Ananda Brito de Assis Anlise sobre a microbiota cutnea de anfbios em fragmentos de Floresta Atlntica e sua eficcia contra agentes patognicos Analysis on the bacterial microflora on the amphibian skin of Atlantic Forest fragments and its effectiveness against pathogens So Paulo 2011 Ananda Brito de Assis Anlise sobre a microbiota cutnea de anfbios em fragmentos de Floresta Atlntica e sua eficcia contra agentes patognicos Analysis on the bacterial microflora on the amphibian skin of Atlantic Forest fragments and its effectiveness against pathogens DissertaoapresentadaaoInstitutode BiocinciasdaUniversidadedeSoPaulo, paraaobtenodeTtulodeMestreem Cincias, na rea de Fisiologia Geral. Orientador:Prof.Dr.CarlosArturoNavas Iannini Co-orientadora: Prof a. Dra. Cristine Chaves Barreto So Paulo Verso corrigida. Originalencontra-sedisponvel no Instituto de Biocincias. Comisso Julgadora: _______________________________________________ Prof(a). Dr(a).Prof(a). Dr(a). ______________________ Prof. Dr. Orientador Assis, Ananda B. Anlisesobreamicrobiotacutneadeanfbios emfragmentosdeFlorestaAtlnticaesuaeficcia contra agentes patognicos 103 pginas Dissertao(Mestrado)InstitutodeBiocinciasda UniversidadedeSoPaulo.Departamentode Fisiologia. 1. Anura 2. Microbiota cutnea 3. Ambiente I.UniversidadedeSoPaulo.InstitutodeBiocincias. Departamento de Fisiologia Geral. minha famlia,meu sustentculo. A mais profunda emoo que podemos experimentar inspirada pelo senso do mistrio. Essa a emoo fundamental que inspira a verdadeira arte e a verdadeira cincia.Albert Einstein 1879-1955 Agradecimentos Otrabalhoaquiapresentadonopoderiatersidorealizadosema contribuio de diversas pessoas, que tiveram participao, direta ou indireta, do meu aprendizado e construo desta pesquisa.Sou grata ao meu orientador Carlos Arturo Navas Iannini e minha co-orientadora Cristine Chaves Barreto por terem acreditado e me acompanhado nesta pesquisa, desde o incio at a elaborao deste manuscrito. Agradeo ao Instituto de Biocincias pela infra-estrutura e Fundao deAmparoPesquisadoEstadodeSoPaulo,pelabolsademestradoconcedidae financiamento. SouimensamentegrataaoscolegasdoLaboratriodeEcologia MicrobianadoInstitutoOceanogrfico,quetemoscuidadosdaprofessoraVivian Helena Pellizari, especialmente Carol, Priscila e Dani, por estarem sempre dispostas atirarminhaseternasdvidasrelacionadasaosprocedimentosemMicrobiologia. Aindanestelaboratrio,devoumagradecimentoespecialRosa,pelainiciao nesses procedimentos, disposio e estmulo.AgradeoaosamigosdolaboratriodeBiologiaMolecular,da UniversidadeCatlicadeBraslia,especialmenteFlviaportersidogrande companheira nos estudos de comunidades microbianas, que no foram includos neste trabalho,masqueserviramdepreparoparaasetapasseguintesdesteestudo.Esses procedimentos foram realizados no Laboratrio de Fisiologia de Tripanossomatdeos esougrataprofessoraLucileFloeter-Winter,portercedidooespaoepelas orientaes nas metodologias utilizadas. Sou imensamente grata ao Ricardo Zampieri, peloaprendizado,ajudaepacinciaduranteosprocedimentos.Assimcomoaos demais colegas sempre to prestativos: Marcos, Fernanda e Ermeson.Sougrataaosamigosdolaboratriodoqualfaoparte:Fisiologia Ecolgica e Evolutiva, por fazerem parte da minha formao como cientista, durante asestimulantesdiscusses,especialmenteaoPedroRibeiro,pelassugestesparao manuscritoeLyepelasaventurasnocampo.Soutambmgratapelaamizadee predisposio em ajudar uns aos outros, caractersticas marcantes dessas pessoas.AgradeoRoseliporestarsempredispostaanosauxiliarnaseternas burocraciasacadmicaseGisele,porfazerdasburocraciasacadmicase administrativas problemas simples e dissolveis.Um agradecimento especial ao Be, peloimensurvelcompanheirismoeamizadeduranteedepoisdostrabalhosde campo e Telma pelo auxlio na manuteno das cepas eauxlio nos procedimentos no laboratrio. Porfim,tenhotambmgrandegratidoapessoasquenocontriburam diretamente nesta pesquisa ou aprendizado cientfico e acadmico, mas indiretamente, pelo simples e complexo fato de fazerem parte de minha vida: minha enorme famlia, especialmentemeupaiFernando,meMarinaemeusirmosAldeneMayan.Sem faltarminhatiaRosenilda,quetoparceiraemminhaestadiaemSoPauloeo Marcus, por todo companheirismo e carinho. Sumrio Introduo Geral...........................................................................................................01 Captulo 1. Anlise sobre a densidade de microbiota cutnea de quatroespcies de anfbios: Proceratophrys boiei (Anura, Cicloramphidae), Dendropsophus minutus, Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta (Anura, Hylidae), em paisagens contnuas e fragmentadas de Floresta Atlntica.............................................06 Resumo...............................................................................................................07 1. Introduo......................................................................................................08 2. Objetivos .......................................................................................................13 3. Materiais e Mtodos......................................................................................13 3.1 Espcies estudadas........................................13 3.2 reas de estudo.................................................................................14 3.3 Temperatura e umidade.....................................................................17 3.4 Microbiologia em campo..................................17 4. Resultados 4.1 Coleta dos espcimes........................................................................21 4.2 Densidade de colnias bacterianas ...................................................22 4.3. Anlises de temperatura e umidade..........................29 5. Discusso........................................................................................................30 6. Concluso.......................................................................................................34 Captulo 2. Caracterizao da microbiota cutnea de quatro espcies de anuros em diferentes fragmentos de Floresta Atlntica: Riqueza epotencial antimicrobiano...............................................................................................36 Resumo...............................................................................................................37 1. Introduo......................................................................................................38 2. Materiais e Mtodos......................................................................................42 2.1Isolamento dos morfotipos de colnias bacterianas...........................42 2.2 Inibio de crescimento bacteriano.......................................43 3. Resultados..............................................45 3.1. Morfotipos........................................45 3.2. Densidade de morfotipos..............................46 3.3. Ensaio de poder inibitrio de patgenos...........................................48 4. Discusso........................................................................................................50 4.1 Riqueza microbiana............................................................................50 4.2 Efeito inibitrio..................................................................................51 5. Concluso........................................................................................................52 Captulo 3. Identificao de morfotipos de colnias bacterianas isoladasde comunidades microbianas residentes da pele de quatro anuros daFloresta Atlntica.............................................................................................................54 Resumo................................................................................................................55 1. Introduo......................................................................................................56 2. Materiais e Mtodos......................................................................................58 2.1 Identificao dos isolados......................................58 2.2 Clonagem.......................................................59 2.3.Determinaodaseqnciadenucleotdeoeanlise filogentica...........................................................................................................61 3. Resultados...............................................62 4. Discusso.........................................................................................................63 Anexo 1................................................................................................................72 Anexo 2................................................................................................................78 Discusso Geral e Concluses.......................................................................................83 Resumo (GERAL)......................................................................................................85 Abstract .........................................................................................................................87 Referncias Bibliogrficas............................................................................................87 1 Introduo Geral 2 Declnios de populaes de anfbios Nasltimasdcadasdiversaspopulaesdeanfbiostmsofridodeclnioe extino local, ou total em alguns casos. (Heyer et al., 1988; Echegaray & Hernando, 2004; Eterovick et al., 2005; Lips, et al., 2005;La Marca et al., 2005; Carey & Alexander, 2003; Keisecker etal., 2001; Funk & Mills, 2003; Carey etal., 1999; Rollins-Smith etal., 2002; Alexander&Eischeid,2001;Lipsetal.,2006;MendelsonIIIetal.,2006;Poudsetal., 2006). Nesse perodo, pelo menos 43% das espcies de anfbios tem sofrido declnio, 32.5% esto globalmente ameaadas, 34 foram extintas e 88 esto passveis ou possivelmente esto extintas (Lips et al. 2006). No Brasil, 20 espcies de anfbios anuros parecem estar sofrendo declnio em suas populaes, sendo que duas destas espcies ocorrem no Bioma Cerrado e todasasdemaisnaFlorestaAtlntica(Eterovicketal.,2005). Muitoscasosdedeclnio populacional em anfbios esto relacionados s ocorrncias de novos patgenos (Carey et al., 1999; Schumacher, 2006).Por isso, o termoEmergingInfectiousDiseases (EIDs), antes usadoapenasparasereferiradoenashumanasdeflagradasemlargaescalageogrfica, agora aplicado tambm vida selvagem, fazendo aluso srie de epidemias constatadas no meio natural nestes ltimos anos (Daszak et al., 2001).OfungoquitrdioBatrachochytriumdendrobatidisindicadocomooprincipal agente envolvido nos casos de declnios de populaes de anfbios em diversas partes do mundoejfoidetectadoemalgumascomunidadesdeanfbiosnoBrasil.Asprimeiras menesdessefungoempopulaesdeanfbiosnaFlorestaAtlnticadatamde1981e, segundo Carnaval etal. (2006), estariam relacionados aos primeiros registros de declnios populacionais em territrio brasileiro. 3 O cenrio ambiental As populaes selvagens de anfbios podem estar mais susceptveis aos patgenos se modificaes em variveis fsicas do ambiente est relacionada com eventos de doenas. Um exemplobem estudado a diminuio nos valoresmdios de parmetros do sistema imune, tais como clulas de defesa, quando animais so expostos a pesticidas.Neste caso, os indivduos se tornam mais vulnerveis s infeces por patgenos presentes naturalmente no ambiente e a sobrevivncia de toda uma populao pode ser comprometida (Christin etal., 2004; Raffel et al. 2006; Vos et al., 1989).Mudanasambientaisdeorigemantropognicanasreasnaturaispodem contribuirparaoestabelecimentodeumcenriopropciodisseminaodedoenasem grandeescala.Destacam-seasmudanasclimticas,aumentodaincidnciaderadiao ultravioleta(UV-B),introduodeespciesexticasecompetidoras,contaminaopor agentes txicos e fragmentao das reas de mata que causam perda de hbitat e isolamento de populaes (Keisecker et al., 2001; Blaustein & Kiesecker, 2002; Echegaray & Hernando, 2004).Nessecontexto,osanfbioscompemumgrupoconsideradoparticularmente vulnerveladiversostiposdeimpactoambiental.Porisso,diversasvariveisbiticase abiticas tm sido estudadas no contexto dos declnios populacionais desse grupo e alguns autoresconsideramafragmentaodehabitatcomoaprincipalcausadedeclnios populacionais de anfbios, tpicos de ambientes florestais (Saunders etal. 1991; Joly etal., 2003). As primeiras barreiras de proteo contra patgenos Osanfbiospossuemumsofisticadosistemaimuneeumapelequeatuacom barreira inicial contra predadores e microorganismos patognicos (Zasloff 2002). Alm de secretar molculas componentes de venenos, molculas bioativas com ao antimicrobiana, 4 essasuperfciecontinuamenteumidificadapormucoquepodeterumpapelna termorregulao(Lillywhite,1974).Emalgumasespcieshtambmsecreodeceras liberadas por glndulas para prevenir a dessecao (Fontana et al., 2006).Estudos sobre a microbiota cutnea de anfbios apontam para um papel funcional de proteo contra patgenos. A primeira meno sobre microbiota cutnea na literatura data de 1986, no trabalho de Bettin & Greven, com a espcie Salamandra salamandra. Aps isso Austin (2000) tambm constatou a presena de uma comunidade microbiana residente sobre apeledasalamandraPlethodonventralis.Nessetrabalhofoisugeridoqueantibiticos produzidos pelas bactrias componentes dessas comunidades poderiam prevenir a infeco fngicadosovoschocadospelasfmeas(Austin,2000).Assim,essascomunidades consistem de populaes de microorganismos que so capazes de se multiplicar na pele e que podem inibir o crescimento de outros microorganismos seja pela produo de substncias ou pela competio.Dessa forma, a compreenso da interao entre a microbiota cutnea e os agentes patognicos, alm dos fatores que ditam variaes na sua composio, importante nosentidodeentendermosacontribuiodessascomunidadesparaaresistnciaou susceptibilidade dos anfbios s doenas infecciosas.Contextualizando o trabalho Osmicrorganismossovulnerveissalteraesnosubstrato ondevivem,tais como temperatura, pH, disponibilidade de gua, nutrientes, entre outros (Madinganetal., 2004). Portanto, os microorganismos presentes na epiderme dos anuros, por sua vez exposta salteraesfsicas,qumicasebiticastpicasdosremanescentesdeFlorestaAtlntica, podemteraestruturadesuascomunidadesalteradas.Almdisso,possvelque caractersticas da histria natural, por exemplo, o microhabitat ocupado por uma espcie de 5 anfbio tambm contribua para a determinao dos perfis das comunidades microbianas da pele.Pela breve discusso realizada at o momento, podemos sugerir que 1) os anuros possuem uma microbiota residente na pele, 2) tal comunidade microbiana desempenha um papelimportantecontraaaodepatgenos,3)essacomunidadepodeserafetadapor variveis associadas ao microhabitat e histria natural de cada espcie e 4) tais consideraes devem ser muito importantes no contexto de anuros de ambientes florestais fragmentados.A presente pesquisa estevefocadaem trsfrentes detrabalhosimultneas, que resultou na produo de trs captulos independentes. O primeiro trata sobre as densidades de bactriascutneasdequatroespciesdeanuros:Proceratophrysboiei,Aplastodiscus leucopygius,PhyllomedusadistinctaeDendropsophusminutus,emdoiscontextosde paisagem:reascontnuaefragmentada.Dessaforma,anlisesforamfeitassobas perspectivas da paisagem,espcie elocalidade onde os animaisforam coletados, sendo a discusso focada nesses aspectos e naqueles relacionados histria natural dessas espcies. O captulo dois est focado na caracterizao morfolgica das entidades das comunidades amostradas na primeira parte do trabalho, que compe o captulo um, e nos experimentos realizados in vitro para a verificao do potencial de ao inibitria dessas entidades isoladas contraalgunspatgenosconhecidos.Noterceirocaptuloconstamasidentificaes,por mtodos moleculares, de parte das entidadesbacterianasisoladas.Neste h tambm uma abordagem comparativa com txons de bactrias isoladas de outras espcies de anfbios, a partir de dados disponibilizados na literatura. 6 Captulo 1 Anlise sobre a densidade de microbiota cutnea de quatro espcies de anfbios:Proceratophrysboiei(Anura,Cicloramphidae),Dendropsophus minutus, Aplastodiscus leucopygius e Phyllomedusa distincta (Anura, Hylidae), em paisagens contnuas e fragmentadas de Floresta Atlntica 7 Resumo Opotencialdebactriasisoladasdascomunidadesmicrobianasdapelede anfbios, contra patgenos importantes como o fungo Batrachochytriumdendrobatidis tem sidoverificadoemestudosanteriores.Nesseaspecto,indispensveloentendimentoda estrutura e funo dessas comunidades para as espcies de anfbios, que tm experimentado eventos de declnio e extino de populaes, principalmente devido destruio de habitat e ocorrncia de epidemiasno meio natural. So desconhecidos os fatores que modulam a estruturadessasmicrobiotascutneas,porm,oambienteseperfilacomocomponente fundamentalnadeterminaodosperfisdessascomunidades.Adensidadeumdos componentes principais dos ecossistemas microbianos e pode ser um bom norteador nesse momento inicial de pesquisa, onde buscamos entender de que maneira o ambiente modula as microbiotas cutneas dos anfbios.O objetivo geral dessa pesquisa foi a identificao dos padresdedensidademicrobianacutneadequatroespciesdeanfbios,tantosoba perspectivadasespciesquantodapaisagemondeosindivduosestoinseridos.Foram coletadosindivduosemreascontnuasefragmentadasdeFlorestaAtlnticaenossos resultados mostraram que existem diferenas entre as espcies e entre as paisagens. Sendo P.boieiaespciecomamaiordensidademicrobiana,assimcomoosremanescentesde floresta, em contraposio s reas contnuas. 8 1. Introduo Apresenadecomunidadesmicrobianassobreapeledosanfbiosjfoi constatada em trabalhos anteriores, assim como a caracterizao de algumas bactrias como potentes inibidores do crescimento de patgenos importantes para esses animais (Harris et al., 2006; Woodhams et al., 2007; Lauer et al., 2007; Lauer et al., 2008; Culp et al., 2007; Brucker et al., 2008; Lam et al., 2009). possvel, portanto, que a microbiota cutnea desses animais atue como um componente fundamental de primeira proteo contra patgenos no meio natural. Apesar disso, no tm sido estudados os fatores que modulam os perfis dessas comunidades microbianas.Apartirdeestudosprvios,nopublicados,realizadospormtodoDenaturing Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE) observamos que o perfil das comunidades microbianas presentessobreapeledeanfbiossobrepunhaparcialmenteaqueledascomunidades microbianas dos microhabitats ocupados pelos animais (Assis et al., no publicado). Culp et al.,2007tambmdetectaramapresenadeentidadesmicrobianastpicasdeambientes, comocomponentesdasmicrobiotascutneasdetrsespciesdeanfbios.Dessaforma, podemos apontar o ambiente como um componente importante na colonizao e composio das comunidades que se estabelecem sobre a pele dos anfbios.Os microrganismos podem ser fortemente afetados por mudanas nas condies dealgumasvariveisqumicasefsicas,principalmentetemperatura,disponibilidadede gua,pHeoxignio,almdeoutrostaiscomopressoeradiao(Pelczaretal.,1981; Madigan et al., 2004; Madigan et al., 2009). Mesmo a pele dos animais no um substrato constante,epodevariarconformeascondiesambientais,porexemplo,durantea termorregulao ou secreo de ceras para diminuir a perda de gua e venenos para defesa 9 (Daly, 1995). Assim, os perfis dessas comunidades microbianas poderiam ser influenciados pela condio do hospedeiro e o ambiente onde este se encontra. 1.1 Fragmentao da paisagem e microbiota ambiental OprocessodefragmentaodefinidoporFranklinetal.,2002comoum conjunto de mecanismos que levam descontinuidade a distribuio espacial dos recursos e condies presentes em uma rea em uma dada escala que afeta a ocupao, reproduo e sobrevivnciaemespciesparticularese,segundoSaundersecolaboradores,em1991, alteraascondiesmicroclimticasdentroeforadasreasremanescentes,pormeiode alteraes nos valores mdios e varincias de diversos parmetros fsicos. Esse processo de perda de hbitat est entre as maiores ameaas s populaes de anfbios (Cushman, 2006).Umadasvariveisquepoderiaafetaramicrobiotacutneadosanfbiosem remanescentes de floresta seria o aumento na incidncia de radiao solar que alcana o solo dentro da mata. Esta por si s j muda a composio microbiana nesse substrato, assim como mudanas no regime termal local, com dias mais quentes e noites mais frias do que seria em reas de floresta contnua (Saunders et al. 1991). O aumento da temperatura no solo afeta a ciclagem de nutrientes deste, o que afeta as suas comunidades microbianas (Plante & Parton, 2007). Uma maior incidncia de vento resulta em reduo da umidade relativa e alterao nas caractersticas da superfcie do solo devido ao aumento no folhio pela maior queda de partesdevegetao.Gradientesdrsticosdosnveisdenutrientesnosolosotambm formados, principalmente na rea da borda da mata (Saunders et al. 1991). O fluxo de gua atingido pelo movimento de sais, nutrientes e pesticidas advindos das clareiras adjacentes e pode oferecer impactos significantes nos sistemas hdricos da rea (Saunders etal. 1991). Umavez que, parte da microbiota cutnea de algunsanfbios composta de bactrias de 10 ambiente (Culp etal. 2007), esta deve ser afetada por conseqncia das alteraes acima mencionadas. 1.2 Alteraes na pele dos anuros, um substrato para a microbiota residente Apeledosanfbiosumrgodegrandeimportnciaparaastrocasgasosas, processo durante o qual a secreo de muco e a evapotranspirao atuam como mecanismos auxiliares (Lillywhite, 1974). Tambm um rgo de defesa, feita por meio da secreo de venenos e molculas antimicrobianas, que so parte do sistema imune inato (Rollins-Smith et al., 2005). possvel ento perceber que a pele desses animais no um substrato constante, no qual devem ocorrer mudanas de temperatura, pH e umidade. Isso nos faz pensar que a comunidade microbiana residente deve ser tolerante, ou mesmo adaptada a essas alteraes naturais.A pele pode inclusive servir de substrato nutritivo, dada presena de carboidratos no muco, por exemplo, ou mesmo seletivo, devido aos peptdeos antimicrobianos (Brizzi et al., 2002; Rollins-Smith et al., 2005). Mudanasnascaractersticasdapeledosanfbiostambmpodemser conseqncia das condies s quais os animais so expostos (Pelczar et al., 1981; Madigan etal.,2004),comoaquelescenriosdeimpactosambientais.Porexemplo,algunsdos peptdeos secretados pelas glndulas da derme so seqestrados da dieta (Daly et al., 1995), por isso, alteraes no tipo e disponibilidade de presas podem acarretar mudanas no perfil molecular das secrees (Daly et al., 1997). Alm disso, a exposio a txicos e o aumento da radiao ultravioleta, que so alterados nos remanescentes (Saunders et al. 1991), podem tambm acarretar impactos sobre a microbiota cutnea dos anfbios. Cabe ainda ressaltar a importncia da temperatura, pois esta se configura como uma varivel indispensvel de se considerar ao falarmos sobre comunidades microbianas que habitam a superfcie corprea de 11 animaisectotrmicos.Essesmicrorganismos,defato,devemserafetadospelospadres termais corpreos obtidos durante os eventos de termorregulao, nos quais as temperaturas corporais so determinadas pela interao com o microhabitat (Navas, 1996). 1.3 Relevncia da densidade microbianaA densidade microbiana um fator importante na relao da comunidade residente com o seu hospedeiro e com eventuais patgenos com potencial para infeccion-lo. Alm disso, a densidade populacional de microrganismos sobre ou no interior de um organismo muitas vezes determinante na deflagrao de uma doena infecciosa (Madigan et al., 2009). Emtermosdamicrobiotacutneadeanfbios,umaaltadensidademicrobiana residente, sobretudo das espcies bacterianas produtoras de antibiticos, poderia prevenir a infeco por patgenos atravs da pele. Lam etal., 2009 explicou a persistncia de uma populao de Ranamucosa pela alta proporo deindivduos hospedando bactrias com potencial contra o fungo quitrdio (Bd), apesar da ocorrncia desta na populao. Em alguns casos,adensidadepopulacionalumfatordeterminantenabiossntesedecompostos antimicrobianos.Aproduodaviolacena,umimportanteantibiticoproduzidopela bactria Chromobacteriumviolaceum,porexemplo,densidadedependentesendo controladaporprocessodecomunicaomicrobianaqueondehsinalizaopara alteraes na expresso gnica, de acordo com a densidade populacional (quorum sensing).Esse composto tambm produzido por uma espcie de bactria simbionte em espcies de salamandras e especula-se sobre a produo densidade dependente quando da infeco por Bd (Brucker et al., 2008). 12 1.4 Contexto da pesquisa A microbiota cutnea de anfbios poderia ser afetada por mudanas ambientais s quaisessesanimaisseexpem.Umcenrioondealgunsparmetrosambientaisso,de forma constatada, alterados, aquele dos remanescentes de Floresta Atlntica, produtos do processodefragmentaodehabitats.Nessecenrio,possvelqueasalteraesno macroambiente se estendam aos microhabitats ocupados pelos anfbios. Nessas condies, a microbiota residente na pele desses animais pode ser afetada de forma direta pelos fatores ambientais, ou indireta, pelas mudanas fisiolgicas s quais os animais ficam sujeitos, uma vez expostos s variaes biticas e abiticas tpicas desses remanescentes. Temperatura e umidadesoduasvariveisabiticasimportantesnocrescimentobacterianoe estabelecimento de comunidades sobre os substratos. Assim, poderiam afetar a comunidade microbiana residente da pele dos anfbios tanto em condies naturais, como quando estes esto sujeitos a regimes de temperatura diferenciados, por exemplo, estando em paisagens fragmentadas.Umpapelimportantedascondiesmacroemicroambientaissobrea microbiota cutnea de anuros seria corroborado por nossa hiptese inicial: ao comparar as comunidadesmicrobianascutneasdeindivduosrepresentandoespciesdeanurosem paisagens contnuas de Floresta Atlntica e aqueles em paisagens fragmentadas desse mesmo bioma, e, alm disso, ao comparar indivduos ocupantes de microhabitats distintitos, existem diferencias, mesmo que a magnitude e direo das mesmas no poderiam ser previstas com a informaodisponvel.provvelquehajamdiferenasentrepaisagenscontnuase fragmentadas relacionadas s variveis temperatura e umidade relativa. 13 Objetivos Para testar as hipteses propostas determinamos como objetivo deste trabalho: 1.Estimaradensidadetotaldemicrobiotacutneaempopulaesdeanuros provenientes de paisagens fragmentadas e contnuas de Floresta Atlntica. 2.Estimaradensidadebacterianatotalempopulaesdeanurosdediferentes espcies e microhabitats ocupados. 3. Caracterizar as reas de estudo sobre as variveis temperatura e umidade, em busca de relaes entre esses fatores abiticos e os padres de densidade microbiana cutnea total encontrados. 3. Materiais e Mtodos 3.1 Espcies estudadas Quatroespciesdeanfbiosanurosadultosforamutilizadasnestetrabalho: Proceratophrysboiei,famliaCicloramphidae,Dendropsophusminutus,famliaHylidae, Aplastodiscusleucopygius,famlia HylidaeePhyllomedusadistincta,famlia Hylidae.As espciesrepresentammicrohabitats:PhyllomedusadistinctaeAplastpdiscusleucopygius comorepresentantesdomicrohabitatvegetao(Bertoluci,2005;Heyer,etal.,1990); Proceratophrysboiei que ocupa a serrapilheira do interior das matas (Zina etal., 2007) e Dendropsophus minutos mais relacionado a corpos de gua e ambientes abertos (Pombal & Haddad, 2005), ocupando o extrato arbreo quando no est no stio reprodutivo (Gomes, comunicao pessoal, 14 de maro de 2011). Destas espcies, P.disticta consta na Red List comoespcienoameaada,mascompopulaesemdeclnio,asdemaispossuem populaes estveis (IUCN, 2010). 14 3.2 reas de estudoConsideramos paisagens contnuas asflorestas com grandes extenses dematas primriasqueestodentrodasUnidadesdeConservaoepaisagensfragmentadasos remanescentes descontnuos de florestas. Foram determinadas duas grandes regies para este estudo (Figura 1).AprimeiraregiocompreendefragmentosdeFlorestaAtlnticasituadosno municpio de So Lus do Paraitinga, estado de So Paulo, entre a Serra da Mantiqueira e a SerradoMar(2313S,4520W).Paisagisticamente,caracterizada,pelacoberturade matrizesdepastagens,cercade50,8%sendoqueos11%deFlorestaestdistribudana forma de pequenos e dispersos fragmentos (Becker, 2007).A paisagem contnua uma rea de floresta com 60% de mata primitiva, com 17 mil hectares (Projeto de preservao da Mata Atlntica, 2007) localizados Ncleo Santa Virgnia (317' a 2324' S, 4503 a 4511' W), do Parque Estadual da Serra do Mar, situado, em grande parte, no municpio acima citado, alm de Cunha e Ubatuba (Figura 2). 2 1 Figura 1. Imagens de satlite das regies de coleta. Regio 1 Fragmentos de Floresta Atlnticanomunicpio So Lus do Paraitinga e Ncleo Santa Virgnia, ParqueEstadualdaSerradoMarRegio2Fragmentosnosmunicpiosde Ribeiro Grande e Capo Bonito e Fazenda Paraso, floresta contnua com o Parque Estadual Intervales. 15 NasegundaregioestoosfragmentossituadosnomunicpiodeRibeiroGrande (2405S, 4821W) eCapo Bonito (2400S, 4820W). Os entornos dessesfragmentos so normalmente circundados por matrizes de monoculturas, a principal atividade econmica daregio.Comopaisagemcontnua,oParqueEstadualIntervales(2412Se2432,e 4803e4832W),situadonosmunicpiosdeGuapiara,RibeiroGrande,SeteBarras, Eldorado e Iporanga, Estado de So Paulo (Campos, 1994).Sendo os espcimes coletados dentro da propriedade particular Fazenda Paraso Eco Lodge (2414S, 4822W), cuja rea de floresta primria, conservada e contnua com aquela do Parque (Figura2). 16 DCBA Figura 2. Imagens de satlite das regies de coleta. A. rea 1 Fragmentos de Floresta AtlnticanomunicpioSoLusdoParaitinga;B.rea2-NcleoSantaVirgnia, Parque Estadual da Serra do Mar; C. rea3 - Fragmentos no municpio de Ribeiro Grande;D.rea4-FazendaParaso,florestacontnuacomoParqueEstadual Intervales. 17 3.3 Temperatura e umidade Foram utilizados registradores automticos de dados Ibbuton (Sistema de MonitoramentodeTemperaturaKooltrak)paraobtenoderegistrosdetemperaturae umidade. Os aparelhos foram distribudos a partir da borda, a cada 25m at 100m no interior da mata, incluindo os corpos de gua que se encontravam no interior ou na borda das matas. Paracadatransectoumnicoaparelhoparamediodeumidaderelativafoicolocado. Totalizando 5 aparelhos Ibbutons para cada mata durante um perodo de pelo menos 10 dias. Foram primeiramente colocados na fazenda Paraso (mata contnua com o Parque Estadual de Intervales) e trs fragmentos adjacentes, no municpio de Ribeiro Grande, onde o foram coletados os animais. Posteriormente, no Parque Estadual Serra do Mar - Ncleo de Santa Virgnia e um fragmento em So Lus do Paraitinga. As duas etapas foram feitas durante o vero, mas em meses diferentes. Nas reas abertas onde ocorria a espcie Dendropsophus. Minutus foram colocados aparelhos a 1 e 3 m dos corpos de gua onde foram coletados os animais. TPara comparar os parmetros mdia, mxima, mnima e amplitude de temperatura e umidade relativa,nosfragmentos e reas contnuas,foi utilizado o Test T, para amostras independentes. 3.4 Microbiologia em campo AlgumastcnicasclssicasemMicrobiologiaforamadaptadasrealidadedo campo,paraquehouvesseapossibilidadedepreservao,aomximopossvel,das caractersticas da microbiota cutnea nas amostras obtidas dos animais coleados. 18 3.4.1 Coletas dos animais Todos os animais foram coletados por busca ativa, utilizando luvas previamente desinfetadasporlcoola70%.Paracadaindivduo,umaluvafoiusadaeemseguida descartada. Aps a captura, os animais foram colocados em sacos tipo ziplock, um indivduo por saco. 3.4.2 Coleta de microbiota Amicrobiotacutneafoicoletadalogoapsacapturadosanimais,aindaem campo, nas estalaes dos alojamentos onde era preparada a logstica para os procedimentos emmicrobiologia.Osanimaisforamlevadosparaoalojamento,ondeumespaofoi previamente destinado para os trabalhos em microbiologia. Os animais foram retirados do saco plstico sendo a manipulao realizada com luvas, previamente desinfetadas com etanol 70%. A seguir, os animais foram lavados com doisbanhosdeguadestiladaautoclavadaemgarrafaspreviamenteesterilizadasem autoclave. Conforme descrito por Lauer et al, 2008 esse procedimento remove a microbiota transiente preservando a microbiota residente. A microbiota da pele foi ento amostrada com o auxlio de um cotonete estril, passando o mesmo em toda a extenso do dorso e ventre, bemcomoacabeaearegiogulardoanimal.Essasreasdeamostragemforam determinadasapsverificarmosqueforammaisrepresentativas,quandocomparadasa esquadros de 1 e 2 cmP2P, em termos de densidade e de riqueza de colnias, sendo esta ltima utilizada em estudo posterior (Captulo2). O cotonete impregnado com a comunidade microbiana foi depositado em um tubo contendo 1 mL de soluo fisiolgica (NaCl 0,9%) agitando-se durante 1min com o auxlio de vrtex. Dessa maneira, espera-se que a maior parte das clulas presas no cotonete passe 19 para a soluo, alm de garantir a sua homogeneizao. A partir dessa primeira amostra que corresponde comunidade total foram feitas diluies seriadas. Com o auxlio de uma pipeta estril, 100 L da primeira amostra transferida para outro tubo contendo 900 L de soluo fisiolgica estril, correspondendo diluio 10P-1P e em seguida o procedimento repetido paraadiluio10P-. PEssadiluiofoiescolhidaparaocultivoemplacadepoisde experimentos pilotos, onde se verificou que essa foi a diluio que permitiu o crescimento de 30 a 300 colnias por placa para a maioria das espcies de anuros testada.Foram inoculados 100 L da diluio 10P-P em placas de Petri plsticas estreis de 90x15mm, contendo meio de cultivo R2A gar (DIFCO). Escolhemos o R2A gar porque, em geral, este o meio de cultivo utilizado nos estudos sobre microbiota cutnea de anfbios, oquepermitiuumacomparaoposteriordosnossosresultadoscomaquelesdeoutros grupos de pesquisa (Veja captulo 3, tabela 2). Alm disso, disso, outros meio de cultivo foram testados e o R2A gar apresentou maior efecincia para a obsevao da riqueza de morfotipos (Captulo 2).Todo o contedo inoculado na placa foi espalhado com ala de Drigalski plstica e estril, at que o lquido fosse absorvido pelo meio, seguindo o mtodo de espalhamento em placa,descritoemMadiganetal.,2009.Paracadaamostrasofeitasduasrepeties, obtendo-se assim, triplicatas. Esse procedimento foi realizado em proximidade a uma chama de gs. Foram executados controles com placas de Petri abertas sobre a bancada durante as etapas de coleta e plaqueamento da comunidade microbiana da seguinte forma: duas placas de Petri, contendo o mesmo meio de cultivo, foram deixadas abertas a 10 e 40 cm da chama. Para essas ltimas, aofinal do tempo de crescimento das outras placas,nofoi esperado crescimento bacteriano. 20 As placas foram incubadas por 48hs a temperatura ambiente, conforme realizado para cultivo de bactrias de amostras de solo. A incubao foi feita em campo, para que as temperaturasfossemaquelasdalocalidadeondeforamcoletadasasamostras.Algunsj foram detectados nas primeiras 24hs e outros foram visualizados aps o terceiro dia. Assim, o nmero de colnias foi determinado aps 48hs e 72 horas de crescimento.Aps a coleta da microbiota os animais foram soltos. Apenas dois animais de cada espcie e de cada rea de coelta foram preservados em lcool a 70% para verificao da taxonomia e criao de uma pequena coleo de referncia.Porfim,caberessaltarque,pelosmtodosutilizados, todos osresultados obtidos neste trabalho (todos os captulos) so relacionados poro cultivvel, em meio R2A gar, da microbiota cutnea das espcies anuros estudadas. 3.4.3 Estimativa da densidade bacteriana. Para a contagem das colnias, foi utilizado o mtodo padro contagem de placa heterotrfica (CPH), utilizado comumente para estimar o nmero de bactrias heterotrficas vivas, coletadas em corpos de gua. Uma colnia que surge a partir da proliferao de uma nica clula bacteriana denominada unidade formadora de colnia ou UFC (Madigan et al., 2004) e essa nomenclatura utilizada no decorrer deste trabalho. A contagem foi feita considerando todas as unidades visualizadas com o auxlio de lupa sobre um contador de colnias da marca (Quimis). Para se estimar a quantidade de UFC por amostra a seguinte frmula foi utilizada: Fator de diluio x UFC 0,1 21 Sendo o fator de diluio igual a 100, UFC, a quantidade de unidades formadoras decolniascontadasnaplacaeodenominador corrigeovolumeparamL(Eatonetal., 1995).Asmdiasdecadatriplicatadeplacasforamconsideradas.Paraseestudara dependnciadadensidadebacterianaresidentesobreapeledosanurosDendropsophus minutus, Proceratophrysboiei, Aplastodiscusleucopygius e Phyllomedusadistincta, foram utilizadostestesdeKruskal-Wallis,dependentesdaespcie,paisagem,localidadee microhabitat, seguidos de testes de Mann-Whitney para comparaes pareadas. 4. Resultados 4.1 Coleta dos espcimes Umtotalde187indivduosadultosfoicoletado.Destes,52foramdaespcie Proceratophrysboiei,famliaCicloramphidae;73indivduosdeDendropsophusminutus, famliaHylidae;28indivduosdeAplastodiscusleucopygius,famliaHylidae;e34 indivduos dePhyllomedusadistincta, famlia Hylidae.Em relao s localidades, para P.boiei foram 5 indivduos coletados no Parque EstadualSerradoMarNcleodeSantaVirgnia;18nomunicpiodeSoLusdo Paraitinga, 17 na fazenda Paraso Parque Estadual de Intervales e 12 no municpio de Ribeiro Grande. Houve 31 indivduos de D.minutus capturados Parque Estadual Serra do Mar Ncleo de Santa Virgnia; 9 no municpio de So Lus do Paraitinga, 17 na fazenda ParasoParque EstadualdeIntervalese16 nomunicpiodeRibeiroGrande.Foram coletados 16 indivduos de P.distincta espcimes na fazenda Paraso Parque Estadual de Intervalese18nomunicpiodeRibeiroGrande.Finalmente,foramcapturados14 indivduos de A. leucopygius no Parque Estadual Serra do Mar Ncleo de Santa Virgnia; 14 no municpio de So Lus do Paraitinga (Tabela 1). 22 Tabela 1. Total de indivduos coletados por espcie e localidade. Espcie MicrohabitatNSVSLPINTRG Dendropsophus minutusrea aberta3191716 Proceratophrys boieiFolhio5181712 Aplastodiscus leucopygiusrvores1414-- Phyllomedusadistinctarvores--1618 Abreviaes: NSV, Ncleo de Santa Virgnia; SLP, So Lus do Paraitinga; INT, Intervales - Fazenda Paraso; RG, Ribeiro Grande 4.2 Densidade de colnias bacterianas Previamente s anlises de densidade total, foi detectado que as espcies de anuros estudadas possuem tamanhos diferenciados. Por exemplo, a mdia de comprimento rostro-cloacal em A.leucopygius 39,8mm,P.boiei52,75 mm,P.distincta 56,14mm e D. minutus 39,87 mm (Figura 2). Julgamos que essas diferenas nas dimenses corpreas das espcies poderiam atuar como um vis nos resultados finais de densidade microbiana. Por isso, foram feitas medies de massa e comprimento rostro-cloacal e uma funo dessas duas medidasserviuparaobterumavarivelproporcionalsreascorpreasamostradasdos indivduos. Para avaliar a importncia do tamanho dos espcimes, e, por conseqncia, a rea corprea amostrada, nas mdias de densidade de microbiota cutnea desses indivduos, foi utilizadaestatsticaFetestedecorrelaocomessesfatoresmorfomtricos,ondese verificouqueotamanhocorpreodosanimaisnoumbompreditordasmdiasde densidademicrobiana (rP2P 0,26;F crtico 2,26; F1,3).Neste trabalho, o termo densidade refere-se ao nmero total de unidades formadoras de colnias para cada espcime de anfbio amostrado. 23 Figura 2. Espcies de anuros estudadas, com escala de tamanho corpreo. A. Proceratophrys boiei; B. Aplastodiscus leucopygius; C. Dendropsophus minutus; D. Phyllomedusa distincta. 0,5 cm0,5 cm0,5 cm0,5 cmABCD 24 A densidade bacteriana na pele dos indivduos testados variou de 0 a 1.278.000 UFC/mL,sendoobservadadiferenasentreasespciesdeanurosanalisadas(p=9,49-21) (Figura 3). 04080120160200240280320360400440480A. leucopygius D. minutus P. boiei P.distinctaMilharesEspcieUFC Mdio T Figura 3. TMdia e desvio padro das densidades de UFC/ml amostradas em quatro espcies de anuros. ComoauxliodotestedeMann-Whitney,foramfeitasanlisespareadasde espciesparaverificardiferenasnadensidadedeUFC/mLsobreapeledosindivduos, entre espcies, comnvel de significncia p=