeven werden

uitgevoerd met HLM en/of S9-leverfracties. De fase I stalen werden gedurende 2/4/6/18 uur

geïncubeerd. Analyse gebeurde nadien via LC-HRMS.

De aanwezigheid van de inwendige standaard werd opnieuw gecontroleerd, alsook de

aanwezigheid van de metabolieten van methandiënone.


opnieuw gehaald uit de literatuur39 en uit gevormde fragmenten van de PC. Omdat de

abundantie van de PC groter is in positieve modus dan in negatieve modus werd hier vooral

geconcentreerd op de positieve modus. In Figuur 20 worden de resultaten van de fase I+II

incubatie weergegeven. Deze resultaten zijn representatief voor alle uitgevoerde proeven,

zowel fase I als II. Vergelijking van de teststalen met de substraat stabiliteitscontrolestalen en

negatieve controle stalen leidde tot de selectie van vier metabolieten (A1-A4). A1, A2 en A4

worden enkel enzymatisch gevormd aangezien deze niet te detecteren zijn/andere

retentietijden hebben bij de substraat stabiliteitscontrolestalen. A3 wordt naast enzymatisch

ook niet-enzymatisch gevormd, maar ongeveer tien keer minder. De metabolieten waren niet

te detecteren in de negatieve controlestalen.


Figuur 20: Weergave van de PC, BAY 85-3934, en zijn vier metabolieten (weergegeven als [M+H]+). Links:

EIC na een fase I+II incubatie van een substraat stabiliteitscontrolestaal zonder HLM. Rechts: EIC na een fase

I+II incubatie van de PC met HLM.

36

De massa’s van de PC en zijn vier metabolieten worden weergegeven in Tabel 4. Vergelijking

van de theoretische massa met de experimentele massa laat toe de massa afwijking te bepalen.

Alle afwijkingen zijn hier kleiner dan 1 ppm en dus aanvaardbaar.

Tabel 4: Controleren van de massa afwijking van de metabolieten van BAY85-3934.


formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

BAY 85-

3934 7,4 C13H14O2N8 [M+H]+ 315,1312 315,1314 0,42

A1 5,95 C13H14O3N8 [M+H]+ 331,1262 331,1259 0,64

A2 6,3 C13H16O3N8 [M+H]+ 333,1418 333,1419 0,20

A3 4,3 C10H15ON5 [M+H]+ 222,1349 222,1348 0,62

A4 6,45 C19H22O8N8 [M+H]+ 491,1633 491,1628 0,99

A1 vertoont een toename in massa van 16 Da in vergelijking met de PC, wat wijst op een

hydroxylatie. A2 vertoont een toenamen in massa van 18 Da in vergelijking met de PC en 2

Da met A1, dit wijst op een hydroxylatie en bijkomende reductie (+2H) van de PC. Deze

laatste kan wijzen op ringopening van de PC. A3 vertoont een daling in massa van 93 Da, dit

komt neer op een verlies van C3HN3O. Als laatste heeft A4 een massa die 176 Da hoger ligt

dan die van de PC, dit komt neer op een glucuronidatie van de PC.

Er werd opnieuw een product ion scan uitgevoerd in positieve modus van de

referentiestandaard van BAY 85-3934 (Figuur 21), alsook van A1-A3 op de Q-Exactive.

Jammer genoeg kon geen additionele structuurinformatie gehaald worden uit de vergelijking

van de verschillende fragmentatiepatronen. Een voorstelling van de mogelijke structuren van

de metabolieten wordt weergegeven in Figuur 22.

37

Figuur 21: Product ion scan in positieve modus op Q-exactive (LC-HRMS/MS) van BAY 85-3934 (bij 45 eV).

Figuur 22: Weergave van de structuur van de PC, BAY 85-3934, en de mogelijke structuren van zijn vier

metabolieten (A1-A4). De additie van H2 bij A2 kan wijzen op een ringopening.

38

3.1.3 FG-4592

Zuiverheid

Analyse van de zuiverheid van het aangekochte staal vond opnieuw plaats aan de hand van

een full scan analyse via LC-HRMS. Het chromatogram toont aan dat FG-4592 elueert na

15,12 min. Het bijhorende massaspectrum bevat duidelijk de massa van de geprotoneerde

component, alsook die van zijn Na+- en K+-adduct (hier niet afgebeeld). Hier worden enkel de

resultaten in positieve modus afgebeeld, in negatieve modus werden gelijkaardige resultaten

teruggevonden (Figuur 23).

Figuur 23: Links boven: TIC en links onder: EIC van FG-4592 in positieve modus op LC-HRMS. Rechts: Full

scan massaspectrum in positieve modus van FG-4592 op LC-HRMS.






Tabel 5: LC-HRMS analyse van referentie standaard van FG-4592.

Component RT

(min)

Chemische

formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

FG-4592 15,12 C19H16O5N2

[M+H]+ 353,1132 353,1127 1,42

[M+Na]+ 375,0951 375,0946 1,33

[M+K]+ 391,0691 391,0685 1,53

39

In vitro testen



uitgevoerd met HLM. De fase I stalen werden gedurende 2/4/18 uur geïncubeerd. Analyse

gebeurde nadien via LC-HRMS.

De aanwezigheid van de inwendige standaard werd opnieuw gecontroleerd, alsook de

aanwezigheid van de metabolieten van methandiënone.


opnieuw gehaald uit de literatuur39 en uit gevormde fragmenten van de PC. Omdat de

abundantie van de PC groter is in positieve modus dan in negatieve modus werd hier vooral

geconcentreerd op de positieve modus. In Figuur 24 worden de resultaten van de fase I+II

incubatie weergegeven. Deze resultaten zijn representatief voor alle uitgevoerde proeven,

zowel fase I als II. Vergelijking van de teststalen met de substraat stabiliteitscontrolestalen en

negatieve controle stalen leidde tot de selectie van twee metabolieten (X1 & X2). Beide

metabolieten worden enkel enzymatisch gevormd aangezien de retentietijden van de substraat

stabiliteitscontrolestalen verschillen van die van de incubaties. De metabolieten waren niet te

detecteren in de negatieve controlestalen. Een positief geval van FG-4592 werd beschreven

door Buisson et al., daar werd enkel de PC gedetecteerd in de humane urinestalen.16


Figuur 24: Weergave van de PC, FG-4592, en zijn twee metabolieten (weergegeven als [M+H]+). Links: EIC na

een fase I+II incubatie van een substraat stabiliteitscontrolestaal zonder HLM. Rechts: EIC na een fase I+II

incubatie van de PC met HLM.

40

De massa’s van de PC en zijn twee metabolieten worden weergegeven in Tabel 6.

Vergelijking van de theoretische massa met de experimentele massa laat toe de massa

afwijking te bepalen. Alle afwijkingen zijn hier kleiner dan 1 ppm en dus aanvaardbaar.

Tabel 6: Controleren van de massa afwijking van de metabolieten van FG-4592.


formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

FG-4592 15,12 C19H16O5N2 [M+H]+ 353,1132 353,1129 0,79

X1 13,43 C19H16O6N2 [M+H]+ 369,1081 369,1079 0,63

X2 13,01 C25H24O11N2 [M+H]+ 529,1453 529,1450 0,60

X1 vertoont een toename in massa van 16 Da in vergelijking met de PC, wat wijst op een

hydroxylatie. X2 heeft een massa die 176 Da hoger ligt dan die van de PC, dit komt neer op

een glucuronidatie van de PC.

Om meer informatie te verkrijgen over op welke positie de hydroxylatie zich zal bevinden

werd een product ion scan uitgevoerd op de Q-exactive. Figuur 25 toont de product ion scans

van FG-4592 en zijn metaboliet (X1), elk uitgevoerd bij 45 eV. Wanneer de fragmenten van

de PC vergeleken worden met die van X1 valt het op dat er telkens een massaverschil van 16

Da optreedt, wat duidt op een hydroxylatie. De product ion scans in negatieve modus toonden

gelijkaardige resultaten. In Figuur 26 worden de belangrijkste gevormde fragmenten

weergegeven. Een voorstelling van de mogelijke structuren van de metabolieten wordt

weergegeven in Figuur 27.

PC X1

Figuur 25: LC-HRMS/MS product ion scan in positieve modus van FG-4592 en X1 (allebei bij 45 eV).

41

Figuur 26: FG-4592: voorstelling van de belangrijkste fragmenten die gevormd worden. (m/z 268: C16H14O3N;

m/z 296: C17H14O4N)

Figuur 27: Weergave van de structuur van de PC, FG-4592, en de mogelijke structuren van zijn twee

metabolieten (M1-M2).

42

3.1.4 FG-2216

Beuck et al. beschreven eerder al het metabolisme van FG-2216 in een artikel gepubliceerd in

2011.14 Hier werd deze studie gereproduceerd ter bevestiging. Er werden enkel

incubatiestudies uitgevoerd met HLM, niet met S9-leverfracties.

Zuiverheid

Er werd opnieuw eerst een full scan analyse uitgevoerd via LC-HRMS. Het chromatogram

(TIC en EIC) toont dat de component elueert na 19,3 min. Het bijhorende massaspectrum

toont duidelijk de aanwezigheid van de massa van de geprotoneerde component, alsook van

zijn Na+-adduct. (Figuur 28). In negatieve modus werden gelijkaardige resultaten

teruggevonden.

Figuur 28: Links boven: TIC en links onder: EIC van FG-2216 in positieve modus op LC-HRMS. Rechts: Full

scan massaspectrum in positieve modus van FG-2216 op LC-HRMS.






Tabel 7: LC-HRMS analyse van referentie standaard van FG-2216.

Component RT

(min)

Chemische

formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

FG-2216 19,3 C12H9O4N2Cl

[M+H]+ 281,0324 281,0322 0,68

[M+Na]+ 303,0143 303,0141 0,68

[M-H]- 279,0178 279,0175 1,03

43

In vitro testen



uitgevoerd met HLM. De fase I stalen werden gedurende 2/4/18 uur geïncubeerd. Analyse

gebeurde nadien via LC-HRMS.

In Figuur 29 worden de resultaten van de fase I+II incubatie weergegeven, deze resultaten zijn

representatief voor alle uitgevoerde proeven, zowel fase I als II. In negatieve modus werden

vergelijkbare resultaten gezien. De metabolieten die beschreven werden in het artikel van

Beuck et al. werden hier ook opgespoord, 3 metabolieten werden teruggevonden. Y1 is een

hydroxylatie van de PC, Y2 een glucuronidatie van de PC en Y3 is een hydroxylatie van de

PC met het verlies van chloor. Y1 en Y2 worden enkel enzymatisch gevormd aangezien ze

niet te detecteren zijn in de substraat stabiliteitscontrolestalen. De metabolieten waren niet te

detecteren in de negatieve controlestalen.


Figuur 29: Weergave van de PC, FG-2216, en zijn drie metabolieten (weergegeven als [M+H]+). Links: EIC na

een fase I+II incubatie van een substraat stabiliteitscontrolestaal zonder HLM. Rechts: EIC na een fase I+II

incubatie van de PC met HLM.

Tabel 8 geeft alle massa afwijkingen weer, deze zijn allemaal kleiner dan 5 ppm en dus

aanvaardbaar.

Tabel 8: Controleren van de massa afwijking van de metabolieten van FG-2216.

Component RT

(min)

Chemische

formule

Adduct

ion

Theoretische

exacte massa

Experimentele

exacte massa

Massa

afwijking

(ppm)

FG-2216 13,4 C12H9O4N2Cl [M+H]+ 281,0324 281,0322 0,68

[M-H]- 279,0178 279,0177 0,49

44

Y1

11,5

&

12,1

C12H9O5N2Cl [M+H]+ 297,0273 297,0272 0,39

[M-H]- 295,0116 295,0124 2,69

Y2 13,3 C18H17O10N2Cl [M+H]+ 457,0644 457,0644 0,13

[M-H]- 455,0488 455,0498 2,13

Y3

7,7

&

9,5

C12H10O5N2 [M+H]+ 263,0662 263,0662 0,11

[M-H]- 261,0506 261,0516 3,88

Y1 vertoont een toename in massa van 16 Da in vergelijking met de PC, wat wijst op een

hydroxylatie. Y2 heeft een massa die 176 Da hoger ligt dan die van de PC, dit komt neer op

een glucuronidatie van de PC. Y3 vertoont een verschil in massa van 18 Da met de PC, dit

kan wijzen op een hydroxylatie van de PC en een bijkomend verlies van Cl-.

Om meer informatie te verkrijgen over de positie waarop de hydroxylatie heeft

plaatsgevonden werd een product ion scan uitgevoerd op de Q-exactive. Figuur 30 toont de

product ion scans van FG-2216 en Y1, elk bij 45 eV. Wanneer de fragmenten van de PC

vergeleken worden met die van Y1 valt het op dat er frequent een massaverschil van 16 Da

optreedt, wat duidt op een hydroxylatie. De product ion scans in negatieve modus toonden

gelijkaardige resultaten. Verschillende fragmenten in de product ion scan van Y3, hier niet

afgebeeld, toonden een verschil van 18 Da met die van de PC, wat de hydroxylatie gekoppeld

met het verlies van chloor bevestigde. In Figuur 31 worden de belangrijkste fragmenten

aangeduid. Gelijkaardige fragmentatiepatronen werden gezien bij Beuck et al. Daar werden

dezelfde drie metabolieten gedetecteerd, alsook nog een hydroxylatie van Y2 en een

oxygenatie van de PC.14 Een voorstelling van de mogelijke structuren van de metabolieten

wordt weergegeven in Figuur 32.

FG-2216 Y1

Figuur 30: LC-HRMS/MS product ion scan in positieve modus van FG-2216 en Y1 (allebei bij 45 eV).

45

Figuur 31: FG-2216: voorstelling van de belangrijkste fragmenten die gevormd worden. (m/z 196: C9H7O2NCl;

m/z 224: C10H7O3NCl; m/z 235: C11H8O2N2Cl)

Figuur 32: Weergave van de structuur van de PC, FG-2216, en de mogelijke structuren van zijn drie

metabolieten (Y1-Y3).

46

3.2 Methodevalidatie

Een methodevalidatie werd uitgevoerd op een routine screeningsmethode, om te evalueren of

deze wel degelijk geschikt is voor zijn toepassing.

3.2.1 LOD

Om de LOD te bepalen wordt gebruik gemaakt van de tien geselecteerde urinestalen die

geïnjecteerd werden met de vier componenten. De LOD is gelijk aan de laagste massa van de

component die in alle tien de stalen teruggevonden wordt met een S/N groter dan 3 (Tabel 9).

Tabel 9: LOD bepaling van de vier componenten.

BAY 87-2243 BAY 85-3934 FG-4592 FG-2216

1 ng/ml 100 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml

3.2.2 Matrix effect

Bij het matrix effect wijst een positief getal op een versterking van het signaal door de matrix,

een negatief getal op een verzwakking van het signaal door de matrix. Bij FG-4592 wordt het

signaal dus meer dan dubbel zo sterk door toedoen van de matrix waarin het zich bevindt. Bij

de andere drie componenten wordt het signaal afgezwakt door zijn matrix (Tabel 10).

Tabel 10: Bepaling van het matrix effect van de vier componenten.

BAY 87-2243 BAY 85-3934 FG-4592 FG-2216

-36,2051 -30,3835 139,9098 -27,8179

3.2.3 Specificiteit en selectiviteit

De specificiteit werd gecontroleerd door tijdens de methodevalidatie te letten op eventuele

interferenties op de verwachte retentietijden van de componenten. Deze interferenties waren

niet aanwezig en de methode werd dus voldoende specifiek bevonden. De selectiviteit werd

nagegaan door een analyse uit te voeren op een kwaliteitscontrolestaal die verschillende

andere doping gerelateerde componenten bevat, zoals corticosteroïden, stimulantia, diuretica

en narcotica. Er kon geconcludeerd worden dat de methode selectief is, er waren geen

interferenties aanwezig.

47

3.2.4 Extractie-rendement

Het extractie-rendement werd bepaald na het uitvoeren van het initiële protocol (zie 2.6).

Echter, FG-2216 en BAY 85-3934 konden niet teruggevonden worden in alle 10 de stalen die

voor de LLE geïnjecteerd werden (3/10 en 7/10 respectievelijk). Ze werden wel

teruggevonden in alle 10 de stalen die na de LLE geïnjecteerd werden, maar om het extractie-

rendement te kunnen bepalen dient de component in alle 20 stalen gedetecteerd te worden. Er

kon geen verband gelegd worden met de pH, dichtheid of geslacht van de urinestalen.

Tabel 11: Bepaling van het extractie-rendement.

BAY 87-2243 FG-4592

Absoluut: 48,1635 %

Relatief: 49,2485 %

Absoluut: 0,1610 %

Relatief: 0,1473 %

Bij BAY 87-2243 en FG-4592 werd opgemerkt dat het extractie-rendement laag lag en dus

werd er gekozen om het staalvoorbereidingsprotocol van de routine methode te volgen.

Hierbij wordt een deel van de urine direct geïnjecteerd, waardoor het extractie-rendement niet

meer te bepalen is.

3.2.5 Carry-over

Om het carry-over effect na te gaan werd een negatief urinestaal geanalyseerd net na een staal

die de hoogste concentratie aan componenten bevatte. De massa’s van de vier componenten

werden niet teruggevonden in het negatief staal, er is dus geen sprake van carry-over.

3.3 Retrospectieve studie

De data van 4457 stalen die routinematig geanalyseerd werden tussen 02/06/2015 en

17/03/2016 werden opnieuw verwerkt, waarbij gezocht werd naar de aanwezigheid van BAY

85-3934, BAY 87-2243, FG-2216 en FG-4592 en zijn twee metabolieten (X1-X2). Dit was

mogelijk aangezien deze stalen telkens in full scan geanalyseerd werden via LC-HRMS. De

staalvoorbereiding van deze stalen was ook gebaseerd op een gecombineerd protocol waarbij

LLE gecombineerd werd met directe injectie. Initieel werd gekeken of er stalen waren die de

massa van één of meerdere van de componenten bevatten op de bijhorende retentietijden.

Eventueel verdachte stalen werden verder gecontroleerd door na te gaan of de massa’s van het

Na+-, K+- en/of NH4-adduct van de PC en eventuele metabolieten aanwezig waren. Er werden

in het DoCoLab geen ‘positieve’ stalen teruggevonden bij deze retrospectieve studie. Zoals

eerder vermeld werden er wereldwijd wel al vier positieve gevallen van FG-4592 ontdekt.

48

4. Conclusie

Algemeen kan gesteld worden dat alle componenten redelijk stabiel zijn. Het opsporen van de

massa van de parent compound zal de beste methode zijn om misbruik uit te sluiten. Naast de

PC konden telkens slechts enkele metabolieten gedetecteerd worden. Deze resultaten komen

overeen met de bevindingen die eerder gepubliceerd werden over FG-2216 en FG-4592.14,16

In Tabel 12 wordt een overzicht weergegeven van elke component en zijn metabolieten. De

meeste metabolieten werden puur enzymatisch gevormd, enkele metabolieten werden echter

ook niet-enzymatische gevormd. Verder onderzoek zal nodig zijn om het belang van deze

(niet-enzymatisch gevormde) metabolieten na te gaan. Bijkomende experimenten zijn

eveneens vereist om de niet-enzymatische vorming van metabolieten op te helderen.

Tabel 12: Samenvatting van de gevormde metabolieten bij elk van de vier componenten.

Component [M+H]+

(Da)

Massadeviatie

t.o.v. de PC

Fase I/II modificatie Enkel

enzymatisch

gevormd?

BAY 87-2243 526,2173

M1 486,1858 -40 Verlies van cyclopropaan

M2 502,1809 -24 Hydroxylatie M1 ☑

M3 460,1699 -66 Verlies van C5H6 ☑

BAY 85-3934 315,1312

A1 331,1262 +16 Hydroxylatie van de PC ☑

A2 333,1418 +18 Hydroxylatie + ringopening van de PC ☑

A3 222,1349 -93 Hydroxylatie en verlies van C3HN3O

A4 491,1633 +176 Glucuronidatie van de PC ☑

FG-4592 353,1132

X1 369,1081 +16 Hydroxylatie van de PC ☑

X2 529,1453 +176 Glucuronidatie van de PC ☑

FG-2216 281,0324

Y1 297,0273 +16 Hydroxylatie van de PC ☑

Y2 457,0644 +176 Glucuronidatie van de PC ☑

Y3 263,0662 -18 Hydroxylatie van de PC en verlies van Cl-

Als vervolgstudie zou het interessant kunnen zijn om de verschillende componenten toe te

dienen aan een geschikt muismodel, zoals de chimere uPA+/+-SCID muis. Zo kan een

vergelijking gemaakt worden tussen de resultaten in vitro en in vivo.

49

5. Referentielijst

1. Baron, D. A., Martin, D. M. & Abol Magd, S. Doping in sports and its spread to at-risk populations: an

international review. World psychiatry 6, 118–123 (2007).

2. Reardon, C. L. & Creado, S. Drug abuse in athletes. Substance abuse and rehabilitation 5, 95–105

(2014).

3. Bowers, L. D. Abuse of performance-enhancing drugs in sport. Therapeutic Drug Monitoring 24, 178–

181 (2002).

4. WADA. The 2016 Prohibited List. (Date Accessed: 2016-01-28). 0, 1–10

5. WADA. Strategy. (Date Accessed: 2015-10-14). (2015). at <https://www.wada-ama.org/en/who-we-

are/strategy>

6. WADA. Accredited & Approved Laboratories. (Date Accessed: 2015-10-14). (2015). at

<https://www.wada-ama.org/en/who-we-are/anti-doping-community/accredited-approved-laboratories>

7. Zhao, S. & Wu, J. Hypoxia inducible factor stabilization as a novel strategy to treat anemia. Current

medicinal chemistry 20, 2697–2711 (2013).

8. Jelkmann, W. Erythropoiesis stimulating agents and techniques: a challenge for doping analysts. Current

medicinal chemistry 16, 1236–1247 (2009).

9. Haase, V. H. Hypoxia-inducible factors in the kidney. American journal of physiology. Renal physiology

291, 271–281 (2006).

10. USADA. 13th Annual USADA Symposium on Anti-Doping Science: Stimulation of Erythropoiesis and

O2 Utilization. (2014).

11. Balligand, J., Feron, O. & Dessy, C. eNOS Activation by Physical Forces : From Short-Term Regulation

of Contraction to Chronic Remodeling of Cardiovascular Tissues. Physiological Reviews 89, 481–534

(2009).

12. Jelkmann, W. Xenon Misuse in Sports – Increase of Hypoxia-Inducible Factors and Erythropoietin, or

Nothing but „Hot Air“? Deutsche Zeitschrift für Sportmedizin 65, 267–271 (2014).

13. Jelkmann, W. Novel Erythropoietic Agents : a Threat To Sportsmanship. Medicina Sportiva 11, 32–42

(2007).

14. Beuck, S., Bornatsch, W., Lagojda, A., Schänzer, W. & Thevis, M. Development of liquid

chromatography-tandem mass spectrometry-based analytical assays for the determination of HIF

stabilizers in preventive doping research. Drug Testing and Analysis 3, 756–770 (2011).

15. Flamme, I. et al. Mimicking Hypoxia to Treat Anemia: HIF-Stabilizer BAY 85-3934 (Molidustat)

Stimulates Erythropoietin Production without Hypertensive Effects. PLoS ONE 9, e111838 (2014).

16. Buisson, C. et al. Detection by LC–MS/MS of HIF stabilizer FG-4592 used as a new doping agent:

Investigation on a positive case. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 121, 181–187

(2016).

17. Kolata, G. A Drug Hits Cycling Before It Hits the Market. (Date Accessed: 2015-11-05). The New York

Times (2015). at <http://www.nytimes.com/2015/07/30/sports/cycling/fabio-taborre-and-carlos-oyarzun-

drug-tests-suggest-use-of-chemical-meant-for-research.html?_r=0>

18. Cycling News. Taborre positive for novel EPO stimulating drug FG-4592. (Date Accessed: 2015-11-05).

at <http://www.cyclingnews.com/news/taborre-positive-for-novel-epo-stimulating-drug-fg-4592/>

19. U.S. National Institutes of Health. Clinical Trials. (Date Accessed: 2015-10-26). at

<https://clinicaltrials.gov>

20. Ellinghaus, P. et al. BAY 87-2243, a highly potent and selective inhibitor of hypoxia-induced gene

activation has antitumor activities by inhibition of mitochondrial complex I. Cancer medicine 2, 611–

624 (2013).

21. Superhuman Store. BAY 87-2243 500 mg potent and selective hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1)

inhibitor for research. (Date Accessed: 2016-03-07). at

<http://www.superhumanstore.com/shg/shop/research-peptides/bay-87-2243-500-mg-potent-and-

selective-hypoxia-inducible-factor-1-hif-1-inhibitor-for-research/>

22. Emoto, C., Iwasaki, K., Murayama, N. & Yamazaki, H. Drug Metabolism and Toxicity in Chimeric

Mice with Humanized Liver. Journal of Health Science 57, 22–27 (2011).

50

23. Jia, L. & Liu, X. The conduct of drug metabolism studies considered good practice (II): in vitro

experiments. Current drug metabolism 8, 822–829 (2007).

24. Xu, C., Li, C. Y. & Kong, A. T. Induction of Phase I , II and III Drug Metabolism / Transport by

Xenobiotics. Archives of Pharmacal Research 28, 249–268 (2005).

25. Brandon, E. F. A., Raap, C. D., Meijerman, I., Beijnen, J. H. & Schellens, J. H. M. An update on in vitro

test methods in human hepatic drug biotransformation research: pros and cons. Toxicology and Applied

Pharmacology 189, 233–246 (2003).

26. Patten, C. Human Liver Microsomes for In Vitro Drug Metabolism Studies. (Date Acessed: 2015-11-

02). BD Biosciences (2009). at

<https://www.bdbiosciences.com/documents/webinar_2009_05_hlm.pdf>

27. Corning. Tissue Fractions brochure. (Date Accessed: 2015-11-02). (2014). at

<http://www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-DL-GT-020REV2.pdf>

28. Fasinu, P., Bouic, P. J. & Rosenkranz, B. Liver-based in vitro technologies for drug biotransformation

studies - a review. Current drug metabolism 13, 215–24 (2012).

29. Rouessac and Rouessac. Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and Techniques. (2007).

30. Müller, E., Berger, R., Blass, E., Sluyts, D. & Pfennig, A. Liquid–Liquid Extraction. Ullmann’s

Encyclopedia of Industrial Chemistry (2008). doi:0.1002/14356007.b03_06.pub2

31. Deventer, K., Pozo, O. J., Verstraete, A. G. & Van Eenoo, P. Dilute-and-shoot-liquid chromatography-

mass spectrometry for urine analysis in doping control and analytical toxicology. TrAC - Trends in

Analytical Chemistry 55, 1–13 (2014).

32. Lootens, L. et al. Metabolic study of Prostanozol using human liver microsomes and humanized mice.

Recent Advances in Doping Analysis 58–64

33. Arsenault, J. C. & Mcdonald, P. D. Beginners Guide to Liquid Chromatography. Waters (2007).

doi:10.1016/B0-12-226770-2/01631-8

34. Lipschitz, C. & Baars, B. Chromatografie in de praktijk: Gaschromatografie. (Uitgeverij Ten Hagen en

Stam, 1997).

35. Agilent Technologies. Agilent Triple Quadrupole GC/MS Techniques and Operation. (2009).

36. Agilent Technologies. Agilent 7000 Series Triple Quadrupole GC/MS System: Concepts Guide. 1–60

(2011). at <http://www.chem.agilent.com/Library/usermanuals/Public/G3335-

90127_QQQ_Concepts.pdf>

37. Pozo, O. J. PhD: Detection of anabolic steroids and metabolites in doping analysis by LC-MS/MS.

(2009).

38. Kingdon, K. H. A Method for the Neutralization of Electron Space Charge by Positive Ionization at Very

Low Gas Pressures. Physical Review 21, 408–418 (1923).

39. Domínguez-Romero, J. C. et al. Combined data mining strategy for the systematic identification of sport

drug metabolites in urine by liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry. Analytica Chimica

Acta 761, 1–10 (2013).

ann-sofie ryckx...“metabolisme van hif modulatoren d.m.v. in vitro ... ugt...

Documents