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WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de

Alimentos

Sesión nº 9

Detección Cualitativa mediante PCR del Maíz MON810, del Maíz Bt-176 y de la Soja Roundup

Ready

M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

Qualitative Detection of MON810 Maize, Bt-176 Maize and Roundup Ready Soybean by PCR 2

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 9

Índice

Sesión nº 9

Detección Cualitativa mediante PCR del Maíz MON810, del Maíz Bt-176 y de la Soja Roundup Ready

Práctica 3

Introducción 3

PCR específica de plantas: gen de la lectina de soja 6 PCR específica de plantas: gen de la zeína de maíz 9 Método de cribado para detectar vegetales genéticamente modificados 12 Detección del promotor 35S 12 Detección del terminador nos 14 Detección específica mediante PCR anidada del maíz MON810, del maíz Bt-176 y de la

soja Roundup Ready 17 Detección del maíz MON810 17 Detección del maíz Bt-176 22 Detección de la soja Roundup Ready 26



Práctica

Introducción

Los protocolos siguientes son métodos basados en la PCR que permiten el cribado de OGM

(mediante el promotor 35S y el terminador nos) y la detección de OGM específicos (soja

Roundup Ready, maíz MON810 y maíz Bt-176) en material bruto y transformado por

comparación con muestras correspondientes no modificadas genéticamente (soja y maíz).

Los métodos que siguen sólo permiten obtener resultados cualitativos con una indicación de

la presencia o ausencia de la secuencia diana en la muestra.

Instrumental

• Micropipetas

• Termociclador

• Microcentrífuga

• Mezclador de torbellino

• Soporte para tubos de reacción

• Tubos de reacción para PCR de 0,2 ml

• Tubos para microcentrífuga de 1,5 ml

• Sala estéril aparte con campana ultravioleta

OBSERVACIONES Todo el instrumental debe estar libre de ADN y, cuando sea posible, esterilizarse antes de

su uso.

Para evitar la contaminación, deben usarse puntas de pipeta con barrera, protegidas contra

la formación de aerosoles.

Reactivos

• dATP CAS1923-31-7

• dCTP CAS102783-51-7

• dGTP CAS93919-41-6

• dTTP CAS18423-43-3

• Tampones de PCR concentrados 10 veces (normalmente distribuidos por el

proveedor de ADN polimerasa Taq).



• MgCl2 25 mM

• ADN polimerasa Taq

• Oligonucleótidos de uso anterior y posterior

• Aceite mineral (necesario si se utiliza un termociclador sin tapa caliente)

• Agua libre de nucleasa

Solución madre de dNTP 4 mM

• Los dNTP puede suministrarse en soluciones madre recombinadas (con dATP,

dCTP, dGTP, dTTP en la misma concentración) o separados en distintas soluciones

madre. Si se utilizan soluciones separadas, los distintos dNTP deben disolverse en

agua desionizada esterilizada para obtener una solución madre final de dNTP 4 mM.

• Dividir en alícuotas y guardar a –20 °C. Los dNTP se mantienen estables durante

varios meses.

Solución de cebador 20 µM

Los oligonucleótidos del cebador suelen suministrarse liofilizados, por lo que debe diluirse

hasta alcanzar una concentración de 20 µM.

• Preparar una solución de cebador 20 µM siguiendo las instrucciones del proveedor.

- 1 µM = 1 pmol/µl, por tanto 20 µM = 20 pmol/µl.

- X nmol de cebador + 10 X µl de agua esterilizada = 100 pmol/µl = 100 µM.

- Incubar 5 min a 65 °C, agitar e incubar durante otros 3 min a 65°C.

- Dilución 1:5. Preparar 1 tubo de microcentrífuga con 400 µl de agua esterilizada y

añadir 100 µl de la solución de cebador (100 µM). Concentración final: 20 µM.

• Dividir en alícuotas pequeñas y guardar a –20 °C. Las alícuotas guardadas a –20 °C

se mantienen estables durante al 6 meses. los cebadores liofilizados se mantienen

estables a –20 ºC durante un máximo de tres años.

Tampón PCR 10x

• El tampón para PCR 10x, con KCl 500 mM, Tris-HCI 100 mM (pH 9,0 a 25 °C) y

Tritón X-100 al 1 % suele suministrarse junto con la ADN polimerasa Taq y está listo

para su uso. El tampón debe mezclarse y centrifugarse brevemente antes de cada

uso.

• Las alícuotas se guardan a –20 °C y se mantienen estables durante varios meses.



Solución de MgCl2 25 mM

La solución de MgCl2 «de grado PCR» suele suministrarse junto con la ADN Taq polimerasa

y lista para su uso. La solución debe mezclarse (mezclador de torbellino) antes de cada uso

y centrifugarse brevemente (para destruir el gradiente de concentración que puede formarse

en caso de conservación prolongada). Guardar a –20 °C.

Alícuotas de agua libre de nucleasa

Se preparan alícuotas de agua desionizada, esterilizada y libre de nucleasa para la mezcla

maestra y para la dilución del ADN. En cada serie de análisis debe utilizarse una alícuota

distinta.



PCR específica de plantas: gen de la lectina de soja

La identificación del ADN de la soja se realiza con el gen lectina como diana.

La presencia de ADN amplificable de soja en la muestra se determina mediante PCR con

los cebadores GMO3 y GMO4.

Características de los cebadores GMO3 y GMO4

GMO3 Secuencia GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Longitud 22 Peso molecular (g/mol) 6471,6 Punto de fusión * (G/C) 65,1

GMO4 Secuencia GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Longitud 23 Peso molecular (g/mol) 6981,1 Punto de fusión * (G/C) 59,6

*Suponiendo que la [Na+] sea de 50 mM.

Controles

Es importante realizar ensayos de control con cada análisis por PCR. Los controles

negativos están diseñados para comprobar si los reactivos de la PCR están contaminados

con ADN. Los controles positivos con muestras caracterizadas también son críticos para

determinar la eficacia y la especificidad de la PCR.

Al realizar análisis con PCR deben incluirse los siguientes controles:

• Control positivo: ADN puro, aislado de la soja convencional

• Control negativo: ADN puro, aislado de otras especies y libre del gen lectina

• Control sin plantilla: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en

vez de ADN.

Preparación de la mezcla maestra

Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras (con controles positivos, negativos

y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 1.



El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GMO3 y GMO4 y

2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones

se guardan en hielo.

Cuadro 1. Mezcla maestra GMO3-GMO4

Concentraciónfinal

Mezcla maestra para una muestra

Mezcla maestra para 10 muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido GMO3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido GMO4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl

TOTAL 48 µl 480 µl

• Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml

• Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 1

• Agitar suavemente la mezcla maestra de GMO3 y GMO4 por pipeteado y centrifugar

brevemente

• Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 48 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml

• Añadir 2 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas

• Agitar suavemente y centrifugar brevemente

• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador

Programa PCR* (GMO3/GMO4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min

Desnaturalización 95 ˚C 30 s Anillamiento 63 ˚C 30 s Extensión 72 ˚C 30 s Número de ciclos 40 Extensión final 72 ˚C 3 min 4 ˚C ∞



Tras la amplificación, las muestras se centrifugan brevemente y se colocan en hielo.

* Nota: En el curso se utilizarán termocicladores Perkin Elmer Gene Amp PCR system

9600, ABI 9700. La utilización de modelos o marcas de termocicladores distintos

producirá los mismos resultados siempre que se los programas de PCR se adapten y

comprueben en consecuencia1.

Análisis de los productos de la PCR

Tras la amplificación de la secuencia diana, se analizan los productos de la PCR mediante

electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de una

reacción de PCR con 2 µl de tampón de carga, tras lo cual se cargan las muestras en el gel

de agarosa (1,5 %). Se realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a

electroforesis marcadores de tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos

adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con precisión el tamaño de los

amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede visualizarse mediante

transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado del ensayo, puede

fotografiarse el gel.

Interpretación de los resultados

El sistema se comprueba utilizando la pareja de cebadores GMO3-GMO4 para detectar el

gen de la lectina sin modificar; la calidad de amplificación del ADN extraído se ve

confirmada por una banda de 118 pb, específica del gen lectina.

El control positivo amplificará una banda de 118 pb. Los controles negativo y sin plantilla no

deben arrojar una banda visible.

Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de

las muestras seleccionadas no es válido.

Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a

118 pb, significa que la muestra no contiene ADN de soja amplificable. Conviene observar

que éste (como otros protocolos de esta sesión) es un método cualitativo que sólo permite

obtener un resultado cualitativo (disyuntiva sí-no).

1 El CCI y la OMS no promocionan ningún instrumento utilizado en los cursos de formación o mencionado en el presente manual. Los análisis realizados en nuestros laboratorios deberían reproducirse fácilmente utilizando otros instrumentos, siempre que se tengan en cuenta las características divergentes del sistema usado.



PCR específica de plantas: gen de la zeína de maíz

La identificación del ADN del maíz se realiza con el gen zeína como diana.

La presencia en la muestra de ADN adecuadamente amplificable de maíz se determina

mediante PCR con los cebadores ZEIN3 y ZEIN4.

Características de los cebadores ZEIN3 y ZEIN4

ZEIN3 Secuencia AGTGCGACCCATATTCCAG Longitud 19 Peso molecular (g/mol) 5772,3 Punto de fusión * (G/C) 55,2

ZEIN4 Secuencia GACATTGTGGCATCATCATTT Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6410,9 Punto de fusión * (G/C) 51,7


Controles

• Control positivo: ADN puro, aislado del maíz convencional

• Control negativo: ADN puro, aislado de otras especies y libre del gen zeína


vez de ADN.




El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de ZEIN3 y ZEIN4 y





Cuadro 2. Mezcla maestra ZEIN3-ZEIN4

Concentraciónfinal

Mezcla maestrapara una muestra

Mezcla maestra para 10

muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón de PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido ZEIN3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido ZEIN4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de ZEIN3 y ZEIN4 por pipeteado y centrifugar

brevemente




• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador.

Programa PCR (ZEIN3/ZEIN4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 96 ˚C 1 min Anillamiento/Extensión 60 ˚C 1 min Número de ciclos 40 Extensión final 72 ˚C 3 min 4 ˚C ∞





Tras la amplificación del ADN, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis

en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con

2 µl de tampón de carga, tras lo cual se carga la mezcla en el gel de agarosa (1,5 %). Se

realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de

tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que

pueda determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN

del gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel

del resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.


La calidad de amplificación del ADN extraído se comprueba utilizando la pareja de

cebadores ZEIN3-ZEIN4 para detectar el gen de la zeína del maíz sin modificar. Si el ADN

extraído tiene suficiente calidad de amplificación, se observará en el gel una banda

específica del gen de la zeína de 277 pb.

El control positivo debería también amplificar una banda de 277 pb.

Los controles negativo y sin ADN molde no deben arrojar una banda visible.



Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a

277 pb, significa que la muestra no contiene ADN de maíz amplificable.



Método de cribado para detectar vegetales genéticamente modificados

Los genes están sometidos a la regulación de promotores y terminadores. Las secuencias

más utilizadas para la regulación de un transgén son el promotor 35S (derivado del virus del

mosaico de la coliflor) y el terminador nos (derivado de Agrobacterium tumefaciens). La

detección de una de estas secuencias reguladoras en una muestra con soja o maíz indica la

presencia de OGM. En la soja Roundup Ready, pueden detectarse tanto el promotor 35S

como el terminador nos, mientras que en las líneas de maíz Bt-176 y MON810 sólo se da la

presencia del promotor 35S.

Detección del promotor 35S

Características de los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4

p35S-cf3 Secuencia CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6414.5 Punto de fusión * (G/C) 57,4

p35S-cr4 Secuencia TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7544,2 Punto de fusión * (G/C) 56,3


Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,5 % es GM)

• Control negativo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0 % es GM)

• Control sin ADN molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua

en vez de ADN.






El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-

cr4 y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las

soluciones se guardan en hielo.

Cuadro 3: Mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-cr4

Concentraciónfinal

Mezcla maestrapara una muestra


Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido p35S-cf3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido p35S-cr4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-cr4 por pipeteado y

centrifugar brevemente





Programa PCR (p35S-cf3 y p35S-cr4)

Temperatura TiempoDesnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 95 ˚C 25 s Anillamiento 62 ˚C 30 s Extensión 72 ˚C 45 s Número de ciclos 50 Extensión final 72 ˚C 7 min 4 ˚C ∞





Tras la amplificación, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de

agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con 2 µl de

tampón de carga, tras lo cual se carga la solución en el gel de agarosa (2,5 %). Se realiza

una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de tamaño

(15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda

determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del

gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del

resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.


Para la detección del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se utiliza el par de

cebadores p35S-cf3/p35S-cr4, que rinde un fragmento de 123 pb. Este promotor regula la

expresión de los genes de numerosas plantas transgénicas, como la soja Roundup Ready y

la línea de maíz Bt-176. El control positivo amplificará una banda de 123 pb. Los controles

negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible. Si los controles positivo o

negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras

seleccionadas no es válido.

Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra presenta una banda de

123 pb, significa que la muestra contiene ADN modificado.

Detección del terminador nos

Características de los cebadores HA-nos 118-f y HA-nos 118-r

HA-nos 118-f Secuencia GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Longitud 24 Peso molecular (g/mol) 7462,8 Punto de fusión * (G/C) 56,2

HA-nos 118-r Secuencia GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Longitud 24 Peso molecular (g/mol) 7296,9 Punto de fusión * (G/C) 61,2




Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0,5 % es GM

[soja Roundup Ready])

• Control negativo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0 % es GM)


en vez de ADN.




El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de HA-nos118-f y

HA-nos118-r y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas

las soluciones se guardan en hielo.

Cuadro 4. Mezcla maestra de HA-nos118-f y HA-nos118-r

Concentraciónfinal


Mezcla maestrapara 10

muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido HA-nos118-f 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido HA-nos118-r 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de HA-nos118-f y HA-nos118-r por pipeteado y

centrifugar brevemente







Programa PCR (HA-nos118-f/HA-nos118-r)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial

95 ˚C 3 min













Para la detección del terminador nos se utiliza el par de cebadores HA-nos118-f/HA-

nos118-r, que rinde un fragmento de 118 pb. El terminador nos está presente en la soja

Roundup Ready y en otras líneas de plantas transgénicas (p. ej., la línea de maíz Bt-11).

El control positivo amplificará una banda de 118 pb. Los controles negativo y sin plantilla no

deben arrojar una banda visible. Si los controles positivo o negativo no dan los resultados

esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido.


118 pb, significa que la muestra contiene ADN modificado.



Detección específica mediante PCR anidada del maíz MON810, del maíz Bt-176 y de la soja Roundup Ready

Detección del maíz MON810

El sistema de detección es específico del maíz MON810. Los elementos diana son el

promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y la región de hsp70 exón1-intrón1, que

son respectivamente una secuencia reguladora constitutiva y un gen de una proteína de

choque térmico que produce un mayor nivel de transcripción.

Características de los cebadores GM1, GM2, GM3 y GM4

GM1 Secuencia TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7665,1 Punto de fusión * (G/C) 59,6

GM2 Secuencia TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7560.2 Punto de fusión * (G/C) 57.9

GM3 Secuencia ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7472,2 Punto de fusión * (G/C) 61,2

GM4 Secuencia GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7722,9 Punto de fusión * (G/C) 59,6




Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1 % es GM

[MON810])



en vez de ADN.

Preparación de la mezcla maestra 1



El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GM1 y GM2 y 2

µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones


Cuadro 5. Mezcla maestra GM1-GM2

Concentraciónfinal


Mezcla maestrapara 10

muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido mg1 20 µM 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl Oligonucleótido mg2 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de GM1 y GM2 por pipeteado y centrifugar

brevemente







Programa PCR (mg1/mg2)


95 ˚C 3 min

Desnaturalización 95 ˚C 45 s Anillamiento Extensión

60 ˚C 72 ˚C

50 s 50 s

Número de ciclos 35 Extensión final 72 ˚C 3 min 4 ˚C ∞



Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras se mezclan siguiendo las

instrucciones indicadas en el cuadro 6. El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl

de mezcla maestra de GM3 y GM4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera

PCR. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en

hielo.

Cuadro 6. Mezcla maestra GM3-GM4

Concentraciónfinal



muestras Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido mg3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido mg4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl





• Agitar suavemente la mezcla maestra de GM3 y GM4 por pipeteado y centrifugar

brevemente





Programa de la PCR anidada (mg3-mg4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización

inicial

95 ˚C 3 min


60 ˚C 72 ˚C

50 s 50 s







una migración a 100 V durante 1 hora. Se emplean marcadores de tamaño (15 µl de una

escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con

precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede

visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado

del ensayo, puede fotografiarse el gel.




Las parejas de cebadores mg1-mg2 y mg3-mg4 se diseñaron para la detección específica

de la transformación MON810 mediante PCR anidada, que rinde un fragmento final de PCR

anidada de 149 pb. La especificidad viene dada por el hecho de que los cebadores están

diseñados en la región que comprende el promotor E-35S y el gen exón/intrón de hsp70. El

control positivo amplificará una banda de 189 pb. Los controles negativo y sin plantilla no

deben arrojar una banda visible.




149 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz MON810.



Detección del maíz Bt-176

El gen diana es el gen cryIA(b), que protege la planta de insectos como el piral del maíz.

Características de los cebadores CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 y CRYIA4

CRYIA1 Secuencia CGGCCCCGAGTTCACCTT Longitud 18 Peso molecular (g/mol) 5394,6 Punto de fusión * (G/C) 59,5

CRYIA2 Secuencia CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6519,2 Punto de fusión * (G/C) 57,6

CRYIA3 Secuencia CCGCACCCTGAGCAGCAC Longitud 18 Peso molecular (g/mol) 5397,6 Punto de fusión * (G/C) 61,7

CRYIA4 Secuencia GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6479,2 Punto de fusión * (G/C) 57,6


Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1% es GM

[Bt-176])



en vez de ADN.



y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 7. El



procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 y



Cuadro 7. Mezcla maestra CRYIA1-CRYIA2

Concentraciónfinal



Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido CRYIA1 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido CRYIA2 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 por pipeteado y centrifugar

brevemente





Programa PCR (CRYIA1-CRYIA2)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 95 ˚C 40 s Anillamiento Extensión

60 ˚C 72 ˚C

40 s 40 s







instrucciones indicadas en el cuadro 8.

El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl de mezcla maestra de CRYIA3 y

CRYIA4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la

preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.

Cuadro 8. Mezcla maestra CRYIA3-CRYIA4

Concentraciónfinal



muestras Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido CRYIA3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido CRYIA4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA3 y CRYIA4 por pipeteado y centrifugar

brevemente







Programa de la PCR anidada (CRYIA3/CRYIA4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min


60 ˚C 72 ˚C

40 s 40 s













Las parejas de cebadores CRYIA1-CRYIA2 y CRYIA3-CRYIA4 se diseñaron para la

detección específica del gen sintético cryIA(b) mediante PCR anidada, que rinde un

fragmento final de PCR anidada de 149 pb. Este gen está presente en la línea del maíz Bt-

176 y en otras líneas (p. ej., la línea del maíz Bt-11).

El control positivo amplificará una banda de 189 pb.

Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible.




189 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz Bt-176.



Detección de la soja Roundup Ready

La diana es el gen CP4 EPSPS, que confiere resistencia al herbicida Roundup.

Características de los cebadores GMO5, GMO9, GMO7 y GMO8

GM05 Secuencia CCACTGACGTAAGGGATGACG Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6479,4 Punto de fusión * (G/C) 59,5

GM09 Secuencia CATGAAGGACCGGTGGGAGAT Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6559,4 Punto de fusión * (G/C) 59,5

GMO7 Secuencia ATCCCACTATCCTTCGCAAGA Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6309,6 Punto de fusión * (G/C) 55,8

GM08 Secuencia TGGGGTTTATGGAAATTGGAA Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6579,8 Punto de fusión * (G/C) 51,7


Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0,1% es GM

[soja Roundup Ready])

• Control negativo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0 % es GM)


vez de ADN.










Concentraciónfinal



Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido GMO5 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido GMO9 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl

TOTAL 48 µl 480 µl




brevemente







Programa PCR (GMO5-GMO9)


95 ˚C 3 min





instrucciones indicadas en el cuadro 10.


1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la preparación de la

mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.


Concentraciónfinal



muestras Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido GMO7 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido GMO8 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl

• Preparar un tubo para microcentrifuga de 1,5 ml





brevemente





Programa de la PCR anidada (GMO7-GMO8)


95 ˚C 3 min













Las parejas de cebadores GMO5-GMO9 y GMO7-GMO8 se diseñaron para la detección

específica de la construcción genética de la soja Roundup Ready mediante PCR anidada,



que rinde un fragmento de PCR anidada de 169 pb. Los cebadores GMO5 y GMO7 son

complementarios del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; el GM09 se hibrida

con el gen CP4 EPSPS de Agrobacterium sp., cepa CP4, y el GMO8 con el gen CTP

EPSPS.

El control positivo amplificará una banda de 169 pb.

Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible. Si los controles

positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras

seleccionadas no es válido.


169 pb, significa que la muestra contiene ADN de la soja Roundup Ready.

análisis de la presencia de organismos alimentos...qualitative detection of mon810 maize, bt-176...

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