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ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de

Alimentos

Sesión nº 12

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA

F. Eyquem

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 2

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12

Índice

Sesión nº 12

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA

Introducción 3

La técnica ELISA 8

Práctica 12

Diagrama de flujo 21

Bibliografía 22

Bibliografía complementaria 22



Introducción

La detección inmunológica específica de una proteína nueva sintetizada por un gen

introducido durante la transformación constituye un método alternativo de

identificación de plantas modificadas genéticamente. Hay que tener presente, no

obstante, que la modificación genética no siempre tiene por finalidad específica la

producción de una proteína nueva y no siempre se traduce en unos niveles de

expresión de la proteína útiles para la detección. Además, algunas proteínas se

expresan solo en determinadas partes de la planta (están utilizándose ya promotores

con especificidad tisular para fines concretos) o se expresan a niveles diferentes en

partes distintas o durante fases distintas del desarrollo fisiológico.

Se ha comunicado que los niveles de expresión de los productos transgénicos en las

plantas se sitúan entre el 0 y el 2 % de la proteína soluble total, incluso con

utilización de potentes promotores constitutivos para activar la expresión (Longstaff,

1995). En la mayor parte de los casos, no obstante, los niveles de expresión

comunicados (p. ej., en cultivos GM aprobados) se sitúan por debajo del límite

superior del 2 % (Hemmer, 1997).

Los inmunoensayos son sistemas de medición analítica que utilizan anticuerpos

como reactivos de ensayo. Los anticuerpos son proteínas específicas aisladas a

partir del suero de animales que solo se unen físicamente a la sustancia que ha

provocado su producción. Los anticuerpos se fabrican inyectando la sustancia que

se quiere detectar (p. ej., CP4 EPSPS, la proteína que confiere resistencia al

herbicida Roundup) a animales como el conejo o el ratón, cuyas células somáticas

reconocen la sustancia como «extraña» y responden produciendo anticuerpos contra

ella. Después se purifican los anticuerpos, se acoplan a un marcador detectable y se

utilizan como reactivos para detectar la sustancia de interés.

Un requisito previo para el desarrollo de métodos inmunológicos de detección es

disponer de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína nueva que se quiere

detectar. Además, es necesario que la muestra o las proteínas de interés no se

degraden significativamente.

Los anticuerpos son un instrumento precioso para el biólogo en la detección y

cuantificación de antígenos en mezclas complejas. Todos los inmunoensayos se

basan en la unión específica del anticuerpo al antígeno.

Interacciones anticuerpo-antígeno

Al describir las propiedades de los anticuerpos en tanto que proteínas, la mayoría de

los inmunólogos citará la capacidad de estas moléculas para precipitar los antígenos



de una solución, aun cuando la precipitación de anticuerpos apenas se utilice ya

para aislar o detectar antígenos experimentalmente y los anticuerpos raramente

precipitan antígenos in vivo, salvo en el caso de algunas enfermedades

autoinmunes. El valor pedagógico de la reacción de precipitación por anticuerpos,

ilustrada en la figura 1, es que refleja nítidamente muchas de las propiedades

fundamentales y universales de las moléculas de anticuerpo. Esta técnica

demuestra, entre otras cosas, que:

• los anticuerpos (lgG) séricos son bivalentes en sus reacciones con antígenos y

tienen la capacidad de entrecruzar antígenos;

• los antígenos son a menudo multivalentes en sus interacciones con los

anticuerpos;

• los anticuerpos séricos suelen ser policlonales en la naturaleza, y

• los anticuerpos son sumamente específicos en lo que se refiere a las estructuras

que reconocen en las moléculas antigénicas.

Cuadro 1. Curva de precipitación de un sistema de un antígeno y sus anticuerpos.

En la representación gráfica de la cantidad de anticuerpo precipitada frente a la

concentración de antígeno (siendo constante el total de anticuerpo) se distinguen

tres zonas:

ANTISUERO POLICLONAL

Zona de exceso de anticuerpos

Zona de equivalencia

Zona de exceso de antígeno

Mioglobina

ANTICUERPO MONOCLONAL

Sobrenadantes: Exceso de Ac Exceso de Ag

Anticuerpo precipitado

Antígeno añadido



- una «zona de exceso de anticuerpo» en la que queda inhibida la precipitación y

puede detectarse un exceso de anticuerpo en el sobrenadante;

- una «zona de equivalencia» de precipitación máxima, en la que anticuerpos y

antígenos forman grandes complejos insolubles (de tonos azules) y no se puede

detectar en el sobrenadante ni el antígeno ni el anticuerpo;

- una «zona de exceso de antígeno» en la que queda inhibida la precipitación y

puede detectarse un exceso de antígeno en el sobrenadante.

Aun cuando la reacción de precipitación se presta magníficamente a la

caracterización de las interacciones entre anticuerpos policlonales y antígenos

multivalentes, no suele resultar muy útil para caracterizar las interacciones entre

antígenos y anticuerpos monoclonales, salvo en caso de que los antígenos exhiban

múltiples epítopos idénticos (como las estructuras repetitivas de hidratos de carbono

que se encuentran en los polisacáridos, por ejemplo). Solo entonces podrá un

anticuerpo monoclonal monoespecífico entrecruzar y precipitar antígeno. Sin

embargo, habitualmente los anticuerpos monoclonales se pueden caracterizar

mediante tipos de medición más refinados que aportan detalles sobre la interacción

entre anticuerpo y antígeno, tales como la constante de equilibrio y las tasas

cinéticas de asociación y disociación.

Nunca se insistirá bastante en la utilidad de los anticuerpos para la detección y

aislamiento de antígenos, dado el amplio espectro de aplicaciones extremadamente

potentes de los anticuerpos que se ha ido desarrollando a lo largo de los años. La

utilidad de los anticuerpos se ve además reforzada por su estabilidad relativa en

varias reacciones de modificación química, que alteran la estructura del anticuerpo

sin destruir su capacidad para unirse a antígenos. Los anticuerpos han sido

marcados químicamente con compuestos fluorescentes, magnéticos, radiactivos y

de otros tipos a fin de facilitar la detección o aislamiento de antígenos en

condiciones experimentales diversas.

Preparación de anticuerpos monoclonales

El sistema inmunitario de un organismo es capaz de reconocer como invasoras las

sustancias extrañas al mismo, como las bacterias y los virus patógenos y otros

agentes infecciosos, denominadas antígenos. Nuestras defensas naturales contra

estos agentes infecciosos son los anticuerpos, proteínas que buscan los antígenos y

ayudan a destruirlos.

Los anticuerpos presentan dos características de gran utilidad. En primer lugar, son

extremadamente específicos, es decir, cada anticuerpo se une a un antígeno



particular para atacarlo. En segundo lugar, algunos anticuerpos, una vez activados

por la presencia de una enfermedad, siguen confiriendo resistencia a ella.

Esta segunda característica es la que permite desarrollar vacunas. Una vacuna es

un preparado de bacterias o virus muertos o debilitados que, al ser introducido en el

organismo, estimula la producción de los anticuerpos correspondientes a los

antígenos que contiene.

La primera característica de los anticuerpos, su especificidad, es la responsable de

que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea tan valiosa. Los anticuerpos no

solo pueden utilizarse con fines terapéuticos, para proteger de la enfermedad, sino

también en el diagnóstico de una amplia variedad de enfermedades y en la

detección de la presencia en la sangre de medicamentos, de productos víricos y

bacterianos y de otras sustancias inusuales o anormales.

Dado que estas sustancias de lucha contra la enfermedad tienen usos muy diversos,

se ha investigado durante mucho tiempo su producción en cantidades puras. El

método convencional era inyectar el antígeno a un animal de laboratorio y luego, una

vez formados los anticuerpos, recogerlos del suero sanguíneo (el suero sanguíneo

que contiene anticuerpos se llama antisuero). Este método, sin embargo, presenta

dos problemas: produce antisuero que contiene sustancias no deseadas y produce

una cantidad muy pequeña de anticuerpos utilizables.

La tecnología de anticuerpos monoclonales permite producir grandes cantidades de

anticuerpos puros utilizando células que producen anticuerpos de forma natural y

una clase de células que puede crecer continuamente en cultivo. Si formamos un

híbrido que combine la característica de la «inmortalidad» con la capacidad de

producir la sustancia deseada disponemos, desde luego, de una fábrica de

anticuerpos en funcionamiento permanente.

En la tecnología de anticuerpos monoclonales se fusionan células tumorales

capaces de replicarse indefinidamente con células de mamífero que producen un

anticuerpo. El resultado de esta fusión celular es un «hibridoma» que produce

anticuerpos continuamente. Estos anticuerpos se llaman monoclonales porque

proceden de un único tipo de célula, el hibridoma, mientras que los producidos por

métodos convencionales derivan de preparados que contienen muchos tipos de

células, por lo que se denominan policlonales. Se da a continuación un ejemplo de la

obtención de anticuerpos monoclonales.

Producción de anticuerpos monoclonales

Un mieloma es un tumor de la médula ósea que puede adaptarse para que crezca

permanentemente en un cultivo. Al fusionar células de mieloma con células de bazo



de mamífero productoras de anticuerpos, se halló que las células híbridas

resultantes, o hibridomas, producían grandes cantidades de anticuerpos

monoclonales. Este producto de una fusión celular combinaba las cualidades

deseadas de los dos tipos de células diferentes, a saber, la capacidad de

crecimiento continuo y la de producir grandes cantidades de anticuerpo puro.

Como las células híbridas seleccionadas producen un solo anticuerpo específico,

son más puros que los anticuerpos policlonales producidos mediante técnicas

convencionales y pueden resultar más efectivos que los medicamentos

convencionales para combatir la enfermedad, ya que estos no solamente atacan a la

sustancia extraña, sino también a las células del propio organismo, produciendo a

veces efectos secundarios no deseados tales como reacciones alérgicas. Los

anticuerpos monoclonales atacan a la molécula diana y solo a ella, y sus efectos

secundarios son mínimos o inexistentes.

Producción de anticuerpos monoclonales

Inmunización de un ratón para estimular la producción de anticuerpos

Se aislan células formadoras de anticuerpos a partir del bazo

Se cultivan células tumorales en un cultivo tisular

Las células formadoras de anticuerpos se funden con células tumorales cultivadas para formar hibridomas

Selección de hibridomas para la producción de anticuerpos

Hibridomas productores de anticuerpos clonados

Anticuerpos monoclonales aislados para su cultivo



La técnica ELISA Definición

Un ensayo de inmunosorción enzimática («Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay»)

es cualquier inmunoensayo enzimático que utilice un inmunorreactivo (antígeno o

anticuerpo) marcado con una enzima y un inmunosorbente (antígeno o anticuerpo

unido a un soporte sólido). Para medir una concentración desconocida pueden

usarse diversos métodos (p. ej., unión competitiva entre el reactivo marcado y el

elemento desconocido sin marcar).

ELISA (Clark y Adams, 1977) se basa en interacciones específicas entre anticuerpos

y antígenos. Los reactivos clave en ELISA son los anticuerpos, que son proteínas

solubles producidas por el sistema inmunitario en respuesta a una infección por una

sustancia extraña (llamada «antígeno»). En caso de la detección de OGM, el

antígeno puede ser la nueva proteína sintetizada.

Esta técnica se aplica en la evaluación, en fase experimental, del nivel de expresión

de la(s) proteína(s) sintetizada(s) por el nuevo gen introducido. Por ello, es posible

encontrar información sobre la producción y el uso de anticuerpos específicos en

muchos artículos que describen la creación de plantas transgénicas (Mohapatra et

al., 1999).

Solo se dispone comercialmente de unos cuantos anticuerpos específicos dirigidos

contra proteínas que son producto de los transgenes utilizados en cultivos

modificados genéticamente aprobados: sirvan de ejemplo los anticuerpos contra el

producto del gen nptII, NPTII, o APH(3')II y contra el producto del gen gus.



Existen tres métodos distintos de realizar el ensayo ELISA:

Un método de detección específica de la soja Roundup Ready basado en ELISA fue

desarrollado, sometido a prueba y validado por Lipp et al. (2000).

El método se basa en el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína

CP4 EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, enzima procedente de

Agrobacterium sp., cepa CP4) (Padgette et al., 1995), que es la proteína que

confiere la tolerancia frente al herbicida Roundup en la soja Roundup Ready. Los

resultados preliminares indican que este método (que se aplica utilizando un kit

comercia de ELISA) es capaz de detectar la presencia de OGM en material de soja

bruto en concentraciones que se sitúan entre el 0,3 % y el 5 %.

Principio

Para la detección de la proteína CP4 EPSPS se utiliza un ensayo de

inmunoadsorción enzimática (ELISA) directo de tipo sándwich, según se muestra en

las siguientes figuras:

a) ELISA indirecto

b) ELISA sándwich

c) ELISA competitivo

Pocillo revestido

de antígeno

Añadir anticuerpo específico

Añadir anticuerpo secundario conjugado con enzima

Añadir sustrato (s)

y medir color

Añadir sustrato y

medir color

Añadir sustrato sin color



Añadir antígeno

Añadir (Ag-Ac) al pocillo

revestido de antígeno

Pocillo revestido de anticuerpo

Incubar anticuerpo

con antígeno

lavado lavado lavado

lavado lavado lavado

lavado lavado



Se reviste la superficie de una placa de microvaloración con un anticuerpo de

captura monoclonal específico.

Cuando se añade la muestra de interés, el anticuerpo de captura se une al antígeno.

Los componentes de la muestra que no se han unido se eliminan mediante lavado.

Tras el lavado, se añade un anticuerpo policlonal, unido covalentemente a la

peroxidasa de rábano (HRP), que es específica para un segundo sitio antigénico en

la proteína CP4 EPSPS unida.

Superficie revestida

Y Anticuerpo monoclonal

Superficie revestida

Antígeno

Superfic. revestida

HRP

Superfic. revestida

TM TM

Anticuerpo detector



Tras otro lavado, se añade el cromógeno tetrametilbencidina de la peroxidasa de

rábano. La peroxidasa de rábano genera una señal de color que es proporcional a la

concentración de antígeno en un intervalo lineal. Para detener el desarrollo del color

se añade una solución de parada. El nivel de color producido se mide a una longitud

de onda de 450 nm.



Práctica (GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide (1999). Strategic Diagnostics,

Inc., Rev. 052099, Vers. 1.8.)1

Introducción

El siguiente protocolo especifica un método ELISA para la determinación de la

proteína CP4 EPSPS expresada en la soja Roundup Ready en productos agrícolas

brutos y elaborados como las harinas de soja y las proteínas aisladas de soja.

El método es aplicable a muestras que han sido poco o en absoluto tratadas, por lo

que la proteína CP4 EPSPS no está desnaturalizada. Por ejemplo, la temperatura a

la que se transforman los ingredientes de los alimentos puede repercutir en las

posibilidades de detección de la proteína. Según los datos, las temperaturas de

transformación de no más de 65 °C durante no más de 60 minutos permiten una

detección fiable.

El método ha sido validado para la detección de la proteína CP4 EPSPS y puede

usarse para determinar la concentración de la proteína en la muestra en el intervalo

del 0,3 % al 5 % (p/p) usando material de referencia específico. El kit puede

emplearse igualmente a niveles de detección más bajos (0,05 % a 0,3 %) con

modificaciones en el protocolo.

Instrumental

• Tubos de centrifugación cónicos de polipropileno de 15 ml

• Tubos de ensayo de vidrio de 12 X 75 mm

• Hojas de plástico o aluminio para envolver

• Cinta de plástico o lavador de placas manual

• Frascos lavadores, p. ej. de 500 ml

• Pipetas de precisión capaces de transferir de 20 µl a 500 µl

• Mezclador de torbellino

• Bandejas de pesar o equivalentes

• Espátulas

• Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g

1 El kit que se describe en esta sesión era el único protocolo validado disponible en el comercio en el momento en que se organizaron los cursos y se preparó el presente Manual. El CCI y la OMS no promocionan ninguna marca concreta de kits disponibles en el comercio.



• Centrifugadora que pueda trabajar a 5 000 - 10 000 rpm

• Lector de placas de microvaloración capaz de leer una absorbancia a 450 nm

• Horno de incubación capaz de mantener 37 °C

• Tamiz de 450 µm de abertura o equivalente

• Tamiz de 150 µm de abertura (malla 100) o equivalente

• Pipeta multicanal, p. ej., de 50 µl a 300 µl (opcional)

• Depósitos de reactivo para distribución multicanal (opcional)

• Lavador de placas automático (opcional)

• Soporte para tubos de centrifugación de 15 ml (opcional).

Reactivos

Generalidades

Durante los análisis, y a menos que se indique otra cosa, se utilizarán solamente

reactivos de grado analítico y agua desionizada o destilada.

Cualquier desviación de los criterios de rendimiento definidos podría indicar una

merma de la estabilidad de un reactivo. En caso de que los componentes del

sustrato hayan ya virado de transparente a azul, deberá descartarse el reactivo. No

deberán usarse soluciones tampón turbias.

Todos los componentes del kit deberán almacenarse a una temperatura de entre

2 °C y 8 °C. El período de validez de los componentes del kit viene indicado por su

fecha de caducidad. Sobre la base de ensayos de estabilidad acelerados, la fecha

de caducidad del kit de ensayo se ha fijado en 9 meses a una temperatura de entre

2 °C y 8 °C.

La solución madre «conjugado de soja» de conjugado de anticuerpo y la solución de

trabajo de conjugado de anticuerpo deberán almacenarse a una temperatura de

entre 2 °C y 8 °C hasta la fecha de caducidad del kit. El tampón de lavado de trabajo

diluido deberá almacenarse a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C sin sobrepasar

la fecha de caducidad del kit.

Reactivos que suelen facilitarse con el kit de ensayo

• Tampón de extracción de soja, tampón de borato de sodio, pH 7,5

• Tampón de extracción de soja, PBS, Tween 20, seroalbúmina bovina, pH 7,4

• Pocillos en tiras revestidas (12 tiras de 8 pocillos cada una revestidas con los

anticuerpos de captura monoclonales y un portatiras)

• Conjugado de soja, proteína anti-CP4 EPSPS de conejo, liofilizada



• Diluyente del conjugado de soja, suero de ratón inactivado por calor al 10 %

• Sustrato cromogénico, K-Blue, tetrametilbencidina (TMB), peróxido de

hidrógeno, dimetilformamida al 5 % como disolvente de base

• Solución de parada, ácido sulfúrico al 0,5 %

• Tampón de lavado concentrado diez veces, PBS, Tween 20, pH 7,1

• Patrones de referencia negativos y positivos.

Procedimiento

Limitación del procedimiento

Este sistema de ensayo de la modificación genética mediante ELISA solo es válido

para muestras en las que la expresión de la proteína CP4 EPSPS se pueda

correlacionar con el nivel de material modificado genéticamente presente en los

patrones de referencia utilizados.

El kit de ELISA ha sido diseñado para ofrecer un rendimiento óptimo a una

temperatura ambiente de 15 °C a 30 °C. La absorbancia del patrón de referencia

más elevado debe ser superior a 0,8 y no estar fuera del intervalo lineal del

espectrómetro (el límite superior varía según el aparato). Es importante tener

presente que los valores de la densidad óptica aumentan más deprisa a

temperaturas superiores a 30 °C. En consecuencia, si la temperatura es elevada,

será necesario acortar el tiempo de incubación del sustrato. A temperaturas bajas

(inferiores a 15 °C), por el contrario, habrá que alargar dicho tiempo.

Medidas encaminadas a evitar la contaminación durante la preparación de la muestra

Generalidades. El sistema ELISA de ensayo de OGM es una técnica

extremadamente sensible capaz de detectar cantidades muy pequeñas de

contaminantes GM. Por este motivo, es imperativo que todo el instrumental utilizado

para procesar las muestras de soja sea limpiado a fondo entre dos lotes de

muestras. Los procedimientos que se mencionan a continuación incluyen un primer

paso de eliminación física de cuantas partículas sea posible. El segundo paso, un

lavado con alcohol, tiene por finalidad desnaturalizar la muestra de manera que no

reaccione durante el ensayo con ninguna proteína GM que pueda haber quedado en

el instrumental.



Limpieza del triturador o batidora. Cepillar con un cepillo de cerdas suave. Lavar

el cepillo periódicamente y remojarlo en una solución de alcohol. Secar el cepillo

antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave o un paño de laboratorio.

Lavar con alcohol, que puede tenerse almacenado para su uso en una botella con

pulverizador o pitorro. Se recomiendan dos lavados o pulverizaciones. Luego, se

enjuagará a fondo con agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizar enseguida el

instrumento, con un secador de pelo comercial.

Limpieza del tamiz. El polvo de soja suele endurecerse, atascando el tamiz.

Sacudir bruscamente el tamiz contra una superficie dura para desprender el material

endurecido.

Cepillar con un cepillo de cerdas suave y limpio. Lavar el cepillo periódicamente y

remojarlo en una solución de alcohol durante al menos un minuto. Secar el cepillo

antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave.

Remojar en alcohol durante al menos cinco minutos y luego enjuagar a fondo con

agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizarlo enseguida, con un secador de pelo

comercial.

Una alternativa sería el uso de un baño de ultrasonidos seguido de un secado al

aire.

Limpieza de la zona de trabajo. También es importante la limpieza de la zona de

trabajo. Dado que el ensayo es muy sensible, una ligerísima contaminación por

polvo GM del tubo de ensayo podría conducir a un falso positivo. Hay que evitar la

contaminación por polvo de soja en la zona de trabajo. No debe permitirse que el

polvo de soja de un proceso contamine el instrumental que se usará en un proceso

posterior. Lo ideal es realizar el ensayo en un espacio separado de la instalación en

la que se efectúa el triturado y la preparación de la muestra, a fin de evitar la posible

contaminación por polvo.

Preparación de la muestra

Debe tomarse de la muestra de laboratorio una submuestra incremental homogénea.

Si la muestra es de semillas de soja en bruto, se colocarán al menos 500 g en una

batidora adecuada y se triturarán durante 3 minutos aproximadamente, o hasta que

sea suficientemente fina para atravesar los tamices. Para análisis cuantitativos,

deberá obtenerse un tamaño de partícula inferior a 150 µm, y para análisis

cualitativos, inferior a 450 µm. En la fase de tamizado debe ponerse cuidado en

evitar la contaminación, así como en evitar el calentamiento excesivo. La batidora



permitirá mezclar y triturar la muestra. Se tomará una submuestra de

aproximadamente 100 g de material triturado, que se pasará a través de un tamiz

con un tamaño de poro de 450 µm (malla 40). Al menos el 90 % de esta submuestra

deberá atravesar el tamiz de 450 µm. Puede usarse este material directamente si se

trata de un ensayo cualitativo, pero si es cuantitativo debe volverse a pasar por un

tamiz con tamaño de poro de 150 µm. Como se ha demostrado que el material que

atraviesa el tamiz de 450 µm es homogéneo, basta hacer pasar por el tamiz de

150 µm suficiente material para obtener la muestra final.

Otros tipos de muestras deben recibir un tratamiento semejante, aunque puedan

utilizarse tamaños de muestra más pequeños.

Procedimiento de ensayo

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usarlos.

Se sacan las tiras revestidas y el portatiras de la bolsa de papel de aluminio. Tras

extraer el número de tiras adecuado, hay que volver a cerrar siempre la bolsa.

Hacen falta diez pocillos para los patrones de referencia y los blancos de ensayo.

Cada placa debe tener sus propios patrones y controles. Si se utiliza un lavado

manual, pegar con cinta de plástico los bordes de todas las tiras necesarias para un

ciclo al portatiras, a fin de evitar que caigan accidentalmente de este durante el

lavado.

Preparación del conjugado de anticuerpo

Solución madre de conjugado de anticuerpo. Pipetear 1 ml de diluyente de

conjugado de soja procedente de la botella de diluyente de conjugado de soja en el

frasco de conjugado de soja. Agitar en el mezclador de torbellino durante 10 s

aproximadamente.

Solución de trabajo de conjugado de anticuerpo. Volver a poner 240 µl de

conjugado de soja reconstituido en la botella de diluyente de conjugado de soja.

Marcar la botella con la fecha del día y mezclar invirtiéndola 20 veces.

Preparación del tampón de lavado

Dejar que el tampón de lavado concentrado diez veces alcance la temperatura

ambiente.

Diluir dicho tampón concentrado en agua desionizada para preparar el tampón de

lavado de trabajo (p. ej., 50 ml de tampón de lavado concentrado diez veces en 450

ml de agua desionizada).



Añadir al lavador de placas automático o al frasco lavador.

Extracción de muestras y patrones de referencia

Se extraen las muestras y los patrones de referencia negativos y positivos en las

mismas condiciones y por duplicado, según se describe a continuación.

Cuando vayan a pesarse las muestras, pesar cada patrón de referencia por orden de

concentración creciente y luego las muestras.

Pesar 0,5 g ± 0,01 g de cada patrón de referencia y de la muestra en distintos tubos

de centrifugación de polipropileno de 15 ml. Para evitar la contaminación, limpiar la

espátula entre cada pesada.

Añadir 4,5 ml de tampón de extracción de soja en cada uno de los tubos que

contienen una muestra de 0,5 g y agitar en un mezclador de torbellino durante 10 s.

Centrifugar las mezclas a aproximadamente 5000 rpm durante 15 minutos.

Utilizando una pipeta de transferencia, retirar cuidadosamente el sobrenadante sin

aspirar material sólido y colocarlo en un tubo de centrifugación de 15 ml limpio y

etiquetado.

Antes de comenzar el ensayo, diluir los extractos de la muestra y los extractos del

patrón de referencia con tampón de ensayo de soja con arreglo a lo indicado en el

cuadro 1.

Los extractos de proteína deben almacenarse a entre 2 °C y 8 °C, pero no durante

más de un día de trabajo.

Cuadro 1. Intervalos de dilución en función de la matriz

Matriz Dilución

Semillas de soja Harina de soja

Harina de soja desgrasadaAislado de proteínas

1:300 1:300 1:300 1:10

Dilución de extractos de muestras Para el control negativo extraído, para cada referencia positiva extraída y para cada

muestra, se precisan dos tubos de ensayo de 12 X 75 mm para realizar la dilución.

Pipetear 280 µl del tampón de ensayo de soja en uno de los dos tubos de ensayo de

12 x 75 mm.

Pipetear 380 µl del tampón de ensayo de soja en el otro tubo de ensayo de 12 x 75

mm. Marcar el tubo de 280 µl con la inscripción «1:15» y el de 380 µl con «1:300».



Pipetear 20 µl de cada extracto de muestra en el tubo «1:15» y agitar en el

mezclador de torbellino.

Transferir 20 µl del tubo «1:15» agitado al tubo «1:300» y agitar en el mezclador de

torbellino.

Repetir los mismos pasos para el control negativo, para cada referencia positiva y

para los extractos de muestra.

Procedimiento de inmunoensayo ELISA

Generalidades

El kit de ensayo ELISA puede utilizarse en distintos formatos con cualquier número

de bandas de 8 pocillos. Se recomienda seguir un sistema de carga aleatorio.

Todos los pocillos de reacción deben emplearse por duplicado, calculándose el valor

medio de absorbancia de cada pocillo. Cada ciclo está integrado por el blanco del

tampón de ensayo, el control negativo y la referencia positiva.

Una vez iniciado un ensayo, deben completarse todas sus etapas sin interrupción.

Adición de la muestra

Añadir 100 µl de extractos diluidos y el blanco de ensayo a los pocillos oportunos.

Usar puntas desechables distintas en cada etapa de pipeteo para evitar la

contaminación cruzada. Cubrir la placa con hoja de aluminio o de plástico para evitar

la contaminación y la evaporación.

Incubación de la muestra

Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.

Lavado

Lavar 3 veces con 300 µl de tampón de lavado.

Lavado manual. Vaciar los pocillos invirtiéndolos sobre un fregadero o un

contenedor de residuos adecuado. Utilizando un frasco lavador de 500 ml que

contenga solución de lavado de trabajo, llenar cada pocillo hasta el borde, dejar

reposar 60 s, y luego vaciar la placa como se acaba de indicar. Repetir el lavado un

total de 3 veces. Eliminar el líquido y las burbujas residuales sacudiendo boca abajo

la placa sobre varias capas de toallas de papel.

Se impedirá que las tiras caigan del marco sujetándolas con cinta adhesiva.

Lavado automático. Al final del período de incubación, aspirar el contenido de

todos los pocillos utilizando un lavador de micropocillos, y luego llenarlos con

tampón de lavado de trabajo. Repetir la aspiración y el llenado un total de 3 veces.



Por último, aspirar todos los pocillos mediante el lavador de micropocillos y sacudir

la placa invertida sobre una pila de toallas de papel para eliminar las gotitas

residuales de tampón de lavado y las burbujas.

No hay que dejar que los pocillos se evaporen, ya que esto podría afectar al

rendimiento del ensayo.

Un lavado inadecuado puede ocasionar resultados erróneos. Tanto si se utiliza un

lavador manual como automático, es importante cerciorarse de que todos los

pocillos de ensayo se lavan con idénticos volúmenes.

Adición del conjugado de anticuerpo

Añadir 100 µl de solución de trabajo de conjugado de anticuerpo a cada pocillo.

Cubrir la placa para evitar la contaminación y la evaporación.

Incubación

Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.

Lavado

Concluido el período de incubación, repetir el lavado según lo anteriormente

descrito.

Adición del sustrato

Añadir 100 µl de la solución de color a cada pocillo.

Agitar suavemente la placa e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

La adición de sustancia cromogénica debe efectuarse sin interrupciones. Mantener

la misma secuencia e intervalo de tiempo durante el pipeteo. Proteger la placa de

microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del color.

Adición de la solución de parada

Al final del período de incubación, añadir 100 µl de solución de parada a cada

pocillo, pipeteándola en la misma secuencia en que se haya añadido el reactivo de

color.

La adición de solución de parada debe efectuarse sin interrupciones. Proteger la

placa de microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del

color.

Lectura de la absorbancia

Utilizando un lector de microplacas equipado del filtro adecuado para efectuar

lecturas a 450 nm, medir la absorbancia de cada pocillo de ensayo.



Todas las lecturas deben efectuarse dentro de los 30 minutos siguientes a la adición

de la solución de parada.

Tomar nota de los resultados obtenidos y calcular los valores medios de

absorbancia, o recurrir a un programa informático.

Evaluación

Deben usarse los valores de los patrones para desarrollar una curva patrón. El valor

del blanco de ensayo deberá sustraerse de todos los valores de las muestras y

patrones de referencia. Se utilizarán los valores medios corregidos correspondientes

a cada punto de referencia duplicado para crear una curva patrón. Luego se

utilizarán los datos promedio de cada muestra duplicada para interpolar una

concentración a partir de dicha curva.

Criterios de aceptación o rechazo de un ciclo

Para tener validez, cada ciclo deberá satisfacer los criterios de aceptación o rechazo

del procedimiento. Un ciclo consistirá en lo siguiente: el blanco de ensayo, la

extracción de cada patrón GM de referencia positiva, el control negativo y cada

muestra desconocida. Todos los extractos de proteína y el blanco de ensayo se

utilizarán en duplicados. Si un ciclo no satisface los criterios de aceptación del

ensayo, deberá repetirse íntegramente.

Ciclo Criterios

Blanco de tampón de ensayo A450nm < 0,30

Patrón 0 % GM A450nm < 0,30

Referencia 2,5 % A450nm > 0,8

Todos los patrones positivos CV de los duplicados < 15 %

Muestras desconocidas CV de los duplicados < 20 %



Diagrama de flujo Diagrama de la extracción de la muestra y del patrón de referencia

Procedimiento Volumen/peso Descripción

Pesada 0,5 g Pesar muestras, blanco de ensayo y patrones de referencia

Adición 4,5 ml Añadir el tampón de extracción

Mezclado Mezclar la muestra con el tampón de extracción hasta que quede homogénea

Centrifugado 5000 rpm Centrifugar la muestra a 5000 rpm durante 15 minutos Eliminar el sobrenadante y pasarlo a un tubo limpio

Dilución 1:300 o 1:10 según el material investigado

Diluir las muestras y patrones de referencia

Diagrama del procedimiento de inmunoensayo ELISA

Procedimiento Volumen Descripción

Adición 100 µl Pipetear los extractos diluidos de muestras, patrones de referencia y blanco tampón de ensayo en los correspondientes pocillos

Incubación Incubar 1 h a 37 °C

Lavado Lavar 3 veces con tampón de lavado

Adición 100 µl Distribuir el conjugado de anticuerpo en cada pocillo de ensayo

Incubación Incubar 1 h a 37 °C

Lavado Lavar 3 veces con tampón de lavado

Adición 100 µl Distribuir la solución de color en cada pocillo

Incubación Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Adición 100 µl Distribuir la solución de parada en cada pocillo de ensayo

Medida de la absorbancia

Medir el valor de la absorbancia de cada pocillo en un lector de placas a 450 nm



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análisis de la presencia de organismos genéticamente...

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