szteroid gyógyszeranyagok tisztaságvizsgálata kromatográfiás...
Post on 25-Dec-2019
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Szteroid gyógyszeranyagok
tisztaságvizsgálata
kromatográfiás technikákkal
Bagócsi Boglárka
Kémia Doktori Program Programvezető: Prof. Dr. Inzelt György
Témavezető: Ferencziné Dr. Fodor Katalin (Richter Gedeon Nyrt.) Egyetemi konzulens: Horváthné Dr. Otta Klára (ELTE TTK)
Richter Gedeon Nyrt. Budapest, 2007
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönöm Társaságunk és a Minőségirányítási Igazgatóság vezetőségének a lehetőséget, hogy munkahelyemen, a Richter Gedeon Nyrt. Minőségellenőrző laboratóriumában elvégezhettem doktori munkámat. Hálásan köszönöm témavezetőmnek Ferencziné Dr. Fodor Katalinnak munkám irányítását, ösztönzését. Köszönöm konzulensemnek Horváthné Dr. Otta Klárának dolgozatommal kapcsolatos hasznos észrevételeit, tanácsait és segítségét. Köszönöm Mahó Sándornak a Richter Gedeon Nyrt. Szteroid szintetikus laboratórium vezetőjének a munkámhoz szükséges vegyületek biztosítását, értékes szakmai tanácsait. Köszönöm Laukó Annának a Kémia VI., és Németh Sándornak a Biokémia II. üzemellenőrző laboratóriumok vezetőinek a szteroidszintézissel kapcsolatos munkáknál nyújtott segítségüket, a HPLC és gázkromatográfiás mérések végzését. Köszönöm Dr. Végh Zoltánnak szakmai tanácsait, a rétegkromatográfiás fotók, videofelvételek elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Görög Sándor professzor úrnak a dolgozatommal kapcsolatos kritikai megjegyzéseit, hasznos tanácsait. Külön köszönettel tartozom Katona Mihályné és Tóth Gábor munkatársaimnak a gyakorlati munka elvégzésében nyújtott segítségükért.
2
TARTALOMJEGYZÉK
Gyakran használt rövidítések................................................................................................. 5
1. BEVEZETÉS – CÉLOK ................................................................................................... 6
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.............................................................................................. 7
2.1. A szteroid hormonok .................................................................................................. 7
2.1.1. A norszteroid-szintézis......................................................................................... 8
2.2. Vizsgálati lehetőségek .............................................................................................. 11
2.2.1. Általánosan használt technikák ......................................................................... 11
2.2.2. A túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) szerepe a szteroidok
tisztaságvizsgálatában ................................................................................................. 12
2.3. Gyógyszeranyagok szennyezéseire vonatkozó előírások ......................................... 15
3. KÍSÉRLETI RÉSZ .......................................................................................................... 17
3.1. Felhasznált eszközök, vegyszerek ............................................................................ 17
3.2. Módszerleírások ....................................................................................................... 17
3.2.1. Az előhívási kísérletekhez használt módszerek .................................................. 17
3.2.2. A szteroidsor kísérleteihez használt kromatográfiás módszerek ....................... 18
3.2.3. A teljesítményjellemzők meghatározásához használt módszerek ...................... 20
4. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS ..................................................................................... 25
4.1. Vizsgált szteroidok ................................................................................................... 25
4.1.1. Nandrolon.......................................................................................................... 26
4.1.2. Dienoléter .......................................................................................................... 27
4.1.3. Ösztradiol-metiléter-acetát................................................................................ 29
4.1.4. Molon................................................................................................................. 32
4.1.5. A szteroidszintézissel kapcsolatos eredmények ................................................. 36
4.2. Előhívások ................................................................................................................ 38
4.2.1. Az előhívási kísérletek során készített kromatogramok ..................................... 40
4.2.2. Az előhívási kísérletek során mért csúcsterületek ............................................. 43
4.2.3. Az előhívási kísérletek során kapott szintvonalas ábrák ................................... 48
4.2.4. Az előhívási kísérletek értékelése ...................................................................... 57
4.3. Teljesítményjellemzők ............................................................................................. 60
3
4.3.1. Etinil-ösztradiol ................................................................................................. 61
4.3.2. Noretiszteron ..................................................................................................... 67
4.3.3. Nandrolon.......................................................................................................... 73
4.3.4. Gesztodén .......................................................................................................... 79
4.3.5. A teljesítményjellemzőkkel kapcsolatos kísérletek eredménye .......................... 83
4.4. Szűrővizsgálatok....................................................................................................... 85
4.4.1. Szűrővizsgálatok lehetséges szennyezésekre ..................................................... 86
4.4.2. Szűrővizsgálatok főkomponensekre ................................................................... 87
4.4.3. Elővizsgálatok lehetősége készüléktisztításnál .................................................. 93
5. ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................................ 95
6. SUMMARY .................................................................................................................... 96
7. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................. 97
4
Gyakran használt rövidítések
VRK vékonyrétegkromatográfia
OPLC túlnyomásos rétegkromatográfia
HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia
GC gázkromatográfia
UV ultraibolya
NMR mágneses magrezonancia spektroszkópia
FID lángionizációs detektor
HPTLC nagyhatékonyságú vékonyrétegkromatográfia
RF retardációs faktor
RRF relatív retardációs faktor
Rt retenciós idő
RRt relatív retenciós idő
Rs csúcsfelbontás
H elméleti tányérmagasság
N elméleti tányérszám
5
1. BEVEZETÉS – CÉLOK
A Richter Gedeon Nyrt. hagyományos termékpalettáján a szteroidok
vegyületcsoportja igen fontos szerepet játszik. Felhasználják fogamzásgátló, hormonpótló
készítményekben, de alapanyag formában is exportálják ezeket a vegyületeket.
A szteroidokon belül különös fontosságúak a norszteroidok, amelyeken az
alapváznál eggyel kevesebb metil-csoport van. Ezeket soklépéses szintézissel állítják elő:
azonos kiindulási anyagokból; a technológiai folyamat elágazásával különböző termékek
keletkeznek. Így a közös kiindulási anyagok folytán ezeknek a szteroidoknak a
szennyezés-profilja összefügg.
Munkám célja a szteroid totálszintézis fontosabb vegyületeinek (melyek ismertebb
termékei a nandrolon-dekanoát, noretiszteron, allilösztrenol) részletes tanulmányozása az
alábbi szempontok szerint:
- Az egyes technológiai lépések követésével a közös szennyezések és prekurzoraik
felderítése a különböző szteroidokban, analógiák keresése.
- Olyan tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozása, amelyek lehetővé teszik az UV-
elnyelést nem mutató szteroid-szennyezők kimutatását, amelyek az UV-detektálást
alkalmazó HPLC-módszerrel észrevétlenek maradnak. A planár-kromatográfiás módszerek
(VRK, OPLC) speciális előhívó reagensek alkalmazásával ezt lehetővé teszik.
- Olyan gyors ellenőrző módszerek kidolgozása, amelyek alkalmasak a reakcióelegyek és
köztitermékek vizsgálatára is.
6
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A szteroid hormonok
A hormonok speciális felépítésű anyagok, amelyek a vér útján jutnak el a rájuk
specifikusan érzékeny sejtekhez, ill. szövetekhez, ahol már igen alacsony koncentrációban
kifejtik hatásukat. Kémiai felépítésük alapján három csoportba oszthatók:
- szteroid hormonok,
- peptid hormonok,
- fenolszármazékok.
Az egyes szerkezeti csoportokon belül hatásuk szerint további csoportosítás
lehetséges. Részletesebben a szteroid hormonokkal foglalkozom, amelyek a szteránvázas
vegyületek közé tartoznak (1. ábra), ezek szubsztituált és általában részben telítetlen
származékaik.
A B
C D12
3
45
67
8
910
1112
13
14 15
16
17
1. ábra. A szteránváz
A szteroid hormonok lehetnek nemi hormonok és mellékvesekéreg-hormonok vagy
kortikoszteroidok. A nemi hormonok között megkülönböztetünk férfi nemi hormonokat,
ezeket hívjuk androgéneknek, ill. női nemi hormonokat, amelyek az ösztrogének vagy
tüszőhormonok és a gesztagének vagy sárgatest-hormonok.
Az androgénekre jellemző alapváz a C19-es androsztán-váz (2. ábra). Képviselőjük
az androszteron és a tesztoszteron. A másodlagos férfi nemi jelleg kialakításában van
szerepük. Androgén aktivitásuk mellett anabolikus hatásuk is van, vagyis elősegítik a
fehérjék tárolását, megtartását, ezáltal gyorsítják a szövetképződést, növekedést, elősegítik
a regenerációt. Az androgén és az anabolikus hatás között azonban nincs párhuzam. A
vázon végzett megfelelő szerkezeti változtatásokkal elő lehet állítani olyan szteroidokat,
amelyeknek vagy az androgén vagy az anabolikus hatásuk dominál. Utóbbiakat anabolikus
szteroidoknak nevezzük, egyik legismertebb képviselőjük a nandrolon-dekanoát.
7
HO
19
18
18
19
20
21
18
androsztán (C19) ösztrán (C18) pregnán (C21)
2. ábra. Férfi, ill. női nemi hormonok alapvázai
Az ösztrán alapvázzal (C18) rendelkező vegyületek közül az ösztrogének vázában az
A-gyűrű aromás szerkezetű. Ide tartozik az ösztron, az ösztradiol és az ösztriol. Ezek a
hormonok a pete érését és az ovulációt segítik, leghatásosabb közülük az ösztradiol.
A gesztagéneknek, amelyeket más néven terhességi hormonoknak nevezünk, mert a
peteérést és az ovulációt gátolják, C21-es pregnán alapvázuk van, képviselőjük a
progeszteron. Ovulációgátló hatásuk miatt a születésszabályozásban van szerepük;
rendkívül intenzív hatású mesterséges gesztagéneket is előállítottak és használnak a
fogamzásgátló készítményekben, mint például a noretiszteront.
A mellékvesekéreg hormonjai, a kortikoszteroidok között megkülönböztetjük a
szénhidrátanyagcserét szabályozó glükokortikoszteroidokat, mint például a kortizon és a
hidrokortizon, ill. a mineralokortikoszteroidokat, amelyek a só- és vízháztartást
szabályozzák. A kortikoszteroidok között is léteznek mesterséges származékok, főleg
gyulladásgátló és antireumás szerek [1-4].
2.1.1. A norszteroid-szintézis
A szteroid hormonok előállítására több lehetőség van. Az ún. félszintézisek során
növényi vagy állati eredetű szteroidokat alakítanak át más szteroidokká. Például
dioszgeninből vagy koleszterinből kiindulva tesztoszteron, ösztradiol vagy progeszteron
előállítása válik lehetővé. Másik lehetőség a totálszintézis. Az első anabolikus androgén
szteroid hormon, a 19-nortesztoszteron (nandrolon) teljesen szintetikus előállítása először
1950-ben vált lehetővé a Birch-redukció segítségével [5]. Ezután számos norszteroid
totálszintézisét valósították meg. Ennek egyik példája Torgov nevéhez fűződik, aki ösztron
előállítását írta le metoxi-tetralonból kiinduló teljes szintézissel [6].
A Gyár az 1950-es évek végén kezdte el a szintetikus szteroidelőállítási eljárások
kidolgozását [7]. A szteroid hormonok totálszintézisének kiindulási anyaga a β-naftol. A
többlépcsős szintézisút kezdeti reakcióit követően a keletkezett molekulát metil-, ill. etil-
8
9
ciklopentándionnal kondenzálják. A metil-ciklopentándion az ún. metilsor vegyületeinek
kiindulási anyaga, amelyek a szteroidváz (1. ábra) 13-as szénatomján metil-csoportot
tartalmaznak, míg az etil-ciklopentándion az ún. etilsor kiindulási anyaga, a 13-as szénen
etil-csoportot tartalmazó szteroidoké.
A szintézis során a β-naftolból hidrogénezéssel, metilezéssel, oxidációval és
Grignard-reakcióval létrehozott vinil-karbinolt reagáltatják a ciklopentándionnal, amely
egy báziskatalizálta reakció, a hidroxi-csoporthoz képest allil-helyzetben kapcsolódik a
ciklopentándion molekula, közben enolizáció játszódik le. Metil-szekodion keletkezik,
amelyből további reakciókkal ösztradiol-metil-acetátot, Birch-redukcióval és savas
hidrolízissel pedig 19-nortesztoszteront, más néven nandrolont kapunk. A 3. ábrán a
szteroidok totálszintézisének doktori munkámban vizsgált ágát mutatom be vázlatosan.
10
etinodiol-diacetát
nesztoron
∫∫
∫∫ nandrolon nordion
nandrolon-dekanoát
∫∫∫∫
noretiszteron
noretiszteron-acetát
∫∫ vinil-karbinol +
metil-ciklopentándion
ÖDME-acetát ösztradiol-17-acetát∫∫
∫∫ ∫∫
3. ábra. A norszteroid-totálszintézis „metilsorának” vázlata [8]
allilösztrenol
β-naftol
ösztradiol
: elágazási pont : végtermék
etinil-ösztradiol
____
A technológiai folyamat elágazásaival különböző termékek keletkeznek, amelyek
szennyezésprofilja a közös kiindulási anyagok miatt összefügg.
2.2. Vizsgálati lehetőségek
2.2.1. Általánosan használt technikák
Szteroidok tisztaságvizsgálatára többféle kromatográfiás módszert használnak [9].
A hatóanyagok, végtermékek minőségének ellenőrzésére a hagyományos
vékonyrétegkromatográfiás (VRK) módszerek visszaszorulóban vannak a pontosabb,
kvantitatív eredményeket biztosító nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC)
módszerekkel szemben.
A gyártásközi ellenőrző laboratóriumokban intermedierek vizsgálatára,
reakciókövetésre még ma is használják a VRK-módszereket, ugyanakkor HPLC és
gázkromatográfiás (GC) módszerek, ill. speciális esetekben egyéb – pl. spektrofotometriás
– módszerek is használatosak.
A VRK-módszerek előnye abban rejlik, hogy egyszerűek, olcsók és gyorsak. Több
minta egyidejű, standard melletti analízisét is lehetővé teszik, komplex, ill. nyers minták
előkészítés nélkül, vagy minimális mintaelőkészítéssel azonnal felvihetők a szorbensre. A
minta valamennyi detektálható komponense egyidejűleg megjeleníthető a rétegen, a starton
maradó és a frontba kerülő anyagok is detektálhatók, szemben az oszlopos technikákkal.
Egyszerűen alkalmazható sokféle előhívási technika, amelyekkel a szorbensre felvitt anyag
különböző komponensei láthatóvá tehetők, detektálhatók. Lehetőség van kvantitatív
denzitometriás értékelésre, valamint félkvantitaív vizuális értékelésre [10-13].
Hátrány azonban, hogy a VRK-módszerek nem teljesen automatizálhatók. Az egyes
lépések, mint mintafelvitel, kifejlesztés, előhívás, detektálás automatizálhatók, de a lépések
között manuális beavatkozásra van szükség. Másik hátrány, hogy a VRK nyitott rendszer,
a környezeti tényezők jelentős hatást gyakorolnak az elválasztásra. Pl. a legelterjedtebben
használt normál fázisú szilikagél rétegek esetében a levegő változó nedvességtartalma
okozhat problémát. A mobil fázis áramlási sebességét a kapilláris erők határozzák meg
(kivéve a kényszeráramlásos VRK technikákat, pl. OPLC), melyeket szintén több tényező
befolyásol. Ezen okok kedvezőtlenül hatnak a kromatogramok reprodukálhatóságára.
Ennek javítására Reich dolgozatában találunk javaslatokat [14]. A gyógyszeranyagok
vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával több összefoglaló közlemény foglalkozik [15-
18].
11
A szteroidok esetében normál- (TLC) vagy finomszemcsés (HPTLC) szilikagél
állófázisok használatosak. Az előhívási technikák közül gyakori a kénsavas etanolos
bepermetezés vagy a reagensoldatba történő bemerítés és az azt követő néhány perces 100-
120 °C-on történő hevítés. Ilyenkor 366 nm-es ultraibolya (UV) fénnyel besugározva
különböző színnel, intenzíven fluoreszkáló foltok jelennek meg.
A HPLC-módszerek előnye a zárt rendszerből és az eluens egyenletes áramlási
sebességéből adódóan a reprodukálhatóság és az automatizálhatóság; pontos, kvantitatív
eredmények kaphatók velük [19]. A technika hatékonysága, az elméleti tányérszám itt
jóval nagyobb, mint a VRK-nál.
A hagyományos HPLC hátránya ugyanakkor a hosszú analízisidő, a nagy
oldószerigény és költség. A kromatográfiás oszlop kondícionálásához szükséges időt és
oldószert is figyelembe kell vennünk. A végtermékekre használt rutinanalitikai méréseknél
ugyanis még nem használják széles körben a monolit oszlopokat [19], vagy a rendkívül kis
szemcseméretű töltettel rendelkező rövid oszlopokat [19], amelyek jelentős mértékben
meggyorsítják az analízist. Komplex minták (pl. gyógyszerkészítmények, reakcióelegyek)
előkészítés nélkül általában nem vizsgálhatók. A gyógyszeriparban általánosan használt
UV-detektorral ellátott HPLC készülékek pedig a csekély UV-elnyelést mutató
komponensek kimutatására nem alkalmasak.
Tisztaságvizsgálatra ritkábban használják a GC-technikát [20]. Ez a módszer
kvantitatív, gyors, tömegarányos analitikai jelet ad és tömegspektrometriás (MS)
detektálással ismeretlen csúcsok azonosítását is lehetővé teszi. Hátránya, hogy a
hőérzékeny és a kevésbé illékony komponensek nem vagy nem pontosan mérhetők. A 3-
keto-Δ4 szerkezetű szteroidok például kisebb hőbomlást szenvednek az injektorban [21].
A gyártásközi ellenőrzéseknél UV spektrofotometriás módszert is használnak
reakciókövetésre.
2.2.2. A túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) szerepe a szteroidok
tisztaságvizsgálatában
A kényszeráramlásos rétegkromatográfiás technikák közé tartozik a túlnyomásos
rétegkromatográfia – OPLC (Over-Pressured Layer Chromatography, vagy Optimum
Performance Laminar Chromatography) – egy síkelrendezésű folyadékkromatográfiás
módszer, amely ötvözi magában a VRK és a HPLC előnyeit [22-26].
12
Az OPLC kamrában a szorbensréteget egy rugalmas fóliával nyomás alatt
letakarjuk, így gyakorlatilag nincs gőztér. Az eluenst a szorbensrétegbe nyomás alatt,
mikropumpával juttatjuk el.
Az OPLC alkalmas on-line, illetve off-line mintafelvitelre, elválasztásra és
detektálásra és ezek kombinációira (részleges off-line módszerek). Az on-line módban az
oldott anyagokat az elfolyó eluensben detektáljuk egy átfolyócellás detektor segítségével.
Az off-line módban a kromatográfiás folyamat valamennyi lépése (mintafelvitel,
elválasztás, értékelés) egymást követően külön-külön valósul meg. Az OPLC
rendszerekben az eluens összetételének változtatása jó lehetőséget biztosít speciális
elválasztási módszerek alkalmazására, mint az izokratikus, a gradiens és a lépcsős gradiens
módszer. A technika előnye, hogy az eluens összetételének változtatása egyszerűen és
gyorsan elvégezhető, a rendszer nem igényel több órán át tartó kondícionálást.
A hagyományos rétegkromatográfiában az eluens a kapilláris erők révén vándorol
az álló rétegben, míg a lineáris OPLC esetében pumparendszer segítségével biztosítja az
eluensfront állandó sebességét a szorbensben. A normál kamrában végzett futtatás esetében
az eluens frontjának sebessége folyamatosan csökken, emiatt a kromatografált anyagok
foltjainak szétterülése az idő előrehaladtával egyre jelentősebbé válik. Az α front
vándorlását a következő függvénnyel jellemezhetjük:
zf2 = k ⋅ t (2.1)
ahol zf az α front távolsága, t a kifejlesztési idő és k egy állandó, mely az
elválasztás körülményeitől függ.
A lineáris kifejlesztésű túlnyomásos futtatás (OPLC) esetében a front vándorlása a
következő lineáris függvénnyel írható le:
zi = ui ⋅ t (2.2)
ahol zi az i-edik komponens, vagy az eluensfront távolsága, ui az i-edik komponens,
vagy az eluensfront áramlási sebessége és t a kifejlesztési idő.
13
4. ábra. Az eluensfront vándorlásának időfüggése hagyományos VRK és OPLC esetében [27] 1-hagyományos kifejlesztés, 2-lineáris OPLC kifejlesztés, 3-lineáris OPLC kifejlesztés gyors szakasz beiktatásával, 4-a mintafelvitel javasolt helye
A 4. ábra szemlélteti a hagyományos vékonyrétegkromatográfia eluensfrontjának
vándorlási sebességére jellemző négyzetes, valamint a lineáris kifejlesztésű OPLC
esetében a lineáris összefüggést [28].
OPLC esetében – hasonlóan a HPLC-hez – az eluens optimált, állandó áramlási
sebessége miatt a foltok terülése jóval kisebb, mint a normálkamrában, így a HPLC-hez
hasonló hatékonyságú elválasztást érhetünk el.
Az OPLC technika előnyei közé tartozik, hogy a gőztér kizárásával a környezeti
tényezők jóval kevésbé befolyásolják a kromatográfiás kifejlesztést, mint a hagyományos
VRK esetében. Az eluensfront állandó sebességének biztosítása szintén az eredmények
jobb reprodukálhatóságának kedvez. A szorbensre felvitt mintából kedvező esetben gyors
előfuttatással eliminálni lehet a futtatást zavaró komponenseket, ezzel kiváltva az
időigényes mintatisztítási lépéseket.
A finomszemcsés réteglapokon a kényszeráramlásos technikával biztosított állandó
áramlási sebesség lehetővé teszi a hosszabb kifejlesztési távolságot. Hagyományos kamrás
kifejlesztés esetében legfeljebb 7 cm a futási távolság finomszemcsés szorbensen. OPLC-
vel a réteglap teljes hossza (20 cm) kihasználható, túlfuttatásra is van lehetőség.
Ugyanakkor a foltkiszélesedés jóval kisebb mértékű, ezáltal hatékonyabb elválasztásra van
lehetőség.
14
A Richter Gedeon Nyrt.-ben az OPLC-módszereknek komoly hagyományuk van.
Az első kísérleti körkörös készüléket itt használták először digitálisz-glikozidok
vizsgálatára az 1980-as években [29]. Több hatóanyag, valamint készítmény esetében
validált OPLC-módszerekkel végzik a rutinanalitikai munkában a minősítéshez szükséges
tisztaságvizsgálatot [30-35], ezen kívül a tisztításvalidálásban is alkalmazzák [36].
2.3. Gyógyszeranyagok szennyezéseire vonatkozó előírások
A szennyezéseket különféleképpen csoportosíthatjuk. Vannak szerves, és szervetlen
szennyezések, valamint oldószermaradékok. Ezek meghatározására különféle vizsgálati
technikák és módszerek léteznek. Munkám során a szerves szennyezések, ezen belül
rokonvegyületek elválasztásával foglalkoztam. A hatóanyagra jellemző szerves
szennyezések között beszélhetünk a gyártás kiindulási anyagáról, a gyártásból eredő
melléktermékekről, intermedierekről, bomlástermékekről, különféle reagensekről, vagy
katalizátorokról [37]. A gyártónak a törzskönyvi beadványában fel kell sorolnia a
hatóanyagában ténylegesen meglévő és elméletileg lehetséges szennyezéseket. Ez utóbbiak
azok, amelyek a gyártás, tisztítás, vagy tárolás során keletkezhetnek [38-39].
Ezek vizsgálatára szigorú szabályozás van érvényben a gyógyszeriparban.
Általában különféle kromatográfiás technikákat ajánlanak az egyes szennyezések és a
főkomponens egymástól való elválasztására. Egy hatóanyagban megengedhető maximális
szennyezettség a nemzetközi harmonizációs irányelvek alapján a hatóanyag napi dózisától
függ. Amennyiben a napi dózis 2 g-nál nem nagyobb, akkor a legújabb ajánlások szerint az
ismeretlen szennyezések a hatóanyag-végtermékben nem haladhatják meg a 0,10%-ot.
Minden szennyezést, ami meghaladja ezt a mennyiséget, azonosítani kell. Ezt a
pontosságot biztosítani képes technikák szükségesek a rutinanalitikai vizsgálatokhoz. A
gyártásközi ellenőrzések során viszont ilyen pontosságot még nem várnak el. Ott az
analitikai munkák során a gyorsaság az egyik legfontosabb szempont, valamint
természetesen az, hogy a kérdéses komponensek elválasztása megfelelő legyen [40].
Az Amerikai és Európai Gyógyszerkönyv egyaránt általános fejezeteiben tárgyalja
a szokásos szennyezésekre vonatkozó információkat [41-42]. Az Amerikai
Gyógyszerkönyv VRK vizsgálatot javasol, ha az egyedi cikkely nem ír elő másik
tisztaságvizsgálati módszert, ilyenkor az általános fejezetben megadott maximum 2,0%
összes, és maximum 0,1% ismeretlen szennyezés jelenléte van megengedve a
hatóanyagban.
15
Az Európai Gyógyszerkönyv ezzel szemben a megnevezett analitikai módszerrel
detektálható szennyezésekre vonatkozóan adja meg a követelményeket. Több cikkelyben
fel is sorolják a lehetséges szennyezéseket. Egyes gyártók anyagában olyan – egyébként
ismert – szennyezés is keletkezik, amely nem szerepel a cikkelyben és így maximum
0,10% a rá vonatkozó követelmény.
A végtermékek minőségét befolyásolja az intermedierek minősége, a reakció
lejátszódásának mértéke. Ezeket a gyártásközi ellenőrző laboratóriumokban ellenőrzik,
ahol a gyors és megbízható módszerek alkalmazása elengedhetetlen.
16
3. KÍSÉRLETI RÉSZ
3.1. Felhasznált eszközök, vegyszerek
A méréseim során használt vegyszerek analitikai tisztaságúak (p.a.) voltak, melyeket
a Merck Kft.-től szereztünk be (E. Merck, Darmstadt, Germany).
A normál kamrás és az OPLC futtatásokhoz alufólia hordozóra felvitt
normálszemcsés (Merck 5554) és finomszemcsés (Merck 5548) szilikagél szorbenst
(20x20 cm Kieselgel 60 F254) használtam. Az OPLC futtatásokat P-OPLC BS 50
rétegkromatográffal végeztem (OPLC-NIT Ltd., Budapest, Hungary). Az OPLC
futtatáshoz szükséges rétegszélezést az OPLC-NIT Ltd. végezte. Minden esetben 300 μl
kiindulási gyors eluenstérfogatot és 50 bar külső nyomást alkalmaztam.
Az OPLC-futtatások esetében használt kloroformot – mind eluensként, mind
mintaoldószerként használva – a következő eljárással mentesítettem az etanoltól: 100 ml
kloroformot 3 x 20 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal rázótölcsérben kiráztam,
majd a kloroformos fázist nátrium-szulfáton szárítottam.
A szorbensek előhívó reagenssel való bepermetezésére motoros, Merck gyártmányú
permetezőt használtam (Merck Art.No. 1.08540). A hevítésüket pedig Camag sütőlapon
(TLC Plate Heater III) (Camag, Muttenz, Switzerland) végeztem.
A kromatogramok dokumentálására Camag VideoStore 2 készüléket használtam, a
videodenzitometriás értékelésre pedig a Camag VideoScan szoftvert.
3.2. Módszerleírások
3.2.1. Az előhívási kísérletekhez használt módszerek
A szteroid-eleggyel végzett előhívási kísérletekhez a vizsgált szteroidok 0,02%-os
koncentrációjú kloroformos oldatát használtam modellelegyként, amelyből 5–5 μl-t vittem
fel finomszemcsés szilikagél szorbensre (Merck 5548) 5 mm-es sávokban. P-OPLC BS 50
típusú túlnyomásos rétegkromatográffal végeztem a kromatográfiás kifejlesztéseket.
Eluensként ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) arányú elegyét használtam,
amely a modellelegy valamennyi komponensére megfelelő elválást adott. A külső ún.
párnanyomás 50 bar volt, 400 μl/min eluensáramlási sebességgel, 300 μl gyors kiindulási
és 4200 μl kifejlesztési eluenstérfogattal dolgoztam.
Videodokumentációs rendszerként a Camag VideoStore 2 berendezését használtam. A 366
nm-es fényben rögzített képek esetében UV-2A, valamint CC-30Y jelzésű színszűrőt
17
használtam. A videodenzitometriás értékeléshez a VideoScan szoftver nyújtott segítséget,
amelynek beépített szűrői közül a zöldet használtam.
A különböző előhívó reagensekkel végzett kimutatási határ vizsgálatokhoz különböző
koncentrációjú oldatokból 2-5 μl térfogatból vittem fel a szorbensre 0,1 μg és 0,0075 μg
tartományban különböző mennyiségű anyagot.
3.2.2. A szteroidsor kísérleteihez használt kromatográfiás módszerek
Dienoléter (3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién)
VRK
Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554)
Futtató: ciklohexán – aceton 7+3 (V/V)
Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm (Desaga GmbH., Heidelberg, Germany)
Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,
Switzerland
Futási távolság: 14 cm
Előhívás, értékelés: bepermetezés 10% kénsavas etanollal, hevítés 120°C-on kb. 2
percig (Camag TLC Plate Heater III), 366 nm-es ultraibolya fényben értékelve.
OPLC
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Futtató: ciklohexán – butil-acetát – etil-acetát 8+1+1 (V/V)
Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: 8000 μl, túlfuttatás
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
Előhívás, értékelés: bepermetezés 10% kénsavas etanollal, hevítés 120°C-on kb. 2
percig, 366 nm-es UV-fényben értékelve
Ösztradiol-metiléter-acetát (3-metoxi-ösztradiol-17β-acetát)
OPLC
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Futtató: toluol – kloroform – ciklohexán – butil-acetát 55+3+40+2 (V/V)
Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: 4000 – 8000 μl
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
18
Előhívás, értékelés: 254 nm-en, majd 10%-os kénsavas etanolos bepermetezést és
120°C-on 2 percig történő hevítést követően 366 nm-es UV- és látható fehér fényben
értékelve
GC
Készülék: Focus gázkromatográf (Thermo Separation Products, San Jose, CA, USA)
Oszlop: Restek Rtx-5 30 m x 0,25 mm x 0,5 μm fused silica (Restek Corporation,
Bellefonte, PA, USA), 240°C
Injektor és detektor hőmérséklet: 280°C
Detektor: lángionizációs (FID)
Vivőgáz: hélium
Áramlási sebesség: 20 cm/sec
Split-arány: 1:50
Oldószer: diklórmetán – metanol 1+1 (V/V)
Injektált térfogat: 1 μl
Molon (metil-szeko-olon)
OPLC
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Futtató: toluol – etil-acetát – butil-acetát 8+1+1 (V/V)
Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: 8000 μl, túlfuttatás
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
Előhívás, értékelés: 366 nm-es ultraibolya fényben az anyag saját fluoreszcenciáját
vizsgálva, majd 10% kénsavas etanollal való bepermetezést és 120°C-on 2 percig való
hevítést követően, 366 nm-es fényben
HPLC 1.
Shimadzu LC-2010A típusú folyadékkromatográfon (Shimadzu Corporation, Tokyo,
Japan)
Oszlop: Wakosil C18 RS, 150 x 4,6 mm, 5 μm (SGE Analytical Science, Melbourne,
Australia)
Eluens: metanol – víz – ecetsav 70+30+0,3 (V/V)
Áramlási sebesség: 1 ml/min
Injektálási térfogat: 10 μl
19
Detektálás: λ=265 nm
HPLC 2.
Oszlop: Wakosil C18 RS, 150 x 4,6 mm, 5 μm
Eluens: metanol – víz – ecetsav 40+60+0,3 (V/V)
Áramlási sebesség: 1 ml/min
Hőmérséklet: 35°C
Injektálási térfogat: 10 μl
Detektálás: λ=265 nm
3.2.3. A teljesítményjellemzők meghatározásához használt módszerek
Etinil-ösztradiol (19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trién-20-in-3,17-diol)
VRK
Mintaoldószer: kloroform – metanol 9+1 (V/V)
Felvitt oldattérfogat: 1-5 μl
Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554)
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
Futtató: toluol – etanol 9+1 (V/V)
Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm
Futási távolság: 15 cm
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
OPLC
Mintaoldószer: kloroform
Felvitt oldattérfogat: 1-5 μl
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)
Eluens áramlási sebesség: 300 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: 7000 μl
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
HPLC
20
Hewlett Packard 1100 típusú készüléken (Hewlett Packard Gmbh. Waldbronn,
Germany)
Oszlop: Symmetry C18, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 25 °C-ra termosztálva (Waters
Corporation, Milford, MA, USA)
Eluens: víz – acetonitril – metanol 50+30+20 (V/V)
Mintaoldószer: az eluens, koncentráció: 3 mg/ml
Áramlási sebesség: 1 ml/min
Injektálási térfogat: 30 μl
Analízisidő: 40 min
Detektálás: λ=280 nm
Noretiszteron (17β-hidroxi-19-nor-17α-pregn-4-én-20-in-3-on)
VRK
Mintaoldószer: kloroform
Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl
Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554)
Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel
Futtató: kloroform – aceton 9+1 (V/V)
Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm
Futási távolság: 15 cm
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
OPLC
Mintaoldószer: kloroform
Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
Futtató: 1. n-hexán
2. butil-acetát – kloroform 85+15 (V/V)
Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: 1. 4000 μl és megállás nélkül:
2. 4000 μl
21
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
HPLC
Spectra Focus típusú folyadékkromatográfon (Thermo Separation Products, San Jose,
CA, USA)
Oszlop: Hypersil 120 ODS 3 μm, 125 x 4 mm (Agilent Technologies, Waldbronn,
Germany)
Eluens: A, acetonitril – víz 5+95 (V/V)
B, acetonitril – víz 95+5 (V/V)
hatlépcsős gradiens program
Mintaoldószer: acetonitril – víz 4+6 (V/V)
Áramlási sebesség: 1,0 ml/min
Injektálási térfogat: 25 μl
Analízisidő: 60 + 10 min
Detektálás: λ=242 nm
Nandrolon (17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on)
VRK
Mintaoldószer: kloroform
Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl
Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554)
Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel
Futtató: n-hexán – etil-acetát 1+2 (V/V)
Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm
Futási távolság: 15 cm
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
OPLC
Mintaoldószer: kloroform
Felvitt oldattérfogat: 1 – 2,5 μl
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
22
Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 50+25+25 (V/V)
Eluens áramlási sebessége: 300 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: többszörös kifejlesztés, közben 5 – 5 perc szárítás
szobahőmérsékletű levegőárammal
1. 2000 μl
2. 3000 μl
3. 4000 μl
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
HPLC
Hewlett Packard 1100 típusú folyadékkromatográf (Hewlett Packard Gmbh.
Waldbronn, Germany)
Oszlop: Eclipse XDB C18 150 x 3.0 mm, 3.5 μm (Agilent Tecnologies, Waldbronn,
Germany)
Eluens: gradiens program
idő (min) víz (%) acetonitril (%) metanol (%)
0 75 10 15
40 59 26 15
80 4 56 40
81 75 10 15
90 75 10 15
Mintaoldószer: acetonitril – víz 1+8 (V/V)
Áramlási sebesség: 0,5 ml/min
Injektálási térfogat: 15 μl
Analízisidő: 90 min
Detektálás: λ1=210 és λ2=225 nm
GC
Carlo Erba Mega II. készüléken (Carlo Erba, Milan, Italy)
Oszlop: Supelco 30 m x 0,25 mm x 1,0 μm film MDN-5S (Supelco, Bellefonte, PA,
USA), 270°C
Injektor és detektor hőmérséklet: 300°C
Detektor: lángionizációs (FID)
Vivőgáz: hélium
23
Áramlási sebesség: 20 cm/sec
Split-arány: 1:50
Oldószer: kloroform – metanol 1+1 (V/V)
Injektált térfogat: 1 μl
Gesztodén (13-etil-17-hidroxi-18,19-dinor-17α-pregna-4,15-dién-20-in-3-on)
OPLC
Mintaoldószer: kloroform
Felvitt oldattérfogat: 2-5 μl
Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)
Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel
Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)
Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min
Kifejlesztési eluenstérfogat: 6500 μl
Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces
hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan
HPLC
Shimadzu LC20A típusú folyadékkromatográf (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan)
Oszlop: YMC-ODS-AQ C18 250x4.6 mm, 5μm (YMC Co., Kyoto, Japan)
Oszloptermosztálás: 30°C
Eluens: gradiens program
A-komponens: acetonitril – víz 30+70 (V/V)
B-komponens: acetonitril – víz 95+5 (V/V)
Idő (min) A-komponens
(%)
B-komponens
(%)
0 85 15
60 45 55
61 85 15
68 85 15
Áramlási sebesség: 1,0 ml/min
Injektálási térfogat: 20 μl
Analízisidő: 68 min
Detektálás: λ=210 nm
24
4. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS
4.1. Vizsgált szteroidok
A szteroidváz sajátos szerkezetéből adódóan a különböző intermediereknél és
végtermékeknél találkozhatunk tipikus szennyezésekkel (5. ábra). A 3-keto-Δ4 szerkezetű
szteroidok esetében (R1: =O) általánosan jellemző az izoméria miatt melléktermékként
kialakuló Δ5(10)-származék, amelyben a 4-5 helyzetű szénatomok közötti kettős kötés az 5-
10 pozícióba kerül. Ez a szennyezés a főkomponensnél általában kevésbé poláris
tulajdonságú, ezért szilikagél szorbensen végezve az elválasztást 1,0-nál nagyobb relatív
RF-értéken helyezkedik el a főkomponenshez viszonyítva. Szintén gyakori a telített A-
gyűrűvel rendelkező komponens, az 5α-4,5-dihidro-származék, amelynek igen csekély az
UV-elnyelése, ezért a gyógyszeriparban jellemzően használt UV-detektorral ellátott
HPLC-készülékekkel nem vagy csak igen alacsony érzékenységgel detektálható. Gyakori
még a 8-as és 14-es szénatomok között kialakuló kettős kötésű származék (Δ8(14)),
amelynek UV-elnyelése a több kettős kötés miatt jelentős. Ezen lehetséges szennyezések
szerkezete egymástól és a főkomponenstől csak kis mértékben különbözik. Elválasztásuk
kritikus lehet. Bomlástermékként leggyakrabban 6-os α- és β-helyzetű hidroxi-származék
(R2: -OH), ill. 6-keto-származék (R2: =O) keletkezhet. Ezek a főkomponensnél polárisabb
szennyezésekként általában erősebben kötődnek az állófázishoz, a főkomponensnél
alacsonyabb RF-értékük van.
2
3
45 6 7
8910
11 13
14 15
1617
CH3
R1
R2
R3R4
1
12
A B
C D
5. ábra. A szteroidváz
Az eddigiekben említetteken kívül természetesen az egyes anyagokra jellemző
egyedi szennyezésekkel is találkozhatunk.
Az allilösztrenol nem a 3-keto szerkezetű szteroidok közé tartozik (R1: -H), ezért a
jellemző bomlástermékei nem a 6-os-, hanem a 3-as helyzetben szubsztituált származékok
(R1: -OH vagy =O, R2: -H).
25
Az 1. táblázat ismert szennyezésprofillal rendelkező szteroid hatóanyagok néhány
jellegzetes szennyezését foglalja össze.
1. táblázat. Szteroid hatóanyagok jellegzetes szennyezései
6-OH 6-keto Δ8(14) Δ5(10) 4,5-dihidro tájékoztató relatív RF-értékek * 0,0 – 0,3 0,4 – 0,8 0,9 – 1,2 1,3 – 1,5 1,0 – 1,6
Etinil-ösztradiol + + Δ9(11) - - Noretiszteron + + - - - Allilösztrenol 3-OH 3-keto + - + * az adott főkomponensre vonatkoztatva
A szteroidok szintézisében igyekeztem megtalálni azokat a reakciókat, amelyek
során a jellemző analóg szennyezések keletkeznek.
A szintézisút elágazásainál találhatunk ún. kulcsintermediereket, amelyek több
végtermék előállításának is intermedierjei. Az egyik ilyen anyag a nandrolon, belőle
állítják elő a nandrolon-dekanoátot, az allilösztrenolt, a noretiszteront és ennek
származékait.
4.1.1. Nandrolon
A nandrolon (17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on) tipikus szennyezéseiről Görög és
munkatársai számoltak be [43-44]. Vizsgálatára többféle kromatográfiás módszert
használtunk. Ezekről a módszerekről a teljesítményjellemzők összehasonlításával
foglalkozó fejezetben számolok be részletesen. A fent felsoroltakon kívül jellemző
szennyezése az ösztradiol-metiléter, amelynek A-gyűrűje az ösztradiolhoz hasonlóan
aromás szerkezetű. Lehetséges szennyezése még a dienoléter, amely a nandrolon
szintézisének utolsó intermedierje, önmagában is egy kulcsintermedier.
A dienoléter szintézisekor keletkező, vagy már meglévő enoléter típusú
szennyezések a dienoléterrel együtt a savas hidrolízis hatására átalakulnak 3-keto
szerkezetű vegyületté. Vagyis a nandrolon szennyezéseinek prekurzorait megtaláljuk a
dienoléter szennyezései között (ld. 6. ábra).
26
CH3OH
H
OH3C
H
H
CH3OH
H
H
H
O
HH+
dienoléter nandrolon
3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién 17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on
H+
CH3OH
H
H
H
O
H
H
CH3OH
HH
HH
HO
H3C
telített dienoléter telített nandrolon
3-metoxi-17β-hidroxi-ösztr-2-én 17β-hidroxi-ösztrán-3-on
CH3OH
H
OH3C
CH3OH
H
O
HH+
Δ8(14)-dienoléter Δ8(14)-nandrolon 3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5,8(14)-trién 17β-hidroxi-ösztra-4,8(14)-dién
6. ábra. A nandrolon és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei
4.1.2. Dienoléter
A dienoléter (3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién) vizsgálatára szintén több
kromatográfiás módszert használtunk [45]. A VRK módszerrel csak az utolsó intermedier
mennyiségét lehet ellenőrizni (7. ábra). GC-vel az enoléter-szerkezetű komponensek csak
savas hidrolízist követően, 3-keto-formában mérhetőek. A technikára jellemző magas
hőmérsékletű mérési körülmények között a nandrolon kismértékű bomlása következik be
(8. ábra) [44]. Az általam kidolgozott OPLC-eljárással viszont a dienoléter minden ismert
szennyezése szelektíven értékelhető (7. ábra).
27
12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13
VRK
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
OPLC
Felvitel:
1 0,2 μg ösztradiol-metiléter 2 0,2 μg telített dienoléter 3 0,2 μg Δ8(14)-dienoléter 4 0,2 μg telített dimetilketál 5 0,2 μg dienoléter 6 0,2 μg összes szennyezés 7 25 μg krist. dienoléter és 0,1 μg összes szennyezés 8 25 μg krist. dienoléter 9 50 μg krist. dienoléter 10 25 μg nyers dienoléter 11 50 μg nyers dienoléter 12 oldószer
7. ábra. A dienoléter VRK- és OPLC-módszerrel a specifikusság ellenőrzésére készített
kromatogramja
28
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 min
mV
olt
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1 2
3
4
5 6
1 3-dezoxo-nandrolon 2 5α-4,5-dihidro-nandrolon 3 nandrolon Δ5-izomer 4 nandrolon Δ5(10)-izomer 5 Δ8(14)-nandrolon 6 ösztradiol-metiléter 7 nandrolon
7
bomlástermékek
8. ábra. A dienoléter nandrolonná történt átalakítás után készített GC kromatogramja
A dienoléter savas hidrolízisekor az ösztradiol-metiléter nem alakul át, változatlan
formában és mennyiségben találjuk meg a nandrolonban. Ez a vegyület a szintézis előző
lépéséből ered az ösztradiol-metiléter-acetáton végrehajtott Birch-redukcióból. Ekkor
cseppfolyós ammóniás közegben fém nátriummal végzik a redukálást, közben az aromás
A-gyűrű változatlan formában marad és különböző mértékben redukálódott
melléktermékek keletkeznek [43].
4.1.3. Ösztradiol-metiléter-acetát
Az ösztradiol-metiléter-acetátot (3-metoxi-ösztradiol-17β-acetát, ÖDME-acetát)
egy olyan 4-lépéses szintézissel állítják elő molonból (metil-szeko-olonból), amelyben a
köztes intermediereket nem izolálják. A szintézis lépései: acilezés, gyűrűzárás, katalitikus,
valamint ionos redukció (9. ábra).
29
OCH3
CH3
OH
O
molon metil-szeko-olon
→ O
CH3
CH3
O
O
CH3
O
1
→
OCH3
CH3
OCH3
O
2
gyűrűzárás acilezés
→ O
CH3
CH3
O
H
CH3
O
3
→O
CH3
CH3
O
HH
H
CH3
O
ÖDME-acetát
redukció redukció
9. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát előállításának lépései
A reakció lépéseit GC-vel és OPLC-vel követtük nyomon. A 9. ábrán 2-vel és 3-
mal jelölt intermedierek, valamint az ÖDME-acetát csak egy-egy kettős kötés meglétében
különböznek egymástól. GC-vel a 2-es és 3-as intermedierek nem váltak el egymástól (10.
ábra). OPLC-vel viszont legnehezebbnek az ÖDME-acetát és a 3-as intermedier
elválasztása bizonyult. Ezt finomszemcsés (HPTLC) szilikagél szorbensen, jelentős
túlfuttatás segítségével sikerült megoldani. Az RF-értékük azonban még így is
meglehetősen közelinek bizonyult, eltérő UV-elnyelésük miatt 254 nm-en és kénsavas
előhívást követően látható fényben különböző színük miatt mégis jól elkülöníthetők és
értékelhetők (11. és 13. ábra). A 2-es és 3-as intermedierek eltérő hullámhosszon mutatott
maximális UV-elnyelése miatt lehetőség van a 3-as intermedier spektrofotometriás
értékelésére is pl. 325 nm-en, ahol a 2-es intermediernek már nincs UV-elnyelése (12.
ábra). A reakció során melléktermékként Δ8(14)-ÖDME-acetát keletkezik, amely GC-vel jól
értékelhető. OPLC-vel az elválása a 3-as intermediertől nem tökéletes, de mennyisége
vizuálisan becsülhető az eltérő mértékű UV-elnyelés miatt (13. ábra). A 3-as intermedier
főbb szennyezéseit különböző módszerekkel mérve és értékelve a 2. táblázatban tüntettem
fel az eredményeket.
30
2-es, 3-as intermedier
Δ8(14)-ÖDME-acetát
10. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát GC kromatogramja
a b c d e f g h i j
UV366
3. intermedier
2. intermedier
a b c d e f g h i j
UV366, kénsavas előhívás után
2. intermedier
3. intermedier
Δ8(14)-származék
Felvitel:
a-d 1,0 – 0,1 μg 2. intermedier e-f 10 és 5 μg 3. intermedier g-j 0,1 – 1,0 μg Δ8(14)-származék
11. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát OPLC kromatogramjáról készített felvételek
31
12. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát intermedierjeinek UV-spektruma
2. táblázat. Az ösztradiol-metiléter-acetát intermedierjének és Δ8(14)-származékának
különböző technikákkal mért mennyisége
OPLC GC UV-
spektrofotometria λ=325 nm
2. intermedier 5,5% nem válik el 4,2%
Δ8(14)-származék 4,0% 4,5% szelektíven nem mérhető
4.1.4. Molon
A molon (metil-szeko-olon) → ÖDME-acetát átalakítások redukciós lépésénél a
reakció előrehaladását követtük GC-vel és OPLC-vel [46]. Az előhívást követő 366 nm-es
értékeléssel az ÖDME-acetát szennyezés foltjai értékelhetők. A reakció időbeli
követésekor összevetettük a kétféle kromatogramon a növekvő, ill. csökkenő csúcsokat /
foltokat (13. ábra). A szorbensen levő anyag egyes foltjairól reflexiós UV-spektrumot
vettünk fel.
Az OPLC kromatogramokon látható X-jelű szennyezést a GC-vel kapott csúcsok
között is megtaláltuk (14. ábra) [46]. A tömegspektrometriás azonosítás szerint az ÖDME-
acetáthoz hasonlóan 328-as molekulatömegű anyagról van szó [47]. Végül mágneses
32
magrezonancia spektroszkópiával (NMR) sikerült ténylegesen azonosítani, eszerint ez a
szennyezés a 8β,9α térszerkezetű ÖDME-acetát 8β,9β-izomerje [48].
UV254 előhívás után UV366 és látható fényben
1 2 3 4 5 6 7
ÖDME-acetát
3. intermedier
1 2 3 4 5 6 7
Δ8(14)-ÖDME-acetát ÖDME-
acetát
3. intermedier X
1 2 3 4 5 6 7
X
ÖDME-acetát
3. intermedier
Δ8(14)-ÖDME-
Felvitel:
1 25 μg 3. intermedier reakcióelegy 2 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 0 min. 3 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 10 min. 4 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 20 min. 5 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 30 min. 6 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 70 min. 7 25 μg ÖDME-acetát
13. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát OPLC kromatogramjáról készített felvételek
33
0 min 10 min
0.0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 0.07
19.05
38.02
57.0
75.98
94.95
mVolt
min
3. intermedier
ÖDME-acetát
Δ8(14)-ÖDME-acetát
X
0.0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 min -1.3
23.7
48.8
73.8
98.8
123.8
mVolt
Δ8(14)-ÖDME-acetát
X3. intermedier
ÖDME-acetát
14. ábra. A molon → ÖDME-acetát átalakítás gázkromatogramjai
A többlépcsős szintézis kiindulási anyaga a molon, amit fermentációs úton állítanak
elő metil-szekodionból. A molont HPLC-vel és OPLC-vel vizsgáltuk. A gázkromatográfia
során hő hatására bomlás történik, ezért ezzel a módszerrel nem mérhető (15. ábra) [44].
hőbomlás terméke
molon
15. ábra. A molon gázkromatogramja
34
OPLC-vel különböző minőségű molon tételeket vizsgáltam (16. ábra). A tételek
HPLC-vel történő vizsgálatakor az OPLC kromatogramokon látható egyik jelentős
szennyezést (X-szennyezést) nem tudtuk detektálni. A HPLC-módszer kismértékű
módosításával a szennyezés elválasztása sikerült. A 16. ábrán szereplő „b”-jelű minta régi
és új HPLC-módszerrel készített kromatogramja látható a 17. ábrán.
a b c d e f g h i
kénsavas előhívás után 366 nm
X
16. ábra. Különböző minőségű molon tételek OPLC kromatogramja
1. „régi” módszer
35
X-szennyezés
2. „új” módszer
17. ábra. A „b”-jelű molon minta régi és új HPLC kromatogramja
A molon rendkívül érzékenynek bizonyult a savnyomokra, azonnali bomlása
követezik be sav hatására. Ilyenkor közvetlenül a főfolt alatti, a molonra egyébként is
jellemző szennyezés keletkezik (X), amelyet NMR-rel azonosítottak. A molonban 9-11
helyzetű kettős kötés a bomlástermékben 8-9 helyzetbe került [48].
Az OPLC és HPLC-módszerek együttes alkalmazása lehetővé tette egy addig
ismeretlen szennyezés azonosítását, valamint keletkezési körülményeinek felderítését.
4.1.5. A szteroidszintézissel kapcsolatos eredmények
A végtermékekben is megtalálható szennyezések nagy része a Birch-redukcióból és
az azt követő savas hidrolízisből származik. Ekkor keletkeznek a különböző mértékben
redukált származékok és melléktermékek.
Az 1. táblázatot kiegészítve az intermedierekben is megtalálható tipikus
szennyezésekkel, a következő eredményre jutottam:
36
3. táblázat. Szteroid hatóanyagok és intermedierek jellegzetes szennyezései
6-OH 6-keto Δ8(14) Δ5(10) 4,5-dihidro tájékoztató relatív RF-értékek* 0,0 – 0,3 0,4 – 0,8 0,9 – 1,2 1,3 – 1,5 1,0 – 1,6
Etinil-ösztradiol + + Δ9(11) - - Noretiszteron + + - + + Allilösztrenol 3-OH 3-keto + - +
általam kimutatott komponensek ÖDME-acetát - - + - - Dienoléter ** ** + - + Nandrolon + ** + + + Nandrolon-dekanoát + + + + + * az adott főkomponensre vonatkoztatva ** standard anyag nem állt rendelkezésre az azonosításhoz, RRF alapján azonosítva
37
4.2. Előhívások
A vékonyrétegkromatogramok értékelésére számos lehetőség van. Amennyiben
színtelen anyagokat vizsgálunk, UV-fényben vizuálisan ellenőrizhetjük a mérendő anyag
UV-elnyelését, ill. saját fluoreszcenciáját 254, ill. 366 nm-en. A legelterjedtebben használt
szilikagél szorbensek fluoreszcens adalékot tartalmaznak, így a rövid hullámhosszú, nagy
energiájú ultraibolya fény (254 nm) hatására zöldes színnel fluoreszkáló háttéren az UV-
elnyelést mutató vizsgálandó anyag gyengíti a fluoreszcenciát és sötét foltként jelentkezik.
Amennyiben a mérendő minta nem mutat UV-elnyelést, kémiai reakciókkal segítik elő a
foltok megjelenését. Szteroidok esetében leggyakrabban savas előhívó reagenseket
használnak, amelyeket bepermetezéssel vagy bemerítéssel juttatnak a réteglapra. A reakció
lejátszódásának meggyorsításához szükséges lehet a réteglap bizonyos ideig történő
melegítése. A használt reagenstől függően látható fényben vagy hosszú hullámhosszú (366
nm) UV-fényben értékeljük a kromatogramot. Gyakori savas előhívó reagens a kénsavas
etanol, amelynek segítségével 366 nm-en különböző színnel fluoreszkáló foltokat kapunk.
Az egyes komponensekre vagy tipikus szerkezetekre utaló színek a minőségi
meghatározásban, azonosításban jelentenek segítséget.
Bepermetezéses előhívó technika esetén a vékonyrétegkromatográfiás foltok
egyenletes megjelenítéséhez a reagensoldatot apró cseppekben, aeroszol formában juttatjuk
a réteglapra speciális geometria szerint (Waldi-elrendezés) [49]. A reagens homogén
eloszlása következtében kisebb a zaj, ezáltal jobb kimutatási határ válik lehetővé. A
bepermetezést, bemerítést követő melegítési időt nem mindig definiálják pontosan,
gyakran „amíg a foltok megjelennek” utasítás szerepel a módszerleírásokban.
Szteroidok tisztaságvizsgálatára a gyógyszerkönyvek általában 10-20%-os kénsavas
etanolos oldatot javasolnak [50-51], amennyiben nem tartalmaz ettől eltérő utasítást az
adott anyagra vonatkozó cikkely. Azonossági vizsgálathoz 2-20%-os kénsavas etanollal
történő bepermetezés az előírás. A bepermetezést követő melegítési hőmérsékletet és időt
is definiálják, ez általában 100-120°C-on 5-15 perc melegítést jelent.
Az Európai Gyógyszerkönyv a noretiszteron VRK tisztaságvizsgálatához 20%-os
kénsavas etanolt ír elő majd 100-105°C-on 5 perces melegítést [52]. Az Amerikai
Gyógyszerkönyv pedig 30%-os kénsavas metanolt, valamint 100°C-on 5 percig való
melegítést ír elő [53].
38
Ugyanakkor gyártásközi ellenőrzésnél vagy intermedier-vizsgálatnál a Richter
Gedeon Nyrt. üzemi laboratóriumaiban gyakran alkalmaznak 50%-os kénsavas etanolos
reagenst is előhívószerként. Ez kevésbé egyenletes reagenseloszlást eredményez,
kedvezőtlenül hat az egyes foltok kimutathatóságára.
Zarzycki és munkatársai koleszterinre és rokonvegyületeire a gyógyszerkönyvi
foszformolibdénsavas előhívást optimalizálták. Kísérleteik alapján szilikagél szorbensen
50-60°C-on 20 percig történő melegítés adott maximális intenzitást [54].
Kísérleteim során néhány szteroid alapanyag modellelegye esetében vizsgáltam
meg az optimális előhívási körülményeket. Különböző előhívó reagenseket használtam,
különböző ideig és különböző hőmérsékleteken végeztem a bepermetezést követő
melegítést.
A modellelegy valamennyi szteroidja az ún. metilsor anyagai közül került ki.
Kiválasztásuknál figyelembe vettem, hogy legyen eltérő a mozgékonyságuk az elválasztás
és a jobb összehasonlíthatóság érdekében, valamint legyenek közös oldatból
kromatografálhatók. Vannak közöttük azonos váz mellett a C17-es oldalláncban eltérő
szerkezetűek, vagy az A-gyűrűben és a C3-as szubsztituensében eltérő szerkezetűek. A
következő hét szteroid alapanyagot tanulmányoztam: nandrolon, noretiszteron, etinil-
ösztradiol, noretiszteron-acetát, dienoléter, noretiszteron-önantát és nandrolon-dekanoát. A
szerkezeti képleteik a 19. ábrán láthatók.
39
H3C
HO
C CH
OH
Etinil-ösztradiol
Noretiszteron
C CH
OH
O
H3CC CH
O
O
H3C
CCH3
O
Noretiszteron-acetát
C CH
O
O
H3C
C(CH2
O
)5 CH3
Noretiszteron-önantát
O
OHH3C
NandrolonO
OH3C
Nandrolon-dekanoát
O
OH
H3C
H3C
Dienoléter
CO
(CH2)8 CH3
19. ábra. Az előhívási modellelegyben levő szteroidok szerkezeti képletei
4.2.1. Az előhívási kísérletek során készített kromatogramok
Három különböző minőségű előhívó reagenst használtam: kénsavas,
foszformolibdénsavas és foszforsavas etanolos oldatokat. Összehasonlítottam a különböző
reagensek azonos – 10%-os – koncentrációjú oldatával kapott eredményeket, valamint a
legelterjedtebben használt kénsavas reagens különböző koncentrációjú – 10%, 30% és
50%-os – oldatával kapott eredményeket. A bepermetezést követő melegítést
szabályozható hőmérsékletű kalibrált kerámialapon végeztem a 10%-os kénsavas reagens
esetében 60, 80, 100, 120 és 140 °C-on, 2, 5, 10, 20 valamint 30 percen át. A foszforsavas,
a foszformolibdénsavas, a 30% és az 50%-os kénsavas reagens esetében 80, 100, 120 és
140°C-on 2, 5, 10 és 20 percig végeztem a hevítést.
Az így előhívott kromatogramok képét videodokumentációs rendszer segítségével
rögzítettem, majd a VideoScan szoftver segítségével videodenzitogramokat készítettem. A
kapott csúcsterületeket szintvonalas grafikonokon ábrázoltam a hőmérséklet és az idő
függvényében.
40
A 20-24. ábrákon bemutatásra kerülő, különböző reagenssel előhívott
kromatogramok videofelvételei a jobb összehasonlíthatóság kedvéért valamennyi esetben
120 °C-on 2 percen át történő melegítés után készültek. Mellettük ugyanezen
kromatogramok videodenzitogramjai következnek.
1
2
3
4
5
6
7
RF
1
2 3 4
5
6
7
20. ábra. 10% kénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és
videodenzitogramja
1
2 3
4 5
6
7
RF
1
2
3
4
5
6
7
21. ábra. 10% foszforsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és
videodenzitogramja
41
1
2
3
4 5
6 7
RF
1 2 3 4 5
6
7
22. ábra. 10% foszformolibdénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és
videodenzitogramja
1
2
3
4
5
6
7
RF
1
2
3
4
5
6
7
23. ábra. 30% kénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és
videodenzitogramja
42
1
2
3
4
5
6
7
RF
1
2
3
4
5
6
7
24. ábra. 50% kénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és
videodenzitogramja
4.2.2. Az előhívási kísérletek során mért csúcsterületek
A 4-8. táblázatokban szerepelnek az egyes szteroidokhoz tartozó csúcsterületek
értékei.
43
4. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől
10% kénsavas etanollal való előhívás után
Nandrolon 60°C 80°C 100°C 120°C 140°C
2 perc 0 1370 19100 34200 6800 5 perc 0 9630 20600 24800 5920
10 perc 640 14000 12100 4760 2280 20 perc 1030 19800 10900 0 -* 30 perc 15300 10700 7950 0 -*
Noretiszteron 2 perc 570 6040 9480 14600 0 5 perc 4420 8360 7420 6750 0
10 perc 6740 8750 2140 0 0 20 perc 7860 8220 1200 0 -* 30 perc 6930 2720 0 0 -*
Etinil-ösztradiol 2 perc 2280 36900 37200 16900 1390 5 perc 14900 34300 29100 6880 1260
10 perc 21900 29400 10800 0 0 20 perc 19000 29000 10900 0 -* 30 perc 17200 13500 2710 0 -*
Noretiszteron-acetát 2 perc 3280 8940 18400 24100 0 5 perc 8200 12700 17100 7820 0
10 perc 9440 15400 1910 0 0 20 perc 9220 17800 3790 0 -* 30 perc 8900 6600 0 0 -*
Dienoléter 2 perc 2170 11400 30000 48900 14700 5 perc 3200 16600 29200 26800 14100
10 perc 6480 20400 12800 9760 5550 20 perc 6360 26100 16400 5420 -* 30 perc 7550 18100 12200 1800 -*
Noretiszteron-önantát 2 perc 620 8500 18300 21000 0 5 perc 4580 11600 14000 4440 0
10 perc 8180 15400 1930 0 0 20 perc 7380 17500 3570 0 -* 30 perc 7510 6640 0 0 -*
Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 680 7920 60800 9552 5 perc 0 1500 18800 33800 11100
10 perc 0 4330 17600 5760 1090 20 perc 0 9320 21100 3880 -* 30 perc 0 11600 12600 1120 -*
* értékelhetetlen eredmények a magas hevítési hőmérséklet miatt
44
5. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől
10% foszforsavas etanollal való előhívás után
Nandrolon 80°C 100°C 120°C 140°C 2 perc 0 0 800 1690 5 perc 0 0 1600 4330
10 perc 0 940 2110 4710 20 perc 0 2070 2990 5810
Noretiszteron 2 perc 2620 15300 10900 6930 5 perc 13400 10900 6830 5210
10 perc 15100 8470 7630 2660 20 perc 13400 8200 4670 1030
Etinil-ösztradiol 2 perc 5490 39800 34000 22100 5 perc 36700 36100 18000 7230
10 perc 37200 25400 13800 2100 20 perc 31200 17400 7130 0
Noretiszteron-acetát 2 perc 7450 12600 11300 10200 5 perc 18300 10200 10300 7270
10 perc 12400 9140 10100 5450 20 perc 10400 9750 6840 2610
Dienoléter 2 perc 3470 15700 29900 32300 5 perc 12300 28200 32300 24600
10 perc 21800 32500 28400 14300 20 perc 22700 32400 20200 6590
Noretiszteron-önantát 2 perc 5160 7680 7610 6720 5 perc 9980 6420 6500 4730
10 perc 6600 5510 6930 2720 20 perc 5540 5850 5030 720
Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 0 0 0 5 perc 0 0 850 1770
10 perc 0 0 1200 3060 20 perc 0 0 1640 3150
45
6. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől
10% foszformolibdénsavas etanollal való előhívás után
Nandrolon 80°C 100°C 120°C 140°C 2 perc 640 4250 9320 8990 5 perc 2610 8600 7200 6450
10 perc 3090 4550 5060 3550 20 perc 5740 7250 4340 2720
Noretiszteron 2 perc 2860 9390 9580 8840 5 perc 7120 11400 8770 5870
10 perc 6240 6100 5300 5140 20 perc 9820 6980 5220 3920
Etinil-ösztradiol 2 perc 7580 12400 10900 8780 5 perc 12130 13600 10700 6080
10 perc 7650 7970 5400 5180 20 perc 12660 9410 5980 4290
Noretiszteron-acetát 2 perc 3680 9530 12500 11000 5 perc 7610 11700 11300 9320
10 perc 6680 8540 8110 5980 20 perc 9480 8150 7830 3330
Dienoléter 2 perc 5290 9550 12700 11900 5 perc 7810 11700 11500 9580
10 perc 8040 8240 9330 5370 20 perc 9780 8130 8240 4020
Noretiszteron-önantát 2 perc 2520 7110 9570 8490 5 perc 5450 8080 7730 6480
10 perc 5670 6120 6670 4810 20 perc 8060 6560 6360 4970
Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 1490 3210 2820 5 perc 1240 2400 2870 3720
10 perc 1240 2590 2400 3000 20 perc 2070 3310 3390 2160
46
7. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől
30% kénsavas etanollal való előhívás után
Nandrolon 80°C 100°C 120°C 140°C 2 perc 1260 10500 8860 6880 5 perc 6210 9750 5690 0
10 perc 12900 10600 3200 0 20 perc 14100 7700 1480 0
Noretiszteron 2 perc 4130 2530 640 0 5 perc 3670 1110 0 0
10 perc 5030 0 0 0 20 perc 5140 0 0 0
Etinil-ösztradiol 2 perc 43600 26000 10700 2170 5 perc 34700 18600 1810 0
10 perc 34000 6450 0 0 20 perc 26000 4760 0 0
Noretiszteron-acetát 2 perc 5380 4370 1770 0 5 perc 5990 2810 0 0
10 perc 8060 1160 0 0 20 perc 3820 0 0 0
Dienoléter 2 perc 8930 14800 13900 8400 5 perc 12000 15400 8810 0
10 perc 11400 11100 3610 0 20 perc 13800 9210 0 0
Noretiszteron-önantát 2 perc 4580 3010 1070 0 5 perc 5220 2020 0 0
10 perc 6460 0 0 0 20 perc 2650 0 0 0
Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 4820 6590 2280 5 perc 1810 5820 3680 0
10 perc 3440 6970 780 0 20 perc 7460 5340 0 0
47
48
8. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől
50% kénsavas etanollal való előhívás után
Nandrolon 80°C 100°C 120°C 140°C
2 perc 1880 8380 9840 5370 5 perc 3410 12400 6910 0
10 perc 6020 16100 3420 0 20 perc 10900 13400 0 0
Noretiszteron 2 perc 2070 2610 0 0 5 perc 1850 1910 0 0
10 perc 2420 0 0 0 20 perc 1820 0 0 0
Etinil-ösztradiol 2 perc 34600 32000 13500 2280 5 perc 25500 18200 7560 0
10 perc 25700 6430 1340 0 20 perc 25700 4930 0 0
Noretiszteron-acetát 2 perc 3610 8250 0 0 5 perc 2960 3660 0 0
10 perc 4870 0 0 0 20 perc 5050 0 0 0
Dienoléter 2 perc 9000 20600 13800 7030 5 perc 10500 20200 11800 0
10 perc 14000 12900 6550 0 20 perc 20600 10300 0 0
Noretiszteron-önantát 2 perc 2730 2870 0 0 5 perc 2190 2320 0 0
10 perc 2310 0 0 0 20 perc 3340 0 0 0
Nandrolon-dekanoát 2 perc 720 6680 5330 1500 5 perc 2430 11900 2910 0
10 perc 3030 10100 2560 0 20 perc 9480 5190 0 0
4.2.3. Az előhívási kísérletek során kapott szintvonalas ábrák
A 24-31. ábrák a vizsgált szteroidok jelintenzitásait mutatja szintvonalas
grafikonokon. Először a különböző minőségű, de azonos koncentrációjú reagenssel
előhívott kromatogramokról nyert adatokat hasonlítom össze (25-28. ábra), majd a
különböző koncentrációjú kénsavas reagenssel kapottakat (29-32. ábra).
Nandrolon
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
3500
7000
1,05E4
1,4E4
1,75E4
2,1E4
2,45E4
2,8E4
3,15E4
3,5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
600,0
1200
1800
2400
3000
3600
4200
4800
5400
6000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
Noretiszteron
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
1600
3200
4800
6400
8000
9600
1,12E4
1,28E4
1,44E4
1,6E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
1600
3200
4800
6400
8000
9600
1,12E4
1,28E4
1,44E4
1,6E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
1,1E4
1,2E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
25. ábra. A nandrolon és a noretiszteron különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
49
Etinil-ösztradiol
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
4000
8000
1,2E4
1,6E4
2E4
2,4E4
2,8E4
3,2E4
3,6E4
4E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
4000
8000
1,2E4
1,6E4
2E4
2,4E4
2,8E4
3,2E4
3,6E4
4E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
1,1E4
1,2E4
1,3E4
1,4E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
Noretiszteron-acetát
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
2600
5200
7800
1,04E4
1,3E4
1,56E4
1,82E4
2,08E4
2,34E4
2,6E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
2000
3800
5600
7400
9200
1,1E4
1,28E4
1,46E4
1,64E4
1,82E4
2E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
1,1E4
1,2E4
1,3E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
26. ábra. Az etinil-ösztradiol és a noretiszteron-acetát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
50
Dienoléter
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
5000
10000
1,5E4
2E4
2,5E4
3E4
3,5E4
4E4
4,5E4
5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
3500
7000
1,05E4
1,4E4
1,75E4
2,1E4
2,45E4
2,8E4
3,15E4
3,5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
4000
4900
5800
6700
7600
8500
9400
1,03E4
1,12E4
1,21E4
1,3E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
Noretiszteron-önantát
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
2200
4400
6600
8800
1,1E4
1,32E4
1,54E4
1,76E4
1,98E4
2,2E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
2000
2800
3600
4400
5200
6000
6800
7600
8400
9200
10000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
27. ábra. A dienoléter és a noretiszteron-önantát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
51
Nandrolon-dekanoát
10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
7000
1,4E4
2,1E4
2,8E4
3,5E4
4,2E4
4,9E4
5,6E4
6,3E4
7E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
350,0
700,0
1050
1400
1750
2100
2450
2800
3150
3500
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
0
400,0
800,0
1200
1600
2000
2400
2800
3200
3600
4000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
28. ábra. A nandrolon-dekanoát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
52
Nandrolon
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
3500
7000
1,05E4
1,4E4
1,75E4
2,1E4
2,45E4
2,8E4
3,15E4
3,5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
1600
3200
4800
6400
8000
9600
1,12E4
1,28E4
1,44E4
1,6E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
1800
3600
5400
7200
9000
1,08E4
1,26E4
1,44E4
1,62E4
1,8E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
Noretiszteron
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
1600
3200
4800
6400
8000
9600
1,12E4
1,28E4
1,44E4
1,6E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
550,0
1100
1650
2200
2750
3300
3850
4400
4950
5500
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
280,0
560,0
840,0
1120
1400
1680
1960
2240
2520
2800
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
29. ábra. A nandrolon és a noretiszteron különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
53
Etinil-ösztradiol
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
4000
8000
1,2E4
1,6E4
2E4
2,4E4
2,8E4
3,2E4
3,6E4
4E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
4500
9000
1,35E4
1,8E4
2,25E4
2,7E4
3,15E4
3,6E4
4,05E4
4,5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
3500
7000
1,05E4
1,4E4
1,75E4
2,1E4
2,45E4
2,8E4
3,15E4
3,5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
Noretiszteron-acetát
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
2600
5200
7800
1,04E4
1,3E4
1,56E4
1,82E4
2,08E4
2,34E4
2,6E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
900,0
1800
2700
3600
4500
5400
6300
7200
8100
9000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
900,0
1800
2700
3600
4500
5400
6300
7200
8100
9000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
30. ábra. Az etinil-ösztradiol és a noretiszteron-acetát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
54
Dienoléter
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
5000
10000
1,5E4
2E4
2,5E4
3E4
3,5E4
4E4
4,5E4
5E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
1600
3200
4800
6400
8000
9600
1,12E4
1,28E4
1,44E4
1,6E4
hőmérséklet (oC)idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
0
2200
4400
6600
8800
1,1E4
1,32E4
1,54E4
1,76E4
1,98E4
2,2E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
Noretiszteron-önantát
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
2200
4400
6600
8800
1,1E4
1,32E4
1,54E4
1,76E4
1,98E4
2,2E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
700,0
1400
2100
2800
3500
4200
4900
5600
6300
7000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
350,0
700,0
1050
1400
1750
2100
2450
2800
3150
3500
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
31. ábra. A dienoléter és a noretiszteron-önantát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
55
56
60 70 80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
25
30
0
7000
1,4E4
2,1E4
2,8E4
3,5E4
4,2E4
4,9E4
5,6E4
6,3E4
7E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 140
0
5
10
15
20
0
800,0
1600
2400
3200
4000
4800
5600
6400
7200
8000
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
80 90 100 110 120 130 1400
5
10
15
20
0
1200
2400
3600
4800
6000
7200
8400
9600
1,08E4
1,2E4
hőmérséklet (oC)
idő
(min
)
10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH
Nandrolon-dekanoát
32. ábra. A nandrolon-dekanoát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása
4.2.4. Az előhívási kísérletek értékelése
Kénsavas reagens használata megkönnyíti a 366 nm-es UV-fényben történő
vizuális értékelést az egyes szteroidokra jellemző színnel fluoreszkáló foltok miatt. A
legtöbb vizsgált anyag esetében 120°C-on 2 percig történő melegítés bizonyult
megfelelőnek. Az etinil-ösztradiol azonban ilyen magas hőmérsékleten már megégett, 80-
100°C-on 2-5 percig tartva kaptam a maximális csúcsterületeket. Több anyag esetében is
kedvezőnek bizonyult az alacsonyabb hőmérsékleten (80-100°C) hosszabb ideig (10-20
perc) történő melegítés. A foltok intenzitása így ugyan valamivel kisebb, mint a maximális
intenzitást mutató 120°C-nál, de ez bizonyult a robosztusabb előhívási módnak. A
nandrolon és a nandrolon-dekanoát esetében azonban az alacsonyabb hőmérséklet nem volt
kedvező. Az elvégzendő feladattól függően rutin eljárásokhoz a megbízható teljesítményű,
robosztusabb 80°C-on 10-20 percen át tartó melegítést javaslom. Nagyobb érzékenységet
kívánó egyedi esetekben pedig a 120°C 2 perces kombinációt.
Foszforsavas reagens használatakor szintén eltérő színnel fluoreszkáló foltokat
kaptam, azonban a színek kevésbé jellemzőek, mint a kénsavas reagens esetében. Ebben az
esetben az értékelést az könnyíti meg, hogy sokkal egyenletesebb a réteglapok háttere,
kevésbé zajos videodenzitogramokat kaptam. Itt nagyobb eltérést tapasztaltam az egyes
szteroidok esetében. A legalacsonyabb hőmérséklet (80°C) a noretiszteron származékainak
kedvezett (-acetátnak és -önantátnak), míg magának a noretiszteronnak kissé magasabb
hőfok a kedvező (100°C). Az etinil-ösztradiol esetében 100°C-on 2-5 percig történő
melegítés az optimális. A nandrolon és a nandrolon-dekanoát pedig 140°C-on 10-20 perc
után jelent meg maximális intenzitással. A dienoléter esetében közel azonos területeket
kaptam 140°C 2 perc, 120°C 5 perc és 100°C 15-20 perc kombinációkban. A nandrolon és
származéka kivételével a foszforsavas előhívásnál még jelentősebb az a tendencia, hogy az
alacsonyabb hőmérséklet és a hosszabb melegítési idő is ugyanolyan kedvező lehet, mint a
magasabb hőmérsékleten rövidebb ideig történő melegítés.
Foszformolibdénsavas reagens használatakor látható fehér fényben történik az
értékelés. Ilyenkor a sárgás hátterű réteglapokon kékes színnel jelennek meg a foltok.
Valamennyi szteroid azonos színnel jelenik meg, amely a minőségi értékelésben nem jelent
kiegészítő információt, azonban a vizuális becslést és a videodenzitometriát megkönnyíti,
hiszen a foltok csupán méretükben és intenzitásukban különböznek egymástól. A kénsavas
reagenshez hasonlóan itt is a 120°C-on 2 percig történő melegítés bizonyult ideálisnak
leggyakrabban. Az etinil-ösztradiol esetében ezúttal is ennél alacsonyabb hőmérséklet volt
57
a kedvező (100°C 5 perc). A nandrolon és származéka pedig magasabb hőmérsékleten
(140°C-on) mutatott maximális intenzitást, akárcsak a foszforsavas reagens használatakor.
Ennek az előhívószernek a használata kívánja a legnagyobb gyakorlatot, bepermetezés
közben ugyanis könnyen megfolyhat a szorbensen, ezáltal a foltok is elmozdulnak.
Nehezebb egyenletesen és reprodukálhatóan bepermetezni a szorbenst a
foszformolibdénsavas előhívóval, mint a többi reagenssel.
A 30%, ill. az 50%-os kénsavas előhívó reagensek használatakor általános
tapasztalat, hogy kevésbé egyenletesen vihetők fel a szorbensre a nagyobb viszkozitású
oldatokból. Az alacsonyabb hőmérséklet több esetben bizonyult kedvezőbbnek, mint a
10%-os kénsavas reagensnél. A két legmagasabb hőmérsékletet (120-140°C-ot) igénylő
szteroid – a nandrolon és a nandrolon-dekanoát – esetében is elegendő a 100°C-on
hosszabb ideig történő melegítés.
A három különböző minőségű, de azonos koncentrációjú előhívó reagens esetében
120°C 2 perc kombináció bizonyult az általánosan használható előhívási körüménynek a
vizsgált szteroidokra. Nem minden esetben kaptam itt a legintenzívebb foltokat, azonban a
nandrolon-dekanoát kivételével valamennyi anyag detektálható volt ilyen körülmények
között. Ennek pontosítására meghatároztam a kimutatási határokat.
Csökkenő mennyiségű anyagot vittem fel a szorbensre és a még legkisebb látható
mennyiséget fogadtam el kimutatási határként. Ebben az esetben is a szteroidok közös
oldataiból dolgoztam. A kromatográfiás kifejlesztést követően a szorbenseket
bepermeteztem egy-egy előhívó reagenssel és 120°-on 2 percig történő melegítést
követően ellenőriztem az egyes szteroidokra jellemző kimutatási határ-értékeket,
amelyeket a 9. táblázatban foglaltam össze.
58
9. táblázat. Különböző szteroidok kimutatási határ-értékei eltérő minőségű reagenssel
történő előhívást követően
10% kénsavas etanol 10% foszforsavas etanol
10% foszformolibdén-
savas etanol Nandrolon 0,0075 μg 0,075 μg 0,0075 μg
Noretiszteron 0,01 μg 0,01 μg 0,0075 μg
Etinil-ösztradiol 0,01 μg 0,025 μg 0,075 μg Noretiszteron-acetát 0,025 μg 0,025 μg 0,01 μg
Dienoléter 0,01 μg 0,025 μg 0,025 μg Noretiszteron-önantát 0,025 μg 0,025 μg 0,025 μg
Nandrolon-dekanoát 0,01 μg > 0,1 μg 0,075 μg
A kénsavas és a foszformolibdénsavas előhívó reagens használata érzékenyebb
kimutatást tett lehetővé, mint a foszforsavasé. A várakozásoknak megfelelően a nandrolon-
dekanoát, amely foszforsavas előhívással csak 140 °C-os hőmérsékletnél jelent meg, a
kimutatási határ vizsgálatának hőmérsékletén nem volt kimutatható a vizsgált mennyiségek
egyikében sem.
Összegzésként elmondható, hogy a 10%-os kénsavas és foszformolibdénsavas
előhívás általánosságban azonos érzékenységűnek bizonyult a vizsgált szteroidokra.
Szerkezeti sajátosságok miatt adódtak különbségek. Amíg a kénsavas előhívásnál jellemző
színük miatt könnyebb az egyes komponensek azonosítása, addig a foszformolibdénsavas
reagensnél a mennyiségi értékelés egyszerűbb.
A savas előhívások optimális körülményei kis mértékben változnak az
anyagtípustól függően. A planárkromatográfiás eljárások optimalizálásakor ezért nem csak
az eluens összetételét, hanem az előhívási körülményeket is optimalizálni kell.
59
4.3. Teljesítményjellemzők
Több szteroid anyag esetében különböző kromatográfiás rendszerek teljesítményét
hasonlítottam össze. A vizsgált anyagokra meglévő hagyományosan VRK
tisztaságvizsgálati módszerek mellett a nagyobb pontosságú meghatározásokat lehetővé
tevő OPLC és HPLC módszerek elválasztóképességét (Rs), elméleti tányérszámát (N),
valamint elméleti tányérmagasság-értékeit (H) vizsgáltam. Azokban az esetekben, amikor
gradiens programmal végzett elválasztásról volt szó, csak az elválasztóképességet
számoltam ki.
VRK és OPLC esetében a következő számolási képleteket alkalmaztam:
layer
xapp,F z
zR = (4.1)
ref
xF z
zRR = (4.2)
2
2x
w)z(16
N = (4.3)
x
2
z16wH = (4.4)
21
1x2xs ww
)zz(2R+−
= (4.5)
ahol zx: a komponens migrációs távolsága a felviteli helytől mérve
zlayer: a felvitel helye és az eluenskivezető csatorna közötti távolság
zref: a referencia anyag migrációs távolsága a felviteli helytől mérve
N: elméleti tányérszám
w: a csúcs alapvonalszélessége
H: elméleti tányérmagasság
Rs: csúcsfelbontás
HPLC esetében használt számolási képletek [55]:
2
2tR
545,5Nω
= (4.6)
NLH = (4.7)
60
12
1t2ts
RR18,1R
ωω +−
= (4.8)
ahol Rt: retenciós idő
ω: a csúcs félértékszélessége
L: oszlophossz
Az összehasonlítás alapját képező szteroidok az ún. „metilsor” anyagai közül
kerültek ki: noretiszteron, etinil-ösztradiol és nandrolon, a gesztodén azonban az
„etilsorba” tartozik.
A különböző módszerekkel végzett vizsgálatok kísérleti körülményei a 3.
fejezetben találhatók.
4.3.1. Etinil-ösztradiol
Az etinil-ösztradiol esetében az Európai és az Angol Gyógyszerkönyv 2000-ig
VRK tisztaságvizsgálati módszert írt elő, amelynek szelektivitása és pontossága elmarad a
kívánt szinttől (34-35. ábra). A lehetséges egyedi szennyezések közül az ösztronra (33.
ábra), mint utolsó intermedierre állapítottak meg limitet. Az Európai Gyógyszerkönyvhöz
2000-ben készült kiegészítés már HPLC tisztaságvizsgálati módszert írt elő, ezt az Angol
Gyógyszerkönyv is átvette, majd 2002-től szigorították a limiteket, amelyek jelenleg is
érvényesek. Az Amerikai Gyógyszerkönyv nem írja elő az etinil-ösztradiol
tisztaságvizsgálatát. Laboratóriumunkban kidolgozásra és validálásra került egy OPLC
módszer, amely lehetővé teszi az etinil-ösztradiol szennyezéseinek egymástól és a
főkomponenstől való szelektív elválasztását (36-37. ábra). Ugyanakkor egy HPLC
módszer is kidolgozásra került, amely a Gyár hivatalos előírása szerint az etinil-ösztradiol
tisztaságvizsgálatára jelenleg is alkalmazott módszer (38. ábra).
Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot, a
kapott kromatogramokat ábrázoltam, a számolt teljesítményjellemzőket táblázatokban
tüntettem fel (10-12. táblázat) [56-57]. Valamennyi esetben egységes számozással jelöltem
a különböző vegyületeket.
61
CH3
HO
OH
CH
H H
H
CH3
HO
OH
CH
H H
H
OH etinil-ösztradiol 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol
CH3
HO
OH
CH
H H
H
OH
CH3
HO
OH
CH
H H
H
O 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 6-keto-etinil-ösztradiol
HO
H H
H
CH3OH
O
HOH H
H
CH3OH
CH
ösztradiol 16-keto-etinil-ösztradiol
HO
H
H
CH3OH
CH
HO
H H
OHH
CH3
CH
Δ9(11)-etinil-ösztradiol 17-epi-etinil-ösztradiol
ösztron HO
O
H H
H
CH3
33. ábra. Az etinil-ösztradiol és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei
62
2 3 5 8 9 1 4 a b 7 6
Felvitelek:
1 0,5 μg 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 2 0,5 μg 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 3 0,5 μg 6-keto-etinil-ösztradiol 4 0,5 μg ösztradiol 5 0,1 μg 16-keto-etinil-ösztradiol 6 0,5 μg Δ9(11)-etinil-ösztradiol 7 100 μg etinil-ösztradiol (EÖD) 8 0,5 μg 17-epi-etinil-ösztradiol 9 0,5 μg ösztron a 0,1 μg 16-keto-EÖD + 0,5 μg EÖD +
+ 0,5-0,5 μg minden egyéb szennyezésből b 100 μg etinil-ösztradiol + 0,5-0,5 μg minden szennyezésből
34. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK kromatogramjáról készített fotó
RF
35. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram
10. táblázat. A VRK technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők
RF RRF N H (μm) Rs
1 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,24 0,57 1024 70,3 - 2 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,26 0,62 1079 72,3 0,65 4 ösztradiol 0,36 0,86 2535 42,2 3,22
3,5,6,7
6-keto-EÖD, 16-keto-EÖD, Δ9(11)-EÖD, EÖD 0,42 1,00 940 134,5 1,56
8 17-epi-etinil-ösztradiol 0,46 1,10 2330 57,0 0,45 9 Ösztron 0,50 1,19 2742 52,5 1,02 =H 71,5 μm
63
Felvitelek:
1 0,5 μg 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol
2 1 3 5 b 7 a 8 6 9 4
2 0,5 μg 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 3 0,5 μg 6-keto-etinil-ösztradiol 4 0,5 μg ösztradiol 5 0,1 μg 16-keto-etinil-ösztradiol 6 0,5 μg Δ9(11)-etinil-ösztradiol 7 100 μg etinil-ösztradiol (EÖD) 8 0,5 μg 17-epi-etinil-ösztradiol 9 0,5 μg ösztron a 0,1 μg 16-keto-EÖD + 0,5 μg EÖD +
0,5-0,5 μg minden egyéb szennyezésből b 100 μg etinil-ösztradiol + 0,5-0,5 μg minden
szennyezésből
36. ábra. Az etinil-ösztradiol OPLC kromatogramjáról készített fotó
RF
37. ábra. Az etinil-ösztradiol OPLC kromatogramjáról készített videodenzitogram
11. táblázat. Az OPLC technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők
RF,app RRF N H (μm) Rs
1 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0.03 0.05 64 62.5
2 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0.05 0.09 154 50.4 1.67
3 6-keto-etinil-ösztradiol 0.22 0.38 784 40.2 6.79 4 Ösztradiol 0.36 0.62 4807 10.8 5.47 5 16-keto-etinil-ösztradiol 0.42 0.72 3782 16.3 2.71 6 Δ9(11)-etinil-ösztradiol 0.53 0.91 5929 13.0 3.88 7 etinil-ösztradiol 0.58 1.00 9773 8.9 2.53 8 17-epi-etinil-ösztradiol 0.67 1.16 10050 10.0 3.67 9 Ösztron 0.72 1.24 11664 9.3 1.94 H 24,6 μm =
64
38. ábra. Az etinil-ösztradiol HPLC kromatogramja
min0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
10
20
30
40
VWD1 A, Wavelength=280 nm (EED0128\037-0901.D)
4.5
49
4.7
37
5.3
85
7.3
02
9.1
73
14.
905
16.
072
17.
226 1
8.51
6
20.
580
26.
219
9 7
6
4 5 1
2
3 8
12. táblázat. A HPLC technikával végzett vizsgálatból származó teljesítményjellemzők
ω [min] Rt [min] N H [μm] Rs
2 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,1133 4,544 8919 28,0 -
1 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,1222 5,379 10744 23,3 4,18
3 6-keto-etinil-ösztradiol 0,1731 7,288 9829 25,4 7,63 5 16-keto-etinil-ösztradiol 0,1879 9,151 13152 19,0 6,09 4 ösztradiol 0,2768 14,878 16020 15,6 14,54 6 Δ9(11)-etinil-ösztradiol 0,3025 16,033 15577 16,0 2,35 7 etinil-ösztradiol 0,3384 18,472 16522 15,1 4,49 9 Ösztron 0,3644 20,531 17602 14,2 3,46 8 17-epi-etinil-ösztradiol 0,4602 26,149 17903 14,0 8,04 H 19,0 μm =
A 39. ábrán összehasonlítottam néhány tétel tisztaságvizsgálatához szükséges
analízisidőt a különböző módszerek esetében. Mindegyik módszernél a vizsgálandó
tételekből két bemérés – azaz két minta – készült, a HPLC-nél mintánként két injektálás
történt. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és
rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást.
Az OPLC és a VRK-módszer esetében egy szorbensen 3 tétel párhuzamos mintái
vizsgálhatók a standard anyagok mellett egyidejűleg. Sávos mintafelvitellel egy 20x20 cm-
es méretű réteglapra körülbelül 12 minta vihető fel. Egy kromatogram OPLC-vel történő
65
kifejlesztéséhez szükséges idő 30 perc, a VRK-hoz kb. 60 perc, míg a HPLC-hez 400-600
perc volt a vizsgálandó tételek számának függvényében.
0
100
200
300
400
500
600
idő
(min
)
1 2 3vizsgált tételek
TLCOPLCHPLC
39. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK, OPLC, ill. HPLC technikával végzett
tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében
Értékelés
A három különböző kromatográfiás módszer közül egyedül a VRK nem bizonyult minden
szennyezésre specifikusnak. Az egyes komponensek elválasztása a HPLC-nél bizonyult a
legjobbnak, de OPLC-vel is 1,5 feletti Rs-értéket kaptam minden egyes vizsgált
anyagpárra. Ezzel a két módszerrel specifikusan értékelhetők az etinil-ösztradiol lehetséges
szennyezései. Az OPLC módszer vizuális becslésen alapuló félkvantitatív módszer, a
HPLC pedig kvantitatív eredményeket szolgáltat, ezért a pontosság tekintetében különbség
van a két módszer között.
A tányérmagassági értékekből látható, hogy hatékonyságában az OPLC és a HPLC
módszer összemérhető, a VRK azonban elmarad ettől a szinttől. A tányérmagasság
átlagértékére ( H ) HPLC-nél 19 μm-t, OPLC-nél 25 μm-t kaptam, míg VRK-nál 72 μm-t,
ez megfelel az irodalomban található adatoknak [13].
A módszerek időigényében jelentős különbség van. Míg a VRK és OPLC kromatogramok
kifejlesztéséhez szükséges idő nem több, mint egy óra, addig a HPLC-nél három tétel
vizsgálata esetén már 10 óra a szükséges idő.
Az etinil-ösztradiol alapanyag tisztaságvizsgálatára az OPLC és HPLC módszer egyaránt
alkalmas. OPLC-vel gyors limit-tesztet, HPLC-vel nagy pontosságot igénylő vizsgálatokat
végezhetünk.
66
4.3.2. Noretiszteron
A noretiszteron esetében mind az Európai, mind az Amerikai Gyógyszerkönyv
VRK tisztaságvizsgálati módszert írt elő (41-42. ábra). Laboratóriumunkban kidolgoztunk
és validáltunk egy félkvantitatív OPLC tisztaságvizsgálati módszert, amelyet azóta a
hatóanyag minőségének ellenőrzésére használunk (43-44. ábra) [58]. Egy HPLC módszer
is kidolgozásra került (45. ábra). Mind az OPLC, mind a HPLC módszerrel specifikusan
vizsgálhatók a noretiszteron szennyezései, amelyek a 40. ábrán láthatók. A Norcolut
tabletta tisztaságvizsgálatához, amelynek hatóanyaga a noretiszteron, adaptáltuk az OPLC
módszert [59]. A továbbiakban a készítmény minőségellenőrzésére ezt a módszert
használjuk. 2006-ban lépett életbe az Európai Gyógyszerkönyvben egy új HPLC-módszer
az alapanyag tisztaságának ellenőrzésére [60].
67
O
H H
H H
H3COH
C CH
OHO
H H
H H
H3COH
C CH
noretiszteron 6β-hidroxi-noretiszteron
O
H H
H H
H3COH
C CH
OH O
H
H H
H3COH
C CH
OH
6α-hidroxi-noretiszteron 10β-hidroxi-noretiszteron
O
H
H H
H3COH
C CH
H
OO
H
H H
H3C
H
O
Δ4-nordion 6-keto-noretiszteron
O
H
H H
H3C
H
C CHOH
17-epi-noretiszteron
40. ábra. A noretiszteron és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei
68
Felvitelek:
4 7 5 3 2 1 a b c d 6
1 0,5 μg 6β-hidroxi-noretiszteron 2 0,5 μg 6α-hidroxi-noretiszteron 3 0,5 μg 10β-hidroxi-noretiszteron 4 0,5 μg Δ4-nordion 5 0,5 μg 6-keto-noretiszteron 6 50 μg noretiszteron 7 0,5 μg 17-epi-noretiszteron a placebo b 0,5-0,5 μg noretiszteron és minden szennyezés c 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából és
0,5-0,5 μg a szennyezésekből d 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából
41. ábra. A noretiszteron és Norcolut tabletta VRK kromatogramjáról készített felvétel
1-3
5 6-7
4
42. ábra. A noretiszteron VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram
Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot,
táblázatokban tüntettem fel a számolt teljesítményjellemzőket. (13-15. táblázat).
13. táblázat. A VRK technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők
RRF Rs H (μm) 1 6β-hidroxi-noretiszteron 0,19 - 344 2 6α-hidroxi-noretiszteron 0,19 0,0 344 3 10β-hidroxi-noretiszteron 0,19 0,0 344 5 6-keto-noretiszteron 0,81 4,73 91 6 Noretiszteron 1,00 1,33 69 7 17-epi-noretiszteron 1,00 0,0 69 4 Δ4-nordion 1,28 1,64 106 =H 195 μm
69
Felvitelek:
1 0,5 μg 6β-hidroxi-noretiszteron
4 7 5 3 2 1 a b c d e
2 0,5 μg 6α-hidroxi-noretiszteron 3 0,5 μg 10β-hidroxi-noretiszteron 4 0,5 μg Δ4-nordion 5 0,5 μg 6-keto-noretiszteron 6 50 μg noretiszteron 7 0,5 μg 17-epi-noretiszteron a placebo b 0,5-0,5 μg noretiszteron és minden szennyezés c 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából és
0,5-0,5 μg a szennyezésekből d 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából e 50 μg noretiszteron
43. ábra. A noretiszteron és Norcolut tabletta OPLC kromatogramjáról készített felvétel
1 2
3
4 5 6 7
44. ábra. A noretiszteron OPLC kromatogramjáról készített videodenzitogram
14. táblázat. Az OPLC technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők
RRF Rs H (μm) 1 6β-hidroxi-noretiszteron 0.32 - 55 2 6α-hidroxi-noretiszteron 0.36 0.48 44 3 10β-hidroxi-noretiszteron 0.47 2.69 45 4 Δ4-nordion 0.72 6.58 14 5 6-keto-noretiszteron 0.83 2.00 37 6 Noretiszteron 1.00 2.87 18 7 17-epi-noretiszteron 1.13 3.12 14 =H 32 μm
70
2 1 3
5 4
6 7
HPLC
45. ábra. A noretiszteron HPLC kromatogramja
15. táblázat. A HPLC technikával végzett vizsgálatból származó teljesítményjellemzők
RRt Rs
2 6α-hidroxi-noretiszteron 0.20 - 1 6β-hidroxi-noretiszteron 0.22 1.84 3 10β-hidroxi-noretiszteron 0.30 5.63 5 6-keto-noretiszteron 0.73 23.27 4 Δ4-nordion 0.92 6.94 6 Noretiszteron 1.00 2.98 7 17-epi-noretiszteron 1.45 16.25
Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért
tányérmagasság értékeket (H) ebben az esetben nem adtam meg.
A 46. ábrán mutatom be a noretiszteron tisztaságvizsgálatához szükséges
analízisidő alakulását különböző módszerekkel végezve az elemzést. A VRK és OPLC
esetében a mintafelvitel idejét is figyelembe vettem. Mindegyik módszernél a vizsgálandó
tételekből két bemérés – azaz két minta – készült, a HPLC-nél mintánként két injektálás
történt. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és
rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást.
71
0
200
400
600
800
1000
1200
idő
(min
)1 2 3
vizsgált tételek
TLCOPLCHPLC
46. ábra. A noretiszteron VRK, OPLC, ill. HPLC technikával végzett
tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében
Az OPLC-módszerhez szükséges idő 30-40 perc, a VRK-hoz kb. 60 perc, míg a
HPLC-hez 600-1200 perc volt az analízisidő a vizsgálandó tételek számának
függvényében.
Értékelés
A VRK módszer szelektivitása nem megfelelő a noretiszteron hatóanyag és a Norcolut
tabletta tisztaságának vizsgálatára. A fotódokumentációs rendszer a kékes színű foltokat
kis mértékben torzítja, intenzívebbnek tűnnek a foltok a videofelvételen vizuális becsléssel,
mint a kromatogramon. Ennek következtében – jóllehet vizuálisan elkülöníthetők
egymástól a 6-hidroxi-noretiszteron szennyezések az OPLC módszerrel készített
kromatogramon – videodenzitometriás értékeléssel Rs=0,5-ös csúcsfelbontás értéket
kaptunk. A HPLC módszerrel valamennyi komponenspár esetében megfelelő – 1,5-nél
nagyobb – elválasztást tapasztaltunk. A két utóbbi módszer különböző értékelési módját
figyelembe véve a szelektivitásuk megfelelőnek mondható.
Hatékonyság tekintetében az OPLC és a HPLC módszer összemérhető. Az átlagos
tányérmagasság OPLC-nél 32 μm, a VRK-módszer a 195 μm-es átlagos tányérmagassági
értékkel jóval kevésbé hatékony.
A módszerek időigényét figyelembe véve VRK-val körülbelül egy óra alatt elkészíthetjük
a kromatogramot, OPLC-vel ennél is kevesebb időre (20 perc) van szükség, azonban
HPLC-vel 10-20 órára is szükség van az eredményhez.
72
A gyors limit tesztnek tekinthető OPLC módszernél valamennyi komponens mennyisége
megbecsülhető vizuálisan, a kvantitatív HPLC módszer pedig pontos meghatározást tesz
lehetővé.
4.3.3. Nandrolon
Több szteroid hatóanyag szintézisénél is kulcsintermedier a nandrolon.
Tisztaságvizsgálatára többféle módszer is használható [44].
Lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képleteit a 47. ábrán mutatom be.
CH3
HH
OH
HH
O
CH3
HH
OH
HH
OH
nandrolon 5α-4,5-dihidro-nandrolon CH3
H
OH
HH
O
CH3
H
OH
H
O nandrolon-Δ5(10)-izomer Δ8(14)-nandrolon
CH3
H
OH
HH
OCH3
CH3
HH
OH
HH
O
OH dienoléter 6β-hidroxi-nandrolon
CH3
H
OH
HH
OCH3
ösztradiol-metiléter
47. ábra. A nandrolon és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei
A nandrolon tisztaságvizsgálatának egyik lehetősége egy VRK-módszer, amely azonban
nem minden szennyezésre specifikus (48-49. ábra). Az általam kidolgozott OPLC-
módszerrel valamennyi szennyezés szelektíven értékelhető (50-51. ábra).
73
Egy HPLC tisztaságvizsgálati módszer is kidolgozásra került. A szennyezések eltérő UV-
elnyelése miatt két hullámhosszon történik az értékelés, 210 és 225 nm-en. A 4,5-dihidro-
nandrolon azonban UV-detektorral nem mutatható ki (52. ábra).
Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot,
táblázatokban tüntettem fel a számolt teljesítményjellemzőket. (16-18. táblázat).
2 3 4 5 6 7 a b 1 c
Felvitelek:
2 0,2 μg 5α-4,5-dihidro-nandrolon 3 0,2 μg nandrolon-Δ5(10)-izomer 4 0,2 μg Δ8(14)-nandrolon 5 0,2 μg dienoléter 6 0,2 μg 6β-hidroxi-nandrolon 7 0,2 μg ösztradiol-metiléter a 0,2 – 0,2 μg nandrolon és minden szennyezés b 50 μg nandrolon és 0,2 μg minden szennyezés 1 50 μg nandrolon c oldószer 48. ábra. A nandrolon VRK kromatogramjáról készített felvétel
RF
49. ábra. A nandrolon VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram 16. táblázat. A VRK módszer teljesítményjellemzői
RF RRF Rs
6 6β-hidroxi-nandrolon 0,10 0,36 -
1, 4 Nandrolon, Δ8(14)-nandrolon 0,28 1,00 2,3
2, 3 4,5-dihidro-nandrolon, Δ5(10)-izomer 0,37 1,32 1,0
5, 7 dienoléter, ösztradiol-metiléter 0,47 1,68 1,1
74
Felvitelek:
2 3 4 5 6 7 a b c d
2 0,2 μg 5α-4,5-dihidro-nandrolon 3 0,2 μg nandrolon-Δ5(10)-izomer 4 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon 5 0,2 μg dienoléter 6 0,2 μg 6β-hidroxi-nandrolon 7 0,2 μg ösztradiol-metiléter a 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon és 0,2-0,2 μg
nandrolon és összes egyéb szennyezés b 25 μg nandrolon, 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon
és 0,2-0,2 μg összes egyéb szennyezés c 25 μg nandrolon d 50 μg nandrolon
50. ábra. A nandrolon OPLC kromatogramjáról készített felvétel
RF
51. ábra. Az OPLC kromatogramról készített videodenzitogram
17. táblázat. Az OPLC-módszer teljesítményjellemzői
RF RRF Rs
6 6β-hidroxi-nandrolon 0,04 0,15 -
1 Nandrolon 0,27 1,00 8,7
4 Δ8(14)-nandrolon 0,33 1,22 2,2
2 4,5-dihidro-nandrolon 0,43 1,59 5,2
3 Δ5(10)-izomer 0,46 1,70 0,8
7 ösztradiol-metiléter 0,63 2,33 5,8
5 dienoléter 0,72 2,67 1,5
75
λ = 210 nm
min0 10 20 30 40 50 60 70 80
mAU
-20
0
20
40
60
80
100
120
*DAD1 A, Sig=210,8 Ref=off (NAND1109\022-0301.D - NAND1109\021-0401.D)
16.
855 3
8.84
9
41.
732
50.
550
63.
370
68.
571
6
4
13
7
5
λ = 225 nm
min0 10 20 30 40 50 60 70 80
mAU
-20
0
20
40
60
80
100
120
*DAD1 B, Sig=225,16 Ref=off (NAND1109\022-0301.D - NAND1109\021-0401.D)
16.
855
38.
849
41.
732
50.
550
63.
370
68.
571
6 41
3
7
5
52. ábra. A nandrolon HPLC kromatogramja 210 és 225 nm-en
18. táblázat. A HPLC módszer teljesítményjellemzői 225 nm-en értékelve
Rt (perc) RRt Rs
6 6β-hidroxi-nandrolon 16,9 0,40 -
4 Δ8(14)-nandrolon 38,8 0,93 54,1
1 Nandrolon 41,7 1,00 6,1
3 Δ5(10)-izomer 50,5 1,21 15,0
7 ösztradiol-metiléter 63,4 1,52 25,9
5 Dienoléter 68,6 1,64 11,8
76
Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért
tányérmagassági értékeket (H) ebben az esetben sem adtam meg.
A nandrolon tisztaságának mérésére gázkromatográfiás módszerrel is van lehetőség
[44]. A 4,5-dihidro-nandrolon pontosan mérhető ezzel a technikával, azonban maga a
nandrolon kismértékű bomlást szenved az injektorban és Δ5(10)-izomer keletkezik. Az 53.
ábrán mutatom be a GC kromatogramot, amelyen az egyes csúcsok számozása megegyezik
az előző nandrolon kromatogramokon látható számozással.
2
3
5
7
4 1
6
53. ábra. A nandrolon gázkromatogramja [44]
Az 54. ábrán mutatom be a különböző technikákkal végzett vizsgálatok
analízisidejének alakulását a vizsgált tételek számának függvényében. Valamennyi
módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés készült. A számolásnál figyelembe
vettem a szükséges standard és rendszerelkalmassági felviteleket, illetve injektálásokat.
77
Az OPLC és VRK módszerek esetében a kromatogram kifejlesztésének időigénye
általában 30-60 perc volt, a GC-módszernél 200-250 perc, azonban a HPLC-módszernél
1200 percig tartott három tétel vizsgálata.
0
200
400
600
800
1000
1200
idő
(min
)
1 2 3
vizsgált tételek
TLCOPLCHPLCGC
54. ábra. A nandrolon VRK, OPLC, HPLC és GC technikával végzett
tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében
Értékelés
A nandrolon tisztaságvizsgálatára a VRK módszer szelektivitása nem megfelelő. Az OPLC
módszer esetében a 4,5-dihidro-nandrolon és a nandrolon-Δ5(10)-izomer esetében a
csúcsfelbontás nem éri el az 1,5-ös értéket, azonban kénsavas előhívás után eltérő színnel
fluoreszkálnak 366 nm-es fénnyel megvilágítva, így vizuálisan értékelhetők. A HPLC
módszernél a 4,5-dihidro-nandrolon szennyezés, amely a nandrolon egyik fő szennyezése,
nem mérhető, mert nem mutat UV-elnyelést. A többi lehetséges szennyezés pedig 2
hullámhosszon mérendő a pontos mennyiségi értékelés érdekében. A GC-módszerrel a 4,5-
dihidro-nandrolon pontosan mérhető, azonban a főkomponens az injektorban kis
mértékben bomlik a nandrolon Δ5(10)-izomerjére.
Valamennyi szennyezés egyidejű értékeléséhez a félkvantitatív OPLC módszer bizonyult
alkalmasnak. A HPLC módszer a 4,5-dihidro-nandrolon kivételével, amely nem mérhető
UV-detektálással, a szennyezések pontos kvantitatív meghatározását tette lehetővé.
Az időigény szempontjából a VRK és OPLC-módszerekkel végzett vizsgálathoz körülbelül
egy órára volt szükség, a HPLC tisztaságvizsgálathoz azonban 15-20 óra kellett.
78
4.3.4. Gesztodén
Az ún. „etilsor” anyagai közül a gesztodén különböző vizsgálati módszereire végeztünk
összehasonlítást.
A gesztodén nem szerepel az Amerikai és az Európai Gyógyszerkönyvben. A gesztodén és
lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei az 55. ábrán láthatók. Hivatalos
tisztaságvizsgálati módszere OPLC technikával történik (56-57. ábra). A folyamatosan
bevezetésre kerülő hatósági szabályozás miatt a tisztaságvizsgálati követelmények egyre
szigorúbbá válnak [38-40]. Az elvárt pontosságot a vizuális értékelésű OPLC-módszer
nem tudja kellő biztonsággal teljesíteni, ezért kidolgoztak egy HPLC-tisztaságvizsgálati
módszert (58. ábra) [61]. Jelenleg mindkét módszer érvényben van. A következőkben az
elválasztóképességüket hasonlítom össze [62].
79
HH
O
OH
H
CHCH3
H
HH
O
OH
H
CHCH3
H
gesztodén Δ6-gesztodén
HH
O
OH
H
CHCH3
H
OH
HH
OH
OH
H
CHCH3
O 6β-OH-gesztodén aromás 6-keto-gesztodén
HH
O
OH
H
CHCH3
H
OO
CH3
HH
OH
H
CHCH3
O
O 15α-acetoxi-levonorgesztrel gesztodén ketál izomerek
HH
O
OH
H
CHCH3
H
OCH3
5-metoxi-gesztodén
55. ábra. A gesztodén és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei
80
Felvitelek:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0,2 μg Δ6-gesztodén 2 0,2 μg gesztodén ketál izomerek 3 0,2 μg 5-metoxi-gesztodén 4 0,2 μg 15α-acetoxi-levonorgesztrel 5 0,2 μg aromás 6-keto-gesztodén 6 0,2 μg 6β-hidroxi-gesztodén 7 0,2-0,2 μg gesztodén és összes szennyezése 8 100 μg gesztodén és 0,2 μg összes szennyezése 9 100 μg gesztodén 10 oldószervak
56. ábra. A gesztodén OPLC kromatogramjáról készített felvétel
3 9
1 2
6 5 4
RF
57. ábra. Az OPLC kromatogramról készített videodenzitogram
81
2b minta + standard-elegy
minta
oldószer
standard-elegy
2a 3
9
1 4
5
6
mAbs
58. ábra. A gesztodén HPLC kromatogramja [62]
19. táblázat. A gesztodén OPLC és HPLC tisztaságvizsgálati módszer
elválasztóképességének összehasonlítása
OPLC HPLC
RF Rs Rs
0,05 6β-OH-gesztodén 6β-OH-gesztodén 6
0,17 15α-acetoxi-levonorg. 2,3 18,4 aromás 6-keto-gesztodén 5
4 0,22 aromás 6-keto-gesztodén 2,8 15,8 15α-acetoxi-levonorg.
0,37 Δ6-gesztodén 3,7 11,2 6,7-didehidro-gesztodén 1
0,41 Gesztodén 1,4 4,8 Gesztodén 9
0,59 5-metoxi-gesztodén 5,1 12,7 5-metoxi-gesztodén 3
0,75 gesztodén ketál 1. 4,2 28,6 gesztodén ketál 1. 2a
0,80 gesztodén ketál 2. 1,3 2,4 gesztodén ketál 2. 2b
Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért
tányérmagasság értékeket (H) ebben az esetben sem adtam meg.
82
Az 59. ábrán összehasonlítottam néhány tétel tisztaságvizsgálatához szükséges
analízisidőt a kétféle módszerhez. Az OPLC esetében a mintafelvitel idejét is figyelembe
vettem. Mindegyik módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés – azaz két minta –
készült. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és
rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást.
0100200300400500600700800900
1000
idő
(min
)
1 2 3
vizsgált tételek
OPLCHPLC
59. ábra. A gesztodén OPLC és HPLC technikával végzett tisztaságvizsgálatának
időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében
Míg OPLC-vel 30-40 perc a kromatogram elkészítésének ideje, addig HPLC-vel
egyetlen injektálás analízisideje 68 perc, három tétel vizsgálatához szükséges idő 950 perc.
Értékelés
Mindkét módszer megfelelő szelektivitást mutat. A HPLC-módszerrel pontosabb értékelés
válik lehetővé. Azonban ebben az esetben csak 210 nm-en történő detektálással lehet
valamennyi ismert szennyezést kimutatni.
A HPLC-módszer időigénye körülbelül húszszorosa az OPLC-módszerének.
A gyors, közelítő eredményekhez célszerű az OPLC-módszert használni.
4.3.5. A teljesítményjellemzőkkel kapcsolatos kísérletek eredménye
Mind a négy vizsgált szteroid esetében levonhatjuk azt a következtetést, hogy a VRK
módszerek nem kellően szelektívek az adott anyag és lehetséges szennyezéseinek
elválasztására. Az OPLC és a HPLC módszerek szelektivitás tekintetében alkalmasnak
bizonyultak.
83
Hatékonyságukat összehasonlítva a VRK-módszereknél általában 100 μm körüli átlagos
tányérmagasság-értéket kaptam. Ezzel szemben a másik két módszerrel összemérhető
értékeket kaptam: OPLC-vel 20-40 μm, míg HPLC-vel 10-30 μm volt az átlagos
tányérmagasság az etinil-ösztradiol esetében, ahol izokratikus körülmények között történt a
meghatározás. A többi esetben a HPLC-módszernél gradiens programmal történt az
elválasztás, ezért nem adtam meg tányérmagasság értékeket.
Az elválasztás hatékonysága a VRK-módszernél bizonyult a legkevésbé kedvezőnek, az
OPLC és a HPLC esetében pedig hasonló volt.
Az időigény tekintetében az OPLC-módszerek nem haladták meg a 30-40 percet, a VRK-
módszerek körülbelül egy órát igényeltek. A HPLC-módszerek esetében a kromatogramok
elkészítésének ideje általában 10-20-szor tovább tartott, mint az OPLC-nél.
Gyors, limit tesztnek megfelelő eredményt kaphatunk OPLC-módszerekkel az egyes
szennyezések mennyiségére. HPLC-vel pedig – bár jóval hosszabb idő alatt – pontos,
kvantitatív meghatározás válik lehetővé.
84
4.4. Szűrővizsgálatok
Új vegyületek vizsgálatakor célszerű először VRK-technikával „feltérképezni” a
lehetséges szennyezéseket, mivel ezzel a módszerrel valamennyi komponens a szorbensen
marad és detektálható. A technika kisebb hatékonysága és elválasztóképessége miatt
azonban elképzelhető, hogy a felviteli helyen marad a komponensek egy része, vagy nem
válnak el egymástól, ill. a főfolttól. A polaritás függvényében sávokra bonthatjuk a
kromatogramot és ezeket a különböző polaritású sávokat a nagyobb hatékonyságú és
elválasztóképességű OPLC-technikával tovább bonthatjuk. A rétegkromatográfiás
módszerek specifikusságát növelheti a különböző előhívószerek alkalmazhatósága. HPLC-
vel pedig további komponenseket választhatunk el. A háromféle technika kiegészíti
egymást eltérő szelektivitásuk és detektálási lehetőségeik miatt.
Az OPLC-technika gyorsasága, nagy hatékonysága és jó elválasztóképessége miatt
különösen alkalmas szűrővizsgálatokra, vagy előfuttatások végzésére a HPLC
tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozásánál. Az eluensek összeállításához az oldószerek
széles választéka áll rendelkezésre, hiszen az off-line detektálás következtében a közeli
UV-tartományban elnyelő oldószerek is használhatók. Általánosan elmondható, hogy egy
új szteroid anyagot célszerű különböző, széles polaritási tartományt átfogó futtató
elegyekkel megvizsgálni, hogy valamennyi szennyezését detektálni tudjuk. Az
eluenskomponensek megválasztásánál azonban ügyelnünk kell arra, hogy a kívánt
eluenserősséget olyan komponensek elegyítésével érjük el, amelyek együttes használata
nem okoz frontképződést.
A norszteroidok vizsgálatánál ciklohexánt, illetve toluolt észterekkel és / vagy
kloroformmal kevertem. Észterként leggyakrabban etil-, ill. butil-acetátot alkalmaztam.
Apoláris komponensek szilikagél szorbensen történő elválasztására alkalmas
elegyek:
ciklohexán – butil-acetát 9+1 (V/V)
ciklohexán – butil-acetát – kloroform 90+12+2 (V/V)
ciklohexán – butil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)
Poláris komponensek elválasztására alkalmas eluenselegyek:
toluol – etil-acetát – kloroform 5+1+4 (V/V)
ciklohexán – etil-acetát – kloroform 2+2+1 (V/V)
ciklohexán – butil-acetát 1+1 (V/V)
85
Amennyiben meggyőződtünk róla, hogy nincs irreverzibilis adszorbció, élhetünk a
többszörös kifejlesztés lehetőségével [63]. A többszörös kifejlesztésnél a foltok
tömörödnek, ez megkönnyíti az értékelést. Túlfuttatást is alkalmazhatunk, ha már
meggyőződtünk arról, hogy nincs olyan apoláris komponens, amely „lefutna” a
szorbensről.
4.4.1. Szűrővizsgálatok lehetséges szennyezésekre
A szteroid-szennyezőket sorbaállíthatjuk polaritásuk függvényében. Ekkor a
szteroidváz különböző szubsztituenseit kell elsősorban figyelembe venni. A leginkább
poláris szubsztituensek a hidroxi- valamint a keto-csoportok. Kisebb polaritást adnak a
molekulának az éterkötésben résztvevő oxigének, valamint az észterkötést tartalmazó
csoportok. Legkevésbé polárisak az oxigént nem tartalmazó szubsztituensek.
Gyakran azonos konstitúció mellett térszerkezetbeli különbség van a szennyezés-
molekulák között. A szteroidvázhoz 17-es pozícióban kapcsolódó hidroxi-csoport és etinil-
csoport esetében az etinil-csoport jellemzően α-helyzetű. Az epimer párja, a β-helyzetű
etinil-csoport általában kevésbé poláris.
A norszteroidok tipikus szennyezéseinek polaritási sora:
6β-OH > 6α-OH > 10-OH > 6-keto > Δ8(14) ≥ Δ9(11) ≥ Δ6 ≥ főkomponens
RRF*: 0,0-0,3 0,2-0,5 0,8-1,0 1,0
főkomponens > 17-epi > telített A-gyűrűs származék > Δ5 > Δ5(10) > biszetinil** > dezoxo**
RRF*: 1,0 1,0-1,2 1,1-1,6 5,0-7,0 * az adott főkomponensre vonatkoztatva ** az „etilsor” anyagaira jellemző szennyezések
A szennyezések azonosítását segítheti, hogy savas előhívás után különböző színnel
fluoreszkáló foltokként jelennek meg a szorbensen 366 nm-es fénnyel megvilágítva. A
szteroidvázon többlet hidroxi-csoportot tartalmazó komponensek kénsavas előhívást
követően élénk kék színűek. Ha az adott szennyező-molekulák további kettős kötést
tartalmaznak (Δ8(14)-származékok) gyakran intenzív zöldes színnel fluoreszkálnak.
86
4.4.2. Szűrővizsgálatok főkomponensekre
Különböző szteroid végtermékek elválasztására (60. ábra) alkalmaztam az eltérő
erősségű eluenseket OPLC-technikával. A végtermékek kiválasztása a gyártóhely alapján
történt. A cél olyan szűrőrendszer kidolgozása volt, amelynek segítségével az egy üzemben
gyártott szteroidok esetleges keresztszennyezései gyorsan kimutathatók és azonosításuk
egyszerűbbé válik. Az így szerzett tapasztalatok azonban felhasználhatók a hasonló
szerkezetű új szteroid molekulák vizsgálatánál is. Az összesen húsz hatóanyagot egymás
mellett, azonos szorbensen kromatografáltam az előzőekben ismertetett különböző
erősségű eluensekkel.
CH3 CH2
OH
H2CH3C OH
CH
O
CH3
CH3O
O
a, allilösztrenol b, dezogesztrel c, drospirenon
CH3
HO
OH
CH
O
CH3O CH3
O
CH
H3C
O
HNO
CH3
CH3NH
O
H
CH3
CH3
CH3
d, etinil-ösztradiol e, etinodiol-diacetát f, finaszterid
O
H3C OH
CH
O
OHH3C
CH
O
CH3O (CH2)8
O
CH3
g, gesztodén h, levonorgesztrel i, nandrolon-dekanoát
O
CH3
CH2
H3COO
CH3
O
HON
H3C OH
CH
O
CH3OH
CH
j, nesztoron k, 17-dezacetil-norgesztimét l, noretiszteron
87
O
CH3
CH
O CH3
O
HON
H3C
CH
O CH3
O
O
OHH3C
CH
m, noretiszteron-acetát n, norgesztimét o, d,l-norgesztrel
O
O
CH3
CH3CH3
OH
HO
CH3OH
p, oxandrolon q, ösztradiol
O
OH3C
N
N+
H3C
H3CCH3
O
OCH3
N N+CH3
Br-
CH3
CH3
Br-
r, pipekurónium bromid
O
CH3
CH3HO OHO
O (CH2)4
O
CH3
O
CH3
CH3
S
OH3C
O
O
s, prednizolon-21-kapronát t, spironolakton
60. ábra. A szűrővizsgálatoknál vizsgált szteroidok szerkezeti képletei
A felvitel minden esetben a 60. ábrán szereplő betűjelzés szerint ABC-sorrendben
történt, valamennyi komponensből 5-5 μg került a szorbensre és a kifejlesztési
eluenstérfogat 4200 μl volt. A különböző erősségű futtatókkal végzett kísérletek
kromatogramjait mutatom be a következő ábrákon (61-64. ábra).
88
254 nm kénsavas előhívás után 366nm
a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t
61. ábra. Közepes erősségű futtató (1.) használata szteroidok elválasztására toluol – etil-acetát – kloroform 5+1+4 (V/V)
62. ábra. Közepes erősségű futtató (2.) használata szteroidok elválasztására
ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)
a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t
kénsavas előhívás után 366nm
kénsavas előhívás után 366nm 254 nm
254 nm
a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t
63. ábra. Nagy polaritású futtató használata szteroidok elválasztására ciklohexán – butil-acetát 1+1 (V/V)
89
kénsavas előhívás után 366nm 254 nm
a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t
64. ábra. Kis polaritású futtató használata szteroidok elválasztására ciklohexán – butil-acetát 9+1 (V/V)
254 nm-es fényben, és kénsavas előhívást követően 366 nm-es fénnyel
megvilágítva végeztem az értékelést. A finaszterid és a pipekurónium-bromid sajátos
szerkezetük miatt ezzel a módszerrel nem voltak detektálhatók, más előhívási technikát
kell használni az értékelésükhöz. Erre a célra a Dragendorff-reagenssel történő előhívás a
megfelelő.
A kapott kromatogramok alapján a vizsgált szteroidokat négy csoportba soroltam:
1. apoláris: allilösztrenol, dezogesztrel, etinodiol-diacetát
2. közepesen poláris: nandrolon-dekanoát, noretiszteron-acetát, etinil-ösztradiol,
norgesztrel, levonorgesztrel, gesztodén
3. poláris: norgesztimét, noretiszteron, 17-dezacetil-norgesztimét,
ösztradiol, nesztoron
4. erősen poláris: drospirenon, oxandrolon, finaszterid, prednizolon-21-
kapronát, spironolakton, pipekurónium-bromid
Az egyes szteroidok azonosításához nyújt segítséget a 20. táblázat, amelyben a
különböző detektálási lehetőségeket, a kénsavas, ill. a Dragendorff-oldattal való előhívás
utáni jellemző színeket tüntettem fel.
90
91
20. táblázat. A szűrővizsgálatba bevont szteroidok kromatográfiás és detektálási
tulajdonságai
UV254kénsavas előhívás után 366
nm Dragendorff polaritási csoport vizsgált szteroid
detektálhatóság szín detektálhatóság (és szín)
1. b, dezogesztrel - + sárgás - 1. a, allilösztrenol - + kékesszürke - 1. e, etinodiol-diacetát - + sárgás -
2. i, nandrolon-dekanoát + + halványkék + (narancs)
2. m, noretiszteron-acetát + + piros + (rózsaszín)
2. o, norgesztrel, h, levonorgesztrel + + piros + (rózsaszín)
2. d, etinil-ösztradiol (+) + narancs - 2. g, gesztodén + + kék + (rózsaszín) 3. n, norgesztimét + + szürkéssárga + (narancs) 3. l, noretiszteron + + piros + (kék) 3. j, nesztoron + + sárgás + (sötétbarna)
3. k, 17-dezacetil-norgesztimét + + szürkéssárga + (narancs)
3. q, ösztradiol (+) + halványzöld - 4. f, finaszterid (+) - - + (narancs) 4. t, spironolakton + ++ sárga + (narancs)
4. s, prednizolon-21-kapronát + + szürkéskék (+) (narancs)
4. p, oxandrolon - + halványkék (+) (narancs) 4. c, drospirenon + (+) kékesszürke + (narancs)
4. r, pipekurónium bromid - - - + (narancs)
- nem detektálható (+) rosszul detektálható + detektálható ++ intenzív jelet ad
A szteroid-hatóanyagok azonosítása a 65. ábrán látható folyamattal valósítható
meg. Az ábrán aláhúzással jelölt végtermékek már elkülöníthetők egymástól, azonban
azonosításukhoz még standard anyag mellett is el kell végezni az utolsó futtatást.
92
Közepes polaritású 1. futtató UV254, kénsavas előhívás UV366
UV254: + UV366: -
UV254: - UV366: +
UV254: + UV366: +
UV254: - UV366: -
Dragendorff: +
finaszterid RF=0,03
allilösztrenol, dezogesztrel,
etinodiol-diacetát, oxandrolon
RF >0,6 oxandrolon RF=0,09 nem
igen
Apoláris futtató etinodiol-diacetát RF=0,32 allilösztrenol RF=0,49 dezogesztrel RF=0,51
RF >0,3 igen
nandrolon-dekanoát RF=0,50 noretiszteron-acetát RF=0,34 nem
Poláris futtató
Dragendorff: +
pipekurónium-bromidRF=0,00
RF >0,6 UV254: (+) UV366: +
etinil-ösztradiolRF=0,70
igen
nem
RF >0,4
igen
Kettős foltot ad?
igen norgesztimét RF, syn=0,43 és RF, anti=0,53 17-dezacetil-norgesztimét RF, syn=0,36 és RF, anti=0,54
nem
Közepes polaritású 2. futtató
ösztradiol RF=0,18 gesztodén RF=0,28 (levo)norgesztrel RF=0,32
nem
UV254: (+) UV366: +
UV254: + UV366: +
drospirenon RF=0,06
spironolakton RF=0,11 prednizolon-21-kapronát RF=0,16 nesztoron RF=0,18 noretiszteron RF=0,30
65. ábra. Folyamatábra a vizsgált 20 szteroid azonosításához
4.4.3. Elővizsgálatok lehetősége készüléktisztításnál
Abban az esetben, ha a szteroid hatóanyagot nem keresztszennyezésként keressük,
hanem azt a készüléktisztításnál mint egykomponensű szennyezőt kell kimutatnunk,
alkalmas lehet az elővizsgálatra a futtatás nélküli foltvizsgálat. A különböző előhívási és
detektálási eljárásokkal kapott jellegzetes színű foltok segítik a gyors azonosítást. A 66.
ábrán mutatom be az így kapott „kromatogramokat”. A felviteli sorrend jelzése megfelel a
60. ábrán szereplő betűjelzésnek.
Előhívás: Dragendorff-reagenssel Detektálás: látható, fehér fényben
Előhívás: kénsavas reagenssel, 120°C, 2 min
Detektálás: 366 nm-en
Előhívás: - Detektálás: 254 nm-en
a b c d e
p q r s t
a b c d e a b c d e
f g h i j f g h i j
k l m n o k l m n o
f g h i j
k l m n o
p q r s t p q r s t
66. ábra. Foltvizsgálat különböző detektálással
A futtatás nélküli felvitelek esetén kimutatási határ vizsgálatot végeztem a húsz
vizsgált szteroidra. Valamennyi szteroidból tíz különböző mennyiséget vittem fel a
szorbensre a 0,5 ng – 10 μg tartományban. Kimutatási határként a legkisebb, vizuálisan
detektálható mennyiséget fogadtam el. A finaszterid és a pipekurónium-bromid esetében
93
Dragendorff-reagenssel hívtam elő a különböző mennyiségű anyagot a szorbensen, a többi
esetben 10% kénsavas etanolt alkalmaztam előhívószerként. A megállapított kimutatási
határértékeket a 21. táblázatban foglaltam össze.
21. táblázat. Kimutatási határértékek futtatás nélküli foltvizsgálatnál
jelölés anyag neve előhívás előtt, UV254
kénsavas előhívással,
UV366
Dragendorff-reagenssel,
4200 K a Allilösztrenol n. d. 5 ng * b Dezogesztrel n. d. 1 ng * c Drospirenon 10 ng 1 ng * d Etinil-ösztradiol 100 ng 1 ng * e Etinodiol-diacetát n. d. 1 ng * f Finaszterid 100 ng n. d. 50 ng g Gesztodén 10 ng 1 ng * h Levonorgesztrel 10 ng 1 ng * i Nandrolon-dekanoát 10 ng 5 ng * j Nesztoron 10 ng 1 ng * k 17-dezacetil-norgesztimét 10 ng 5 ng * l Noretiszteron 50 ng 5 ng * m Noretiszteron-acetát 50 ng 5 ng * n Norgesztimét 10 ng 5 ng * o Norgesztrel 10 ng 5 ng * p Oxandrolon n. d. 5 ng * q Ösztradiol 100 ng 1 ng * r Pipekurónium-bromid n. d. n. d. 10 ng s Prednizolon-21-kapronát 100 ng 5 ng * t Spironolakton 10 ng 0,5 ng *
n. d. nem detektálható * mérés nélkül
A kimutatási határértékek kénsavas előhívással leggyakrabban 1 – 5 ng-nak
bizonyultak. A spironolakton esetében azonban még ennél kisebb mennyiség is
detektálható volt a szorbensen. A Dragendorff-reagenssel előhívott vegyületekre viszont
magasabb volt a kimutatási határérték (10-50 ng).
Fentiek alapján megállapítottam, hogy a „pontkromatogram” rendkívül érzékeny
kimutatást tesz lehetővé, ezért alkalmas készüléktisztítás utáni ellenőrző vizsgálatra.
94
5. ÖSSZEFOGLALÁS
Munkám során a norszteroid-szintézis „metilsorában” keletkező intermedierek
szennyezésprofiljának felderítésével foglalkoztam. Gyors tisztaságvizsgálati eljárásokat
dolgoztam ki túlnyomásos rétegkromatográfiás módszerrel a nandrolon, a dienoléter, az
ösztradiol-metiléter-acetát és a molon (metil-szeko-olon) vizsgálatára. A fenti
intermedierek esetében értékeltem a más kromatográfiás technikával kapott eredményeket
is. A nandrolon két fő szennyezését – az 5α-4,5-dihidro-nandrolont és a nandrolon Δ5(10)-
izomert – csak OPLC-vel sikerült kimutatni egymás mellett. Ez a két közeli szerkezetű
molekula VRK-val nem válaszható el egymástól, ultraibolya detektálású HPLC-vel az 5α-
4,5-dihidro-nandrolon nem mutatható ki, GC-vel megfelelően elválaszthatók, de a
főkomponens a vizsgálat során Δ5(10)-izomerre bomlik, így az eredmény nem megbízható.
A dienoléter esetében az általam kidolgozott OPLC-eljárással minden ismert szennyezés
szelektíven értékelhető, az ösztradiol-metiléter-acetátnál pedig a módszerek kombinációja
vezetett eredményre. A molon esetében OPLC-vel elválasztottam a fő szennyezést a
főkomponenstől, tisztáztam a főszennyezés keletkezési körülményeit, és elősegítettem
annak azonosítását.
Optimalizáltam és összehasonlítottam a szteroidoknál leggyakrabban használt savas
előhívó módszereket. Különböző előhívó reagensek esetében a rövid ideig magasabb
hőmérsékleten történő előhívás érzékenyebb, míg az alacsonyabb hőmérsékleten hosszabb
ideig történő hevítés stabilabb, robosztusabb előhívást eredményez.
Különböző szteroid alapanyagokra kifejlesztett VRK, OPLC és HPLC tisztaság-
vizsgálati módszerek teljesítőképességét vizsgáltam és hasonlítottam össze.
Megállapítottam, hogy az OPLC és a HPLC módszer hatékonysága közeli, a VRK ettől
messze elmaradt.
A szteroidsor tipikus szennyezéseire polaritási sort állítottam fel.
Az egy üzem által gyártott szteroidokra olyan szűrővizsgálatot dolgoztam ki, amely
lehetővé teszi az esetleges keresztszennyezések gyors vizsgálatát és azonosítását az adott
vegyületcsoportra. Kifejlesztés nélküli pont-vizsgálati módszert dolgoztam ki, amely
alkalmas lehet a készüléktisztítás során a mosás hatékonyságának ellenőrzésére.
Munkám tapasztalatai alapján a gyógyszeranalitikában a rétegkromatográfiás
technika, elsősorban az OPLC, a hatóságok által javasolt és elvárt HPLC módszer mellett a
jövőben is jól használható szteroidok tisztaságvizsgálatára, előzetes vizsgálatként, új
anyagok szennyezésprofiljának felderítésére és igazolására, valamint gyors
szűrővizsgálatok elvégzésére.
95
6. SUMMARY
Elucidation of impurity profiles of intermediates originated in the „methyl line” of
the norsteroid synthesis was the object of my study. I have worked out rapid purity test
procedures by overpressured thin layer chromatographic method for examining nandrol-
one, dienolether, estradiol methylether acetate and molone (methyl-seco-olone). In the case
of the above intermediates I have evaluated the results obtained with other chromato-
graphic techniques, too. Simultaneous detection of 5α-4,5-dihydro-nandrolone and
nandrolone Δ5(10)-isomer, the two main impurities of nandrolone, was successful only by
OPLC. These two molecules of similar structure cannot be separated from each other by
TLC, 5α-4,5-dihydro-nandrolone cannot be determined by HPLC with UV detection, GC
can separate them adequately but the principal component decomposes to Δ5(10)-isomer du-
ring the examination, thus the result is not reliable. Concerning dienolether the OPLC pro-
cedure worked out by me each known impurity can be evaluated selectively, and regarding
estradiol methylether acetate the combination of the methods was successful. In the case of
molone I have separated the main impurity from the principal component by OPLC, I have
cleared up the arising conditions of the main impurity and promoted its identification.
I have optimized and compared the most often used acidic visualisation methods for
steroids. Visualisation at higher temperatures lasting for shorter periods is more sensitive
however heating for longer periods at lower temperatures results a more stable, robust
visualisation comparing the different visualizing reagents.
I have studied and compared the efficiencies of TLC, OPLC and HPLC purity test
methods developed for different steroid active substances. I have established that the
efficacies of OPLC and HPLC methods are similar, that of TLC has been far inferior.
I have constructed a polarity line for the typical impurities of the steroid line.
I have worked out a screening test for the steroids manufactured by the same plant
which enables rapid examinations and identifications of the possible cross contaminants
for the given compound group. I have worked out a point examination method without
development which can be suitable for checking the effectiveness of the washing during
the cleaning of the equipment.
On the basis of my working experiences the thin layer chromatographic techniques,
first of all the OPLC, besides the HPLC method proposed and expected by the authorities,
can also be used well in the future for the purity tests of steroids in the pharmaceutical
analysis as preliminary test, detecting and proving the impurity profiles of new substances,
as well as performing rapid screening tests.
96
7. IRODALOMJEGYZÉK
1 S. Görög and Gy. Szász, Analysis of steroid hormone drugs, Akadémiai Kiadó,
Budapest (1978) p.p. 48-61
2 Knoll J., Gyógyszertan, Medicina Könyvkiadó, Budapest (1987) 599-630
3 Donáth T., Anatómia – élettan, Medicina Könyvkiadó, Budapest (1996) 245-246
4 Kajtár M., Természetes szénvegyületek kémiája (Szerves kémia – III), Budapest,
ELTE egyetemi jegyzet, évszám nélkül
5 A.J. Birch and S.M. Mukherji, J. Chem. Soc., (1949) 2351; (1950) 867
6 Ananchenko, S.N.; Torgov, I.V., Tetrahedron 18 (1963) 1335
7 Csontos J., Fekete Gy, Kováts T., Lőw M., Pillich L., Takács I., A Richter Gedeon
Rt. 100 éves története, Medicina Könyvkiadó (2001)
8 Mahó S., személyes közlés, 2003.
9 S. Görög, Analytical Sci. 20 (2004) 767-782
10 Tyihák E., A rétegkromatográfia zsebkönyve, Műszaki könyvkiadó, Budapest
(1979)
11 J. Sherma, B. Fried (eds.), Handbook of Thin-Layer Chromatography 3rd ed.,
Marcel Dekker Inc., New York – Basel – Hong Kong (2003)
12 P. D. Sethi, High Performance Thin-Layer Chromatography. Quantitative Analysis
of Pharmaceutical Formulations, CBS, New Delhi (1996)
13 C. F. Poole, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 963-984
14 E. Reich, A: Schibli, J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 438-443
15 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, in: S. Görög (ed.), Identification and Determination of
Impurities in Drugs, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands (2000) p.p. 146-182
16 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, B. Renger, in: Sz. Nyiredy (ed.), Planar
Chromatography – A Retrospective View for the Third Millennium, Springer,
Hungary (2001) p.p. 585-607
17 Sz. Nyiredy, K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, G. Szepesi, in: J. Sherma, B. Fried (eds.),
Handbook of Thin-Layer Chromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, New York
(2003) p.p. 807-863
18 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, B. Renger, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 778-789
19 Fekete J., Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft.,
Budapest 2006
20 Balla J., A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., 1997
97
21 F. Dravetz, E. Francsics-Czinege, P. Horváth, 8th Int. Meeting Recent
Developments in Pharmaceutical Analysis (RDPA ’99), 29th June-3rd July, 1999,
Rome
22 E. Tyihák, E. Mincsovics, H. Kalász, J. Chromatogr., 174 (1979) 75-81
23 E. Mincsovics, E. Tyihák, H. Kalász, J. Chromatogr., 191 (1980) 293-300
24 E. Mincsovics, M. Garami, L. Kecskés, B. Tapa, Z. Végh, Gy. Kátay, E. Tyihák, J.
AOAC Int. 82 (1999) 587-598
25 E. Tyihák, E. Mincsovics, in: Sz. Nyiredy (Editor), Planar Chromatography – A
Retrospective View for the Third Millenium, Springer, Budapest, Hungary (2001)
137-176
26 Sz. Nyiredy, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 985-
27 E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák, Handbook of Thin Layer
Chromatography Chapter 7 Marcel Dekker, NewYork, 1996
28 E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák, Overpressured Layer
Chromatography, in: J. Sherma, B. Fried (eds), Handbook of Thin-Layer-
Chromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, New York, USA (2003) 175-205
29 Tyihák E., személyes közlés
30 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, J. Planar Chromatogr. 6 (1993) 256-258
31 A. Nagy-Turák, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 8 (1995) 188-
191
32 K. Ferenczi-Fodor, S. Mahó, S. Pap-Sziklay, I. Török, L. Borka, Pharmeuropa Vol.
9 No. 4 (1997)
33 Z. Szikszay, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 11 (1998) 428-432
34 A. Wiszkidenszky, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 11
(1998) 463-466
35 A. Kassai, A. Szécsi, A. Koppány, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar
Chromatogr. 13 (2000) 30-32
36 Z. Katona, L. Vincze, Z. Végh, Á. Trompler, K. Ferenczi-Fodor, J. Pharm. Biomed.
Anal. 22 (2000) 349-353
37 S. Görög Anal. Bioanal. Chem. 377 (2003) 852-862
38 ICH guideline Q3A(R), Impurities Testing Guideline: Impurities in New Drug
Substances, CPMP/ICH/2737/99
39 ICH guideline Q3B(R), Impurities in New Drug Products, CPMP/ICH/2738/99
98
40 ICH guideline Q6A, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for
New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances,
CPMP/ICH/367/96 corr
41 The United States Pharmacopeia, 30th ed., <466> Ordinary Impurities, p. 170,
USP Convention, Rockville, MD 20852, USA
42 European Pharmacopeia 5th ed., 07/2006:2034 Substances for Pharmaceutical Use,
p. 4151, Council of Europe, Strasbourg, France
43 S. Görög, M. Babják, G. Balogh, J. Brlik, F. Dravecz, M. Gazdag, P. Horváth, A.
Laukó, K. Varga, J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1998) 511-525
44 B. Bagócsi, D. Fábián, A. Laukó, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor,
J. Planar Chromatogr. 15 (2002) 252-257
45 B. Bagócsi, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.), Proc. Int.
Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2004, Visegrád, Hungary, May
2004, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 215-219
46 B. Bagócsi, A. Laukó, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.),
Proc. Int. Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2003, Budapest,
Hungary, June 2003, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 185-
189
47 Dravecz F., személyes közlés, 2003
48 Szántay Cs., személyes közlés, 2003
49 Stahl E., Thin-Layer Chromatography - A Laboratory Handbook, 2nd ed., George
Allen & Unwin Ltd., London, Springer-Verlag, Berlin, (1969)
50 The United States Pharmacopeia, 30th ed. <466> Ordinary Impurities, Key for
Visualization Techniques (5) Acid spray, p. 170, USP Convention, Rockville, MD
20852, USA
51 European Pharmacopeia 5th ed., 4.1.1. Reagents, Sulphuric acid, alcoholic solution
of, 1086803, 04/2006:40101, p. 3805, Council of Europe, Strasbourg, France
52 European Pharmacopeia 5th ed., General Monographs 01/2005:0234
Norethisterone, p. 2116, Council of Europe, Strasbourg, France
53 The United States Pharmacopeia, 29th ed. Monographs Norethindrone, USP
Convention, Rockville, MD 20852, USA, p. 1552
54 P. K. Zarzycki, M. A. Bartoszuk, A. I. Radziwon, J. Planar Chromatogr., 19 (2006)
52-57
99
55 European Pharmacopoeia 5th ed. 2.2.46. Chromatographic separation techniques,
Council of Europe, Strasbourg, France (2005) 69-73
56 Bagócsi B., Magyar Kémikusok Egyesülete – Fiatal Kémikusok Előadóülése, 1999.
nov. 23. Budapest
57 B. Bagócsi, D. Fábián, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, 11th Int.
Symp. Pharm. Biomed. Anal., 14-18 May 2000, Basel, Switzerland, Abstracts,
P019
58 B. Bagócsi, G. Rippel, Z. Végh, S. Mahó, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.),
Proc. Int. Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2000, Lillafüred,
Hungary, June 2000, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp.151-156
59 B. Bagócsi, G. Rippel, M. Mezei, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 16
(2003) 359-362
60 European Pharmacopoeia 5.5, General Monographs 04/2006:0234 Norethisterone,
p. 4278, Council of Europe, Strasbourg, France
61 Kozma J. személyes közlés, 2006.
62 Kozma J., Bagócsi B., Ferencziné Fodor K., Elválasztástechnikai Ankét 2006,
Budapest
63 K. Ferenczi-Fodor, A. Laukó, A. Wiszkidenszky, Z. Végh, K. Újszászy, J. Planar
Chromatogr. 12 (1999) 30-37
100
top related