polmoniti virali: epidemiologia e ruolo del laboratorio prof. pierlanfranco dagaro uco igiene e...

Polmoniti virali: epidemiologiae ruolo del laboratorio

Prof. Pierlanfranco D’Agaro

UCO Igiene e Medicina Preventiva

SS Virologia

Polmoniti

 WHO severe pneumonia

BTS severe pneumonia

Respiratory rate 

Infants > 50 / min > 70 / min

Children > 40 / min > 50 / min

• Definizione di caso: febbre, segni e sintomi di distress respiratorio e radiologia torace positiva

• Le polmoniti virali sono molto diverse per gravità in funzione dell’agente, dell’età dell’ospite e del suo stato immunitario

Prayle A. et al. Paed. Resp. Rev. 2011,12: 60–69

Problema di definizioni

• LRTI was defined as the onset or increase of cough, sputum production, shortness of breath, wheezing, chest pain, or focal or diffuse signs on chest examination, as well as the presence of at least 1 constitutional symptom, including fever, confusion, sweating, headaches, and leukocytosis.

• Pneumonia was defined as LRTI with a new or progressive infiltrate detected on a chest radiograph.

Oosterheert JJ, Clin Infect Dise 2005; 41:1438–44

Questione di definizioni

P. R. Myles and others, Epidemiol. Infect. (2009), 137, 709–716.

P. R. Myles and others, Epidemiol. Infect. (2009), 137, 709–716.

Polmoniti virali

Origine dell’infezione

ospite

Agentevirale

Virus respiratorivirus P. incubazione P. infettivo trasmissione

Influenza 1-4 7 gg Diretta, droplets

PIV 1-7 1-3 sett. Diretta, droplets

RSV 2-8 3-8 gg > 3-4 sett Diretta, droplets

Adenovirus 2-14 Gg > sett Diretta, droplets

Rhinovirus 2-3 7-10 gg Diretta, droplets

hMPV 4-6 5 gg droplets

CoV 2-4 3 sett.? Diretta, droplets

SARS CoV 2-10 ? Droplets, fecale

Bocavirus ? ? ?

Parvov. 4/5 ? ? ?

Mimiv. ? ? ambientale

Mahony JB. Clin. Microbiol. Rev. 2008, 21:716–747

Virus respiratorivirus Prevalenza (%) N. studi/ N. paesi

Influenza 6-40 7 / 5

PIV 15-30 4 / 4

RSV 16-30 4 / 4

Adenovirus 2-4 4 / 4

Rhinovirus 12-45 6 / 5

hMPV 1.5-30 18 / 10

HCoV-OC43 5-30 5 / 4

HCoV-229E 1-5 3 / 3

HCoV-NL63 1.7-9.3 12 / 9

HCoV-HKU1 1-11.3 9 / 8

Bocavirus 2.1-11.3 14 / 12

Mahony JB. Clin. Microbiol. Rev. 2008, 21:716–747

Origine dell’infezione

Comunitaria(CAP)

Nosocomiale

Ospite

Bambino

Adulto immunocompetente

Paziente critico

Ad. immunocompromesso

Anziano

Incidenza CAP per età

P. R. Myles and others, Epidemiol. Infect. (2009), 137, 709–716.

Cause di polmonite pediatrica

Prayle A. et al. Paed. Resp. Rev. 2011,12: 60–69

2001-2 2001-2 2000

Polmoniti in età pediatrica

Lahti E, Thorax 2009;64:252–257

Stagionalità

Figure 1. Seasonal distribution of viruses associated with radiologically diagnosed CAAP over the 4 study years. NW, nasopharyngeal wash.

Wolf et al. J Pediatr 2010;156:115-20

• Stagionali– Influenza– RSV– Metapneumov.

• Non stagionali– Adenovirus– Rhinovirus– Parainfluenza

Etiologia virale per età

1296 casi di polmonite CA confermate radiologicamente (Israele)

Wolf et al. J Pediatr 2010;156:115-20

Polmoniti (CAP) nell’adulto

• Le conoscenze sulle polmoniti virali nell’adulto sono scarse

• L’incidenza delle polmoniti in questa fascia di età è relativamente bassa (~1-2/1000)

Etiologia virale nelle CAP

Figueiredo LTM, J Bras Pneumol. 2009;35(9):899-906

Etiologia virale nelle CAParea Nuova

ZelandaSpagna Grecia Olanda

periodo 1999-2000 1996-2001 2002? 2002-2004

soggetti Tutti i soggetti >18a ricoverati con CAP

Soggetti >18a ricoverati con CAP e completo accertamento microbiologico

Soggetti di 5–14a ricoverati con CAP in un anno

Soggetti >18a ricoverati con LRTI

Età: 63.6±16.3

campione 304 338/1356 75 107

Tecniche virologiche

Miste: sierologia, IF diretta, Coltura, molecolare

sierologica molecolare molecolare

Positivi per virus

88 (29%) 61 (18%) 49 (65%) 24 (22%)

Infezioni miste b/v

45 (51%) 30 (49%) 21 (43%) 6 (25%)

referenza Jennings LC, et al. Thorax 2008, 63:42-48

De Roux A, et al. Chest 2004, 125:1343-51

Tsolia MN, et al. Clin. Infect. Dis. 2004; 39:681–6

Oosterheert JJ, et al. Clin. Infect. Dis. 2005; 41:1438–44

Polmoniti in pazienti immuno-compromessi

Vigil et al. J Intensive Care Med , 2010, 25 307-326

M. Camps Serra ET AL. Eur Respir J 2008; 31: 618–624

Sede: BarcellonaPazienti: 92 tecnica: Multiplex PCRdiagnosi etiologica: 61 (66%)non virale: 38 (41%)mista: 11 (12%)virale: 12 (13%)

M. Camps Serra ET AL. Eur Respir J 2008; 31: 618–624

Infezioni respiratorie in pazienti ematologici

Williams JV, The J Infect Dis 2005; 192:1061–5

Citomegalovirus

• Incidenza di 10-30% in HSCT allogenici

• Incidenza in trapianti di organo (SOT)– Polmone 10-55% (con profilassi)– Polmone 86-100% (senza profilassi)– Fegato 0-9.2%– Cuore 0.8-8%– Rene <1%

Sede: ClevelandTecnica: ibridazione

• Sede: Vienna• Pazienti: trapianto polmone (25)• Campioni: 97 campioni appaiati BAL,

sangue• Tecnica: real time PCR

Herpes Simplex Virus

• HSV viene dimostrato frequentemente mediante PCR nelle basse vie respiratorie di pazienti critici: patogeno reale o presenza bystander?

• HSV nel BAL potrebbe essere espressione di contaminazione dalle vie alte o di riattivazione locale.

• Lesioni alla mucosa da intubazione e ventilazione meccanica possono stimolare la riattivazione del virus.

• Non sono stati evidenziati patterns radiologici specifici associati ad elevati livelli di HSV

Sede: MaastrichtPazienti: 462 in T.I.Campioni BAL Tecnica: real time PCRHSV-1+: TI, 32%

non TI, 15%CA, 4.3%

De Vos et al. Clin Microbiol Infect 2009; 15: 358–363

Polmoniti nell’anziano

Falsey AR, Walsh EE, Clin Infect Dis, 2006; 42:518-24

RSV vs INFLUENZA

Ann R. Falsey et al. N Engl J Med 2005;352:1749-59.

• Studio di coorte, Rochester, NY• Campione

– Soggetti sani >65 – pazienti >21 con patologie cardiache o polmonari

croniche (gruppo ad alto rischio)– Soggetti >65 ospedalizzati con sint. Respiratoria

acuta

• Periodo: autunno 1999-primavera 2003 (4 stagioni epidemiche)

• Outcome: infezioni respiratorie e accesso servizi sanitari

Incidenza di infezioni respiratorie

>65 saniPaz. a rischio

Paz. ospedalizzati

N° casi (incidenza)

519 (10.4% pers.-mese)

524 (14.3% pers.-mese)

1471

RSV 46 (8.9%) 56 (10.7%) 142 (9.7%)

Influenza A 24 (4.6%) 20 (3.8%) 154 (10.5%)

Influenza B 7 (1.3%) 12 (2.3%) 16 (1.1%)

Falsey AR et al. N Engl J Med 2005;352:1749-59.

RSV influenza

>65 sani

(N=46)

Paz. a rischio

(N=56 )

Sani >65 (N=24)

Paz. a rischio (N=20)

Ricovero ospedale

0 9 (16%) 0 4 (20%)

morti 0 2 0 0

Falsey AR et al. N Engl J Med 2005;352:1749-59.

Ricerca qualitativa di agenti virali in 235 campioni di BAL a Trieste (2009-2010)

AGENTE TOTALE NEGATIVI POSITIVI % POS

CMV 235 190 46 19.6%

EBV 56 40 16 28.6%

HSV 100 78 22 22.0%

ADENO 76 75 1 1.3%

Influenza 73 70 12 16.4%

Infl H1v 10  

Infl H3 1  

Infl B 1  

RSV 72 71 1 1.4%

MPV 59 59 0 0.0%

Parainfluenza 66 66 0 0.0%

Chl PN 76 74 2 2.6%

Myc PN 77 73 4 5.2%

PN Jer 232 199 33 14.2%

Positività per singolo patogenoagente totale positivi % Pos

CMV 235 26 11.1%

EBV 56 6 10.7%

HSV 100 9 9.0%

Adenovirus 76 1 1.3%

Influenza 73 7 9.6%

A/H1v   6 8.2%

A/H3   1 1.4%

RSV 72 1 1.4%

Chlam pneum 76 1 1.3%

Mycopl pneum 77 3 3.9%

Pneum jerovecii 232 14 6.0%

Campioni con positività per più di un patogeno

 numero di patogeni nel campione

Numero di campioni 

 tipi di patogeno  numero

DUE 25 CMV + Pneumoc. jerov. 12

    CMV + EBV 3

    CMV + HSV 1

    CMV + FLU 1

    EBV + HSV 2

    HSV + Pneumoc. jerov. 3

    HSV + FLU 2

    FLU + MYC PN 1

TRE 5 CMV + EBV + HSV 1

    CMV+EBV + PN JER 1

    CMV + HSV + PN JER 1

    EBV + HSV + FLU 1

    EBV + HSV +PN JER 1

QUATTRO 1 EBV + HSV + CHL PN + PN JER 1

Analisi quantitativa

AGENTE TOTALE POSITIVI %BASSI (<E3)

INTERMEDI (E3-E4)

ALTI (>E4)

CMV 96 12 12.5% 4 2 6 (50%)

HSV 87 17 19.5% 7 3 7 (41%)

EBV 56 16 28.6% 8 4 4 (25%)

Diagnosi di laboratorio delle polmoniti virali

• Uso appropriato di antibiotici

• Controllo delle infezioni ospedaliere

• Trattamenti specifici

Vigil et al. J Intensive Care Med , 2010, 25 307-326

Laboratorio • Diagnosi sierologica• Isolamento in colture cellulari

– Metodo tradizionale– Metodo rapido (SVC)

• ELISA• Immunofluorescenza diretta• Test rapidi • Metodi molecolari

– PCR/RT PCR– Nested PCR/RT PCR– Real time PCR/RT PCR– Multiplex PCR/real time PCR– Microarray

Indagini sierologiche

• Metodiche con diversa sensibilità

– Elisa– Immuno-fluorescenza indiretta– Fissazione del complemento

• Scarsa utilità della ricerca delle IgM specifiche

• Necessità di determinazione su doppio siero

Colture cellulari

• Isolamento in diverse linee cellulari suscettibili (p.e. Vero, Hep-2, LLC-Mk2, MDCK-Siat)

• Identificazione con tecniche sierologiche o molecolari

• Deve essere effettuata in ambiente sicuro (BSL 2/3)

• Bassa sensibilità, colture negative non escludono la diagnosi

• Tempi generalmente lunghi

Metodi molecolari

• RT-PCR –Buona sensibilità–Campioni adeguati–Rischio

contaminazioni–Pannello di controlli–Tempi brevi (24-48

ore)

primers (BN-1) esterni interni

-2 -4 -6 -8 -10 cn -2 -4 -6 -8 -10

Home made SARS-CoV Nested PCR (primers da Drosten, BNI)

195 bp

110 bp

Diagnosi: real time PCR

Flu A (M) Flu A Sw (NP)H1 Sw (HA)RnaseP

• Real time PCR–Tempi brevi (<6 ore)–Buona Sensibilità–Buona Specificità–Ridotte

contaminazioni–Semplificazione delle

tecniche quantitative

QUANTIFICAZIONE

• Quantificazione assoluta, confronto con curva standard

• Determinazione del viral load

• Standardizzazione delle metodiche di estrazione e di analisi

• Cut-off variabili in funzione di substrato e tipo dipaziente

Microarray per influenza H1N1 pandemica

Multiplex Sensibilità e specificità

Krunic et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222 (2011) 6–13

Variabili biologiche che condizionano i risultati di laboratorio

• Età del paziente: i bambini hanno un viral load più elevato degli adulti/anziani

• Timing del prelievo: generalmente più precoce è il prelievo più elevata è la sensibilità

• Sede del prelievo: – tampone/aspirato naso-faringeo, – t. faringeo, – aspirato tracheale, – escreato, – BAL

Valutazione economica

Oosterheert JJ, et al. Clin. Infect. Dis. 2005; 41:1438–44

Conclusioni 1

• Le polmoniti CAP sono sostenute dai stessi virus responsabili delle infezioni respiratorie acute

• Le polmoniti nel paziente critico e in quello immunodepresso sono spesso dovute ad infezione/riattivazione di virus herpetici (CMV, HSV, EBV?)

• Nell’anziano e nel bambino il RSV è un patogeno importante

• Nuovi virus sono emersi recentemente la cui importanza non è ancora ben definita: Metapneumovirus, Bocavirus, Coronavirus, Mimivirus

Conclusioni 2

• Il laboratorio può svolgere un ruolo importante nell’accertamento diagnostico delle polmoniti virali

• E’ importante la comunicazione clinico laboratorista per una diagnosi corretta ed appropriata

• Le notizie cliniche ed epidemiologiche sono essenziali per indirizzare la ricerca dell’agente

Grazie per l’attenzione

UCO Igiene e Medicina Preventiva Università degli Studi di Trieste

IRCCS “Burlo Garofolo”Laboratorio di Virologia

• Comar M.• Santon D.• Zanotta N.• Samar E.• Cortini E.