szteroid gyógyszeranyagok tisztaságvizsgálata kromatográfiás...

Szteroid gyógyszeranyagok

tisztaságvizsgálata

kromatográfiás technikákkal

Bagócsi Boglárka

Kémia Doktori Program Programvezető: Prof. Dr. Inzelt György

Témavezető: Ferencziné Dr. Fodor Katalin (Richter Gedeon Nyrt.) Egyetemi konzulens: Horváthné Dr. Otta Klára (ELTE TTK)

Richter Gedeon Nyrt. Budapest, 2007

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönöm Társaságunk és a Minőségirányítási Igazgatóság vezetőségének a lehetőséget, hogy munkahelyemen, a Richter Gedeon Nyrt. Minőségellenőrző laboratóriumában elvégezhettem doktori munkámat. Hálásan köszönöm témavezetőmnek Ferencziné Dr. Fodor Katalinnak munkám irányítását, ösztönzését. Köszönöm konzulensemnek Horváthné Dr. Otta Klárának dolgozatommal kapcsolatos hasznos észrevételeit, tanácsait és segítségét. Köszönöm Mahó Sándornak a Richter Gedeon Nyrt. Szteroid szintetikus laboratórium vezetőjének a munkámhoz szükséges vegyületek biztosítását, értékes szakmai tanácsait. Köszönöm Laukó Annának a Kémia VI., és Németh Sándornak a Biokémia II. üzemellenőrző laboratóriumok vezetőinek a szteroidszintézissel kapcsolatos munkáknál nyújtott segítségüket, a HPLC és gázkromatográfiás mérések végzését. Köszönöm Dr. Végh Zoltánnak szakmai tanácsait, a rétegkromatográfiás fotók, videofelvételek elkészítésében nyújtott segítségét. Köszönöm Dr. Görög Sándor professzor úrnak a dolgozatommal kapcsolatos kritikai megjegyzéseit, hasznos tanácsait. Külön köszönettel tartozom Katona Mihályné és Tóth Gábor munkatársaimnak a gyakorlati munka elvégzésében nyújtott segítségükért.

2

TARTALOMJEGYZÉK

Gyakran használt rövidítések................................................................................................. 5

1. BEVEZETÉS – CÉLOK ................................................................................................... 6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.............................................................................................. 7

2.1. A szteroid hormonok .................................................................................................. 7

2.1.1. A norszteroid-szintézis......................................................................................... 8

2.2. Vizsgálati lehetőségek .............................................................................................. 11

2.2.1. Általánosan használt technikák ......................................................................... 11

2.2.2. A túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) szerepe a szteroidok

tisztaságvizsgálatában ................................................................................................. 12

2.3. Gyógyszeranyagok szennyezéseire vonatkozó előírások ......................................... 15

3. KÍSÉRLETI RÉSZ .......................................................................................................... 17

3.1. Felhasznált eszközök, vegyszerek ............................................................................ 17

3.2. Módszerleírások ....................................................................................................... 17

3.2.1. Az előhívási kísérletekhez használt módszerek .................................................. 17

3.2.2. A szteroidsor kísérleteihez használt kromatográfiás módszerek ....................... 18

3.2.3. A teljesítményjellemzők meghatározásához használt módszerek ...................... 20

4. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS ..................................................................................... 25

4.1. Vizsgált szteroidok ................................................................................................... 25

4.1.1. Nandrolon.......................................................................................................... 26

4.1.2. Dienoléter .......................................................................................................... 27

4.1.3. Ösztradiol-metiléter-acetát................................................................................ 29

4.1.4. Molon................................................................................................................. 32

4.1.5. A szteroidszintézissel kapcsolatos eredmények ................................................. 36

4.2. Előhívások ................................................................................................................ 38

4.2.1. Az előhívási kísérletek során készített kromatogramok ..................................... 40

4.2.2. Az előhívási kísérletek során mért csúcsterületek ............................................. 43

4.2.3. Az előhívási kísérletek során kapott szintvonalas ábrák ................................... 48

4.2.4. Az előhívási kísérletek értékelése ...................................................................... 57

4.3. Teljesítményjellemzők ............................................................................................. 60

3

4.3.1. Etinil-ösztradiol ................................................................................................. 61

4.3.2. Noretiszteron ..................................................................................................... 67

4.3.3. Nandrolon.......................................................................................................... 73

4.3.4. Gesztodén .......................................................................................................... 79

4.3.5. A teljesítményjellemzőkkel kapcsolatos kísérletek eredménye .......................... 83

4.4. Szűrővizsgálatok....................................................................................................... 85

4.4.1. Szűrővizsgálatok lehetséges szennyezésekre ..................................................... 86

4.4.2. Szűrővizsgálatok főkomponensekre ................................................................... 87

4.4.3. Elővizsgálatok lehetősége készüléktisztításnál .................................................. 93

5. ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................................ 95

6. SUMMARY .................................................................................................................... 96

7. IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................. 97

4

Gyakran használt rövidítések

VRK vékonyrétegkromatográfia

OPLC túlnyomásos rétegkromatográfia

HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

GC gázkromatográfia

UV ultraibolya

NMR mágneses magrezonancia spektroszkópia

FID lángionizációs detektor

HPTLC nagyhatékonyságú vékonyrétegkromatográfia

RF retardációs faktor

RRF relatív retardációs faktor

Rt retenciós idő

RRt relatív retenciós idő

Rs csúcsfelbontás

H elméleti tányérmagasság

N elméleti tányérszám

5

1. BEVEZETÉS – CÉLOK

A Richter Gedeon Nyrt. hagyományos termékpalettáján a szteroidok

vegyületcsoportja igen fontos szerepet játszik. Felhasználják fogamzásgátló, hormonpótló

készítményekben, de alapanyag formában is exportálják ezeket a vegyületeket.

A szteroidokon belül különös fontosságúak a norszteroidok, amelyeken az

alapváznál eggyel kevesebb metil-csoport van. Ezeket soklépéses szintézissel állítják elő:

azonos kiindulási anyagokból; a technológiai folyamat elágazásával különböző termékek

keletkeznek. Így a közös kiindulási anyagok folytán ezeknek a szteroidoknak a

szennyezés-profilja összefügg.

Munkám célja a szteroid totálszintézis fontosabb vegyületeinek (melyek ismertebb

termékei a nandrolon-dekanoát, noretiszteron, allilösztrenol) részletes tanulmányozása az

alábbi szempontok szerint:

- Az egyes technológiai lépések követésével a közös szennyezések és prekurzoraik

felderítése a különböző szteroidokban, analógiák keresése.

- Olyan tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozása, amelyek lehetővé teszik az UV-

elnyelést nem mutató szteroid-szennyezők kimutatását, amelyek az UV-detektálást

alkalmazó HPLC-módszerrel észrevétlenek maradnak. A planár-kromatográfiás módszerek

(VRK, OPLC) speciális előhívó reagensek alkalmazásával ezt lehetővé teszik.

- Olyan gyors ellenőrző módszerek kidolgozása, amelyek alkalmasak a reakcióelegyek és

köztitermékek vizsgálatára is.

6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A szteroid hormonok

A hormonok speciális felépítésű anyagok, amelyek a vér útján jutnak el a rájuk

specifikusan érzékeny sejtekhez, ill. szövetekhez, ahol már igen alacsony koncentrációban

kifejtik hatásukat. Kémiai felépítésük alapján három csoportba oszthatók:

- szteroid hormonok,

- peptid hormonok,

- fenolszármazékok.

Az egyes szerkezeti csoportokon belül hatásuk szerint további csoportosítás

lehetséges. Részletesebben a szteroid hormonokkal foglalkozom, amelyek a szteránvázas

vegyületek közé tartoznak (1. ábra), ezek szubsztituált és általában részben telítetlen

származékaik.

A B

C D12

3

45

67

8

910

1112

13

14 15

16

17

1. ábra. A szteránváz

A szteroid hormonok lehetnek nemi hormonok és mellékvesekéreg-hormonok vagy

kortikoszteroidok. A nemi hormonok között megkülönböztetünk férfi nemi hormonokat,

ezeket hívjuk androgéneknek, ill. női nemi hormonokat, amelyek az ösztrogének vagy

tüszőhormonok és a gesztagének vagy sárgatest-hormonok.

Az androgénekre jellemző alapváz a C19-es androsztán-váz (2. ábra). Képviselőjük

az androszteron és a tesztoszteron. A másodlagos férfi nemi jelleg kialakításában van

szerepük. Androgén aktivitásuk mellett anabolikus hatásuk is van, vagyis elősegítik a

fehérjék tárolását, megtartását, ezáltal gyorsítják a szövetképződést, növekedést, elősegítik

a regenerációt. Az androgén és az anabolikus hatás között azonban nincs párhuzam. A

vázon végzett megfelelő szerkezeti változtatásokkal elő lehet állítani olyan szteroidokat,

amelyeknek vagy az androgén vagy az anabolikus hatásuk dominál. Utóbbiakat anabolikus

szteroidoknak nevezzük, egyik legismertebb képviselőjük a nandrolon-dekanoát.

7

HO

19

18

18

19

20

21

18

androsztán (C19) ösztrán (C18) pregnán (C21)

2. ábra. Férfi, ill. női nemi hormonok alapvázai

Az ösztrán alapvázzal (C18) rendelkező vegyületek közül az ösztrogének vázában az

A-gyűrű aromás szerkezetű. Ide tartozik az ösztron, az ösztradiol és az ösztriol. Ezek a

hormonok a pete érését és az ovulációt segítik, leghatásosabb közülük az ösztradiol.

A gesztagéneknek, amelyeket más néven terhességi hormonoknak nevezünk, mert a

peteérést és az ovulációt gátolják, C21-es pregnán alapvázuk van, képviselőjük a

progeszteron. Ovulációgátló hatásuk miatt a születésszabályozásban van szerepük;

rendkívül intenzív hatású mesterséges gesztagéneket is előállítottak és használnak a

fogamzásgátló készítményekben, mint például a noretiszteront.

A mellékvesekéreg hormonjai, a kortikoszteroidok között megkülönböztetjük a

szénhidrátanyagcserét szabályozó glükokortikoszteroidokat, mint például a kortizon és a

hidrokortizon, ill. a mineralokortikoszteroidokat, amelyek a só- és vízháztartást

szabályozzák. A kortikoszteroidok között is léteznek mesterséges származékok, főleg

gyulladásgátló és antireumás szerek [1-4].

2.1.1. A norszteroid-szintézis

A szteroid hormonok előállítására több lehetőség van. Az ún. félszintézisek során

növényi vagy állati eredetű szteroidokat alakítanak át más szteroidokká. Például

dioszgeninből vagy koleszterinből kiindulva tesztoszteron, ösztradiol vagy progeszteron

előállítása válik lehetővé. Másik lehetőség a totálszintézis. Az első anabolikus androgén

szteroid hormon, a 19-nortesztoszteron (nandrolon) teljesen szintetikus előállítása először

1950-ben vált lehetővé a Birch-redukció segítségével [5]. Ezután számos norszteroid

totálszintézisét valósították meg. Ennek egyik példája Torgov nevéhez fűződik, aki ösztron

előállítását írta le metoxi-tetralonból kiinduló teljes szintézissel [6].

A Gyár az 1950-es évek végén kezdte el a szintetikus szteroidelőállítási eljárások

kidolgozását [7]. A szteroid hormonok totálszintézisének kiindulási anyaga a β-naftol. A

többlépcsős szintézisút kezdeti reakcióit követően a keletkezett molekulát metil-, ill. etil-

8

9

ciklopentándionnal kondenzálják. A metil-ciklopentándion az ún. metilsor vegyületeinek

kiindulási anyaga, amelyek a szteroidváz (1. ábra) 13-as szénatomján metil-csoportot

tartalmaznak, míg az etil-ciklopentándion az ún. etilsor kiindulási anyaga, a 13-as szénen

etil-csoportot tartalmazó szteroidoké.

A szintézis során a β-naftolból hidrogénezéssel, metilezéssel, oxidációval és

Grignard-reakcióval létrehozott vinil-karbinolt reagáltatják a ciklopentándionnal, amely

egy báziskatalizálta reakció, a hidroxi-csoporthoz képest allil-helyzetben kapcsolódik a

ciklopentándion molekula, közben enolizáció játszódik le. Metil-szekodion keletkezik,

amelyből további reakciókkal ösztradiol-metil-acetátot, Birch-redukcióval és savas

hidrolízissel pedig 19-nortesztoszteront, más néven nandrolont kapunk. A 3. ábrán a

szteroidok totálszintézisének doktori munkámban vizsgált ágát mutatom be vázlatosan.

10

etinodiol-diacetát

nesztoron

∫∫

∫∫ nandrolon nordion

nandrolon-dekanoát

∫∫∫∫

noretiszteron

noretiszteron-acetát

∫∫ vinil-karbinol +

metil-ciklopentándion

ÖDME-acetát ösztradiol-17-acetát∫∫

∫∫ ∫∫

3. ábra. A norszteroid-totálszintézis „metilsorának” vázlata [8]

allilösztrenol

β-naftol

ösztradiol

: elágazási pont : végtermék

etinil-ösztradiol

____

A technológiai folyamat elágazásaival különböző termékek keletkeznek, amelyek

szennyezésprofilja a közös kiindulási anyagok miatt összefügg.

2.2. Vizsgálati lehetőségek

2.2.1. Általánosan használt technikák

Szteroidok tisztaságvizsgálatára többféle kromatográfiás módszert használnak [9].

A hatóanyagok, végtermékek minőségének ellenőrzésére a hagyományos

vékonyrétegkromatográfiás (VRK) módszerek visszaszorulóban vannak a pontosabb,

kvantitatív eredményeket biztosító nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC)

módszerekkel szemben.

A gyártásközi ellenőrző laboratóriumokban intermedierek vizsgálatára,

reakciókövetésre még ma is használják a VRK-módszereket, ugyanakkor HPLC és

gázkromatográfiás (GC) módszerek, ill. speciális esetekben egyéb – pl. spektrofotometriás

– módszerek is használatosak.

A VRK-módszerek előnye abban rejlik, hogy egyszerűek, olcsók és gyorsak. Több

minta egyidejű, standard melletti analízisét is lehetővé teszik, komplex, ill. nyers minták

előkészítés nélkül, vagy minimális mintaelőkészítéssel azonnal felvihetők a szorbensre. A

minta valamennyi detektálható komponense egyidejűleg megjeleníthető a rétegen, a starton

maradó és a frontba kerülő anyagok is detektálhatók, szemben az oszlopos technikákkal.

Egyszerűen alkalmazható sokféle előhívási technika, amelyekkel a szorbensre felvitt anyag

különböző komponensei láthatóvá tehetők, detektálhatók. Lehetőség van kvantitatív

denzitometriás értékelésre, valamint félkvantitaív vizuális értékelésre [10-13].

Hátrány azonban, hogy a VRK-módszerek nem teljesen automatizálhatók. Az egyes

lépések, mint mintafelvitel, kifejlesztés, előhívás, detektálás automatizálhatók, de a lépések

között manuális beavatkozásra van szükség. Másik hátrány, hogy a VRK nyitott rendszer,

a környezeti tényezők jelentős hatást gyakorolnak az elválasztásra. Pl. a legelterjedtebben

használt normál fázisú szilikagél rétegek esetében a levegő változó nedvességtartalma

okozhat problémát. A mobil fázis áramlási sebességét a kapilláris erők határozzák meg

(kivéve a kényszeráramlásos VRK technikákat, pl. OPLC), melyeket szintén több tényező

befolyásol. Ezen okok kedvezőtlenül hatnak a kromatogramok reprodukálhatóságára.

Ennek javítására Reich dolgozatában találunk javaslatokat [14]. A gyógyszeranyagok

vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával több összefoglaló közlemény foglalkozik [15-

18].

11

A szteroidok esetében normál- (TLC) vagy finomszemcsés (HPTLC) szilikagél

állófázisok használatosak. Az előhívási technikák közül gyakori a kénsavas etanolos

bepermetezés vagy a reagensoldatba történő bemerítés és az azt követő néhány perces 100-

120 °C-on történő hevítés. Ilyenkor 366 nm-es ultraibolya (UV) fénnyel besugározva

különböző színnel, intenzíven fluoreszkáló foltok jelennek meg.

A HPLC-módszerek előnye a zárt rendszerből és az eluens egyenletes áramlási

sebességéből adódóan a reprodukálhatóság és az automatizálhatóság; pontos, kvantitatív

eredmények kaphatók velük [19]. A technika hatékonysága, az elméleti tányérszám itt

jóval nagyobb, mint a VRK-nál.

A hagyományos HPLC hátránya ugyanakkor a hosszú analízisidő, a nagy

oldószerigény és költség. A kromatográfiás oszlop kondícionálásához szükséges időt és

oldószert is figyelembe kell vennünk. A végtermékekre használt rutinanalitikai méréseknél

ugyanis még nem használják széles körben a monolit oszlopokat [19], vagy a rendkívül kis

szemcseméretű töltettel rendelkező rövid oszlopokat [19], amelyek jelentős mértékben

meggyorsítják az analízist. Komplex minták (pl. gyógyszerkészítmények, reakcióelegyek)

előkészítés nélkül általában nem vizsgálhatók. A gyógyszeriparban általánosan használt

UV-detektorral ellátott HPLC készülékek pedig a csekély UV-elnyelést mutató

komponensek kimutatására nem alkalmasak.

Tisztaságvizsgálatra ritkábban használják a GC-technikát [20]. Ez a módszer

kvantitatív, gyors, tömegarányos analitikai jelet ad és tömegspektrometriás (MS)

detektálással ismeretlen csúcsok azonosítását is lehetővé teszi. Hátránya, hogy a

hőérzékeny és a kevésbé illékony komponensek nem vagy nem pontosan mérhetők. A 3-

keto-Δ4 szerkezetű szteroidok például kisebb hőbomlást szenvednek az injektorban [21].

A gyártásközi ellenőrzéseknél UV spektrofotometriás módszert is használnak

reakciókövetésre.

2.2.2. A túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) szerepe a szteroidok

tisztaságvizsgálatában

A kényszeráramlásos rétegkromatográfiás technikák közé tartozik a túlnyomásos

rétegkromatográfia – OPLC (Over-Pressured Layer Chromatography, vagy Optimum

Performance Laminar Chromatography) – egy síkelrendezésű folyadékkromatográfiás

módszer, amely ötvözi magában a VRK és a HPLC előnyeit [22-26].

12

Az OPLC kamrában a szorbensréteget egy rugalmas fóliával nyomás alatt

letakarjuk, így gyakorlatilag nincs gőztér. Az eluenst a szorbensrétegbe nyomás alatt,

mikropumpával juttatjuk el.

Az OPLC alkalmas on-line, illetve off-line mintafelvitelre, elválasztásra és

detektálásra és ezek kombinációira (részleges off-line módszerek). Az on-line módban az

oldott anyagokat az elfolyó eluensben detektáljuk egy átfolyócellás detektor segítségével.

Az off-line módban a kromatográfiás folyamat valamennyi lépése (mintafelvitel,

elválasztás, értékelés) egymást követően külön-külön valósul meg. Az OPLC

rendszerekben az eluens összetételének változtatása jó lehetőséget biztosít speciális

elválasztási módszerek alkalmazására, mint az izokratikus, a gradiens és a lépcsős gradiens

módszer. A technika előnye, hogy az eluens összetételének változtatása egyszerűen és

gyorsan elvégezhető, a rendszer nem igényel több órán át tartó kondícionálást.

A hagyományos rétegkromatográfiában az eluens a kapilláris erők révén vándorol

az álló rétegben, míg a lineáris OPLC esetében pumparendszer segítségével biztosítja az

eluensfront állandó sebességét a szorbensben. A normál kamrában végzett futtatás esetében

az eluens frontjának sebessége folyamatosan csökken, emiatt a kromatografált anyagok

foltjainak szétterülése az idő előrehaladtával egyre jelentősebbé válik. Az α front

vándorlását a következő függvénnyel jellemezhetjük:

zf2 = k ⋅ t (2.1)

ahol zf az α front távolsága, t a kifejlesztési idő és k egy állandó, mely az

elválasztás körülményeitől függ.

A lineáris kifejlesztésű túlnyomásos futtatás (OPLC) esetében a front vándorlása a

következő lineáris függvénnyel írható le:

zi = ui ⋅ t (2.2)

ahol zi az i-edik komponens, vagy az eluensfront távolsága, ui az i-edik komponens,

vagy az eluensfront áramlási sebessége és t a kifejlesztési idő.

13

4. ábra. Az eluensfront vándorlásának időfüggése hagyományos VRK és OPLC esetében [27] 1-hagyományos kifejlesztés, 2-lineáris OPLC kifejlesztés, 3-lineáris OPLC kifejlesztés gyors szakasz beiktatásával, 4-a mintafelvitel javasolt helye

A 4. ábra szemlélteti a hagyományos vékonyrétegkromatográfia eluensfrontjának

vándorlási sebességére jellemző négyzetes, valamint a lineáris kifejlesztésű OPLC

esetében a lineáris összefüggést [28].

OPLC esetében – hasonlóan a HPLC-hez – az eluens optimált, állandó áramlási

sebessége miatt a foltok terülése jóval kisebb, mint a normálkamrában, így a HPLC-hez

hasonló hatékonyságú elválasztást érhetünk el.

Az OPLC technika előnyei közé tartozik, hogy a gőztér kizárásával a környezeti

tényezők jóval kevésbé befolyásolják a kromatográfiás kifejlesztést, mint a hagyományos

VRK esetében. Az eluensfront állandó sebességének biztosítása szintén az eredmények

jobb reprodukálhatóságának kedvez. A szorbensre felvitt mintából kedvező esetben gyors

előfuttatással eliminálni lehet a futtatást zavaró komponenseket, ezzel kiváltva az

időigényes mintatisztítási lépéseket.

A finomszemcsés réteglapokon a kényszeráramlásos technikával biztosított állandó

áramlási sebesség lehetővé teszi a hosszabb kifejlesztési távolságot. Hagyományos kamrás

kifejlesztés esetében legfeljebb 7 cm a futási távolság finomszemcsés szorbensen. OPLC-

vel a réteglap teljes hossza (20 cm) kihasználható, túlfuttatásra is van lehetőség.

Ugyanakkor a foltkiszélesedés jóval kisebb mértékű, ezáltal hatékonyabb elválasztásra van

lehetőség.

14

A Richter Gedeon Nyrt.-ben az OPLC-módszereknek komoly hagyományuk van.

Az első kísérleti körkörös készüléket itt használták először digitálisz-glikozidok

vizsgálatára az 1980-as években [29]. Több hatóanyag, valamint készítmény esetében

validált OPLC-módszerekkel végzik a rutinanalitikai munkában a minősítéshez szükséges

tisztaságvizsgálatot [30-35], ezen kívül a tisztításvalidálásban is alkalmazzák [36].

2.3. Gyógyszeranyagok szennyezéseire vonatkozó előírások

A szennyezéseket különféleképpen csoportosíthatjuk. Vannak szerves, és szervetlen

szennyezések, valamint oldószermaradékok. Ezek meghatározására különféle vizsgálati

technikák és módszerek léteznek. Munkám során a szerves szennyezések, ezen belül

rokonvegyületek elválasztásával foglalkoztam. A hatóanyagra jellemző szerves

szennyezések között beszélhetünk a gyártás kiindulási anyagáról, a gyártásból eredő

melléktermékekről, intermedierekről, bomlástermékekről, különféle reagensekről, vagy

katalizátorokról [37]. A gyártónak a törzskönyvi beadványában fel kell sorolnia a

hatóanyagában ténylegesen meglévő és elméletileg lehetséges szennyezéseket. Ez utóbbiak

azok, amelyek a gyártás, tisztítás, vagy tárolás során keletkezhetnek [38-39].

Ezek vizsgálatára szigorú szabályozás van érvényben a gyógyszeriparban.

Általában különféle kromatográfiás technikákat ajánlanak az egyes szennyezések és a

főkomponens egymástól való elválasztására. Egy hatóanyagban megengedhető maximális

szennyezettség a nemzetközi harmonizációs irányelvek alapján a hatóanyag napi dózisától

függ. Amennyiben a napi dózis 2 g-nál nem nagyobb, akkor a legújabb ajánlások szerint az

ismeretlen szennyezések a hatóanyag-végtermékben nem haladhatják meg a 0,10%-ot.

Minden szennyezést, ami meghaladja ezt a mennyiséget, azonosítani kell. Ezt a

pontosságot biztosítani képes technikák szükségesek a rutinanalitikai vizsgálatokhoz. A

gyártásközi ellenőrzések során viszont ilyen pontosságot még nem várnak el. Ott az

analitikai munkák során a gyorsaság az egyik legfontosabb szempont, valamint

természetesen az, hogy a kérdéses komponensek elválasztása megfelelő legyen [40].

Az Amerikai és Európai Gyógyszerkönyv egyaránt általános fejezeteiben tárgyalja

a szokásos szennyezésekre vonatkozó információkat [41-42]. Az Amerikai

Gyógyszerkönyv VRK vizsgálatot javasol, ha az egyedi cikkely nem ír elő másik

tisztaságvizsgálati módszert, ilyenkor az általános fejezetben megadott maximum 2,0%

összes, és maximum 0,1% ismeretlen szennyezés jelenléte van megengedve a

hatóanyagban.

15

Az Európai Gyógyszerkönyv ezzel szemben a megnevezett analitikai módszerrel

detektálható szennyezésekre vonatkozóan adja meg a követelményeket. Több cikkelyben

fel is sorolják a lehetséges szennyezéseket. Egyes gyártók anyagában olyan – egyébként

ismert – szennyezés is keletkezik, amely nem szerepel a cikkelyben és így maximum

0,10% a rá vonatkozó követelmény.

A végtermékek minőségét befolyásolja az intermedierek minősége, a reakció

lejátszódásának mértéke. Ezeket a gyártásközi ellenőrző laboratóriumokban ellenőrzik,

ahol a gyors és megbízható módszerek alkalmazása elengedhetetlen.

16

3. KÍSÉRLETI RÉSZ

3.1. Felhasznált eszközök, vegyszerek

A méréseim során használt vegyszerek analitikai tisztaságúak (p.a.) voltak, melyeket

a Merck Kft.-től szereztünk be (E. Merck, Darmstadt, Germany).

A normál kamrás és az OPLC futtatásokhoz alufólia hordozóra felvitt

normálszemcsés (Merck 5554) és finomszemcsés (Merck 5548) szilikagél szorbenst

(20x20 cm Kieselgel 60 F254) használtam. Az OPLC futtatásokat P-OPLC BS 50

rétegkromatográffal végeztem (OPLC-NIT Ltd., Budapest, Hungary). Az OPLC

futtatáshoz szükséges rétegszélezést az OPLC-NIT Ltd. végezte. Minden esetben 300 μl

kiindulási gyors eluenstérfogatot és 50 bar külső nyomást alkalmaztam.

Az OPLC-futtatások esetében használt kloroformot – mind eluensként, mind

mintaoldószerként használva – a következő eljárással mentesítettem az etanoltól: 100 ml

kloroformot 3 x 20 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal rázótölcsérben kiráztam,

majd a kloroformos fázist nátrium-szulfáton szárítottam.

A szorbensek előhívó reagenssel való bepermetezésére motoros, Merck gyártmányú

permetezőt használtam (Merck Art.No. 1.08540). A hevítésüket pedig Camag sütőlapon

(TLC Plate Heater III) (Camag, Muttenz, Switzerland) végeztem.

A kromatogramok dokumentálására Camag VideoStore 2 készüléket használtam, a

videodenzitometriás értékelésre pedig a Camag VideoScan szoftvert.

3.2. Módszerleírások

3.2.1. Az előhívási kísérletekhez használt módszerek

A szteroid-eleggyel végzett előhívási kísérletekhez a vizsgált szteroidok 0,02%-os

koncentrációjú kloroformos oldatát használtam modellelegyként, amelyből 5–5 μl-t vittem

fel finomszemcsés szilikagél szorbensre (Merck 5548) 5 mm-es sávokban. P-OPLC BS 50

típusú túlnyomásos rétegkromatográffal végeztem a kromatográfiás kifejlesztéseket.

Eluensként ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V) arányú elegyét használtam,

amely a modellelegy valamennyi komponensére megfelelő elválást adott. A külső ún.

párnanyomás 50 bar volt, 400 μl/min eluensáramlási sebességgel, 300 μl gyors kiindulási

és 4200 μl kifejlesztési eluenstérfogattal dolgoztam.

Videodokumentációs rendszerként a Camag VideoStore 2 berendezését használtam. A 366

nm-es fényben rögzített képek esetében UV-2A, valamint CC-30Y jelzésű színszűrőt

17

használtam. A videodenzitometriás értékeléshez a VideoScan szoftver nyújtott segítséget,

amelynek beépített szűrői közül a zöldet használtam.

A különböző előhívó reagensekkel végzett kimutatási határ vizsgálatokhoz különböző

koncentrációjú oldatokból 2-5 μl térfogatból vittem fel a szorbensre 0,1 μg és 0,0075 μg

tartományban különböző mennyiségű anyagot.

3.2.2. A szteroidsor kísérleteihez használt kromatográfiás módszerek

Dienoléter (3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién)

VRK

Szorbens: normálszemcsés szilikagél (Merck 5554)

Futtató: ciklohexán – aceton 7+3 (V/V)

Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm (Desaga GmbH., Heidelberg, Germany)

Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,

Switzerland

Futási távolság: 14 cm

Előhívás, értékelés: bepermetezés 10% kénsavas etanollal, hevítés 120°C-on kb. 2

percig (Camag TLC Plate Heater III), 366 nm-es ultraibolya fényben értékelve.

OPLC

Szorbens: finomszemcsés szilikagél (Merck 5548)

Futtató: ciklohexán – butil-acetát – etil-acetát 8+1+1 (V/V)

Eluens áramlási sebessége: 400 μl/min

Kifejlesztési eluenstérfogat: 8000 μl, túlfuttatás

Felvitel: 8 mm-es kézi sávok Hamilton fecskendővel

Előhívás, értékelés: bepermetezés 10% kénsavas etanollal, hevítés 120°C-on kb. 2

percig, 366 nm-es UV-fényben értékelve

Ösztradiol-metiléter-acetát (3-metoxi-ösztradiol-17β-acetát)

OPLC


Futtató: toluol – kloroform – ciklohexán – butil-acetát 55+3+40+2 (V/V)


Kifejlesztési eluenstérfogat: 4000 – 8000 μl


18

Előhívás, értékelés: 254 nm-en, majd 10%-os kénsavas etanolos bepermetezést és

120°C-on 2 percig történő hevítést követően 366 nm-es UV- és látható fehér fényben

értékelve

GC

Készülék: Focus gázkromatográf (Thermo Separation Products, San Jose, CA, USA)

Oszlop: Restek Rtx-5 30 m x 0,25 mm x 0,5 μm fused silica (Restek Corporation,

Bellefonte, PA, USA), 240°C

Injektor és detektor hőmérséklet: 280°C

Detektor: lángionizációs (FID)

Vivőgáz: hélium

Áramlási sebesség: 20 cm/sec

Split-arány: 1:50

Oldószer: diklórmetán – metanol 1+1 (V/V)

Injektált térfogat: 1 μl

Molon (metil-szeko-olon)

OPLC


Futtató: toluol – etil-acetát – butil-acetát 8+1+1 (V/V)


Kifejlesztési eluenstérfogat: 8000 μl, túlfuttatás


Előhívás, értékelés: 366 nm-es ultraibolya fényben az anyag saját fluoreszcenciáját

vizsgálva, majd 10% kénsavas etanollal való bepermetezést és 120°C-on 2 percig való

hevítést követően, 366 nm-es fényben

HPLC 1.

Shimadzu LC-2010A típusú folyadékkromatográfon (Shimadzu Corporation, Tokyo,

Japan)

Oszlop: Wakosil C18 RS, 150 x 4,6 mm, 5 μm (SGE Analytical Science, Melbourne,

Australia)

Eluens: metanol – víz – ecetsav 70+30+0,3 (V/V)

Áramlási sebesség: 1 ml/min

Injektálási térfogat: 10 μl

19

Detektálás: λ=265 nm

HPLC 2.

Oszlop: Wakosil C18 RS, 150 x 4,6 mm, 5 μm

Eluens: metanol – víz – ecetsav 40+60+0,3 (V/V)


Hőmérséklet: 35°C



3.2.3. A teljesítményjellemzők meghatározásához használt módszerek

Etinil-ösztradiol (19-nor-17α-pregna-1,3,5(10)-trién-20-in-3,17-diol)

VRK

Mintaoldószer: kloroform – metanol 9+1 (V/V)

Felvitt oldattérfogat: 1-5 μl



Futtató: toluol – etanol 9+1 (V/V)

Kamra: telített normálkamra, 22 x 22 x 12 cm


Előhívás, értékelés: 10% kénsavas etanolos bepermetezést, majd 120°C-on 2 perces

hevítést követően 366 nm-es UV fényben vizuálisan

OPLC

Mintaoldószer: kloroform




Futtató: ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)

Eluens áramlási sebesség: 300 μl/min

Kifejlesztési eluenstérfogat: 7000 μl



HPLC

20

Hewlett Packard 1100 típusú készüléken (Hewlett Packard Gmbh. Waldbronn,

Germany)

Oszlop: Symmetry C18, 250 x 4,6 mm, 5 μm, 25 °C-ra termosztálva (Waters

Corporation, Milford, MA, USA)

Eluens: víz – acetonitril – metanol 50+30+20 (V/V)

Mintaoldószer: az eluens, koncentráció: 3 mg/ml



Analízisidő: 40 min


Noretiszteron (17β-hidroxi-19-nor-17α-pregn-4-én-20-in-3-on)

VRK




Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel

Futtató: kloroform – aceton 9+1 (V/V)





OPLC





Futtató: 1. n-hexán

2. butil-acetát – kloroform 85+15 (V/V)


Kifejlesztési eluenstérfogat: 1. 4000 μl és megállás nélkül:

2. 4000 μl

21



HPLC

Spectra Focus típusú folyadékkromatográfon (Thermo Separation Products, San Jose,

CA, USA)

Oszlop: Hypersil 120 ODS 3 μm, 125 x 4 mm (Agilent Technologies, Waldbronn,

Germany)

Eluens: A, acetonitril – víz 5+95 (V/V)

B, acetonitril – víz 95+5 (V/V)

hatlépcsős gradiens program

Mintaoldószer: acetonitril – víz 4+6 (V/V)

Áramlási sebesség: 1,0 ml/min


Analízisidő: 60 + 10 min


Nandrolon (17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on)

VRK




Felvitel: kézi pontok Hamilton fecskendővel

Futtató: n-hexán – etil-acetát 1+2 (V/V)





OPLC


Felvitt oldattérfogat: 1 – 2,5 μl



22



Kifejlesztési eluenstérfogat: többszörös kifejlesztés, közben 5 – 5 perc szárítás

szobahőmérsékletű levegőárammal

1. 2000 μl

2. 3000 μl

3. 4000 μl



HPLC

Hewlett Packard 1100 típusú folyadékkromatográf (Hewlett Packard Gmbh.

Waldbronn, Germany)

Oszlop: Eclipse XDB C18 150 x 3.0 mm, 3.5 μm (Agilent Tecnologies, Waldbronn,

Germany)

Eluens: gradiens program

idő (min) víz (%) acetonitril (%) metanol (%)

0 75 10 15

40 59 26 15

80 4 56 40

81 75 10 15

90 75 10 15

Mintaoldószer: acetonitril – víz 1+8 (V/V)




Detektálás: λ1=210 és λ2=225 nm

GC

Carlo Erba Mega II. készüléken (Carlo Erba, Milan, Italy)

Oszlop: Supelco 30 m x 0,25 mm x 1,0 μm film MDN-5S (Supelco, Bellefonte, PA,

USA), 270°C

Injektor és detektor hőmérséklet: 300°C

Detektor: lángionizációs (FID)

Vivőgáz: hélium

23

Áramlási sebesség: 20 cm/sec

Split-arány: 1:50

Oldószer: kloroform – metanol 1+1 (V/V)

Injektált térfogat: 1 μl

Gesztodén (13-etil-17-hidroxi-18,19-dinor-17α-pregna-4,15-dién-20-in-3-on)

OPLC







Kifejlesztési eluenstérfogat: 6500 μl



HPLC

Shimadzu LC20A típusú folyadékkromatográf (Shimadzu Corporation, Tokyo, Japan)

Oszlop: YMC-ODS-AQ C18 250x4.6 mm, 5μm (YMC Co., Kyoto, Japan)

Oszloptermosztálás: 30°C

Eluens: gradiens program

A-komponens: acetonitril – víz 30+70 (V/V)

B-komponens: acetonitril – víz 95+5 (V/V)

Idő (min) A-komponens

(%)

B-komponens

(%)

0 85 15

60 45 55

61 85 15

68 85 15





24

4. EREDMÉNYEK, ÉRTÉKELÉS

4.1. Vizsgált szteroidok

A szteroidváz sajátos szerkezetéből adódóan a különböző intermediereknél és

végtermékeknél találkozhatunk tipikus szennyezésekkel (5. ábra). A 3-keto-Δ4 szerkezetű

szteroidok esetében (R1: =O) általánosan jellemző az izoméria miatt melléktermékként

kialakuló Δ5(10)-származék, amelyben a 4-5 helyzetű szénatomok közötti kettős kötés az 5-

10 pozícióba kerül. Ez a szennyezés a főkomponensnél általában kevésbé poláris

tulajdonságú, ezért szilikagél szorbensen végezve az elválasztást 1,0-nál nagyobb relatív

RF-értéken helyezkedik el a főkomponenshez viszonyítva. Szintén gyakori a telített A-

gyűrűvel rendelkező komponens, az 5α-4,5-dihidro-származék, amelynek igen csekély az

UV-elnyelése, ezért a gyógyszeriparban jellemzően használt UV-detektorral ellátott

HPLC-készülékekkel nem vagy csak igen alacsony érzékenységgel detektálható. Gyakori

még a 8-as és 14-es szénatomok között kialakuló kettős kötésű származék (Δ8(14)),

amelynek UV-elnyelése a több kettős kötés miatt jelentős. Ezen lehetséges szennyezések

szerkezete egymástól és a főkomponenstől csak kis mértékben különbözik. Elválasztásuk

kritikus lehet. Bomlástermékként leggyakrabban 6-os α- és β-helyzetű hidroxi-származék

(R2: -OH), ill. 6-keto-származék (R2: =O) keletkezhet. Ezek a főkomponensnél polárisabb

szennyezésekként általában erősebben kötődnek az állófázishoz, a főkomponensnél

alacsonyabb RF-értékük van.

2

3

45 6 7

8910

11 13

14 15

1617

CH3

R1

R2

R3R4

1

12

A B

C D

5. ábra. A szteroidváz

Az eddigiekben említetteken kívül természetesen az egyes anyagokra jellemző

egyedi szennyezésekkel is találkozhatunk.

Az allilösztrenol nem a 3-keto szerkezetű szteroidok közé tartozik (R1: -H), ezért a

jellemző bomlástermékei nem a 6-os-, hanem a 3-as helyzetben szubsztituált származékok

(R1: -OH vagy =O, R2: -H).

25

Az 1. táblázat ismert szennyezésprofillal rendelkező szteroid hatóanyagok néhány

jellegzetes szennyezését foglalja össze.

1. táblázat. Szteroid hatóanyagok jellegzetes szennyezései

6-OH 6-keto Δ8(14) Δ5(10) 4,5-dihidro tájékoztató relatív RF-értékek * 0,0 – 0,3 0,4 – 0,8 0,9 – 1,2 1,3 – 1,5 1,0 – 1,6

Etinil-ösztradiol + + Δ9(11) - - Noretiszteron + + - - - Allilösztrenol 3-OH 3-keto + - + * az adott főkomponensre vonatkoztatva

A szteroidok szintézisében igyekeztem megtalálni azokat a reakciókat, amelyek

során a jellemző analóg szennyezések keletkeznek.

A szintézisút elágazásainál találhatunk ún. kulcsintermediereket, amelyek több

végtermék előállításának is intermedierjei. Az egyik ilyen anyag a nandrolon, belőle

állítják elő a nandrolon-dekanoátot, az allilösztrenolt, a noretiszteront és ennek

származékait.

4.1.1. Nandrolon

A nandrolon (17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on) tipikus szennyezéseiről Görög és

munkatársai számoltak be [43-44]. Vizsgálatára többféle kromatográfiás módszert

használtunk. Ezekről a módszerekről a teljesítményjellemzők összehasonlításával

foglalkozó fejezetben számolok be részletesen. A fent felsoroltakon kívül jellemző

szennyezése az ösztradiol-metiléter, amelynek A-gyűrűje az ösztradiolhoz hasonlóan

aromás szerkezetű. Lehetséges szennyezése még a dienoléter, amely a nandrolon

szintézisének utolsó intermedierje, önmagában is egy kulcsintermedier.

A dienoléter szintézisekor keletkező, vagy már meglévő enoléter típusú

szennyezések a dienoléterrel együtt a savas hidrolízis hatására átalakulnak 3-keto

szerkezetű vegyületté. Vagyis a nandrolon szennyezéseinek prekurzorait megtaláljuk a

dienoléter szennyezései között (ld. 6. ábra).

26

CH3OH

H

OH3C

H

H

CH3OH

H

H

H

O

HH+

dienoléter nandrolon

3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién 17β-hidroxi-ösztr-4-én-3-on

H+

CH3OH

H

H

H

O

H

H

CH3OH

HH

HH

HO

H3C

telített dienoléter telített nandrolon

3-metoxi-17β-hidroxi-ösztr-2-én 17β-hidroxi-ösztrán-3-on

CH3OH

H

OH3C

CH3OH

H

O

HH+

Δ8(14)-dienoléter Δ8(14)-nandrolon 3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5,8(14)-trién 17β-hidroxi-ösztra-4,8(14)-dién

6. ábra. A nandrolon és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

4.1.2. Dienoléter

A dienoléter (3-metoxi-17β-hidroxi-ösztra-2,5-dién) vizsgálatára szintén több

kromatográfiás módszert használtunk [45]. A VRK módszerrel csak az utolsó intermedier

mennyiségét lehet ellenőrizni (7. ábra). GC-vel az enoléter-szerkezetű komponensek csak

savas hidrolízist követően, 3-keto-formában mérhetőek. A technikára jellemző magas

hőmérsékletű mérési körülmények között a nandrolon kismértékű bomlása következik be

(8. ábra) [44]. Az általam kidolgozott OPLC-eljárással viszont a dienoléter minden ismert

szennyezése szelektíven értékelhető (7. ábra).

27

12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13

VRK

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

OPLC

Felvitel:

1 0,2 μg ösztradiol-metiléter 2 0,2 μg telített dienoléter 3 0,2 μg Δ8(14)-dienoléter 4 0,2 μg telített dimetilketál 5 0,2 μg dienoléter 6 0,2 μg összes szennyezés 7 25 μg krist. dienoléter és 0,1 μg összes szennyezés 8 25 μg krist. dienoléter 9 50 μg krist. dienoléter 10 25 μg nyers dienoléter 11 50 μg nyers dienoléter 12 oldószer

7. ábra. A dienoléter VRK- és OPLC-módszerrel a specifikusság ellenőrzésére készített

kromatogramja

28

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 min

mV

olt

5

6

7

8

9

10

11

12

13

1 2

3

4

5 6

1 3-dezoxo-nandrolon 2 5α-4,5-dihidro-nandrolon 3 nandrolon Δ5-izomer 4 nandrolon Δ5(10)-izomer 5 Δ8(14)-nandrolon 6 ösztradiol-metiléter 7 nandrolon

7

bomlástermékek

8. ábra. A dienoléter nandrolonná történt átalakítás után készített GC kromatogramja

A dienoléter savas hidrolízisekor az ösztradiol-metiléter nem alakul át, változatlan

formában és mennyiségben találjuk meg a nandrolonban. Ez a vegyület a szintézis előző

lépéséből ered az ösztradiol-metiléter-acetáton végrehajtott Birch-redukcióból. Ekkor

cseppfolyós ammóniás közegben fém nátriummal végzik a redukálást, közben az aromás

A-gyűrű változatlan formában marad és különböző mértékben redukálódott

melléktermékek keletkeznek [43].

4.1.3. Ösztradiol-metiléter-acetát

Az ösztradiol-metiléter-acetátot (3-metoxi-ösztradiol-17β-acetát, ÖDME-acetát)

egy olyan 4-lépéses szintézissel állítják elő molonból (metil-szeko-olonból), amelyben a

köztes intermediereket nem izolálják. A szintézis lépései: acilezés, gyűrűzárás, katalitikus,

valamint ionos redukció (9. ábra).

29

OCH3

CH3

OH

O

molon metil-szeko-olon

→ O

CH3

CH3

O

O

CH3

O

1

→

OCH3

CH3

OCH3

O

2

gyűrűzárás acilezés

→ O

CH3

CH3

O

H

CH3

O

3

→O

CH3

CH3

O

HH

H

CH3

O

ÖDME-acetát

redukció redukció

9. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát előállításának lépései

A reakció lépéseit GC-vel és OPLC-vel követtük nyomon. A 9. ábrán 2-vel és 3-

mal jelölt intermedierek, valamint az ÖDME-acetát csak egy-egy kettős kötés meglétében

különböznek egymástól. GC-vel a 2-es és 3-as intermedierek nem váltak el egymástól (10.

ábra). OPLC-vel viszont legnehezebbnek az ÖDME-acetát és a 3-as intermedier

elválasztása bizonyult. Ezt finomszemcsés (HPTLC) szilikagél szorbensen, jelentős

túlfuttatás segítségével sikerült megoldani. Az RF-értékük azonban még így is

meglehetősen közelinek bizonyult, eltérő UV-elnyelésük miatt 254 nm-en és kénsavas

előhívást követően látható fényben különböző színük miatt mégis jól elkülöníthetők és

értékelhetők (11. és 13. ábra). A 2-es és 3-as intermedierek eltérő hullámhosszon mutatott

maximális UV-elnyelése miatt lehetőség van a 3-as intermedier spektrofotometriás

értékelésére is pl. 325 nm-en, ahol a 2-es intermediernek már nincs UV-elnyelése (12.

ábra). A reakció során melléktermékként Δ8(14)-ÖDME-acetát keletkezik, amely GC-vel jól

értékelhető. OPLC-vel az elválása a 3-as intermediertől nem tökéletes, de mennyisége

vizuálisan becsülhető az eltérő mértékű UV-elnyelés miatt (13. ábra). A 3-as intermedier

főbb szennyezéseit különböző módszerekkel mérve és értékelve a 2. táblázatban tüntettem

fel az eredményeket.

30

2-es, 3-as intermedier

Δ8(14)-ÖDME-acetát

10. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát GC kromatogramja

a b c d e f g h i j

UV366

3. intermedier

2. intermedier

a b c d e f g h i j

UV366, kénsavas előhívás után

2. intermedier

3. intermedier

Δ8(14)-származék

Felvitel:

a-d 1,0 – 0,1 μg 2. intermedier e-f 10 és 5 μg 3. intermedier g-j 0,1 – 1,0 μg Δ8(14)-származék

11. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát OPLC kromatogramjáról készített felvételek

31

12. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát intermedierjeinek UV-spektruma

2. táblázat. Az ösztradiol-metiléter-acetát intermedierjének és Δ8(14)-származékának

különböző technikákkal mért mennyisége

OPLC GC UV-

spektrofotometria λ=325 nm

2. intermedier 5,5% nem válik el 4,2%

Δ8(14)-származék 4,0% 4,5% szelektíven nem mérhető

4.1.4. Molon

A molon (metil-szeko-olon) → ÖDME-acetát átalakítások redukciós lépésénél a

reakció előrehaladását követtük GC-vel és OPLC-vel [46]. Az előhívást követő 366 nm-es

értékeléssel az ÖDME-acetát szennyezés foltjai értékelhetők. A reakció időbeli

követésekor összevetettük a kétféle kromatogramon a növekvő, ill. csökkenő csúcsokat /

foltokat (13. ábra). A szorbensen levő anyag egyes foltjairól reflexiós UV-spektrumot

vettünk fel.

Az OPLC kromatogramokon látható X-jelű szennyezést a GC-vel kapott csúcsok

között is megtaláltuk (14. ábra) [46]. A tömegspektrometriás azonosítás szerint az ÖDME-

acetáthoz hasonlóan 328-as molekulatömegű anyagról van szó [47]. Végül mágneses

32

magrezonancia spektroszkópiával (NMR) sikerült ténylegesen azonosítani, eszerint ez a

szennyezés a 8β,9α térszerkezetű ÖDME-acetát 8β,9β-izomerje [48].

UV254 előhívás után UV366 és látható fényben

1 2 3 4 5 6 7

ÖDME-acetát

3. intermedier

1 2 3 4 5 6 7

Δ8(14)-ÖDME-acetát ÖDME-

acetát

3. intermedier X

1 2 3 4 5 6 7

X

ÖDME-acetát

3. intermedier

Δ8(14)-ÖDME-

Felvitel:

1 25 μg 3. intermedier reakcióelegy 2 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 0 min. 3 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 10 min. 4 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 20 min. 5 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 30 min. 6 25 μg ÖDME-acetát reakcióelegy 70 min. 7 25 μg ÖDME-acetát

13. ábra. Az ösztradiol-metiléter-acetát OPLC kromatogramjáról készített felvételek

33

0 min 10 min

0.0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 0.07

19.05

38.02

57.0

75.98

94.95

mVolt

min

3. intermedier

ÖDME-acetát


X

0.0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0 min -1.3

23.7

48.8

73.8

98.8

123.8

mVolt


X3. intermedier

ÖDME-acetát

14. ábra. A molon → ÖDME-acetát átalakítás gázkromatogramjai

A többlépcsős szintézis kiindulási anyaga a molon, amit fermentációs úton állítanak

elő metil-szekodionból. A molont HPLC-vel és OPLC-vel vizsgáltuk. A gázkromatográfia

során hő hatására bomlás történik, ezért ezzel a módszerrel nem mérhető (15. ábra) [44].

hőbomlás terméke

molon

15. ábra. A molon gázkromatogramja

34

OPLC-vel különböző minőségű molon tételeket vizsgáltam (16. ábra). A tételek

HPLC-vel történő vizsgálatakor az OPLC kromatogramokon látható egyik jelentős

szennyezést (X-szennyezést) nem tudtuk detektálni. A HPLC-módszer kismértékű

módosításával a szennyezés elválasztása sikerült. A 16. ábrán szereplő „b”-jelű minta régi

és új HPLC-módszerrel készített kromatogramja látható a 17. ábrán.

a b c d e f g h i

kénsavas előhívás után 366 nm

X

16. ábra. Különböző minőségű molon tételek OPLC kromatogramja

1. „régi” módszer

35

X-szennyezés

2. „új” módszer

17. ábra. A „b”-jelű molon minta régi és új HPLC kromatogramja

A molon rendkívül érzékenynek bizonyult a savnyomokra, azonnali bomlása

követezik be sav hatására. Ilyenkor közvetlenül a főfolt alatti, a molonra egyébként is

jellemző szennyezés keletkezik (X), amelyet NMR-rel azonosítottak. A molonban 9-11

helyzetű kettős kötés a bomlástermékben 8-9 helyzetbe került [48].

Az OPLC és HPLC-módszerek együttes alkalmazása lehetővé tette egy addig

ismeretlen szennyezés azonosítását, valamint keletkezési körülményeinek felderítését.

4.1.5. A szteroidszintézissel kapcsolatos eredmények

A végtermékekben is megtalálható szennyezések nagy része a Birch-redukcióból és

az azt követő savas hidrolízisből származik. Ekkor keletkeznek a különböző mértékben

redukált származékok és melléktermékek.

Az 1. táblázatot kiegészítve az intermedierekben is megtalálható tipikus

szennyezésekkel, a következő eredményre jutottam:

36

3. táblázat. Szteroid hatóanyagok és intermedierek jellegzetes szennyezései

6-OH 6-keto Δ8(14) Δ5(10) 4,5-dihidro tájékoztató relatív RF-értékek* 0,0 – 0,3 0,4 – 0,8 0,9 – 1,2 1,3 – 1,5 1,0 – 1,6

Etinil-ösztradiol + + Δ9(11) - - Noretiszteron + + - + + Allilösztrenol 3-OH 3-keto + - +

általam kimutatott komponensek ÖDME-acetát - - + - - Dienoléter ** ** + - + Nandrolon + ** + + + Nandrolon-dekanoát + + + + + * az adott főkomponensre vonatkoztatva ** standard anyag nem állt rendelkezésre az azonosításhoz, RRF alapján azonosítva

37

4.2. Előhívások

A vékonyrétegkromatogramok értékelésére számos lehetőség van. Amennyiben

színtelen anyagokat vizsgálunk, UV-fényben vizuálisan ellenőrizhetjük a mérendő anyag

UV-elnyelését, ill. saját fluoreszcenciáját 254, ill. 366 nm-en. A legelterjedtebben használt

szilikagél szorbensek fluoreszcens adalékot tartalmaznak, így a rövid hullámhosszú, nagy

energiájú ultraibolya fény (254 nm) hatására zöldes színnel fluoreszkáló háttéren az UV-

elnyelést mutató vizsgálandó anyag gyengíti a fluoreszcenciát és sötét foltként jelentkezik.

Amennyiben a mérendő minta nem mutat UV-elnyelést, kémiai reakciókkal segítik elő a

foltok megjelenését. Szteroidok esetében leggyakrabban savas előhívó reagenseket

használnak, amelyeket bepermetezéssel vagy bemerítéssel juttatnak a réteglapra. A reakció

lejátszódásának meggyorsításához szükséges lehet a réteglap bizonyos ideig történő

melegítése. A használt reagenstől függően látható fényben vagy hosszú hullámhosszú (366

nm) UV-fényben értékeljük a kromatogramot. Gyakori savas előhívó reagens a kénsavas

etanol, amelynek segítségével 366 nm-en különböző színnel fluoreszkáló foltokat kapunk.

Az egyes komponensekre vagy tipikus szerkezetekre utaló színek a minőségi

meghatározásban, azonosításban jelentenek segítséget.

Bepermetezéses előhívó technika esetén a vékonyrétegkromatográfiás foltok

egyenletes megjelenítéséhez a reagensoldatot apró cseppekben, aeroszol formában juttatjuk

a réteglapra speciális geometria szerint (Waldi-elrendezés) [49]. A reagens homogén

eloszlása következtében kisebb a zaj, ezáltal jobb kimutatási határ válik lehetővé. A

bepermetezést, bemerítést követő melegítési időt nem mindig definiálják pontosan,

gyakran „amíg a foltok megjelennek” utasítás szerepel a módszerleírásokban.

Szteroidok tisztaságvizsgálatára a gyógyszerkönyvek általában 10-20%-os kénsavas

etanolos oldatot javasolnak [50-51], amennyiben nem tartalmaz ettől eltérő utasítást az

adott anyagra vonatkozó cikkely. Azonossági vizsgálathoz 2-20%-os kénsavas etanollal

történő bepermetezés az előírás. A bepermetezést követő melegítési hőmérsékletet és időt

is definiálják, ez általában 100-120°C-on 5-15 perc melegítést jelent.

Az Európai Gyógyszerkönyv a noretiszteron VRK tisztaságvizsgálatához 20%-os

kénsavas etanolt ír elő majd 100-105°C-on 5 perces melegítést [52]. Az Amerikai

Gyógyszerkönyv pedig 30%-os kénsavas metanolt, valamint 100°C-on 5 percig való

melegítést ír elő [53].

38

Ugyanakkor gyártásközi ellenőrzésnél vagy intermedier-vizsgálatnál a Richter

Gedeon Nyrt. üzemi laboratóriumaiban gyakran alkalmaznak 50%-os kénsavas etanolos

reagenst is előhívószerként. Ez kevésbé egyenletes reagenseloszlást eredményez,

kedvezőtlenül hat az egyes foltok kimutathatóságára.

Zarzycki és munkatársai koleszterinre és rokonvegyületeire a gyógyszerkönyvi

foszformolibdénsavas előhívást optimalizálták. Kísérleteik alapján szilikagél szorbensen

50-60°C-on 20 percig történő melegítés adott maximális intenzitást [54].

Kísérleteim során néhány szteroid alapanyag modellelegye esetében vizsgáltam

meg az optimális előhívási körülményeket. Különböző előhívó reagenseket használtam,

különböző ideig és különböző hőmérsékleteken végeztem a bepermetezést követő

melegítést.

A modellelegy valamennyi szteroidja az ún. metilsor anyagai közül került ki.

Kiválasztásuknál figyelembe vettem, hogy legyen eltérő a mozgékonyságuk az elválasztás

és a jobb összehasonlíthatóság érdekében, valamint legyenek közös oldatból

kromatografálhatók. Vannak közöttük azonos váz mellett a C17-es oldalláncban eltérő

szerkezetűek, vagy az A-gyűrűben és a C3-as szubsztituensében eltérő szerkezetűek. A

következő hét szteroid alapanyagot tanulmányoztam: nandrolon, noretiszteron, etinil-

ösztradiol, noretiszteron-acetát, dienoléter, noretiszteron-önantát és nandrolon-dekanoát. A

szerkezeti képleteik a 19. ábrán láthatók.

39

H3C

HO

C CH

OH

Etinil-ösztradiol

Noretiszteron

C CH

OH

O

H3CC CH

O

O

H3C

CCH3

O

Noretiszteron-acetát

C CH

O

O

H3C

C(CH2

O

)5 CH3

Noretiszteron-önantát

O

OHH3C

NandrolonO

OH3C

Nandrolon-dekanoát

O

OH

H3C

H3C

Dienoléter

CO

(CH2)8 CH3

19. ábra. Az előhívási modellelegyben levő szteroidok szerkezeti képletei

4.2.1. Az előhívási kísérletek során készített kromatogramok

Három különböző minőségű előhívó reagenst használtam: kénsavas,

foszformolibdénsavas és foszforsavas etanolos oldatokat. Összehasonlítottam a különböző

reagensek azonos – 10%-os – koncentrációjú oldatával kapott eredményeket, valamint a

legelterjedtebben használt kénsavas reagens különböző koncentrációjú – 10%, 30% és

50%-os – oldatával kapott eredményeket. A bepermetezést követő melegítést

szabályozható hőmérsékletű kalibrált kerámialapon végeztem a 10%-os kénsavas reagens

esetében 60, 80, 100, 120 és 140 °C-on, 2, 5, 10, 20 valamint 30 percen át. A foszforsavas,

a foszformolibdénsavas, a 30% és az 50%-os kénsavas reagens esetében 80, 100, 120 és

140°C-on 2, 5, 10 és 20 percig végeztem a hevítést.

Az így előhívott kromatogramok képét videodokumentációs rendszer segítségével

rögzítettem, majd a VideoScan szoftver segítségével videodenzitogramokat készítettem. A

kapott csúcsterületeket szintvonalas grafikonokon ábrázoltam a hőmérséklet és az idő

függvényében.

40

A 20-24. ábrákon bemutatásra kerülő, különböző reagenssel előhívott

kromatogramok videofelvételei a jobb összehasonlíthatóság kedvéért valamennyi esetben

120 °C-on 2 percen át történő melegítés után készültek. Mellettük ugyanezen

kromatogramok videodenzitogramjai következnek.

1

2

3

4

5

6

7

RF

1

2 3 4

5

6

7

20. ábra. 10% kénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és

videodenzitogramja

1

2 3

4 5

6

7

RF

1

2

3

4

5

6

7

21. ábra. 10% foszforsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és

videodenzitogramja

41

1

2

3

4 5

6 7

RF

1 2 3 4 5

6

7

22. ábra. 10% foszformolibdénsavas etanollal előhívott kromatogram videofelvétele és

videodenzitogramja

1

2

3

4

5

6

7

RF

1

2

3

4

5

6

7


videodenzitogramja

42

1

2

3

4

5

6

7

RF

1

2

3

4

5

6

7


videodenzitogramja

4.2.2. Az előhívási kísérletek során mért csúcsterületek

A 4-8. táblázatokban szerepelnek az egyes szteroidokhoz tartozó csúcsterületek

értékei.

43

4. táblázat. Videodenzitometriás csúcsterületek függése a hevítési időtől és hőmérséklettől

10% kénsavas etanollal való előhívás után

Nandrolon 60°C 80°C 100°C 120°C 140°C

2 perc 0 1370 19100 34200 6800 5 perc 0 9630 20600 24800 5920

10 perc 640 14000 12100 4760 2280 20 perc 1030 19800 10900 0 -* 30 perc 15300 10700 7950 0 -*

Noretiszteron 2 perc 570 6040 9480 14600 0 5 perc 4420 8360 7420 6750 0

10 perc 6740 8750 2140 0 0 20 perc 7860 8220 1200 0 -* 30 perc 6930 2720 0 0 -*

Etinil-ösztradiol 2 perc 2280 36900 37200 16900 1390 5 perc 14900 34300 29100 6880 1260

10 perc 21900 29400 10800 0 0 20 perc 19000 29000 10900 0 -* 30 perc 17200 13500 2710 0 -*

Noretiszteron-acetát 2 perc 3280 8940 18400 24100 0 5 perc 8200 12700 17100 7820 0

10 perc 9440 15400 1910 0 0 20 perc 9220 17800 3790 0 -* 30 perc 8900 6600 0 0 -*

Dienoléter 2 perc 2170 11400 30000 48900 14700 5 perc 3200 16600 29200 26800 14100

10 perc 6480 20400 12800 9760 5550 20 perc 6360 26100 16400 5420 -* 30 perc 7550 18100 12200 1800 -*

Noretiszteron-önantát 2 perc 620 8500 18300 21000 0 5 perc 4580 11600 14000 4440 0

10 perc 8180 15400 1930 0 0 20 perc 7380 17500 3570 0 -* 30 perc 7510 6640 0 0 -*

Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 680 7920 60800 9552 5 perc 0 1500 18800 33800 11100

10 perc 0 4330 17600 5760 1090 20 perc 0 9320 21100 3880 -* 30 perc 0 11600 12600 1120 -*

* értékelhetetlen eredmények a magas hevítési hőmérséklet miatt

44


10% foszforsavas etanollal való előhívás után

Nandrolon 80°C 100°C 120°C 140°C 2 perc 0 0 800 1690 5 perc 0 0 1600 4330

10 perc 0 940 2110 4710 20 perc 0 2070 2990 5810

Noretiszteron 2 perc 2620 15300 10900 6930 5 perc 13400 10900 6830 5210

10 perc 15100 8470 7630 2660 20 perc 13400 8200 4670 1030

Etinil-ösztradiol 2 perc 5490 39800 34000 22100 5 perc 36700 36100 18000 7230

10 perc 37200 25400 13800 2100 20 perc 31200 17400 7130 0

Noretiszteron-acetát 2 perc 7450 12600 11300 10200 5 perc 18300 10200 10300 7270

10 perc 12400 9140 10100 5450 20 perc 10400 9750 6840 2610

Dienoléter 2 perc 3470 15700 29900 32300 5 perc 12300 28200 32300 24600

10 perc 21800 32500 28400 14300 20 perc 22700 32400 20200 6590

Noretiszteron-önantát 2 perc 5160 7680 7610 6720 5 perc 9980 6420 6500 4730

10 perc 6600 5510 6930 2720 20 perc 5540 5850 5030 720

Nandrolon-dekanoát 2 perc 0 0 0 0 5 perc 0 0 850 1770

10 perc 0 0 1200 3060 20 perc 0 0 1640 3150

45


10% foszformolibdénsavas etanollal való előhívás után


10 perc 3090 4550 5060 3550 20 perc 5740 7250 4340 2720


10 perc 6240 6100 5300 5140 20 perc 9820 6980 5220 3920


10 perc 7650 7970 5400 5180 20 perc 12660 9410 5980 4290


10 perc 6680 8540 8110 5980 20 perc 9480 8150 7830 3330


10 perc 8040 8240 9330 5370 20 perc 9780 8130 8240 4020


10 perc 5670 6120 6670 4810 20 perc 8060 6560 6360 4970


10 perc 1240 2590 2400 3000 20 perc 2070 3310 3390 2160

46




10 perc 12900 10600 3200 0 20 perc 14100 7700 1480 0


10 perc 5030 0 0 0 20 perc 5140 0 0 0


10 perc 34000 6450 0 0 20 perc 26000 4760 0 0


10 perc 8060 1160 0 0 20 perc 3820 0 0 0


10 perc 11400 11100 3610 0 20 perc 13800 9210 0 0


10 perc 6460 0 0 0 20 perc 2650 0 0 0


10 perc 3440 6970 780 0 20 perc 7460 5340 0 0

47

48



Nandrolon 80°C 100°C 120°C 140°C

2 perc 1880 8380 9840 5370 5 perc 3410 12400 6910 0

10 perc 6020 16100 3420 0 20 perc 10900 13400 0 0


10 perc 2420 0 0 0 20 perc 1820 0 0 0


10 perc 25700 6430 1340 0 20 perc 25700 4930 0 0


10 perc 4870 0 0 0 20 perc 5050 0 0 0


10 perc 14000 12900 6550 0 20 perc 20600 10300 0 0


10 perc 2310 0 0 0 20 perc 3340 0 0 0


10 perc 3030 10100 2560 0 20 perc 9480 5190 0 0

4.2.3. Az előhívási kísérletek során kapott szintvonalas ábrák

A 24-31. ábrák a vizsgált szteroidok jelintenzitásait mutatja szintvonalas

grafikonokon. Először a különböző minőségű, de azonos koncentrációjú reagenssel

előhívott kromatogramokról nyert adatokat hasonlítom össze (25-28. ábra), majd a

különböző koncentrációjú kénsavas reagenssel kapottakat (29-32. ábra).

Nandrolon

10% H2SO4/EtOH 10% H3PO4/EtOH 10% foszformolibdénsavas EtOH

60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

3500

7000

1,05E4

1,4E4

1,75E4

2,1E4

2,45E4

2,8E4

3,15E4

3,5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

600,0

1200

1800

2400

3000

3600

4200

4800

5400

6000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

Noretiszteron


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

1600

3200

4800

6400

8000

9600

1,12E4

1,28E4

1,44E4

1,6E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

1600

3200

4800

6400

8000

9600

1,12E4

1,28E4

1,44E4

1,6E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

1,1E4

1,2E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

25. ábra. A nandrolon és a noretiszteron különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

49

Etinil-ösztradiol


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

4000

8000

1,2E4

1,6E4

2E4

2,4E4

2,8E4

3,2E4

3,6E4

4E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

4000

8000

1,2E4

1,6E4

2E4

2,4E4

2,8E4

3,2E4

3,6E4

4E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

1,1E4

1,2E4

1,3E4

1,4E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)



60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

2600

5200

7800

1,04E4

1,3E4

1,56E4

1,82E4

2,08E4

2,34E4

2,6E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

2000

3800

5600

7400

9200

1,1E4

1,28E4

1,46E4

1,64E4

1,82E4

2E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

1,1E4

1,2E4

1,3E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

26. ábra. Az etinil-ösztradiol és a noretiszteron-acetát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

50

Dienoléter


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

5000

10000

1,5E4

2E4

2,5E4

3E4

3,5E4

4E4

4,5E4

5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

3500

7000

1,05E4

1,4E4

1,75E4

2,1E4

2,45E4

2,8E4

3,15E4

3,5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

4000

4900

5800

6700

7600

8500

9400

1,03E4

1,12E4

1,21E4

1,3E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)



60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

2200

4400

6600

8800

1,1E4

1,32E4

1,54E4

1,76E4

1,98E4

2,2E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

2000

2800

3600

4400

5200

6000

6800

7600

8400

9200

10000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

27. ábra. A dienoléter és a noretiszteron-önantát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

51

Nandrolon-dekanoát


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

7000

1,4E4

2,1E4

2,8E4

3,5E4

4,2E4

4,9E4

5,6E4

6,3E4

7E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

350,0

700,0

1050

1400

1750

2100

2450

2800

3150

3500

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

0

400,0

800,0

1200

1600

2000

2400

2800

3200

3600

4000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

28. ábra. A nandrolon-dekanoát különböző minőségű 10%-os előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

52

Nandrolon

10% H2SO4/EtOH 30% H2SO4/EtOH 50% H2SO4/EtOH

60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

3500

7000

1,05E4

1,4E4

1,75E4

2,1E4

2,45E4

2,8E4

3,15E4

3,5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

1600

3200

4800

6400

8000

9600

1,12E4

1,28E4

1,44E4

1,6E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

1800

3600

5400

7200

9000

1,08E4

1,26E4

1,44E4

1,62E4

1,8E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

Noretiszteron


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

1600

3200

4800

6400

8000

9600

1,12E4

1,28E4

1,44E4

1,6E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0

550,0

1100

1650

2200

2750

3300

3850

4400

4950

5500

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

280,0

560,0

840,0

1120

1400

1680

1960

2240

2520

2800

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

29. ábra. A nandrolon és a noretiszteron különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

53

Etinil-ösztradiol


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

4000

8000

1,2E4

1,6E4

2E4

2,4E4

2,8E4

3,2E4

3,6E4

4E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

4500

9000

1,35E4

1,8E4

2,25E4

2,7E4

3,15E4

3,6E4

4,05E4

4,5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

3500

7000

1,05E4

1,4E4

1,75E4

2,1E4

2,45E4

2,8E4

3,15E4

3,5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)



60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

2600

5200

7800

1,04E4

1,3E4

1,56E4

1,82E4

2,08E4

2,34E4

2,6E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

900,0

1800

2700

3600

4500

5400

6300

7200

8100

9000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

900,0

1800

2700

3600

4500

5400

6300

7200

8100

9000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

30. ábra. Az etinil-ösztradiol és a noretiszteron-acetát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

54

Dienoléter


60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

5000

10000

1,5E4

2E4

2,5E4

3E4

3,5E4

4E4

4,5E4

5E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

1600

3200

4800

6400

8000

9600

1,12E4

1,28E4

1,44E4

1,6E4

hőmérséklet (oC)idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

0

2200

4400

6600

8800

1,1E4

1,32E4

1,54E4

1,76E4

1,98E4

2,2E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)



60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

2200

4400

6600

8800

1,1E4

1,32E4

1,54E4

1,76E4

1,98E4

2,2E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

700,0

1400

2100

2800

3500

4200

4900

5600

6300

7000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

350,0

700,0

1050

1400

1750

2100

2450

2800

3150

3500

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

31. ábra. A dienoléter és a noretiszteron-önantát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

55

56

60 70 80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

25

30

0

7000

1,4E4

2,1E4

2,8E4

3,5E4

4,2E4

4,9E4

5,6E4

6,3E4

7E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 140

0

5

10

15

20

0

800,0

1600

2400

3200

4000

4800

5600

6400

7200

8000

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)

80 90 100 110 120 130 1400

5

10

15

20

0

1200

2400

3600

4800

6000

7200

8400

9600

1,08E4

1,2E4

hőmérséklet (oC)

idő

(min

)


Nandrolon-dekanoát

32. ábra. A nandrolon-dekanoát különböző koncentrációjú kénsavas előhívó reagenssel kapott jelintenzitása

4.2.4. Az előhívási kísérletek értékelése

Kénsavas reagens használata megkönnyíti a 366 nm-es UV-fényben történő

vizuális értékelést az egyes szteroidokra jellemző színnel fluoreszkáló foltok miatt. A

legtöbb vizsgált anyag esetében 120°C-on 2 percig történő melegítés bizonyult

megfelelőnek. Az etinil-ösztradiol azonban ilyen magas hőmérsékleten már megégett, 80-

100°C-on 2-5 percig tartva kaptam a maximális csúcsterületeket. Több anyag esetében is

kedvezőnek bizonyult az alacsonyabb hőmérsékleten (80-100°C) hosszabb ideig (10-20

perc) történő melegítés. A foltok intenzitása így ugyan valamivel kisebb, mint a maximális

intenzitást mutató 120°C-nál, de ez bizonyult a robosztusabb előhívási módnak. A

nandrolon és a nandrolon-dekanoát esetében azonban az alacsonyabb hőmérséklet nem volt

kedvező. Az elvégzendő feladattól függően rutin eljárásokhoz a megbízható teljesítményű,

robosztusabb 80°C-on 10-20 percen át tartó melegítést javaslom. Nagyobb érzékenységet

kívánó egyedi esetekben pedig a 120°C 2 perces kombinációt.

Foszforsavas reagens használatakor szintén eltérő színnel fluoreszkáló foltokat

kaptam, azonban a színek kevésbé jellemzőek, mint a kénsavas reagens esetében. Ebben az

esetben az értékelést az könnyíti meg, hogy sokkal egyenletesebb a réteglapok háttere,

kevésbé zajos videodenzitogramokat kaptam. Itt nagyobb eltérést tapasztaltam az egyes

szteroidok esetében. A legalacsonyabb hőmérséklet (80°C) a noretiszteron származékainak

kedvezett (-acetátnak és -önantátnak), míg magának a noretiszteronnak kissé magasabb

hőfok a kedvező (100°C). Az etinil-ösztradiol esetében 100°C-on 2-5 percig történő

melegítés az optimális. A nandrolon és a nandrolon-dekanoát pedig 140°C-on 10-20 perc

után jelent meg maximális intenzitással. A dienoléter esetében közel azonos területeket

kaptam 140°C 2 perc, 120°C 5 perc és 100°C 15-20 perc kombinációkban. A nandrolon és

származéka kivételével a foszforsavas előhívásnál még jelentősebb az a tendencia, hogy az

alacsonyabb hőmérséklet és a hosszabb melegítési idő is ugyanolyan kedvező lehet, mint a

magasabb hőmérsékleten rövidebb ideig történő melegítés.

Foszformolibdénsavas reagens használatakor látható fehér fényben történik az

értékelés. Ilyenkor a sárgás hátterű réteglapokon kékes színnel jelennek meg a foltok.

Valamennyi szteroid azonos színnel jelenik meg, amely a minőségi értékelésben nem jelent

kiegészítő információt, azonban a vizuális becslést és a videodenzitometriát megkönnyíti,

hiszen a foltok csupán méretükben és intenzitásukban különböznek egymástól. A kénsavas

reagenshez hasonlóan itt is a 120°C-on 2 percig történő melegítés bizonyult ideálisnak

leggyakrabban. Az etinil-ösztradiol esetében ezúttal is ennél alacsonyabb hőmérséklet volt

57

a kedvező (100°C 5 perc). A nandrolon és származéka pedig magasabb hőmérsékleten

(140°C-on) mutatott maximális intenzitást, akárcsak a foszforsavas reagens használatakor.

Ennek az előhívószernek a használata kívánja a legnagyobb gyakorlatot, bepermetezés

közben ugyanis könnyen megfolyhat a szorbensen, ezáltal a foltok is elmozdulnak.

Nehezebb egyenletesen és reprodukálhatóan bepermetezni a szorbenst a

foszformolibdénsavas előhívóval, mint a többi reagenssel.

A 30%, ill. az 50%-os kénsavas előhívó reagensek használatakor általános

tapasztalat, hogy kevésbé egyenletesen vihetők fel a szorbensre a nagyobb viszkozitású

oldatokból. Az alacsonyabb hőmérséklet több esetben bizonyult kedvezőbbnek, mint a

10%-os kénsavas reagensnél. A két legmagasabb hőmérsékletet (120-140°C-ot) igénylő

szteroid – a nandrolon és a nandrolon-dekanoát – esetében is elegendő a 100°C-on

hosszabb ideig történő melegítés.

A három különböző minőségű, de azonos koncentrációjú előhívó reagens esetében

120°C 2 perc kombináció bizonyult az általánosan használható előhívási körüménynek a

vizsgált szteroidokra. Nem minden esetben kaptam itt a legintenzívebb foltokat, azonban a

nandrolon-dekanoát kivételével valamennyi anyag detektálható volt ilyen körülmények

között. Ennek pontosítására meghatároztam a kimutatási határokat.

Csökkenő mennyiségű anyagot vittem fel a szorbensre és a még legkisebb látható

mennyiséget fogadtam el kimutatási határként. Ebben az esetben is a szteroidok közös

oldataiból dolgoztam. A kromatográfiás kifejlesztést követően a szorbenseket

bepermeteztem egy-egy előhívó reagenssel és 120°-on 2 percig történő melegítést

követően ellenőriztem az egyes szteroidokra jellemző kimutatási határ-értékeket,

amelyeket a 9. táblázatban foglaltam össze.

58

9. táblázat. Különböző szteroidok kimutatási határ-értékei eltérő minőségű reagenssel

történő előhívást követően

10% kénsavas etanol 10% foszforsavas etanol

10% foszformolibdén-

savas etanol Nandrolon 0,0075 μg 0,075 μg 0,0075 μg

Noretiszteron 0,01 μg 0,01 μg 0,0075 μg

Etinil-ösztradiol 0,01 μg 0,025 μg 0,075 μg Noretiszteron-acetát 0,025 μg 0,025 μg 0,01 μg

Dienoléter 0,01 μg 0,025 μg 0,025 μg Noretiszteron-önantát 0,025 μg 0,025 μg 0,025 μg

Nandrolon-dekanoát 0,01 μg > 0,1 μg 0,075 μg

A kénsavas és a foszformolibdénsavas előhívó reagens használata érzékenyebb

kimutatást tett lehetővé, mint a foszforsavasé. A várakozásoknak megfelelően a nandrolon-

dekanoát, amely foszforsavas előhívással csak 140 °C-os hőmérsékletnél jelent meg, a

kimutatási határ vizsgálatának hőmérsékletén nem volt kimutatható a vizsgált mennyiségek

egyikében sem.

Összegzésként elmondható, hogy a 10%-os kénsavas és foszformolibdénsavas

előhívás általánosságban azonos érzékenységűnek bizonyult a vizsgált szteroidokra.

Szerkezeti sajátosságok miatt adódtak különbségek. Amíg a kénsavas előhívásnál jellemző

színük miatt könnyebb az egyes komponensek azonosítása, addig a foszformolibdénsavas

reagensnél a mennyiségi értékelés egyszerűbb.

A savas előhívások optimális körülményei kis mértékben változnak az

anyagtípustól függően. A planárkromatográfiás eljárások optimalizálásakor ezért nem csak

az eluens összetételét, hanem az előhívási körülményeket is optimalizálni kell.

59

4.3. Teljesítményjellemzők

Több szteroid anyag esetében különböző kromatográfiás rendszerek teljesítményét

hasonlítottam össze. A vizsgált anyagokra meglévő hagyományosan VRK

tisztaságvizsgálati módszerek mellett a nagyobb pontosságú meghatározásokat lehetővé

tevő OPLC és HPLC módszerek elválasztóképességét (Rs), elméleti tányérszámát (N),

valamint elméleti tányérmagasság-értékeit (H) vizsgáltam. Azokban az esetekben, amikor

gradiens programmal végzett elválasztásról volt szó, csak az elválasztóképességet

számoltam ki.

VRK és OPLC esetében a következő számolási képleteket alkalmaztam:

layer

xapp,F z

zR = (4.1)

ref

xF z

zRR = (4.2)

2

2x

w)z(16

N = (4.3)

x

2

z16wH = (4.4)

21

1x2xs ww

)zz(2R+−

= (4.5)

ahol zx: a komponens migrációs távolsága a felviteli helytől mérve

zlayer: a felvitel helye és az eluenskivezető csatorna közötti távolság

zref: a referencia anyag migrációs távolsága a felviteli helytől mérve

N: elméleti tányérszám

w: a csúcs alapvonalszélessége

H: elméleti tányérmagasság

Rs: csúcsfelbontás

HPLC esetében használt számolási képletek [55]:

2

2tR

545,5Nω

= (4.6)

NLH = (4.7)

60

12

1t2ts

RR18,1R

ωω +−

= (4.8)

ahol Rt: retenciós idő

ω: a csúcs félértékszélessége

L: oszlophossz

Az összehasonlítás alapját képező szteroidok az ún. „metilsor” anyagai közül

kerültek ki: noretiszteron, etinil-ösztradiol és nandrolon, a gesztodén azonban az

„etilsorba” tartozik.

A különböző módszerekkel végzett vizsgálatok kísérleti körülményei a 3.

fejezetben találhatók.

4.3.1. Etinil-ösztradiol

Az etinil-ösztradiol esetében az Európai és az Angol Gyógyszerkönyv 2000-ig

VRK tisztaságvizsgálati módszert írt elő, amelynek szelektivitása és pontossága elmarad a

kívánt szinttől (34-35. ábra). A lehetséges egyedi szennyezések közül az ösztronra (33.

ábra), mint utolsó intermedierre állapítottak meg limitet. Az Európai Gyógyszerkönyvhöz

2000-ben készült kiegészítés már HPLC tisztaságvizsgálati módszert írt elő, ezt az Angol

Gyógyszerkönyv is átvette, majd 2002-től szigorították a limiteket, amelyek jelenleg is

érvényesek. Az Amerikai Gyógyszerkönyv nem írja elő az etinil-ösztradiol

tisztaságvizsgálatát. Laboratóriumunkban kidolgozásra és validálásra került egy OPLC

módszer, amely lehetővé teszi az etinil-ösztradiol szennyezéseinek egymástól és a

főkomponenstől való szelektív elválasztását (36-37. ábra). Ugyanakkor egy HPLC

módszer is kidolgozásra került, amely a Gyár hivatalos előírása szerint az etinil-ösztradiol

tisztaságvizsgálatára jelenleg is alkalmazott módszer (38. ábra).

Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot, a

kapott kromatogramokat ábrázoltam, a számolt teljesítményjellemzőket táblázatokban

tüntettem fel (10-12. táblázat) [56-57]. Valamennyi esetben egységes számozással jelöltem

a különböző vegyületeket.

61

CH3

HO

OH

CH

H H

H

CH3

HO

OH

CH

H H

H

OH etinil-ösztradiol 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol

CH3

HO

OH

CH

H H

H

OH

CH3

HO

OH

CH

H H

H

O 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 6-keto-etinil-ösztradiol

HO

H H

H

CH3OH

O

HOH H

H

CH3OH

CH

ösztradiol 16-keto-etinil-ösztradiol

HO

H

H

CH3OH

CH

HO

H H

OHH

CH3

CH

Δ9(11)-etinil-ösztradiol 17-epi-etinil-ösztradiol

ösztron HO

O

H H

H

CH3

33. ábra. Az etinil-ösztradiol és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

62

2 3 5 8 9 1 4 a b 7 6

Felvitelek:

1 0,5 μg 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 2 0,5 μg 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 3 0,5 μg 6-keto-etinil-ösztradiol 4 0,5 μg ösztradiol 5 0,1 μg 16-keto-etinil-ösztradiol 6 0,5 μg Δ9(11)-etinil-ösztradiol 7 100 μg etinil-ösztradiol (EÖD) 8 0,5 μg 17-epi-etinil-ösztradiol 9 0,5 μg ösztron a 0,1 μg 16-keto-EÖD + 0,5 μg EÖD +

+ 0,5-0,5 μg minden egyéb szennyezésből b 100 μg etinil-ösztradiol + 0,5-0,5 μg minden szennyezésből

34. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK kromatogramjáról készített fotó

RF

35. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram

10. táblázat. A VRK technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők

RF RRF N H (μm) Rs

1 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,24 0,57 1024 70,3 - 2 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,26 0,62 1079 72,3 0,65 4 ösztradiol 0,36 0,86 2535 42,2 3,22

3,5,6,7

6-keto-EÖD, 16-keto-EÖD, Δ9(11)-EÖD, EÖD 0,42 1,00 940 134,5 1,56

8 17-epi-etinil-ösztradiol 0,46 1,10 2330 57,0 0,45 9 Ösztron 0,50 1,19 2742 52,5 1,02 =H 71,5 μm

63

Felvitelek:

1 0,5 μg 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol

2 1 3 5 b 7 a 8 6 9 4

2 0,5 μg 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 3 0,5 μg 6-keto-etinil-ösztradiol 4 0,5 μg ösztradiol 5 0,1 μg 16-keto-etinil-ösztradiol 6 0,5 μg Δ9(11)-etinil-ösztradiol 7 100 μg etinil-ösztradiol (EÖD) 8 0,5 μg 17-epi-etinil-ösztradiol 9 0,5 μg ösztron a 0,1 μg 16-keto-EÖD + 0,5 μg EÖD +

0,5-0,5 μg minden egyéb szennyezésből b 100 μg etinil-ösztradiol + 0,5-0,5 μg minden

szennyezésből

36. ábra. Az etinil-ösztradiol OPLC kromatogramjáról készített fotó

RF

37. ábra. Az etinil-ösztradiol OPLC kromatogramjáról készített videodenzitogram

11. táblázat. Az OPLC technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők

RF,app RRF N H (μm) Rs

1 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0.03 0.05 64 62.5

2 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0.05 0.09 154 50.4 1.67

3 6-keto-etinil-ösztradiol 0.22 0.38 784 40.2 6.79 4 Ösztradiol 0.36 0.62 4807 10.8 5.47 5 16-keto-etinil-ösztradiol 0.42 0.72 3782 16.3 2.71 6 Δ9(11)-etinil-ösztradiol 0.53 0.91 5929 13.0 3.88 7 etinil-ösztradiol 0.58 1.00 9773 8.9 2.53 8 17-epi-etinil-ösztradiol 0.67 1.16 10050 10.0 3.67 9 Ösztron 0.72 1.24 11664 9.3 1.94 H 24,6 μm =

64

38. ábra. Az etinil-ösztradiol HPLC kromatogramja

min0 5 10 15 20 25 30 35

mAU

0

10

20

30

40

VWD1 A, Wavelength=280 nm (EED0128\037-0901.D)

4.5

49

4.7

37

5.3

85

7.3

02

9.1

73

14.

905

16.

072

17.

226 1

8.51

6

20.

580

26.

219

9 7

6

4 5 1

2

3 8

12. táblázat. A HPLC technikával végzett vizsgálatból származó teljesítményjellemzők

ω [min] Rt [min] N H [μm] Rs

2 6α-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,1133 4,544 8919 28,0 -

1 6β-hidroxi-etinil-ösztradiol 0,1222 5,379 10744 23,3 4,18

3 6-keto-etinil-ösztradiol 0,1731 7,288 9829 25,4 7,63 5 16-keto-etinil-ösztradiol 0,1879 9,151 13152 19,0 6,09 4 ösztradiol 0,2768 14,878 16020 15,6 14,54 6 Δ9(11)-etinil-ösztradiol 0,3025 16,033 15577 16,0 2,35 7 etinil-ösztradiol 0,3384 18,472 16522 15,1 4,49 9 Ösztron 0,3644 20,531 17602 14,2 3,46 8 17-epi-etinil-ösztradiol 0,4602 26,149 17903 14,0 8,04 H 19,0 μm =

A 39. ábrán összehasonlítottam néhány tétel tisztaságvizsgálatához szükséges

analízisidőt a különböző módszerek esetében. Mindegyik módszernél a vizsgálandó

tételekből két bemérés – azaz két minta – készült, a HPLC-nél mintánként két injektálás

történt. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és

rendszerelkalmassági felvitelt, illetve injektálást.

Az OPLC és a VRK-módszer esetében egy szorbensen 3 tétel párhuzamos mintái

vizsgálhatók a standard anyagok mellett egyidejűleg. Sávos mintafelvitellel egy 20x20 cm-

es méretű réteglapra körülbelül 12 minta vihető fel. Egy kromatogram OPLC-vel történő

65

kifejlesztéséhez szükséges idő 30 perc, a VRK-hoz kb. 60 perc, míg a HPLC-hez 400-600

perc volt a vizsgálandó tételek számának függvényében.

0

100

200

300

400

500

600

idő

(min

)

1 2 3vizsgált tételek

TLCOPLCHPLC

39. ábra. Az etinil-ösztradiol VRK, OPLC, ill. HPLC technikával végzett

tisztaságvizsgálatának időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében

Értékelés

A három különböző kromatográfiás módszer közül egyedül a VRK nem bizonyult minden

szennyezésre specifikusnak. Az egyes komponensek elválasztása a HPLC-nél bizonyult a

legjobbnak, de OPLC-vel is 1,5 feletti Rs-értéket kaptam minden egyes vizsgált

anyagpárra. Ezzel a két módszerrel specifikusan értékelhetők az etinil-ösztradiol lehetséges

szennyezései. Az OPLC módszer vizuális becslésen alapuló félkvantitatív módszer, a

HPLC pedig kvantitatív eredményeket szolgáltat, ezért a pontosság tekintetében különbség

van a két módszer között.

A tányérmagassági értékekből látható, hogy hatékonyságában az OPLC és a HPLC

módszer összemérhető, a VRK azonban elmarad ettől a szinttől. A tányérmagasság

átlagértékére ( H ) HPLC-nél 19 μm-t, OPLC-nél 25 μm-t kaptam, míg VRK-nál 72 μm-t,

ez megfelel az irodalomban található adatoknak [13].

A módszerek időigényében jelentős különbség van. Míg a VRK és OPLC kromatogramok

kifejlesztéséhez szükséges idő nem több, mint egy óra, addig a HPLC-nél három tétel

vizsgálata esetén már 10 óra a szükséges idő.

Az etinil-ösztradiol alapanyag tisztaságvizsgálatára az OPLC és HPLC módszer egyaránt

alkalmas. OPLC-vel gyors limit-tesztet, HPLC-vel nagy pontosságot igénylő vizsgálatokat

végezhetünk.

66

4.3.2. Noretiszteron

A noretiszteron esetében mind az Európai, mind az Amerikai Gyógyszerkönyv

VRK tisztaságvizsgálati módszert írt elő (41-42. ábra). Laboratóriumunkban kidolgoztunk

és validáltunk egy félkvantitatív OPLC tisztaságvizsgálati módszert, amelyet azóta a

hatóanyag minőségének ellenőrzésére használunk (43-44. ábra) [58]. Egy HPLC módszer

is kidolgozásra került (45. ábra). Mind az OPLC, mind a HPLC módszerrel specifikusan

vizsgálhatók a noretiszteron szennyezései, amelyek a 40. ábrán láthatók. A Norcolut

tabletta tisztaságvizsgálatához, amelynek hatóanyaga a noretiszteron, adaptáltuk az OPLC

módszert [59]. A továbbiakban a készítmény minőségellenőrzésére ezt a módszert

használjuk. 2006-ban lépett életbe az Európai Gyógyszerkönyvben egy új HPLC-módszer

az alapanyag tisztaságának ellenőrzésére [60].

67

O

H H

H H

H3COH

C CH

OHO

H H

H H

H3COH

C CH

noretiszteron 6β-hidroxi-noretiszteron

O

H H

H H

H3COH

C CH

OH O

H

H H

H3COH

C CH

OH

6α-hidroxi-noretiszteron 10β-hidroxi-noretiszteron

O

H

H H

H3COH

C CH

H

OO

H

H H

H3C

H

O

Δ4-nordion 6-keto-noretiszteron

O

H

H H

H3C

H

C CHOH

17-epi-noretiszteron

40. ábra. A noretiszteron és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

68

Felvitelek:

4 7 5 3 2 1 a b c d 6

1 0,5 μg 6β-hidroxi-noretiszteron 2 0,5 μg 6α-hidroxi-noretiszteron 3 0,5 μg 10β-hidroxi-noretiszteron 4 0,5 μg Δ4-nordion 5 0,5 μg 6-keto-noretiszteron 6 50 μg noretiszteron 7 0,5 μg 17-epi-noretiszteron a placebo b 0,5-0,5 μg noretiszteron és minden szennyezés c 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából és

0,5-0,5 μg a szennyezésekből d 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából

41. ábra. A noretiszteron és Norcolut tabletta VRK kromatogramjáról készített felvétel

1-3

5 6-7

4

42. ábra. A noretiszteron VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram

Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot,

táblázatokban tüntettem fel a számolt teljesítményjellemzőket. (13-15. táblázat).

13. táblázat. A VRK technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők

RRF Rs H (μm) 1 6β-hidroxi-noretiszteron 0,19 - 344 2 6α-hidroxi-noretiszteron 0,19 0,0 344 3 10β-hidroxi-noretiszteron 0,19 0,0 344 5 6-keto-noretiszteron 0,81 4,73 91 6 Noretiszteron 1,00 1,33 69 7 17-epi-noretiszteron 1,00 0,0 69 4 Δ4-nordion 1,28 1,64 106 =H 195 μm

69

Felvitelek:

1 0,5 μg 6β-hidroxi-noretiszteron

4 7 5 3 2 1 a b c d e

2 0,5 μg 6α-hidroxi-noretiszteron 3 0,5 μg 10β-hidroxi-noretiszteron 4 0,5 μg Δ4-nordion 5 0,5 μg 6-keto-noretiszteron 6 50 μg noretiszteron 7 0,5 μg 17-epi-noretiszteron a placebo b 0,5-0,5 μg noretiszteron és minden szennyezés c 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából és

0,5-0,5 μg a szennyezésekből d 50 μg noretiszteron Norcolut tablettából e 50 μg noretiszteron

43. ábra. A noretiszteron és Norcolut tabletta OPLC kromatogramjáról készített felvétel

1 2

3

4 5 6 7

44. ábra. A noretiszteron OPLC kromatogramjáról készített videodenzitogram

14. táblázat. Az OPLC technikával végzett vizsgálatból számolt teljesítményjellemzők

RRF Rs H (μm) 1 6β-hidroxi-noretiszteron 0.32 - 55 2 6α-hidroxi-noretiszteron 0.36 0.48 44 3 10β-hidroxi-noretiszteron 0.47 2.69 45 4 Δ4-nordion 0.72 6.58 14 5 6-keto-noretiszteron 0.83 2.00 37 6 Noretiszteron 1.00 2.87 18 7 17-epi-noretiszteron 1.13 3.12 14 =H 32 μm

70

2 1 3

5 4

6 7

HPLC

45. ábra. A noretiszteron HPLC kromatogramja

15. táblázat. A HPLC technikával végzett vizsgálatból származó teljesítményjellemzők

RRt Rs

2 6α-hidroxi-noretiszteron 0.20 - 1 6β-hidroxi-noretiszteron 0.22 1.84 3 10β-hidroxi-noretiszteron 0.30 5.63 5 6-keto-noretiszteron 0.73 23.27 4 Δ4-nordion 0.92 6.94 6 Noretiszteron 1.00 2.98 7 17-epi-noretiszteron 1.45 16.25

Az oszlopkromatográfiás kifejlesztés gradiens programmal történik, ezért

tányérmagasság értékeket (H) ebben az esetben nem adtam meg.

A 46. ábrán mutatom be a noretiszteron tisztaságvizsgálatához szükséges

analízisidő alakulását különböző módszerekkel végezve az elemzést. A VRK és OPLC

esetében a mintafelvitel idejét is figyelembe vettem. Mindegyik módszernél a vizsgálandó

tételekből két bemérés – azaz két minta – készült, a HPLC-nél mintánként két injektálás

történt. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és


71

0

200

400

600

800

1000

1200

idő

(min

)1 2 3

vizsgált tételek

TLCOPLCHPLC

46. ábra. A noretiszteron VRK, OPLC, ill. HPLC technikával végzett


Az OPLC-módszerhez szükséges idő 30-40 perc, a VRK-hoz kb. 60 perc, míg a

HPLC-hez 600-1200 perc volt az analízisidő a vizsgálandó tételek számának

függvényében.

Értékelés

A VRK módszer szelektivitása nem megfelelő a noretiszteron hatóanyag és a Norcolut

tabletta tisztaságának vizsgálatára. A fotódokumentációs rendszer a kékes színű foltokat

kis mértékben torzítja, intenzívebbnek tűnnek a foltok a videofelvételen vizuális becsléssel,

mint a kromatogramon. Ennek következtében – jóllehet vizuálisan elkülöníthetők

egymástól a 6-hidroxi-noretiszteron szennyezések az OPLC módszerrel készített

kromatogramon – videodenzitometriás értékeléssel Rs=0,5-ös csúcsfelbontás értéket

kaptunk. A HPLC módszerrel valamennyi komponenspár esetében megfelelő – 1,5-nél

nagyobb – elválasztást tapasztaltunk. A két utóbbi módszer különböző értékelési módját

figyelembe véve a szelektivitásuk megfelelőnek mondható.

Hatékonyság tekintetében az OPLC és a HPLC módszer összemérhető. Az átlagos

tányérmagasság OPLC-nél 32 μm, a VRK-módszer a 195 μm-es átlagos tányérmagassági

értékkel jóval kevésbé hatékony.

A módszerek időigényét figyelembe véve VRK-val körülbelül egy óra alatt elkészíthetjük

a kromatogramot, OPLC-vel ennél is kevesebb időre (20 perc) van szükség, azonban

HPLC-vel 10-20 órára is szükség van az eredményhez.

72

A gyors limit tesztnek tekinthető OPLC módszernél valamennyi komponens mennyisége

megbecsülhető vizuálisan, a kvantitatív HPLC módszer pedig pontos meghatározást tesz

lehetővé.

4.3.3. Nandrolon

Több szteroid hatóanyag szintézisénél is kulcsintermedier a nandrolon.

Tisztaságvizsgálatára többféle módszer is használható [44].

Lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képleteit a 47. ábrán mutatom be.

CH3

HH

OH

HH

O

CH3

HH

OH

HH

OH

nandrolon 5α-4,5-dihidro-nandrolon CH3

H

OH

HH

O

CH3

H

OH

H

O nandrolon-Δ5(10)-izomer Δ8(14)-nandrolon

CH3

H

OH

HH

OCH3

CH3

HH

OH

HH

O

OH dienoléter 6β-hidroxi-nandrolon

CH3

H

OH

HH

OCH3

ösztradiol-metiléter

47. ábra. A nandrolon és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

A nandrolon tisztaságvizsgálatának egyik lehetősége egy VRK-módszer, amely azonban

nem minden szennyezésre specifikus (48-49. ábra). Az általam kidolgozott OPLC-

módszerrel valamennyi szennyezés szelektíven értékelhető (50-51. ábra).

73

Egy HPLC tisztaságvizsgálati módszer is kidolgozásra került. A szennyezések eltérő UV-

elnyelése miatt két hullámhosszon történik az értékelés, 210 és 225 nm-en. A 4,5-dihidro-

nandrolon azonban UV-detektorral nem mutatható ki (52. ábra).

Mindhárom tisztaságvizsgálati technikával elvégezve a specifikusságvizsgálatot,

táblázatokban tüntettem fel a számolt teljesítményjellemzőket. (16-18. táblázat).

2 3 4 5 6 7 a b 1 c

Felvitelek:

2 0,2 μg 5α-4,5-dihidro-nandrolon 3 0,2 μg nandrolon-Δ5(10)-izomer 4 0,2 μg Δ8(14)-nandrolon 5 0,2 μg dienoléter 6 0,2 μg 6β-hidroxi-nandrolon 7 0,2 μg ösztradiol-metiléter a 0,2 – 0,2 μg nandrolon és minden szennyezés b 50 μg nandrolon és 0,2 μg minden szennyezés 1 50 μg nandrolon c oldószer 48. ábra. A nandrolon VRK kromatogramjáról készített felvétel

RF

49. ábra. A nandrolon VRK kromatogramjáról készített videodenzitogram 16. táblázat. A VRK módszer teljesítményjellemzői

RF RRF Rs

6 6β-hidroxi-nandrolon 0,10 0,36 -

1, 4 Nandrolon, Δ8(14)-nandrolon 0,28 1,00 2,3

2, 3 4,5-dihidro-nandrolon, Δ5(10)-izomer 0,37 1,32 1,0

5, 7 dienoléter, ösztradiol-metiléter 0,47 1,68 1,1

74

Felvitelek:

2 3 4 5 6 7 a b c d

2 0,2 μg 5α-4,5-dihidro-nandrolon 3 0,2 μg nandrolon-Δ5(10)-izomer 4 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon 5 0,2 μg dienoléter 6 0,2 μg 6β-hidroxi-nandrolon 7 0,2 μg ösztradiol-metiléter a 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon és 0,2-0,2 μg

nandrolon és összes egyéb szennyezés b 25 μg nandrolon, 0,1 μg Δ8(14)-nandrolon

és 0,2-0,2 μg összes egyéb szennyezés c 25 μg nandrolon d 50 μg nandrolon

50. ábra. A nandrolon OPLC kromatogramjáról készített felvétel

RF

51. ábra. Az OPLC kromatogramról készített videodenzitogram

17. táblázat. Az OPLC-módszer teljesítményjellemzői

RF RRF Rs


1 Nandrolon 0,27 1,00 8,7

4 Δ8(14)-nandrolon 0,33 1,22 2,2

2 4,5-dihidro-nandrolon 0,43 1,59 5,2

3 Δ5(10)-izomer 0,46 1,70 0,8

7 ösztradiol-metiléter 0,63 2,33 5,8

5 dienoléter 0,72 2,67 1,5

75

λ = 210 nm

min0 10 20 30 40 50 60 70 80

mAU

-20

0

20

40

60

80

100

120

*DAD1 A, Sig=210,8 Ref=off (NAND1109\022-0301.D - NAND1109\021-0401.D)

16.

855 3

8.84

9

41.

732

50.

550

63.

370

68.

571

6

4

13

7

5

λ = 225 nm

min0 10 20 30 40 50 60 70 80

mAU

-20

0

20

40

60

80

100

120

*DAD1 B, Sig=225,16 Ref=off (NAND1109\022-0301.D - NAND1109\021-0401.D)

16.

855

38.

849

41.

732

50.

550

63.

370

68.

571

6 41

3

7

5

52. ábra. A nandrolon HPLC kromatogramja 210 és 225 nm-en

18. táblázat. A HPLC módszer teljesítményjellemzői 225 nm-en értékelve

Rt (perc) RRt Rs


4 Δ8(14)-nandrolon 38,8 0,93 54,1

1 Nandrolon 41,7 1,00 6,1

3 Δ5(10)-izomer 50,5 1,21 15,0

7 ösztradiol-metiléter 63,4 1,52 25,9

5 Dienoléter 68,6 1,64 11,8

76


tányérmagassági értékeket (H) ebben az esetben sem adtam meg.

A nandrolon tisztaságának mérésére gázkromatográfiás módszerrel is van lehetőség

[44]. A 4,5-dihidro-nandrolon pontosan mérhető ezzel a technikával, azonban maga a

nandrolon kismértékű bomlást szenved az injektorban és Δ5(10)-izomer keletkezik. Az 53.

ábrán mutatom be a GC kromatogramot, amelyen az egyes csúcsok számozása megegyezik

az előző nandrolon kromatogramokon látható számozással.

2

3

5

7

4 1

6

53. ábra. A nandrolon gázkromatogramja [44]

Az 54. ábrán mutatom be a különböző technikákkal végzett vizsgálatok

analízisidejének alakulását a vizsgált tételek számának függvényében. Valamennyi

módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés készült. A számolásnál figyelembe

vettem a szükséges standard és rendszerelkalmassági felviteleket, illetve injektálásokat.

77

Az OPLC és VRK módszerek esetében a kromatogram kifejlesztésének időigénye

általában 30-60 perc volt, a GC-módszernél 200-250 perc, azonban a HPLC-módszernél

1200 percig tartott három tétel vizsgálata.

0

200

400

600

800

1000

1200

idő

(min

)

1 2 3

vizsgált tételek

TLCOPLCHPLCGC

54. ábra. A nandrolon VRK, OPLC, HPLC és GC technikával végzett


Értékelés

A nandrolon tisztaságvizsgálatára a VRK módszer szelektivitása nem megfelelő. Az OPLC

módszer esetében a 4,5-dihidro-nandrolon és a nandrolon-Δ5(10)-izomer esetében a

csúcsfelbontás nem éri el az 1,5-ös értéket, azonban kénsavas előhívás után eltérő színnel

fluoreszkálnak 366 nm-es fénnyel megvilágítva, így vizuálisan értékelhetők. A HPLC

módszernél a 4,5-dihidro-nandrolon szennyezés, amely a nandrolon egyik fő szennyezése,

nem mérhető, mert nem mutat UV-elnyelést. A többi lehetséges szennyezés pedig 2

hullámhosszon mérendő a pontos mennyiségi értékelés érdekében. A GC-módszerrel a 4,5-

dihidro-nandrolon pontosan mérhető, azonban a főkomponens az injektorban kis

mértékben bomlik a nandrolon Δ5(10)-izomerjére.

Valamennyi szennyezés egyidejű értékeléséhez a félkvantitatív OPLC módszer bizonyult

alkalmasnak. A HPLC módszer a 4,5-dihidro-nandrolon kivételével, amely nem mérhető

UV-detektálással, a szennyezések pontos kvantitatív meghatározását tette lehetővé.

Az időigény szempontjából a VRK és OPLC-módszerekkel végzett vizsgálathoz körülbelül

egy órára volt szükség, a HPLC tisztaságvizsgálathoz azonban 15-20 óra kellett.

78

4.3.4. Gesztodén

Az ún. „etilsor” anyagai közül a gesztodén különböző vizsgálati módszereire végeztünk

összehasonlítást.

A gesztodén nem szerepel az Amerikai és az Európai Gyógyszerkönyvben. A gesztodén és

lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei az 55. ábrán láthatók. Hivatalos

tisztaságvizsgálati módszere OPLC technikával történik (56-57. ábra). A folyamatosan

bevezetésre kerülő hatósági szabályozás miatt a tisztaságvizsgálati követelmények egyre

szigorúbbá válnak [38-40]. Az elvárt pontosságot a vizuális értékelésű OPLC-módszer

nem tudja kellő biztonsággal teljesíteni, ezért kidolgoztak egy HPLC-tisztaságvizsgálati

módszert (58. ábra) [61]. Jelenleg mindkét módszer érvényben van. A következőkben az

elválasztóképességüket hasonlítom össze [62].

79

HH

O

OH

H

CHCH3

H

HH

O

OH

H

CHCH3

H

gesztodén Δ6-gesztodén

HH

O

OH

H

CHCH3

H

OH

HH

OH

OH

H

CHCH3

O 6β-OH-gesztodén aromás 6-keto-gesztodén

HH

O

OH

H

CHCH3

H

OO

CH3

HH

OH

H

CHCH3

O

O 15α-acetoxi-levonorgesztrel gesztodén ketál izomerek

HH

O

OH

H

CHCH3

H

OCH3

5-metoxi-gesztodén

55. ábra. A gesztodén és lehetséges szennyezéseinek szerkezeti képletei

80

Felvitelek:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 0,2 μg Δ6-gesztodén 2 0,2 μg gesztodén ketál izomerek 3 0,2 μg 5-metoxi-gesztodén 4 0,2 μg 15α-acetoxi-levonorgesztrel 5 0,2 μg aromás 6-keto-gesztodén 6 0,2 μg 6β-hidroxi-gesztodén 7 0,2-0,2 μg gesztodén és összes szennyezése 8 100 μg gesztodén és 0,2 μg összes szennyezése 9 100 μg gesztodén 10 oldószervak

56. ábra. A gesztodén OPLC kromatogramjáról készített felvétel

3 9

1 2

6 5 4

RF

57. ábra. Az OPLC kromatogramról készített videodenzitogram

81

2b minta + standard-elegy

minta

oldószer

standard-elegy

2a 3

9

1 4

5

6

mAbs

58. ábra. A gesztodén HPLC kromatogramja [62]

19. táblázat. A gesztodén OPLC és HPLC tisztaságvizsgálati módszer

elválasztóképességének összehasonlítása

OPLC HPLC

RF Rs Rs

0,05 6β-OH-gesztodén 6β-OH-gesztodén 6

0,17 15α-acetoxi-levonorg. 2,3 18,4 aromás 6-keto-gesztodén 5

4 0,22 aromás 6-keto-gesztodén 2,8 15,8 15α-acetoxi-levonorg.

0,37 Δ6-gesztodén 3,7 11,2 6,7-didehidro-gesztodén 1

0,41 Gesztodén 1,4 4,8 Gesztodén 9

0,59 5-metoxi-gesztodén 5,1 12,7 5-metoxi-gesztodén 3

0,75 gesztodén ketál 1. 4,2 28,6 gesztodén ketál 1. 2a

0,80 gesztodén ketál 2. 1,3 2,4 gesztodén ketál 2. 2b


tányérmagasság értékeket (H) ebben az esetben sem adtam meg.

82

Az 59. ábrán összehasonlítottam néhány tétel tisztaságvizsgálatához szükséges

analízisidőt a kétféle módszerhez. Az OPLC esetében a mintafelvitel idejét is figyelembe

vettem. Mindegyik módszernél a vizsgálandó tételekből két bemérés – azaz két minta –

készült. A számolásnál figyelembe vettem valamennyi szükséges standard és


0100200300400500600700800900

1000

idő

(min

)

1 2 3

vizsgált tételek

OPLCHPLC

59. ábra. A gesztodén OPLC és HPLC technikával végzett tisztaságvizsgálatának

időigénye 1, 2, ill. 3 tétel esetében

Míg OPLC-vel 30-40 perc a kromatogram elkészítésének ideje, addig HPLC-vel

egyetlen injektálás analízisideje 68 perc, három tétel vizsgálatához szükséges idő 950 perc.

Értékelés

Mindkét módszer megfelelő szelektivitást mutat. A HPLC-módszerrel pontosabb értékelés

válik lehetővé. Azonban ebben az esetben csak 210 nm-en történő detektálással lehet

valamennyi ismert szennyezést kimutatni.

A HPLC-módszer időigénye körülbelül húszszorosa az OPLC-módszerének.

A gyors, közelítő eredményekhez célszerű az OPLC-módszert használni.

4.3.5. A teljesítményjellemzőkkel kapcsolatos kísérletek eredménye

Mind a négy vizsgált szteroid esetében levonhatjuk azt a következtetést, hogy a VRK

módszerek nem kellően szelektívek az adott anyag és lehetséges szennyezéseinek

elválasztására. Az OPLC és a HPLC módszerek szelektivitás tekintetében alkalmasnak

bizonyultak.

83

Hatékonyságukat összehasonlítva a VRK-módszereknél általában 100 μm körüli átlagos

tányérmagasság-értéket kaptam. Ezzel szemben a másik két módszerrel összemérhető

értékeket kaptam: OPLC-vel 20-40 μm, míg HPLC-vel 10-30 μm volt az átlagos

tányérmagasság az etinil-ösztradiol esetében, ahol izokratikus körülmények között történt a

meghatározás. A többi esetben a HPLC-módszernél gradiens programmal történt az

elválasztás, ezért nem adtam meg tányérmagasság értékeket.

Az elválasztás hatékonysága a VRK-módszernél bizonyult a legkevésbé kedvezőnek, az

OPLC és a HPLC esetében pedig hasonló volt.

Az időigény tekintetében az OPLC-módszerek nem haladták meg a 30-40 percet, a VRK-

módszerek körülbelül egy órát igényeltek. A HPLC-módszerek esetében a kromatogramok

elkészítésének ideje általában 10-20-szor tovább tartott, mint az OPLC-nél.

Gyors, limit tesztnek megfelelő eredményt kaphatunk OPLC-módszerekkel az egyes

szennyezések mennyiségére. HPLC-vel pedig – bár jóval hosszabb idő alatt – pontos,

kvantitatív meghatározás válik lehetővé.

84

4.4. Szűrővizsgálatok

Új vegyületek vizsgálatakor célszerű először VRK-technikával „feltérképezni” a

lehetséges szennyezéseket, mivel ezzel a módszerrel valamennyi komponens a szorbensen

marad és detektálható. A technika kisebb hatékonysága és elválasztóképessége miatt

azonban elképzelhető, hogy a felviteli helyen marad a komponensek egy része, vagy nem

válnak el egymástól, ill. a főfolttól. A polaritás függvényében sávokra bonthatjuk a

kromatogramot és ezeket a különböző polaritású sávokat a nagyobb hatékonyságú és

elválasztóképességű OPLC-technikával tovább bonthatjuk. A rétegkromatográfiás

módszerek specifikusságát növelheti a különböző előhívószerek alkalmazhatósága. HPLC-

vel pedig további komponenseket választhatunk el. A háromféle technika kiegészíti

egymást eltérő szelektivitásuk és detektálási lehetőségeik miatt.

Az OPLC-technika gyorsasága, nagy hatékonysága és jó elválasztóképessége miatt

különösen alkalmas szűrővizsgálatokra, vagy előfuttatások végzésére a HPLC

tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozásánál. Az eluensek összeállításához az oldószerek

széles választéka áll rendelkezésre, hiszen az off-line detektálás következtében a közeli

UV-tartományban elnyelő oldószerek is használhatók. Általánosan elmondható, hogy egy

új szteroid anyagot célszerű különböző, széles polaritási tartományt átfogó futtató

elegyekkel megvizsgálni, hogy valamennyi szennyezését detektálni tudjuk. Az

eluenskomponensek megválasztásánál azonban ügyelnünk kell arra, hogy a kívánt

eluenserősséget olyan komponensek elegyítésével érjük el, amelyek együttes használata

nem okoz frontképződést.

A norszteroidok vizsgálatánál ciklohexánt, illetve toluolt észterekkel és / vagy

kloroformmal kevertem. Észterként leggyakrabban etil-, ill. butil-acetátot alkalmaztam.

Apoláris komponensek szilikagél szorbensen történő elválasztására alkalmas

elegyek:

ciklohexán – butil-acetát 9+1 (V/V)

ciklohexán – butil-acetát – kloroform 90+12+2 (V/V)

ciklohexán – butil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)

Poláris komponensek elválasztására alkalmas eluenselegyek:

toluol – etil-acetát – kloroform 5+1+4 (V/V)

ciklohexán – etil-acetát – kloroform 2+2+1 (V/V)

ciklohexán – butil-acetát 1+1 (V/V)

85

Amennyiben meggyőződtünk róla, hogy nincs irreverzibilis adszorbció, élhetünk a

többszörös kifejlesztés lehetőségével [63]. A többszörös kifejlesztésnél a foltok

tömörödnek, ez megkönnyíti az értékelést. Túlfuttatást is alkalmazhatunk, ha már

meggyőződtünk arról, hogy nincs olyan apoláris komponens, amely „lefutna” a

szorbensről.

4.4.1. Szűrővizsgálatok lehetséges szennyezésekre

A szteroid-szennyezőket sorbaállíthatjuk polaritásuk függvényében. Ekkor a

szteroidváz különböző szubsztituenseit kell elsősorban figyelembe venni. A leginkább

poláris szubsztituensek a hidroxi- valamint a keto-csoportok. Kisebb polaritást adnak a

molekulának az éterkötésben résztvevő oxigének, valamint az észterkötést tartalmazó

csoportok. Legkevésbé polárisak az oxigént nem tartalmazó szubsztituensek.

Gyakran azonos konstitúció mellett térszerkezetbeli különbség van a szennyezés-

molekulák között. A szteroidvázhoz 17-es pozícióban kapcsolódó hidroxi-csoport és etinil-

csoport esetében az etinil-csoport jellemzően α-helyzetű. Az epimer párja, a β-helyzetű

etinil-csoport általában kevésbé poláris.

A norszteroidok tipikus szennyezéseinek polaritási sora:

6β-OH > 6α-OH > 10-OH > 6-keto > Δ8(14) ≥ Δ9(11) ≥ Δ6 ≥ főkomponens

RRF*: 0,0-0,3 0,2-0,5 0,8-1,0 1,0

főkomponens > 17-epi > telített A-gyűrűs származék > Δ5 > Δ5(10) > biszetinil** > dezoxo**

RRF*: 1,0 1,0-1,2 1,1-1,6 5,0-7,0 * az adott főkomponensre vonatkoztatva ** az „etilsor” anyagaira jellemző szennyezések

A szennyezések azonosítását segítheti, hogy savas előhívás után különböző színnel

fluoreszkáló foltokként jelennek meg a szorbensen 366 nm-es fénnyel megvilágítva. A

szteroidvázon többlet hidroxi-csoportot tartalmazó komponensek kénsavas előhívást

követően élénk kék színűek. Ha az adott szennyező-molekulák további kettős kötést

tartalmaznak (Δ8(14)-származékok) gyakran intenzív zöldes színnel fluoreszkálnak.

86

4.4.2. Szűrővizsgálatok főkomponensekre

Különböző szteroid végtermékek elválasztására (60. ábra) alkalmaztam az eltérő

erősségű eluenseket OPLC-technikával. A végtermékek kiválasztása a gyártóhely alapján

történt. A cél olyan szűrőrendszer kidolgozása volt, amelynek segítségével az egy üzemben

gyártott szteroidok esetleges keresztszennyezései gyorsan kimutathatók és azonosításuk

egyszerűbbé válik. Az így szerzett tapasztalatok azonban felhasználhatók a hasonló

szerkezetű új szteroid molekulák vizsgálatánál is. Az összesen húsz hatóanyagot egymás

mellett, azonos szorbensen kromatografáltam az előzőekben ismertetett különböző

erősségű eluensekkel.

CH3 CH2

OH

H2CH3C OH

CH

O

CH3

CH3O

O

a, allilösztrenol b, dezogesztrel c, drospirenon

CH3

HO

OH

CH

O

CH3O CH3

O

CH

H3C

O

HNO

CH3

CH3NH

O

H

CH3

CH3

CH3

d, etinil-ösztradiol e, etinodiol-diacetát f, finaszterid

O

H3C OH

CH

O

OHH3C

CH

O

CH3O (CH2)8

O

CH3

g, gesztodén h, levonorgesztrel i, nandrolon-dekanoát

O

CH3

CH2

H3COO

CH3

O

HON

H3C OH

CH

O

CH3OH

CH

j, nesztoron k, 17-dezacetil-norgesztimét l, noretiszteron

87

O

CH3

CH

O CH3

O

HON

H3C

CH

O CH3

O

O

OHH3C

CH

m, noretiszteron-acetát n, norgesztimét o, d,l-norgesztrel

O

O

CH3

CH3CH3

OH

HO

CH3OH

p, oxandrolon q, ösztradiol

O

OH3C

N

N+

H3C

H3CCH3

O

OCH3

N N+CH3

Br-

CH3

CH3

Br-

r, pipekurónium bromid

O

CH3

CH3HO OHO

O (CH2)4

O

CH3

O

CH3

CH3

S

OH3C

O

O

s, prednizolon-21-kapronát t, spironolakton

60. ábra. A szűrővizsgálatoknál vizsgált szteroidok szerkezeti képletei

A felvitel minden esetben a 60. ábrán szereplő betűjelzés szerint ABC-sorrendben

történt, valamennyi komponensből 5-5 μg került a szorbensre és a kifejlesztési

eluenstérfogat 4200 μl volt. A különböző erősségű futtatókkal végzett kísérletek

kromatogramjait mutatom be a következő ábrákon (61-64. ábra).

88

254 nm kénsavas előhívás után 366nm

a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t

61. ábra. Közepes erősségű futtató (1.) használata szteroidok elválasztására toluol – etil-acetát – kloroform 5+1+4 (V/V)

62. ábra. Közepes erősségű futtató (2.) használata szteroidok elválasztására

ciklohexán – etil-acetát – kloroform 3+1+1 (V/V)


kénsavas előhívás után 366nm

kénsavas előhívás után 366nm 254 nm

254 nm


63. ábra. Nagy polaritású futtató használata szteroidok elválasztására ciklohexán – butil-acetát 1+1 (V/V)

89

kénsavas előhívás után 366nm 254 nm


64. ábra. Kis polaritású futtató használata szteroidok elválasztására ciklohexán – butil-acetát 9+1 (V/V)

254 nm-es fényben, és kénsavas előhívást követően 366 nm-es fénnyel

megvilágítva végeztem az értékelést. A finaszterid és a pipekurónium-bromid sajátos

szerkezetük miatt ezzel a módszerrel nem voltak detektálhatók, más előhívási technikát

kell használni az értékelésükhöz. Erre a célra a Dragendorff-reagenssel történő előhívás a

megfelelő.

A kapott kromatogramok alapján a vizsgált szteroidokat négy csoportba soroltam:

1. apoláris: allilösztrenol, dezogesztrel, etinodiol-diacetát

2. közepesen poláris: nandrolon-dekanoát, noretiszteron-acetát, etinil-ösztradiol,

norgesztrel, levonorgesztrel, gesztodén

3. poláris: norgesztimét, noretiszteron, 17-dezacetil-norgesztimét,

ösztradiol, nesztoron

4. erősen poláris: drospirenon, oxandrolon, finaszterid, prednizolon-21-

kapronát, spironolakton, pipekurónium-bromid

Az egyes szteroidok azonosításához nyújt segítséget a 20. táblázat, amelyben a

különböző detektálási lehetőségeket, a kénsavas, ill. a Dragendorff-oldattal való előhívás

utáni jellemző színeket tüntettem fel.

90

91

20. táblázat. A szűrővizsgálatba bevont szteroidok kromatográfiás és detektálási

tulajdonságai

UV254kénsavas előhívás után 366

nm Dragendorff polaritási csoport vizsgált szteroid

detektálhatóság szín detektálhatóság (és szín)

1. b, dezogesztrel - + sárgás - 1. a, allilösztrenol - + kékesszürke - 1. e, etinodiol-diacetát - + sárgás -

2. i, nandrolon-dekanoát + + halványkék + (narancs)

2. m, noretiszteron-acetát + + piros + (rózsaszín)

2. o, norgesztrel, h, levonorgesztrel + + piros + (rózsaszín)

2. d, etinil-ösztradiol (+) + narancs - 2. g, gesztodén + + kék + (rózsaszín) 3. n, norgesztimét + + szürkéssárga + (narancs) 3. l, noretiszteron + + piros + (kék) 3. j, nesztoron + + sárgás + (sötétbarna)

3. k, 17-dezacetil-norgesztimét + + szürkéssárga + (narancs)

3. q, ösztradiol (+) + halványzöld - 4. f, finaszterid (+) - - + (narancs) 4. t, spironolakton + ++ sárga + (narancs)

4. s, prednizolon-21-kapronát + + szürkéskék (+) (narancs)

4. p, oxandrolon - + halványkék (+) (narancs) 4. c, drospirenon + (+) kékesszürke + (narancs)

4. r, pipekurónium bromid - - - + (narancs)

- nem detektálható (+) rosszul detektálható + detektálható ++ intenzív jelet ad

A szteroid-hatóanyagok azonosítása a 65. ábrán látható folyamattal valósítható

meg. Az ábrán aláhúzással jelölt végtermékek már elkülöníthetők egymástól, azonban

azonosításukhoz még standard anyag mellett is el kell végezni az utolsó futtatást.

92

Közepes polaritású 1. futtató UV254, kénsavas előhívás UV366

UV254: + UV366: -

UV254: - UV366: +

UV254: + UV366: +

UV254: - UV366: -

Dragendorff: +

finaszterid RF=0,03

allilösztrenol, dezogesztrel,

etinodiol-diacetát, oxandrolon

RF >0,6 oxandrolon RF=0,09 nem

igen

Apoláris futtató etinodiol-diacetát RF=0,32 allilösztrenol RF=0,49 dezogesztrel RF=0,51

RF >0,3 igen

nandrolon-dekanoát RF=0,50 noretiszteron-acetát RF=0,34 nem

Poláris futtató

Dragendorff: +

pipekurónium-bromidRF=0,00

RF >0,6 UV254: (+) UV366: +

etinil-ösztradiolRF=0,70

igen

nem

RF >0,4

igen

Kettős foltot ad?

igen norgesztimét RF, syn=0,43 és RF, anti=0,53 17-dezacetil-norgesztimét RF, syn=0,36 és RF, anti=0,54

nem

Közepes polaritású 2. futtató

ösztradiol RF=0,18 gesztodén RF=0,28 (levo)norgesztrel RF=0,32

nem

UV254: (+) UV366: +

UV254: + UV366: +

drospirenon RF=0,06

spironolakton RF=0,11 prednizolon-21-kapronát RF=0,16 nesztoron RF=0,18 noretiszteron RF=0,30

65. ábra. Folyamatábra a vizsgált 20 szteroid azonosításához

4.4.3. Elővizsgálatok lehetősége készüléktisztításnál

Abban az esetben, ha a szteroid hatóanyagot nem keresztszennyezésként keressük,

hanem azt a készüléktisztításnál mint egykomponensű szennyezőt kell kimutatnunk,

alkalmas lehet az elővizsgálatra a futtatás nélküli foltvizsgálat. A különböző előhívási és

detektálási eljárásokkal kapott jellegzetes színű foltok segítik a gyors azonosítást. A 66.

ábrán mutatom be az így kapott „kromatogramokat”. A felviteli sorrend jelzése megfelel a

60. ábrán szereplő betűjelzésnek.

Előhívás: Dragendorff-reagenssel Detektálás: látható, fehér fényben

Előhívás: kénsavas reagenssel, 120°C, 2 min

Detektálás: 366 nm-en

Előhívás: - Detektálás: 254 nm-en

a b c d e

p q r s t

a b c d e a b c d e

f g h i j f g h i j

k l m n o k l m n o

f g h i j

k l m n o

p q r s t p q r s t

66. ábra. Foltvizsgálat különböző detektálással

A futtatás nélküli felvitelek esetén kimutatási határ vizsgálatot végeztem a húsz

vizsgált szteroidra. Valamennyi szteroidból tíz különböző mennyiséget vittem fel a

szorbensre a 0,5 ng – 10 μg tartományban. Kimutatási határként a legkisebb, vizuálisan

detektálható mennyiséget fogadtam el. A finaszterid és a pipekurónium-bromid esetében

93

Dragendorff-reagenssel hívtam elő a különböző mennyiségű anyagot a szorbensen, a többi

esetben 10% kénsavas etanolt alkalmaztam előhívószerként. A megállapított kimutatási

határértékeket a 21. táblázatban foglaltam össze.

21. táblázat. Kimutatási határértékek futtatás nélküli foltvizsgálatnál

jelölés anyag neve előhívás előtt, UV254

kénsavas előhívással,

UV366

Dragendorff-reagenssel,

4200 K a Allilösztrenol n. d. 5 ng * b Dezogesztrel n. d. 1 ng * c Drospirenon 10 ng 1 ng * d Etinil-ösztradiol 100 ng 1 ng * e Etinodiol-diacetát n. d. 1 ng * f Finaszterid 100 ng n. d. 50 ng g Gesztodén 10 ng 1 ng * h Levonorgesztrel 10 ng 1 ng * i Nandrolon-dekanoát 10 ng 5 ng * j Nesztoron 10 ng 1 ng * k 17-dezacetil-norgesztimét 10 ng 5 ng * l Noretiszteron 50 ng 5 ng * m Noretiszteron-acetát 50 ng 5 ng * n Norgesztimét 10 ng 5 ng * o Norgesztrel 10 ng 5 ng * p Oxandrolon n. d. 5 ng * q Ösztradiol 100 ng 1 ng * r Pipekurónium-bromid n. d. n. d. 10 ng s Prednizolon-21-kapronát 100 ng 5 ng * t Spironolakton 10 ng 0,5 ng *

n. d. nem detektálható * mérés nélkül

A kimutatási határértékek kénsavas előhívással leggyakrabban 1 – 5 ng-nak

bizonyultak. A spironolakton esetében azonban még ennél kisebb mennyiség is

detektálható volt a szorbensen. A Dragendorff-reagenssel előhívott vegyületekre viszont

magasabb volt a kimutatási határérték (10-50 ng).

Fentiek alapján megállapítottam, hogy a „pontkromatogram” rendkívül érzékeny

kimutatást tesz lehetővé, ezért alkalmas készüléktisztítás utáni ellenőrző vizsgálatra.

94

5. ÖSSZEFOGLALÁS

Munkám során a norszteroid-szintézis „metilsorában” keletkező intermedierek

szennyezésprofiljának felderítésével foglalkoztam. Gyors tisztaságvizsgálati eljárásokat

dolgoztam ki túlnyomásos rétegkromatográfiás módszerrel a nandrolon, a dienoléter, az

ösztradiol-metiléter-acetát és a molon (metil-szeko-olon) vizsgálatára. A fenti

intermedierek esetében értékeltem a más kromatográfiás technikával kapott eredményeket

is. A nandrolon két fő szennyezését – az 5α-4,5-dihidro-nandrolont és a nandrolon Δ5(10)-

izomert – csak OPLC-vel sikerült kimutatni egymás mellett. Ez a két közeli szerkezetű

molekula VRK-val nem válaszható el egymástól, ultraibolya detektálású HPLC-vel az 5α-

4,5-dihidro-nandrolon nem mutatható ki, GC-vel megfelelően elválaszthatók, de a

főkomponens a vizsgálat során Δ5(10)-izomerre bomlik, így az eredmény nem megbízható.

A dienoléter esetében az általam kidolgozott OPLC-eljárással minden ismert szennyezés

szelektíven értékelhető, az ösztradiol-metiléter-acetátnál pedig a módszerek kombinációja

vezetett eredményre. A molon esetében OPLC-vel elválasztottam a fő szennyezést a

főkomponenstől, tisztáztam a főszennyezés keletkezési körülményeit, és elősegítettem

annak azonosítását.

Optimalizáltam és összehasonlítottam a szteroidoknál leggyakrabban használt savas

előhívó módszereket. Különböző előhívó reagensek esetében a rövid ideig magasabb

hőmérsékleten történő előhívás érzékenyebb, míg az alacsonyabb hőmérsékleten hosszabb

ideig történő hevítés stabilabb, robosztusabb előhívást eredményez.

Különböző szteroid alapanyagokra kifejlesztett VRK, OPLC és HPLC tisztaság-

vizsgálati módszerek teljesítőképességét vizsgáltam és hasonlítottam össze.

Megállapítottam, hogy az OPLC és a HPLC módszer hatékonysága közeli, a VRK ettől

messze elmaradt.

A szteroidsor tipikus szennyezéseire polaritási sort állítottam fel.

Az egy üzem által gyártott szteroidokra olyan szűrővizsgálatot dolgoztam ki, amely

lehetővé teszi az esetleges keresztszennyezések gyors vizsgálatát és azonosítását az adott

vegyületcsoportra. Kifejlesztés nélküli pont-vizsgálati módszert dolgoztam ki, amely

alkalmas lehet a készüléktisztítás során a mosás hatékonyságának ellenőrzésére.

Munkám tapasztalatai alapján a gyógyszeranalitikában a rétegkromatográfiás

technika, elsősorban az OPLC, a hatóságok által javasolt és elvárt HPLC módszer mellett a

jövőben is jól használható szteroidok tisztaságvizsgálatára, előzetes vizsgálatként, új

anyagok szennyezésprofiljának felderítésére és igazolására, valamint gyors

szűrővizsgálatok elvégzésére.

95

6. SUMMARY

Elucidation of impurity profiles of intermediates originated in the „methyl line” of

the norsteroid synthesis was the object of my study. I have worked out rapid purity test

procedures by overpressured thin layer chromatographic method for examining nandrol-

one, dienolether, estradiol methylether acetate and molone (methyl-seco-olone). In the case

of the above intermediates I have evaluated the results obtained with other chromato-

graphic techniques, too. Simultaneous detection of 5α-4,5-dihydro-nandrolone and

nandrolone Δ5(10)-isomer, the two main impurities of nandrolone, was successful only by

OPLC. These two molecules of similar structure cannot be separated from each other by

TLC, 5α-4,5-dihydro-nandrolone cannot be determined by HPLC with UV detection, GC

can separate them adequately but the principal component decomposes to Δ5(10)-isomer du-

ring the examination, thus the result is not reliable. Concerning dienolether the OPLC pro-

cedure worked out by me each known impurity can be evaluated selectively, and regarding

estradiol methylether acetate the combination of the methods was successful. In the case of

molone I have separated the main impurity from the principal component by OPLC, I have

cleared up the arising conditions of the main impurity and promoted its identification.

I have optimized and compared the most often used acidic visualisation methods for

steroids. Visualisation at higher temperatures lasting for shorter periods is more sensitive

however heating for longer periods at lower temperatures results a more stable, robust

visualisation comparing the different visualizing reagents.

I have studied and compared the efficiencies of TLC, OPLC and HPLC purity test

methods developed for different steroid active substances. I have established that the

efficacies of OPLC and HPLC methods are similar, that of TLC has been far inferior.

I have constructed a polarity line for the typical impurities of the steroid line.

I have worked out a screening test for the steroids manufactured by the same plant

which enables rapid examinations and identifications of the possible cross contaminants

for the given compound group. I have worked out a point examination method without

development which can be suitable for checking the effectiveness of the washing during

the cleaning of the equipment.

On the basis of my working experiences the thin layer chromatographic techniques,

first of all the OPLC, besides the HPLC method proposed and expected by the authorities,

can also be used well in the future for the purity tests of steroids in the pharmaceutical

analysis as preliminary test, detecting and proving the impurity profiles of new substances,

as well as performing rapid screening tests.

96

7. IRODALOMJEGYZÉK

1 S. Görög and Gy. Szász, Analysis of steroid hormone drugs, Akadémiai Kiadó,

Budapest (1978) p.p. 48-61

2 Knoll J., Gyógyszertan, Medicina Könyvkiadó, Budapest (1987) 599-630

3 Donáth T., Anatómia – élettan, Medicina Könyvkiadó, Budapest (1996) 245-246

4 Kajtár M., Természetes szénvegyületek kémiája (Szerves kémia – III), Budapest,

ELTE egyetemi jegyzet, évszám nélkül

5 A.J. Birch and S.M. Mukherji, J. Chem. Soc., (1949) 2351; (1950) 867

6 Ananchenko, S.N.; Torgov, I.V., Tetrahedron 18 (1963) 1335

7 Csontos J., Fekete Gy, Kováts T., Lőw M., Pillich L., Takács I., A Richter Gedeon

Rt. 100 éves története, Medicina Könyvkiadó (2001)

8 Mahó S., személyes közlés, 2003.

9 S. Görög, Analytical Sci. 20 (2004) 767-782

10 Tyihák E., A rétegkromatográfia zsebkönyve, Műszaki könyvkiadó, Budapest

(1979)

11 J. Sherma, B. Fried (eds.), Handbook of Thin-Layer Chromatography 3rd ed.,

Marcel Dekker Inc., New York – Basel – Hong Kong (2003)

12 P. D. Sethi, High Performance Thin-Layer Chromatography. Quantitative Analysis

of Pharmaceutical Formulations, CBS, New Delhi (1996)

13 C. F. Poole, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 963-984

14 E. Reich, A: Schibli, J. Planar Chromatogr. 17 (2004) 438-443

15 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, in: S. Görög (ed.), Identification and Determination of

Impurities in Drugs, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands (2000) p.p. 146-182

16 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, B. Renger, in: Sz. Nyiredy (ed.), Planar

Chromatography – A Retrospective View for the Third Millennium, Springer,

Hungary (2001) p.p. 585-607

17 Sz. Nyiredy, K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, G. Szepesi, in: J. Sherma, B. Fried (eds.),

Handbook of Thin-Layer Chromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, New York

(2003) p.p. 807-863

18 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, B. Renger, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 778-789

19 Fekete J., Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft.,

Budapest 2006

20 Balla J., A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Abigél Bt., 1997

97

21 F. Dravetz, E. Francsics-Czinege, P. Horváth, 8th Int. Meeting Recent

Developments in Pharmaceutical Analysis (RDPA ’99), 29th June-3rd July, 1999,

Rome

22 E. Tyihák, E. Mincsovics, H. Kalász, J. Chromatogr., 174 (1979) 75-81

23 E. Mincsovics, E. Tyihák, H. Kalász, J. Chromatogr., 191 (1980) 293-300

24 E. Mincsovics, M. Garami, L. Kecskés, B. Tapa, Z. Végh, Gy. Kátay, E. Tyihák, J.

AOAC Int. 82 (1999) 587-598

25 E. Tyihák, E. Mincsovics, in: Sz. Nyiredy (Editor), Planar Chromatography – A

Retrospective View for the Third Millenium, Springer, Budapest, Hungary (2001)

137-176

26 Sz. Nyiredy, J. Chromatogr. A 1000 (2003) 985-

27 E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák, Handbook of Thin Layer

Chromatography Chapter 7 Marcel Dekker, NewYork, 1996

28 E. Mincsovics, K. Ferenczi-Fodor, E. Tyihák, Overpressured Layer

Chromatography, in: J. Sherma, B. Fried (eds), Handbook of Thin-Layer-

Chromatography, 3rd ed., Marcel Dekker, New York, USA (2003) 175-205

29 Tyihák E., személyes közlés

30 K. Ferenczi-Fodor, Z. Végh, J. Planar Chromatogr. 6 (1993) 256-258

31 A. Nagy-Turák, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 8 (1995) 188-

191

32 K. Ferenczi-Fodor, S. Mahó, S. Pap-Sziklay, I. Török, L. Borka, Pharmeuropa Vol.

9 No. 4 (1997)

33 Z. Szikszay, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 11 (1998) 428-432

34 A. Wiszkidenszky, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 11

(1998) 463-466

35 A. Kassai, A. Szécsi, A. Koppány, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar

Chromatogr. 13 (2000) 30-32

36 Z. Katona, L. Vincze, Z. Végh, Á. Trompler, K. Ferenczi-Fodor, J. Pharm. Biomed.

Anal. 22 (2000) 349-353

37 S. Görög Anal. Bioanal. Chem. 377 (2003) 852-862

38 ICH guideline Q3A(R), Impurities Testing Guideline: Impurities in New Drug

Substances, CPMP/ICH/2737/99

39 ICH guideline Q3B(R), Impurities in New Drug Products, CPMP/ICH/2738/99

98

40 ICH guideline Q6A, Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for

New Drug Substances and New Drug Products: Chemical Substances,

CPMP/ICH/367/96 corr

41 The United States Pharmacopeia, 30th ed., <466> Ordinary Impurities, p. 170,

USP Convention, Rockville, MD 20852, USA

42 European Pharmacopeia 5th ed., 07/2006:2034 Substances for Pharmaceutical Use,

p. 4151, Council of Europe, Strasbourg, France

43 S. Görög, M. Babják, G. Balogh, J. Brlik, F. Dravecz, M. Gazdag, P. Horváth, A.

Laukó, K. Varga, J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1998) 511-525

44 B. Bagócsi, D. Fábián, A. Laukó, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor,

J. Planar Chromatogr. 15 (2002) 252-257

45 B. Bagócsi, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.), Proc. Int.

Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2004, Visegrád, Hungary, May

2004, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 215-219

46 B. Bagócsi, A. Laukó, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.),

Proc. Int. Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2003, Budapest,

Hungary, June 2003, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 185-

189

47 Dravecz F., személyes közlés, 2003

48 Szántay Cs., személyes közlés, 2003

49 Stahl E., Thin-Layer Chromatography - A Laboratory Handbook, 2nd ed., George

Allen & Unwin Ltd., London, Springer-Verlag, Berlin, (1969)

50 The United States Pharmacopeia, 30th ed. <466> Ordinary Impurities, Key for

Visualization Techniques (5) Acid spray, p. 170, USP Convention, Rockville, MD

20852, USA

51 European Pharmacopeia 5th ed., 4.1.1. Reagents, Sulphuric acid, alcoholic solution

of, 1086803, 04/2006:40101, p. 3805, Council of Europe, Strasbourg, France

52 European Pharmacopeia 5th ed., General Monographs 01/2005:0234

Norethisterone, p. 2116, Council of Europe, Strasbourg, France

53 The United States Pharmacopeia, 29th ed. Monographs Norethindrone, USP

Convention, Rockville, MD 20852, USA, p. 1552

54 P. K. Zarzycki, M. A. Bartoszuk, A. I. Radziwon, J. Planar Chromatogr., 19 (2006)

52-57

99

55 European Pharmacopoeia 5th ed. 2.2.46. Chromatographic separation techniques,

Council of Europe, Strasbourg, France (2005) 69-73

56 Bagócsi B., Magyar Kémikusok Egyesülete – Fiatal Kémikusok Előadóülése, 1999.

nov. 23. Budapest

57 B. Bagócsi, D. Fábián, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor, 11th Int.

Symp. Pharm. Biomed. Anal., 14-18 May 2000, Basel, Switzerland, Abstracts,

P019

58 B. Bagócsi, G. Rippel, Z. Végh, S. Mahó, K. Ferenczi-Fodor in Sz. Nyiredy (ed.),

Proc. Int. Symp. Planar Separations – Planar Chromatography 2000, Lillafüred,

Hungary, June 2000, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp.151-156

59 B. Bagócsi, G. Rippel, M. Mezei, K. Ferenczi-Fodor, J. Planar Chromatogr. 16

(2003) 359-362

60 European Pharmacopoeia 5.5, General Monographs 04/2006:0234 Norethisterone,

p. 4278, Council of Europe, Strasbourg, France

61 Kozma J. személyes közlés, 2006.

62 Kozma J., Bagócsi B., Ferencziné Fodor K., Elválasztástechnikai Ankét 2006,

Budapest

63 K. Ferenczi-Fodor, A. Laukó, A. Wiszkidenszky, Z. Végh, K. Újszászy, J. Planar

Chromatogr. 12 (1999) 30-37

100

szteroid gyógyszeranyagok tisztaságvizsgálata kromatográfiás...

Documents