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ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de

Alimentos

Sesión nº 10

PCR Cuantitativa para la Detección de OGM

F. Weighardt

PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 2

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 10

Índice

Sesión nº 10

PCR Cuantitativa para la Detección de OGM

Introducción 3

Métodos de cuantificación basados en la PCR 4

Historia de las técnicas de PCR en tiempo real 7

Principios de la PCR en tiempo real 7

Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real 13

Bibliografía 20



Introducción

Una vez comprobado que un producto alimenticio ha dado positivo en relación con

una o más modificaciones genéticas (soja Roundup Ready, maíz Bt-176, maíz Bt-11,

maíz MON810 y maíz T25), los pasos analíticos posteriores consisten en determinar

si se cumple la legislación vigente (Reglamento (CE) nº 1829/2003 y Reglamento

(CE) nº 1830/2003) midiendo la cantidad de cada OGM presente en cada ingrediente

(figura 1).

Los Reglamentos mencionados disponen que todos los productos que contengan

OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM deben ir etiquetados

como tales.

No es exigible el etiquetado de los productos que incluyan materiales que contengan

OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM en proporción no

superior al 0,9% de los ingredientes alimenticios individualmente considerados,

siempre que esta presencia sea accidental o técnicamente inevitable.

Todos los ingredientes (harina, sémola, aceite, etc.) derivados de una misma

especie (p. ej., maíz, soja, colza, etc.) se consideran colectivamente un solo

ingrediente (p. ej., maíz).

Figura 1. No se exige etiquetado. La cantidad tanto de soja GM como de maíz GM

está por debajo del umbral legal.

Si, por ejemplo, un ingrediente derivado exclusivamente del maíz contiene menos de

un 0,9 % de maíz GM, no es necesario etiquetar el alimento obtenido a partir de él.

Por el contrario, si contiene más de un 0,9 % de maíz GM, es obligado etiquetar los

Maíz no GM99,4%

Maíz GM0,6%

Soja no GM 99,4%

Soja GM0,6%



productos alimenticios derivados. Esto es así incluso si en el producto final,

considerando la suma de todos los ingredientes derivados de especies distintas (p.

ej., soja y maíz), la cantidad relativa de maíz GM desciende por debajo del 0,9 %. Si

están presentes dos o más variedades distintas de maíz GM, habrá que sumar sus

concentraciones y utilizar el porcentaje total para determinar si es necesario o no

etiquetar (figura 2). Si la suma resultante está por debajo del umbral del 0,9 %, no

será obligado etiquetar.

Figura 2. Es necesario etiquetar en razón del ingrediente maíz. La suma de las

modificaciones Bt-11 (0,6 %) y Bt-176 (0,6 %) rebasa el umbral del 0,9 % exigido

para el etiquetado.

El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de

secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de

la planta (p. ej., el de la lectina en el caso de la soja y los de la invertasa o la zeína

en el del maíz). El porcentaje de OGM resultante se expresa, por lo tanto, así: OGM

(%)= ADN-GM/ADN-referencia x 100.

Métodos de cuantificación basados en la PCR

Un grave inconveniente de la PCR convencional es la ausencia de información

cuantitativa exacta debido a la eficiencia de la amplificación. Si la eficiencia de la

Maíz no GM98,8%

Maíz Bt 176 0,6%

Soja no GM 100%

Maíz Bt 11 0,6%



reacción permaneciera constante para cada ciclo de amplificación, la concentración

de ADN posterior a la PCR sería directamente proporcional a la cantidad de ADN

diana inicial. Lamentablemente, la eficiencia de la amplificación varía de una

reacción a otra, así como en ciclos sucesivos de una misma reacción. En particular,

en los últimos ciclos de la PCR los productos de la amplificación se forman de

manera no exponencial y a una velocidad de reacción desconocida.

La cuantificación del ADN basada en la PCR convencional se apoya en la medición

en el punto final, a fin de conseguir la sensibilidad máxima, cuando la amplificación

alcanza el rendimiento máximo (la denominada «fase meseta»). En esta etapa la

reacción ha superado la fase exponencial, a causa fundamentalmente del

agotamiento de los reactivos y de la inactivación térmica gradual de la polimerasa

utilizada. Por ello, la correlación resultante entre la concentración del producto final y

el número de moléculas diana iniciales es limitada.

Para superar este problema se han desarrollado técnicas como la PCR competitiva

cuantitativa (PCR-CC) y la PCR en tiempo real, que se proponen establecer una

relación entre la concentración de ADN diana y la cantidad de producto de la PCR

generada por la amplificación.

PCR competitiva cuantitativa

Uno de los primeros métodos de PCR cuantitativa desarrollados es la PCR

competitiva cuantitativa (Giacca et al., 1994; Studer et al., 1998; Hardegger et al.,

1999). Este método se basa en la coamplificación de la plantilla de ADN diana y

cantidades definidas de un patrón de ADN interno (competidor) que portan los

mismos sitios de unión del cebador. Dado que se conoce la cantidad de competidor

inicial y que la eficiencia de la amplificación es la misma en los ADN competidor y

diana, la proporción de las cantidades de los dos productos de la PCR, determinada

por ejemplo mediante electroforesis en gel, es representativa de la proporción de los

ADN diana y competidor presentes en la mezcla de reacción antes de la

amplificación.

Normalmente un competidor es un plásmido linearizado que lleva la misma

secuencia de nucleótidos que el ADN diana, salvo una supresión o inserción que

permite, una vez coamplificado, obtener dos bandas de distinto tamaño tras una

electroforesis de geles estándar.



ADN amplificado de la diana

ADN amplificado del competidor

Figura 3. Coamplificación de una cantidad fija de ADN diana con distintas

cantidades de ADN competidor.

La PCR competitiva se ha utilizado con éxito para cuantificar tanto el ADN como en

ARN, pero su intervalo dinámico se limita a una proporción diana/competidor

comprendida entre aproximadamente 1:10 y 10:1. De hecho, la máxima exactitud se

obtiene encontrando el punto de equivalencia en el que la proporción

diana/competidor es 1:1 (figura 3). Para conseguir una proporción adecuada, habrá

que ensayar varias diluciones.

Otro inconveniente de este método es la necesidad de construir y caracterizar un

competidor diferente para cada diana que se vaya a cuantificar. En realidad, incluso

diferencias pequeñas en la eficiencia de la amplificación pueden comprometer

gravemente la exactitud de la cuantificación mediante la PCR competitiva

cuantitativa. Por último, al final de la reacción, la PCR competitiva exige una

cuantificación adecuada de los amplicones de la diana y del competidor, lo que suele

exigir un laborioso tratamiento ulterior.

La PCR competitiva es un método semicuantitativo que comporta la comparación de

un patrón (el competidor) con la muestra. Los resultados solo pueden indicar un

valor inferior, igual o superior a una concentración patrón definida.

No obstante, el sistema de la PCR competitiva tiene la ventaja de que los

laboratorios no necesitan adquirir equipos especializados, ya que puede aplicarse

con el instrumental habitual de un laboratorio de biología molecular y PCR.

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real representa una metodología de la PCR más exacta y más

utilizada actualmente. Al contrario que en el caso de las determinaciones en el punto

final, los sistemas de PCR en tiempo real monitorizan la reacción a medida que tiene

lugar. En este tipo de sistema, la PCR se acopla a la emisión de una señal

fluorescente proporcional a la cantidad de producto de la PCR producido en ciclos

posteriores. Esta señal se intensifica proporcionalmente a la cantidad de producto de



la PCR generado en cada ciclo de reacción sucesivo. Registrando la cantidad de

emisión fluorescente en cada ciclo, es posible monitorizar la PCR durante su fase

exponencial. El primer incremento significativo de la fluorescencia se correlaciona

con la cantidad inicial de plantilla diana (Ahmed, 2002).

Historia de las técnicas de PCR en tiempo real

Higuchi et al. (1992,1993) fueron los pioneros del análisis de la cinética de la PCR al

diseñar un sistema capaz de detectar los productos de la PCR a medida que se

acumulan. Este sistema «de tiempo real» incluía la molécula intercalante de bromuro

de etidio en cada mezcla de reacción. Para llevar a cabo las rondas se utilizaba un

termociclador adaptado para irradiar las muestras con luz ultravioleta y capaz de

detectar la fluorescencia resultante con una cámara CCD (dispositivo de

acoplamiento de cargas) controlada por ordenador y refrigerada. A medida que

´tenía lugar la amplificación, se producían cantidades crecientes de ADN bicatenario,

con bromuro de etidio intercalado, que inducían un aumento de la fluorescencia. Al

representar gráficamente la emisión de luz fluorescente frente al número de ciclo, el

sistema producía gráficos de la amplificación que daban una imagen más completa

del proceso de la PCR que el estudio de la acumulación del producto tras un número

de ciclos fijo.

Principios de la PCR en tiempo real

La especificidad del método de la PCR en tiempo real depende de las sustancias

utilizadas para generar y monitorizar la reacción de amplificación y del instrumento

utilizado para monitorizar la señal. Se han desarrollado varias sustancias al efecto:

colorantes de intercalación (bromuro de etidio, SYBR Green I) y sondas de

hibridación (sondas TaqMan, sondas FRET, balizas moleculares, Scorpions y

sondas TaqMan Minor Groove Binder).

PCR en tiempo real con uso del colorante SYBR Green I

La primera aplicación de la PCR en tiempo real derivó directamente de los

experimentos de Higuchi et al. (1992, 1993), sin más que sustituir el bromuro de

etidio por un agente intercalante del ADN bicatenario, fluorescente, menos tóxico y

más específico y sensible (entre 10 y 25 veces), el SYBR Green I (Haugland, 2002).

El colorante SYBR Green I se une al surco menor del ADN bicatenario, pero no al

ADN monocatenario. A consecuencia de esta unión, se potencia enormemente



(entre 800 y 1 000 veces) la fluorescencia (excitación aprox. a 488 nm y 254 nm;

emisión aprox. a 560 nm). Al iniciarse la PCR, el aumento de la cantidad de ADN

recién sintetizado produce un incremento de la señal fluorescente (Figura 4). No

obstante, el sistema de detección de secuencias basado en el SYBR Green I

presenta una limitación, que es la falta de especificidad de su modo de

reconocimiento del ADN. Por este motivo, se cuantifican todas las moléculas de ADN

bicatenario presentes en una PCR, incluidos los productos de la PCR no específicos

y los dímeros de los cebadores. Para resolver este problema y sustraer el

componente de la cuantificación debido a los ADN no específicos y a los dímeros de

cebadores en algunos dispositivos, es posible realizar un análisis de la curva de

fusión. Tras la fase final de la PCR, los productos se funden lentamente y se recogen

los datos de fluorescencia. Toda vez que cada ADN bicatenario tiene una

temperatura de fusión específica, es posible cuantificar los componentes que tienen

temperaturas de fusión diferentes en una única mezcla de reacción, eliminando así

de la cuantificación los componentes no específicos.

Métodos de la PCR en tiempo real basados en sondas específicas para una secuencia

El problema de la especificidad de la detección por fluorescencia del amplicón se ha

resuelto utilizando sondas específicas para una secuencia con un marcado

fluorescente diseñado en el interior del par de cebadores de la PCR. El proceso de

hibridación (y degradación final) de la sonda no suele interferir con la acumulación

exponencial del producto de la PCR. Se utilizan ahora unos pocos principios

diferentes para conseguir reacciones de cuantificación basadas en la PCR en tiempo

real específicas.

Sondas FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) La FRET se basa en la transferencia de energía de un fluoróforo donador a un

fluoróforo aceptor (figura 4) (Haugland, 2002). Las condiciones básicas de la FRET

son:

• Las moléculas del donador y del aceptor deben estar muy próximas (habitualmente

10–100 Å).

• El espectro de absorción del aceptor debe solaparse con el espectro de emisión de

fluorescencia del donador.



• Las orientaciones de los dipolos de transición del donador y el aceptor deben ser

aproximadamente paralelas.

Si los fluoróforos donador y aceptor están muy próximos, la excitación del donador

por la luz azul desencadena una transferencia de energía al aceptor, que entonces

puede emitir luz de una longitud de onda mayor. La formación de productos de la

PCR puede monitorizase utilizando dos sondas de oligonucleótidos con

específicidad de secuencia con una marca fluorescente, denominadas sondas de

hibridación, además de los cebadores de la PCR. Las sondas de hibridación se

diseñan como pares en los que una sonda se marca con el colorante donador (3’-

fluorescina) y la otra con el aceptor (5’- Red 640 o 5’-Red 705). Dado que la FRET

disminuye con la sexta potencia de la distancia, es necesario diseñar las sondas de

hibridación de manera que se hibriden a regiones adyacentes de la plantilla de ADN

(usualmente están separadas por una distancia de 1-5 nucleótidos). Si se hibridan

ambas sondas, los dos colorantes se aproximan mucho y la FRET al colorante

aceptor produce una señal mensurable mediante fluorometría.

Sondas de degradación (principio TaqMan) El ensayo TaqMan aprovecha la actividad exonucleásica 5' - 3' de la ADN

polimerasa Taq para dividir una sonda de degradación durante la PCR (Lie y

Petropoulos, 1998). La sonda de degradación, o TaqMan, suele ser un

oligonucleótido de 20-30 bases de longitud (usualmente con una Tf 10 °C superior a

la Tf de los cebadores) que contiene un colorante delator fluorescente en el extremo

5' y un colorante inhibidor en el 3' (figura 4). Al estar bloqueado el extremo 3', la

sonda no puede extenderse como un cebador. Durante la PCR, en presencia de una

diana, la sonda se hibrida específicamente entre los sitios de los cebadores directo e

inverso. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante delator al

colorante inhibidor produce la supresión de la fluorescencia delatora principalmente

por transferencia de energía de tipo Forster (Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Durante

la reacción, la actividad exonucleásica 5’-3’ de la ADN polimerasa Taq degrada la

sonda entre los colorantes delator e inhibidor solamente si la sonda se hibrida con la

diana. De esta manera, la fluorescencia aumenta a medida que progresa la

amplificación. La acumulación de producto de la PCR se detecta monitorizando el

incremento de la fluorescencia del colorante delator. Este proceso tiene lugar en

cada ciclo y no interfiere con la acumulación exponencial del producto. Las sondas

de degradación, a diferencia de las FRET, liberan fluorocromos en cada ciclo,

añadiendo más colorante al previamente liberado. En consecuencia, la señal



fluorescente se potencia considerablemente en cada ciclo. El ensayo TaqMan utiliza

unos parámetros de los ciclos térmicos y unas condiciones de la PCR que son

universales. Las sondas fluorogénicas exigen, eso sí, que no haya G en el extremo

5'. Una G adyacente al colorante delator inhibe la fluorescencia incluso tras la

división.

Figura 4.Diferentes

principios de la

PCR en tiempo real.

I. SYBR green I.

II. Sondas FRET

(transferencia de energía de

resonancia

fluorescente).

III. Sondas de

degradación TaqMan 5`

III. Sondas TaqMan

II. Sondas de hibridación

I. SYBR Green



Balizas moleculares Las balizas moleculares son sondas de ADN diseñadas para contener una estructura

en forma de piruleta. La secuencia del abultamiento de la piruleta es complementaria

de la diana específica de la sonda y las secuencias del estrechamiento se diseñan

de manera que sean mutuamente complementarias (figura 5) (Tyagi y Kramer,

1996). Los extremos 5’ y 3’ de la sonda se unen covalentemente a un fluoróforo y a

un inhibidor. Cuando se cierra la estructura de piruleta, el fluoróforo y el inhibidor se

aproximan. En este caso, todos los fotones emitidos por el fluoróforo son absorbidos

por el inhibidor. En presencia de una secuencia complementaria, la sonda se

despliega y se hibrida con la diana. El fluoróforo se ve desplazado del inhibidor y la

sonda inicia su fluorescencia.

Figura 5. Principio de las balizas moleculares.

Scorpions Otra posibilidad es la que ofrece la familia de sondas denominadas Scorpions. Un

Scorpion consiste en una secuencia de sonda específica con estructura de piruleta

(figura 6) (Thelwell et al., 2000). Se une un fluoróforo al extremo 5' y la señal fluorescente que da es inhibida en la

estructura de piruleta por una fracción unida al extremo 3'. La piruleta se une al

extremo 5' de un cebador. Tras la extensión del cebador del Scorpion, durante la

amplificación, la secuencia de sonda específica puede unirse a su complemento

dentro de la misma hebra de ADN. Esta hibridación abre el abultamiento de la



piruleta de manera que deja de inhibirse la fluorescencia y puede observarse un

incremento de la señal. Un bloqueante de la PCR situado entre el cebador y la

secuencia del estrechamiento evita que pase a leerse el abultamiento de la piruleta,

lo que podría ocasionar su apertura en ausencia de la secuencia diana específica. El

carácter unimolecular de la hibridación presenta ciertas ventajas con respecto a los

sistemas de sonda homogénea. A diferencia de los ensayos con balizas

moleculares, TaqMan o FRET, los ensayos con Scorpion no requieren una sonda

independiente aparte de los cebadores.

Figura 6. Principio de las sondas Scorpion.

Sondas TaqMan MGB Un MGB (enlazante al surco menor) es una pequeña molécula en forma de media

luna que encaja muy bien en el surco menor del ADN bicatenario (Kutyavin et al.,

2000). En las sondas TaqMan, el grupo MGB está unido al extremo 3' junto con el

colorante inhibidor (figura 7). Cuando la sonda TaqMan se hibrida, el MGB estabiliza

el apareamiento incorporándose al surco menor del ADN bicatenario creado entre la

sonda y la secuencia diana. La estabilización es mucho más eficaz cuando las

Cebador

Extensión

Hibridación

Desnaturalización



secuencias coinciden perfectamente (es decir, no hay desparejamiento). Además del

superior potencial discriminador, la mayor estabilidad hace que las sondas TaqMan

MGB sean muy cortas (normalmente de 13 a 20 bases) en comparación con las

sondas TaqMan estándar (de 18 a 40 bases), sin detrimento del respeto de las

directrices de diseño. Las sondas TaqMan MGB presentan varias ventajas para la

PCR cuantitativa, especialmente para los ensayos Múltiples. El mejor rendimiento

espectral hace posible una precisión y una coherencia superiores entre los distintos

ensayos, y la mayor especificidad de la hibridación permite una discriminación más

precisa de las dianas. Además, al ser la sonda más pequeña se facilita el diseño de

ensayos, pues las sondas se pueden encajar en regiones diana más cortas, tales

como «ventanas» de consenso entre conservación o divergencia de la secuencia. El

tamaño del amplicón puede reducirse al mínimo utilizando sondas MGB más cortas

que pueden contribuir a mejorar la coherencia entre ensayos.

Figura 7. Principio de las sondas MGB.

Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real

Cuantificación relativa El contenido en OGM de una muestra puede expresarse como la cantidad de

material modificado genéticamente en la cantidad total de material. Para determinar

este valor en un sistema basado en la PCR en tiempo real es necesario medir el

número de secuencias de ADN de un gen de referencia endógeno (para usarlo como



«normalizador»), así como el número de secuencias de ADN diana específicas del

OGM. El gen de referencia debe escogerse de manera que sea específico de la

especie, presente en una sola copia por genoma haploide, representado como tal de

manera estable en líneas diferentes de la misma especie y tan amplificable como los

caracteres GM en el análisis (aunque esto se deba más a un buen diseño de

cebadores-sonda). En la cuantificación relativa se plantea un problema debido a la

interpretación del porcentaje de contenido de OGM, que no se especifica en la

legislación; por consiguiente, puede entenderse como contenido en OGM (en

porcentaje) el peso del ingrediente modificado puro en relación con el peso total del

ingrediente puro (p. ej., peso de maíz GM con respecto al peso total del maíz

contenido en la muestra). Desde un punto de vista analítico, es conveniente calcular

el porcentaje de OGM como el número de secuencias de ADN diana por secuencia

específica de taxón diana, pero esta definición no incorpora algunas características

importantes de las líneas de OGM; por este motivo, es preciso sopesar

cuidadosamente los siguientes parámetros en la interpretación de los resultados:

a) La ploidía de la transformación. Es posible que la modificación genética tenga una

ploidía diferente de la de la transformación wt (p. ej., tetraploide en vez de diploide).

b) La cigosidad del evento. El carácter GM podría ser homocigótico o heterocigótico.

c) El número de inserciones por genoma haploide de una única construcción

genética artificial. Un construcción genética se puede insertar en una única copia por

genoma haploide o en varias copias.

El punto c) puede obviarse diseñando el sistema cebador-sonda en la frontera de la

inserción de la construcción genética en el genoma. Como las secuencias de

frontera son únicas, el sistema así construido presentará la doble ventaja de ser

específico de la transformación y excluir de la cuantificación las inserciones múltiples

de la misma construcción genética. Los puntos a) y b) se resuelven empíricamente

utilizando materiales de referencia que sean homogéneos con la muestra (p. ej.,

material de referencia de harina de maíz para cuantificar la harina de maíz).

Alternativamente, pueden calibrarse patrones de cuantificación diferentes de los

materiales de referencia certificados (p. ej., secuencias de ADN clonadas o mezclas

de ADN genómico) utilizando materiales de referencia certificados a fin de corregir

las discrepancias moleculares en la cuantificación. Una manera ampliamente

aceptada de solventar los problemas relacionados con los puntos a) y b) es expresar

el porcentaje de OGM en términos de genomas haploides.

En cualquier caso, es preciso tener en cuenta este aspecto de la cuantificación al

desarrollar el método, dado que el límite de detección (LOD) y el límite de



cuantificación (LOQ) se ven influidos por el número real de copias que se

cuantifican.

Diseño de un experimento de cuantificación de OGM en tiempo real El diseño de un análisis de la PCR en tiempo real debe incluir los siguientes

componentes:

- Un sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de ADN diana

específica de un OGM.

- Un segundo sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de referencia

endógena, posiblemente específica de la especie, pero que se pueda utilizar como

«normalizador» en los cálculos de la concentración o las concentraciones relativas

de OGM.

- Curvas patrón para la diana y la referencia endógena. Para cada muestra

experimental, se determina la cantidad de diana y de referencia endógena a partir de

la curva patrón adecuada. La cantidad de diana se normaliza con la cantidad de

referencia endógena para obtener la concentración relativa de la diana. Para

satisfacer los requisitos estadísticos, las curvas patrón deben incluir por lo menos 4

puntos de concentración distintos. Cada punto de la curva patrón, así como la

muestra, debe cargarse al menos por triplicado.

Además, habrá que añadir un control negativo (NTC o control sin ADN molde) tanto

respecto al gen de referencia como a las cuantificaciones de OGM. Pueden utilizarse

también otros controles (p. ej., control negativo de la diana de ADN y control positivo

de la diana de ADN).

Por último, la cuantificación del gen de referencia y de la secuencia específica del

OGM debe tener lugar en el mismo ciclo de PCR (coamplificación), no en ciclos

diferentes, para evitar una posible fluctuación estadística entre experimentos

distintos.

PCR en tiempo real Múltiplex Dependiendo de las sustancias y del instrumental utilizados en la cuantificación, es

posible diseñar PCR en tiempo real para llevar a cabo la cuantificación de las

secuencias de referencia y OGM por separado en tubos distintos o en los mismos

tubos en tanto que reacción «Múltiplex».

Ambas posibilidades tienen sus ventajas y sus inconvenientes. Con las reacciones

múltiples se ahorran tiempo y reactivos (es posible analizar el doble de muestras en

un único experimento) y se evitan los errores de configuración entre la medida del



gen de referencia y del gen diana del OGM, al producirse en el mismo tubo, pero

resultan menos sensibles (en términos de LOQ) a causa de la interferencia entre las

dos reacciones y del distinto consumo de reactivos en ambas. El uso de reacciones

separadas para medir el gen de referencia y el gen diana del OGM, por su parte,

permite obtener mayor sensibilidad en términos de LOQ, pero exige disponer del

doble de reactivos y de pocillos en el equipo de PCR en tiempo real, y es mayor el

riesgo que suponen, p. ej., los errores de pipeteado, al medir una muestra. La

disponibilidad de múltiples colorantes delatores para las sondas TaqMan permite

detectar la amplificación de más de una diana en el mismo tubo. El colorante delator

(FAM) puede distinguirse del otro (VIC) gracias a las diferentes longitudes de onda

de sus máximos de emisión. Así por ejemplo, la disponibilidad de múltiples

colorantes con distintas longitudes de onda de emisión (FAM, TET, VIC y JOE)

permite realizar ensayos TaqMan Múltiplex. El colorante TAMRA se usa como

inhibidor en la sonda y el ROX como referencia pasiva en la mezcla de reacción. Se

recomienda la combinación de FAM (diana) y VIC (control endógeno) para obtener

los mejores resultados, ya que la diferencia entre sus máximos de emisión es la más

amplia. Por el contrario, JOE y VIC nunca deben combinarse. La realización de

ensayos TaqMan Múltiplex en los sistemas de detección de secuencias ABI PRISM

7700, 7900, 7500, 7300 y 7000 es posible gracias a su capacidad para detectar

colorantes múltiples con longitudes de onda de emisión distintas.

Análisis gráfico de los datos de una PCR en tiempo real A medida que progresa la PCR, se recogen datos sobre fluorescencia (valores Rn)

para construir un gráfico de la cantidad de señal frente al número de ciclo (es decir,

el tiempo). Habitualmente el gráfico se construye a escala semilogarítmica. En la

PCR en tiempo real es posible distinguir tres fases distintas: una primera fase de

«latencia» con ligeras fluctuaciones en los valores correspondientes a la señal de

fondo; una segunda fase exponencial, con valores que se incrementan en paralelo, y

una tercera fase en la que los valores tienden a situarse en una «meseta» (figura 8).



Figura 8. Gráfico de la PCR en tiempo real. Se señalan las fases típicas de una PCR

en tiempo real.

Si la PCR en tiempo real constituye una herramienta potente, esto se debe a que la

cuantificación no se produce en la fase final de la reacción (la meseta), sino en la

fase en que el crecimiento exponencial de la cantidad de ADN amplificado (Rn)

alcanza un valor significativamente superior a la señal de fondo. Al medir de esta

manera, mejora considerablemente la exactitud de la cuantificación, ya que existe

una correlación directa entre la cantidad de plantilla inicial y la fase en la que la

amplificación empieza a ser exponencial. En la PCR en tiempo real, se define

experimentalmente como ciclo umbral (CT) aquel ciclo en que la señal de

fluorescencia alcanza el valor medio de las señales de fluorescencia medidas entre

el ciclo tercero y el decimoquinto incrementado en diez desviaciones estándar.

Cuanto mayor es la cantidad inicial de ADN genómico, antes se detecta el producto

acumulado en el proceso de la PCR, y más bajo es el valor CT. En la práctica, a

menudo es el operador el que elige la línea umbral que determina el valor CT, lo que

constituye uno de los elementos subjetivos de la PCR en tiempo real. La línea

umbral debe situarse por encima de cualquier actividad basal y dentro de la fase de

crecimiento exponencial, que adquiere forma lineal en la transformación logarítmica

(todas las líneas son paralelas). Debe situarse siempre en el nivel en que empiezan

a coincidir más los gráficos de las réplicas. A veces las réplicas presentan, al

Fase exponencial

Valor umbral

Fluorescencia de fondo

Intervalo «meseta»



comienzo de la fase exponencial, una ligera divergencia que se atenúa o desaparece

según progresa la reacción.

Cálculo del contenido en OGM El resultado de una PCR en tiempo real es un valor ∆Rn, diferencia entre Rn+ (señal

de fluorescencia que incluye todos los componentes) y Rn- (señal de fondo de la

reacción – línea de base de la lectura de una muestra de control sin plantilla). El contenido de OGM de una muestra se puede determinar de dos maneras:

1. Se trazan dos curvas patrón, basadas en cantidades distintas de ADN:

- la primera con un sistema de cuantificación específico para el gen de referencia;

- la segunda con un sistema de cuantificación específico para la diana GM.

Para cada muestra, se determinan mediante interpolación con la curva patrón las

cantidades correspondientes a la diana específica y al gen de referencia. Luego se

calcula el contenido (porcentaje) de ADN GM como el cociente entre la cantidad de

la secuencia diana GM y la cantidad de la secuencia del gen de referencia

(GM/referencia * 100). Conviene tener presente que, necesariamente, las muestras analizadas deben estar

situadas entre los límites inferior y superior de ambas curvas patrón. Es preciso

excluir los valores atípicos, ya que suelen relacionarse con errores de cuantificación. 2. Método de comparación de CT (∆∆CT): En este método no se usan cantidades

conocidas de patrones, sino que se compara la cantidad relativa de la secuencia

diana del OGM con la secuencia del gen de referencia. La curva patrón se obtiene

cargando una serie de muestras con concentraciones diferentes y conocidas del

OGM (p. ej., materiales de referencia certificados del IRMM). El resultado es una

curva patrón de valores ∆∆CT (∆CT = CT gen de referencia - CT OGM). El contenido de OGM

se obtiene calculando el valor ∆CT de la muestra y comparándolo con los valores

obtenidos con los patrones. Para que este método dé buenos resultados, es preciso que las eficiencias de

amplificación de los sistemas de PCR diana y de referencia sean similares. Una

manera sensible de controlarlo es fijarse en cómo varía ∆CT (la diferencia entre los

dos valores CT de dos PCR correspondientes a la misma cantidad inicial de plantilla)

con la dilución de la plantilla. Si las eficiencias de los dos amplicones son

aproximadamente iguales, la representación gráfica del logaritmo de la cantidad

frente a ∆CT será una línea casi horizontal (pendiente <0,10). Esto significa que

ambas PCR tienen la misma eficiencia en el intervalo de cantidades de plantilla

iniciales. Si el gráfico pone de manifiesto que la eficiencia es desigual, deberá

aplicarse el método de la curva patrón para cuantificar los OGM. Debe determinarse



el intervalo dinámico para: 1) las concentraciones mínima y máxima de las dianas

para las que los resultados son exactos y 2) las razones mínima y máxima de dos

cantidades de gen para las que los resultados son exactos. En la PCR en tiempo

real competitiva convencional, el intervalo dinámico se limita a una proporción

diana/competidor de aproximadamente 10:1 a 1:10 (la máxima exactitud se obtiene

para una proporción 1:1). La PCR en tiempo real puede conseguir un intervalo

dinámico mucho más amplio.



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