analisi biochimico-cliniche fattori pre- analitici
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Analisi Biochimico-
Cliniche
Analisi Biochimico-
Cliniche
Fattori Fattori pre-pre-
analiticianalitici
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La fase preanaliticaLa fase preanaliticaSerie di procedimenti:Serie di procedimenti: preparazione del paziente raccolta trasporto conservazione manipolazione del campione
biologico, trasferimento di una sua
aliquota nella miscela di reazione.
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La fase preanaliticaLa fase preanalitica
A questi procedimenti partecipano più operatori, spesso eterogenei, appartenendo in parte ai reparti di degenza o al personale addetto agli ambulatori, in parte al personale del laboratorio.
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Preparazione del paziente
Preparazione del paziente
Possono influenzare la concentrazione di alcuni analiti: il tipo d’alimentazioneil tipo d’alimentazione
l’assunzione di bevande l’assunzione di bevande alcoliche alcoliche
di farmacidi farmaci lo stress lo stress
l’affaticamento l’affaticamento
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L’alimentazioneL’alimentazioneInfluenza assunzione di
carboidraticarboidrati nei giorni precedenti sulla prova di tolleranza al glucosio:tolleranza al glucosio: una dieta ricca in carboidrati è
causa di un appiattimento della curva glicemica;
viceversa, una dieta povera di carboidrati la esalta.
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L’alimentazioneL’alimentazioneIl tenore in grassigrassi della dieta
può influenzare la concentrazione plasmatica dei componenti lipidici del sangue. Pasto ricco in trigliceridi trigliceridi può fortemente
influenzare la trigliceridemia fino ad aumentarla del 100%, anche dopo un digiuno di 12 ore, tempo normalmente sufficiente per portare tutti gli analiti in condizioni basali.
Pasto ricco di colesterolocolesterolo influenza poco la colesterolemia misurata il giorno dopo: non più del 2-3%.
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L’alimentazioneL’alimentazione
Incremento fosfatasi alcalinafosfatasi alcalina da 2-4 ore dopo il pasto, dovuto ad un dell’isoenzima intestinaledell’isoenzima intestinale. .
Alto consumo di acidi grassi acidi grassi insaturiinsaturi dà luogo ad una colesterolemiacolesterolemia (applicazioni terapeutiche).
Escrezione urinaria di acido 5-5-idrossiindolacetico idrossiindolacetico nel caso di ingestione di abbondati quantità di banane, pompelmi e dolcibanane, pompelmi e dolci contenenti vaniglia.
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Assunzione di bevande alcoliche
Assunzione di bevande alcoliche
L’alcolL’alcol ha l’effetto di , anche a breve termine, lattato, acidolattato, acido uricourico e a lungo termine l’attività di diversi enzimi plasmatici come la AST e la AST e la --GTGT (dopo 60 ore ancora valori elevati).
Anche la trigliceridemiatrigliceridemia e l’HDLl’HDL aumentano considerevolmente nell’abuso cronico di alcol.
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I farmaciI farmaciFarmaco può avere attività attività
biologiche collateralibiologiche collaterali che causano modificazioni della concentrazione di uno o più analiti, oltre all’effetto che il farmaco si prefigge.
I metabolitimetaboliti possono essere causa di interferenze biologiche.
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I farmaciI farmaciInterferenza di natura fisico-Interferenza di natura fisico-
chimicachimica sul procedimento analitico. Farmaco, o suo catabolita, si combina all’analita da misurare, oppure vera e propria interferenza verso le reazioni del procedimento analitico Le attività degli enzimi plasmaticienzimi plasmatici, e così
pure i procedimenti analitici basati su reazioni enzimatiche, sono particolarmente esposte alla interferenza da farmaci.
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L’esercizio muscolareL’esercizio muscolareSe intenso e su individui non allenati,
causa modificazioni della concentrazione di molti parametri di laboratorio. Questi effetti possono essere transitori transitori
rapida diminuzione, e seguente aumento, nella concentrazione degli acidi grassi liberi, marcato aumento dell’alanina e dell’acido lattico (triplicato).
duraturiduraturivariazioni a carico degli enzimi plasmatici: CK,
aldolasi, LDH, transaminasi; l’attività della CK può risultare raddoppiata nelle 12-30 ore dopo attività sportiva intensa e ancora dopo 50 ore si può riscontrare un aumento fino al 40%.
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L’esercizio muscolareL’esercizio muscolare
Altre modifiche dovute ad esercizio prolungato si riferiscono agli ormoni ormoni sessualisessuali: dopo 6 mesi di allenamento il testosterone, l’androstenedione e l’LH aumentano del 20-25%.
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DigiunoDigiunoDigiuno prolungatoDigiuno prolungato, più di 24
ore, può determinare inaspettate variazioni dei dati di laboratorio: la bilirubina aumenta di due volte
dopo un digiuno di 48 ore, la glicemia dopo tre giorni si
attesta su valori sotto i 50 mg/dL, la concentrazione di trigliceridi,
acidi grassi e glicerolo aumenta senza contemporanei aumenti del colesterolo.
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Effetto della posturaEffetto della posturaPassaggio dalla
posizione supina alla posizione eretta ha come conseguenza la fuoriuscita di acqua e componenti filtrabili dal compartimento vascolare a quello interstiziale;
Componenti non filtrabili, (proteine, enzimi, calcio, il ferro legati alle proteine ecc.) divengono più concentrati nel plasma. Significative variazioni tra i pazienti ambulatoriali e quelli in regime di degenza
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Modalità del prelievoModalità del prelievoTra i liquidi biologici, il sanguesangue è di
gran lunga il più comunemente usato nel laboratorio di analisi. Le procedure per ottenerne un campione sono tre: puntura venosa, puntura arteriosa e puntura della pelle, quest’ultima per ottenere il cosiddetto sangue "capillare”capillare”
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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue venoso
Raccolta e trattamento dei campioni: sangue venoso
Sangue venosoSangue venoso:: Usato per le indagini chimico cliniche. Povero in O2 e differisce nella concentrazione di CO2 e nel pH; glucosio, ammonio e glucosio, ammonio e lattatolattato variano a seconda delle necessità dei tessuti irrorati da cui il sangue deriva.
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Modalità del prelievo: prelievo venoso
Modalità del prelievo: prelievo venoso
La stasi venosastasi venosa mediante laccio emostatico, necessario per evidenziare le vene e facilitare il prelievo, può essere causa di errori preanalitici, se la stasi si protrae per > 1-2 minuti:> 1-2 minuti:
fuoriuscita di acqua e di sostanze filtrabili, secondaria all’aumento della pressione nel vaso, e l’ipossia.
Stasi prolungata, associata ad esercizio fisico della mano, aggiunge a emoconcentrazione effetto metabolico (di ioni idrogeno del 30%, di acido lattico di oltre il 100%, di sodio del 3%, di potassio del 15%)
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Modalità del prelievo: prelievo venoso
Modalità del prelievo: prelievo venoso
Limitare a non oltre un minuto Limitare a non oltre un minuto la stasi venosa!! la stasi venosa!! (segnalare al laboratorio le situazioni di prelievo difficoltoso).
Campione di sangue prelevato dalla vena mediana o dalla vena cubitale profonda, o in caso di necessità da una vena del dorso della mano.
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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue arteriosoRaccolta e trattamento dei campioni: sangue arterioso
Sangue arteriosoSangue arterioso: ossigenato, usato per lo studio dei parametri dell’equilibrio acido-base e della tensione dei gas presenti nel sangue (ossigeno, anidride carbonica) per aver informazioni preziose sulla funzionalità respiratoria. Composizione costante in tutti i distretti del corpo.
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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue arteriosoRaccolta e trattamento dei campioni: sangue arteriosoL’esecuzione del prelievo è molto più laboriosa (e anche più dolorosa) di quella del sangue venoso personale addestrato.Deve essere conservato nella stessa
siringa del prelievo, con l’ago tappato per evitare modificazioni del contenuto dei gas presenti nel sangue a causa di scambi con l’aria. Evitare che all’interno del campione vi siano bolle d’aria.
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Modalità del prelievo: prelievo arterioso
Modalità del prelievo: prelievo arterioso
Immediatamente dopo il prelievo, la siringa o il capillare contenente il campione devono essere inviati al laboratorio in un contenitore con acqua e acqua e ghiaccioghiaccio, allo scopo di rallentare il metabolismo delle cellule del sangue che in breve tempo altererebbe sia il pH sia il contenuto dei gas del sangue.
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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue
"capillare“
Raccolta e trattamento dei campioni: sangue
"capillare“ Sangue "capillareSangue "capillare“:“: Ottenuto per
puntura della pelle ai bambini piccoli, ai soggetti con profonde ustioni, ai soggetti obesi e a diabetici sono sottoposti a continui prelievi.
Negli adulti può essere ottenuto dal lobo dell’orecchio o dal polpastrello di un dito, nei neonati dal calcagno.
Miscela di sangue di derivazione arteriolare, venulare e capillare, oltre alla presenza di liquido interstiziale.
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DisinfezioneDisinfezione
Indispensabile per la parte ove avverrà il prelievo: sostanze efficaci e che non diano luogo a fenomeni di interferenza per l’esame richiesto. Alcol al 70% si è dimostrato
efficace e viene ampiamente usato anche se presenta qualche rara limitazione, come nel caso di dosaggio dell’alcolemia.
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Strumenti per il prelievo di sangue
Strumenti per il prelievo di sangue
Lancette, aghi, siringhe, cannule, cateteri, pipette, provette di vetro e di plastica, sistemi sistemi siringa-contenitore a siringa-contenitore a circuito chiuso sotto circuito chiuso sotto vuoto (tipo vuoto (tipo vacutainer).vacutainer). Devono essere sterili, chimicamente inerti, molto efficienti per quanto riguarda la penetrazione attraverso la cute e, conseguentemente, poco traumatizzanti.
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SieroSieroSieroSieroSangue intero senza senza anticoagulantianticoagulanti.
La coagulazione coinvolge la parte corpuscolata e i fattori plasmatici della coagulazione
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SieroSieroSieroSieroCellule inglobate nel coagulo
subiscono danni e inducono la liberazione di parte del contenuto cellulare. Variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma.
Concentrazione del potassiopotassio, fosfatasi acida e la lattico fosfatasi acida e la lattico deidrogenasideidrogenasi >rispetto a quella del plasma.
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PlasmaPlasmaSangue intero con con anticoagulantianticoagulanti contiene il fibrinogeno e i fattori della coagulazione. Non risente del trauma della coagulazioneno emolisi.
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PlasmaPlasmaIndispensabile per la misura dei
fattori della coagulazionefattori della coagulazione e per l’esame emocromocitometrico e la velocità di eritrosedimentazione.
Più adatto nell’urgenza,nell’urgenza, ottenuto rapidamente per centrifugazione del campione senza attendere il tempo necessario alla coagulazione.
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Anticoagulanti e conservanti
Anticoagulanti e conservanti
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EparinaEparinaMucopolisaccaride acido il cui PM varia moltissimo a seconda della preparazione. Esiste come sale di potassio e di sodio,di litio o di ammonio. Inibisce la trombina e altri fattori della coagulazione.
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EparinaEparinaDotata di un PM elevato è
l’anticoagulante ideale qualora si voglia misurare la osmolalità plasmatica o studiare la fragilità osmotica eritrocitaria.
Non utilizzabile per indagini coagulative, dosaggio del litio o dell’ammonio, calcio e magnesio. Forma complessi non rilevabili dagli elettrodi ionosensibili.
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EDTAEDTAAcido etilendiamminotetraaceticoAcido etilendiamminotetraacetico
il più frequentemente usato. Azione anticoagulante: sequestra lo ione calcio che diventa indisponibile per le reazioni della cascata coagulativa che rimane così inibita.
Pur essendo l’anticoagulante di scelta per l’emocitometria, già dopo 3-4 ore dal prelievo, il sangue raccolto su EDTA non è più idoneo per studi morfologici.
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EDTAEDTAPotente inibitore di molti
enzimi eritrocitari, leucocitari, piastrinici e plasmatici, non consente misure dell’attività di questi come pure dell’attività piastrinica.
Non usare per la determinazione degli elementi pesanti come ferro e rame perché anch’essi vengono sequestrati.
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Altri anticoagulantiAltri anticoagulanti
Citrato.Citrato. Il citrato di sodio viene impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e della funzionalità piastrinica.
OssalatoOssalato. Ossalato doppio di ammonio e di potassio, è il chelante del calcio usato più raramente.
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Altri anticoagulantiAltri anticoagulanti
Sostanze stabilizzantiSostanze stabilizzanti. Mantengono inalterata nel tempo la concentrazione di sostanze da dosare. Per esempio, i fluoruri o fluoruri o il monoiodioacetato, il monoiodioacetato, che inibiscono la glicolisi, trovano impiego quando non si possa dosare il glucosio in tempi brevi dal prelievo.
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Anticoagulanti e conservanti
Anticoagulanti e conservanti
La presenza dell’anticoagulante in soluzione, diluisce il campione: rispettare sempre il
rapporto raccomandato tra volume di anticoagulante e volume di campione.
Diffusione di prelievo con contenitori sotto vuoto ha contribuito in maniera sostanziale alla risoluzione di questi problemi.
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Anticoagulanti e conservanti
Anticoagulanti e conservantiUso di gel separatori,
che con la centrifugazione del campione si interpongono tra il siero e la parte corpuscolata del sangue, migliora la conservazione degli analiti e previene interferenze dovute al contatto delle cellule con alcuni analiti del plasma,glucosio che viene
consumato dal metabolismo cellulare e per il potassio che può aumentare nel plasma per la fuoriuscita dagli elementi cellulari.
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Trasporto e conservazione
Trasporto e conservazione
Dalla sede di raccolta al laboratorio, è importante rispettare le esigenze del tempo di conservazione degli tempo di conservazione degli analitianaliti, e delle condizioni fisico-chimiche che possono alterarne la concentrazione.
All’interno dell’ospedale il trasferimento avviene ad opera di infermieri o di personale specificamente incaricato dei trasporti interni.
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Trasporto e conservazione
Trasporto e conservazione
I materiali provenienti dai reparti arrivano direttamente ai singoli laboratori oppure in una sede centralizzatasede centralizzata per il processo iniziale dicentrifugazione distribuzione ai laboratori di analisi.
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CentrifugazioneCentrifugazione
La separazione del siero e del separazione del siero e del plasma dalla parte corpuscolataplasma dalla parte corpuscolata è essenziale per la conservazione degli analiti che possono subire alterazioni in presenza delle cellule.fuoriuscita di potassiopotassio dalle
cellule, dove si trova alla concentrazione di circa 150 mEq/L, al plasma, dove la sua concentrazione è di circa 4 mEq/L.
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CentrifugazioneCentrifugazione
Se non di separa immediatamente plasma o siero dalla parte corpuscolata è preferibile conservare il campione a temperatura ambiente piuttosto che in frigorifero. bassa temperatura rallenta i processi
metabolici cellulari che mantengono attivamente il gradiente del potassio e di altri componenti tra il compartimento intracellulare e quello extracellulare.
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EmolisiEmolisiRottura dei globuli rossi: Rottura dei globuli rossi:
liberazione del loro contenuto nel siero o nel plasma che di conseguenza assume una colorazione dal rosato al rosso in funzione della quantità di emoglobina liberata. Visibile per Hb> 200-300 mg/L.
Normalmente Hb libera nel siero <50 mg/L e nel plasma <20 mg/L.
Uno dei più importanti fattori che causano interferenze nelle determinazioni su campioni di siero e di plasma.
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Cause di emolisiCause di emolisi biologica biologica
anemie emoliticheanemie emolitiche: fragilità corpuscolare, difetti della normale morfologia eritrocitaria (sferocitosi), deficienze di enzimi eritrocitari (glucoso-6-fosfato deidrogenasi, piruvico chinasi), emoglobinopatie, anticorpi acquisiti in seguito a trasfusioni (emolisine), eritroblastosi fetale, anemie emolitiche autoimmuni; infezioni, assunzione di farmaci ed effetto di agenti fisici (ustioni, protesi intracardiache, ecc.)
meccanicameccanica aghi da prelievo troppo sottiliaghi da prelievo troppo sottili, aspirazione eccessiva durante
il prelievo di sangue, pressione troppo elevata sullo stantuffo al momento dell’espulsione del sangue dalla siringa quando non si toglie l’ago, agitazione troppo vigorosa della provetta
chimica od osmoticachimica od osmotica presenza sulla pelle al momento del prelievo, nell’ago della
siringa o nei contenitori di disinfettantidisinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche
fisicafisica conservazione del campione in condizioni non idonee: il
congelamentocongelamento provoca la cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria la rottura delle membrane e quindi la lisi degli eritrociti
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TorbiditàTorbiditàPercepibile quando la concentrazione dei trigliceridi > i 400 mg/dL trigliceridi > i 400 mg/dL (lattescenza).
Interferenza di natura natura spettrofotometricaspettrofotometricaassorbimento ottico aspecifico delle particelle in sospensione.
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TorbiditàTorbiditàInterferenza specifica in diversi procedimenti analitici particolarmente quelli che fanno uso di enzimi. trigliceridi possono inibire l’attività dell’ureasi e dell’ureasi e dell’uricasidell’uricasi enzimi impiegati nel dosaggio dell’azotemia e dell’uricemia.
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EvaporazioneEvaporazioneEvaporazioneEvaporazioneCausa aumento della concentrazione degli analiti: campione, separato dalla parte corpuscolata, viene trasferito in contenitori o coppette sullo strumento e rimane esposto all’aria: evaporazione!evaporazione!
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Temperatura e umidità Temperatura e umidità relativarelativa
Temperatura e umidità Temperatura e umidità relativarelativa
TemperaturaTemperatura ambiente(21°-23°C), umidità relativaumidità relativa (60-70%), evitare eccessiva ventilazione dei locali. Per urine, abbassamento da 37°C
alla T ambiente, e modificazioni del pH, causa precipitazione di saliprecipitazione di sali come urati e fosfati che trascina altre sostanze e componenti cellulari.
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Altri fattori preanaliticiAltri fattori preanalitici
COCO22 evapora dal plasma (campione tappato!)diminuzione di 5 mMol/L in
un’ora, aT ambiente.
Perdita CO2 causa un pH del siero (pH8.5 in 2 h) e distruzione della fosfatasi fosfatasi acidaacida.
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Conservazione campioniConservazione campioniMetodo ideale di conservazione:
separazione dai globulirapido raffreddamento a -80°C-80°Ca -20°C-20°C dà identici risultati per un
periodo di almeno 6 mesi.Alterata permeabilità delle membrane
degli eritrociti portano ad un aumento della potassiemia potassiemia quando il sangue non è separato dai globuli. Sangue a 4°C la perdita di potassio da
eritrociti sarà maggiore per rallentamento pompa sodio-potassio.
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Criteri di non accettabilità dei campioni biologici
Criteri di non accettabilità dei campioni biologici
Identificazione assente Identificazione incompleta Mancanza di informazioni necessarie
per l’esecuzione dei test Contenitore inidoneo (non conforme
alle indicazioni o necessità del laboratorio, non sterile e/o a imperfetta chiusura, non esente da metalli in tracce, ecc)
Contenitore non integro Prelievo non corretto (effettuato
durante terapia infusionale, senza impiego di terreni di trasporto, ecc)
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Criteri di non accettabilità dei campioni biologici
Criteri di non accettabilità dei campioni biologici
Quantità insufficiente Rapporto sangue/anticoagulante
inadeguato o scorretto Mancata aggiunta di idoneo
conservante Presenza di coaguli (per esempio
emocromo, test coagulativi) Emolisi evidente Conservazione a temperatura non
corretta (emogasanalisi, ammoniemia, ecc)
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Criteri di non accettabilità dei campioni biologici
Criteri di non accettabilità dei campioni biologici
Esposizione a luce solare diretta Congelamenti e scongelamenti
ripetuti Paziente non a digiuno per esami
come glicemia e/o lipidemia Paziente non sottoposto al
previsto regime dietetico (per esempio sangue occulto)
Pazienti non a riposo per test in cui il riposo è indispensabile (per esempio dosaggio renina)
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Accettazione e centrifugazioneAccettazione e
centrifugazioneAll’arrivo in laboratorio, il materiale è
controllato per verificare se sono state adottate tutte le misure preanalitiche necessarie alla sua integrità. In caso contrario i campioni saranno respinti
Il reparto di provenienza deve essere prontamente avvisato della inidoneità del materiale e della necessità di un altro campione.
Il campione di sangue va quindi centrifugato per ottenere il siero (dopo 30’ a T ambiente) o plasma.
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La centrifugazioneLa centrifugazione
Eseguita a 1100 x g1100 x g per 15' per 15' oppure a 3000 x g3000 x g per 10’. per 10’. Il numero dei giri per minuto da impostare sulla centrifuga può essere calcolato per ogni centrifuga con la formula:
g = 1.118 x 10-5 x r x n2g = 1.118 x 10-5 x r x n2 ove : r = raggio in cm del
braccio della centrifuga; n = numero di giri per minuto
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La centrifugazioneLa centrifugazione
Le provette vanno tenute obbligatoriamente tappate,tappate, per motivi di sicurezza, in ogni fase della manipolazione del campione. Al momento opportuno il tappo va tolto con molta precauzione per evitare sia spargimenti di materiale potenzialmente dannoso per l’operatore, sia il rimescolamento delle fasi separate.
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La centrifugazioneLa centrifugazione Migliore separazioneMigliore separazione dei
globuli da siero o plasma, si possono usare delle barriere fisiche che si interpongono tra le due fasi: da granuli o granuli o gelgel già presenti nelle provette, o aggiunti prima della centrifugazione, costituiti di materiale con una densità intermedia, che durante la centrifugazione vanno a disporsi tra i globuli e la parte liquida. La presenza di questi separatori migliora indirettamente la conservabilitàconservabilità del campione.