polmoniti virali: epidemiologia e ruolo del laboratorio prof. pierlanfranco dagaro uco igiene e...
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Polmoniti virali: epidemiologiae ruolo del laboratorio
Prof. Pierlanfranco D’Agaro
UCO Igiene e Medicina Preventiva
SS Virologia
Polmoniti
WHO severe pneumonia
BTS severe pneumonia
Respiratory rate
Infants > 50 / min > 70 / min
Children > 40 / min > 50 / min
• Definizione di caso: febbre, segni e sintomi di distress respiratorio e radiologia torace positiva
• Le polmoniti virali sono molto diverse per gravità in funzione dell’agente, dell’età dell’ospite e del suo stato immunitario
Prayle A. et al. Paed. Resp. Rev. 2011,12: 60–69
Problema di definizioni
• LRTI was defined as the onset or increase of cough, sputum production, shortness of breath, wheezing, chest pain, or focal or diffuse signs on chest examination, as well as the presence of at least 1 constitutional symptom, including fever, confusion, sweating, headaches, and leukocytosis.
• Pneumonia was defined as LRTI with a new or progressive infiltrate detected on a chest radiograph.
Oosterheert JJ, Clin Infect Dise 2005; 41:1438–44
Questione di definizioni
P. R. Myles and others, Epidemiol. Infect. (2009), 137, 709–716.
P. R. Myles and others, Epidemiol. Infect. (2009), 137, 709–716.
Polmoniti virali
Origine dell’infezione
ospite
Agentevirale
Virus respiratorivirus P. incubazione P. infettivo trasmissione
Influenza 1-4 7 gg Diretta, droplets
PIV 1-7 1-3 sett. Diretta, droplets
RSV 2-8 3-8 gg > 3-4 sett Diretta, droplets
Adenovirus 2-14 Gg > sett Diretta, droplets
Rhinovirus 2-3 7-10 gg Diretta, droplets
hMPV 4-6 5 gg droplets
CoV 2-4 3 sett.? Diretta, droplets
SARS CoV 2-10 ? Droplets, fecale
Bocavirus ? ? ?
Parvov. 4/5 ? ? ?
Mimiv. ? ? ambientale
Mahony JB. Clin. Microbiol. Rev. 2008, 21:716–747
Virus respiratorivirus Prevalenza (%) N. studi/ N. paesi
Influenza 6-40 7 / 5
PIV 15-30 4 / 4
RSV 16-30 4 / 4
Adenovirus 2-4 4 / 4
Rhinovirus 12-45 6 / 5
hMPV 1.5-30 18 / 10
HCoV-OC43 5-30 5 / 4
HCoV-229E 1-5 3 / 3
HCoV-NL63 1.7-9.3 12 / 9
HCoV-HKU1 1-11.3 9 / 8
Bocavirus 2.1-11.3 14 / 12
Mahony JB. Clin. Microbiol. Rev. 2008, 21:716–747
Origine dell’infezione
Comunitaria(CAP)
Nosocomiale
Ospite
Bambino
Adulto immunocompetente
Paziente critico
Ad. immunocompromesso
Anziano
Incidenza CAP per età
P. R. Myles and others, Epidemiol. Infect. (2009), 137, 709–716.
Cause di polmonite pediatrica
Prayle A. et al. Paed. Resp. Rev. 2011,12: 60–69
2001-2 2001-2 2000
Polmoniti in età pediatrica
Lahti E, Thorax 2009;64:252–257
Stagionalità
Figure 1. Seasonal distribution of viruses associated with radiologically diagnosed CAAP over the 4 study years. NW, nasopharyngeal wash.
Wolf et al. J Pediatr 2010;156:115-20
• Stagionali– Influenza– RSV– Metapneumov.
• Non stagionali– Adenovirus– Rhinovirus– Parainfluenza
Etiologia virale per età
1296 casi di polmonite CA confermate radiologicamente (Israele)
Wolf et al. J Pediatr 2010;156:115-20
Polmoniti (CAP) nell’adulto
• Le conoscenze sulle polmoniti virali nell’adulto sono scarse
• L’incidenza delle polmoniti in questa fascia di età è relativamente bassa (~1-2/1000)
Etiologia virale nelle CAP
Figueiredo LTM, J Bras Pneumol. 2009;35(9):899-906
Etiologia virale nelle CAParea Nuova
ZelandaSpagna Grecia Olanda
periodo 1999-2000 1996-2001 2002? 2002-2004
soggetti Tutti i soggetti >18a ricoverati con CAP
Soggetti >18a ricoverati con CAP e completo accertamento microbiologico
Soggetti di 5–14a ricoverati con CAP in un anno
Soggetti >18a ricoverati con LRTI
Età: 63.6±16.3
campione 304 338/1356 75 107
Tecniche virologiche
Miste: sierologia, IF diretta, Coltura, molecolare
sierologica molecolare molecolare
Positivi per virus
88 (29%) 61 (18%) 49 (65%) 24 (22%)
Infezioni miste b/v
45 (51%) 30 (49%) 21 (43%) 6 (25%)
referenza Jennings LC, et al. Thorax 2008, 63:42-48
De Roux A, et al. Chest 2004, 125:1343-51
Tsolia MN, et al. Clin. Infect. Dis. 2004; 39:681–6
Oosterheert JJ, et al. Clin. Infect. Dis. 2005; 41:1438–44
Polmoniti in pazienti immuno-compromessi
Vigil et al. J Intensive Care Med , 2010, 25 307-326
M. Camps Serra ET AL. Eur Respir J 2008; 31: 618–624
Sede: BarcellonaPazienti: 92 tecnica: Multiplex PCRdiagnosi etiologica: 61 (66%)non virale: 38 (41%)mista: 11 (12%)virale: 12 (13%)
M. Camps Serra ET AL. Eur Respir J 2008; 31: 618–624
Infezioni respiratorie in pazienti ematologici
Williams JV, The J Infect Dis 2005; 192:1061–5
Citomegalovirus
• Incidenza di 10-30% in HSCT allogenici
• Incidenza in trapianti di organo (SOT)– Polmone 10-55% (con profilassi)– Polmone 86-100% (senza profilassi)– Fegato 0-9.2%– Cuore 0.8-8%– Rene <1%
Sede: ClevelandTecnica: ibridazione
• Sede: Vienna• Pazienti: trapianto polmone (25)• Campioni: 97 campioni appaiati BAL,
sangue• Tecnica: real time PCR
Herpes Simplex Virus
• HSV viene dimostrato frequentemente mediante PCR nelle basse vie respiratorie di pazienti critici: patogeno reale o presenza bystander?
• HSV nel BAL potrebbe essere espressione di contaminazione dalle vie alte o di riattivazione locale.
• Lesioni alla mucosa da intubazione e ventilazione meccanica possono stimolare la riattivazione del virus.
• Non sono stati evidenziati patterns radiologici specifici associati ad elevati livelli di HSV
Sede: MaastrichtPazienti: 462 in T.I.Campioni BAL Tecnica: real time PCRHSV-1+: TI, 32%
non TI, 15%CA, 4.3%
De Vos et al. Clin Microbiol Infect 2009; 15: 358–363
Polmoniti nell’anziano
Falsey AR, Walsh EE, Clin Infect Dis, 2006; 42:518-24
RSV vs INFLUENZA
Ann R. Falsey et al. N Engl J Med 2005;352:1749-59.
• Studio di coorte, Rochester, NY• Campione
– Soggetti sani >65 – pazienti >21 con patologie cardiache o polmonari
croniche (gruppo ad alto rischio)– Soggetti >65 ospedalizzati con sint. Respiratoria
acuta
• Periodo: autunno 1999-primavera 2003 (4 stagioni epidemiche)
• Outcome: infezioni respiratorie e accesso servizi sanitari
Incidenza di infezioni respiratorie
>65 saniPaz. a rischio
Paz. ospedalizzati
N° casi (incidenza)
519 (10.4% pers.-mese)
524 (14.3% pers.-mese)
1471
RSV 46 (8.9%) 56 (10.7%) 142 (9.7%)
Influenza A 24 (4.6%) 20 (3.8%) 154 (10.5%)
Influenza B 7 (1.3%) 12 (2.3%) 16 (1.1%)
Falsey AR et al. N Engl J Med 2005;352:1749-59.
RSV influenza
>65 sani
(N=46)
Paz. a rischio
(N=56 )
Sani >65 (N=24)
Paz. a rischio (N=20)
Ricovero ospedale
0 9 (16%) 0 4 (20%)
morti 0 2 0 0
Falsey AR et al. N Engl J Med 2005;352:1749-59.
Ricerca qualitativa di agenti virali in 235 campioni di BAL a Trieste (2009-2010)
AGENTE TOTALE NEGATIVI POSITIVI % POS
CMV 235 190 46 19.6%
EBV 56 40 16 28.6%
HSV 100 78 22 22.0%
ADENO 76 75 1 1.3%
Influenza 73 70 12 16.4%
Infl H1v 10
Infl H3 1
Infl B 1
RSV 72 71 1 1.4%
MPV 59 59 0 0.0%
Parainfluenza 66 66 0 0.0%
Chl PN 76 74 2 2.6%
Myc PN 77 73 4 5.2%
PN Jer 232 199 33 14.2%
Positività per singolo patogenoagente totale positivi % Pos
CMV 235 26 11.1%
EBV 56 6 10.7%
HSV 100 9 9.0%
Adenovirus 76 1 1.3%
Influenza 73 7 9.6%
A/H1v 6 8.2%
A/H3 1 1.4%
RSV 72 1 1.4%
Chlam pneum 76 1 1.3%
Mycopl pneum 77 3 3.9%
Pneum jerovecii 232 14 6.0%
Campioni con positività per più di un patogeno
numero di patogeni nel campione
Numero di campioni
tipi di patogeno numero
DUE 25 CMV + Pneumoc. jerov. 12
CMV + EBV 3
CMV + HSV 1
CMV + FLU 1
EBV + HSV 2
HSV + Pneumoc. jerov. 3
HSV + FLU 2
FLU + MYC PN 1
TRE 5 CMV + EBV + HSV 1
CMV+EBV + PN JER 1
CMV + HSV + PN JER 1
EBV + HSV + FLU 1
EBV + HSV +PN JER 1
QUATTRO 1 EBV + HSV + CHL PN + PN JER 1
Analisi quantitativa
AGENTE TOTALE POSITIVI %BASSI (<E3)
INTERMEDI (E3-E4)
ALTI (>E4)
CMV 96 12 12.5% 4 2 6 (50%)
HSV 87 17 19.5% 7 3 7 (41%)
EBV 56 16 28.6% 8 4 4 (25%)
Diagnosi di laboratorio delle polmoniti virali
• Uso appropriato di antibiotici
• Controllo delle infezioni ospedaliere
• Trattamenti specifici
Vigil et al. J Intensive Care Med , 2010, 25 307-326
Laboratorio • Diagnosi sierologica• Isolamento in colture cellulari
– Metodo tradizionale– Metodo rapido (SVC)
• ELISA• Immunofluorescenza diretta• Test rapidi • Metodi molecolari
– PCR/RT PCR– Nested PCR/RT PCR– Real time PCR/RT PCR– Multiplex PCR/real time PCR– Microarray
Indagini sierologiche
• Metodiche con diversa sensibilità
– Elisa– Immuno-fluorescenza indiretta– Fissazione del complemento
• Scarsa utilità della ricerca delle IgM specifiche
• Necessità di determinazione su doppio siero
Colture cellulari
• Isolamento in diverse linee cellulari suscettibili (p.e. Vero, Hep-2, LLC-Mk2, MDCK-Siat)
• Identificazione con tecniche sierologiche o molecolari
• Deve essere effettuata in ambiente sicuro (BSL 2/3)
• Bassa sensibilità, colture negative non escludono la diagnosi
• Tempi generalmente lunghi
Metodi molecolari
• RT-PCR –Buona sensibilità–Campioni adeguati–Rischio
contaminazioni–Pannello di controlli–Tempi brevi (24-48
ore)
primers (BN-1) esterni interni
-2 -4 -6 -8 -10 cn -2 -4 -6 -8 -10
Home made SARS-CoV Nested PCR (primers da Drosten, BNI)
195 bp
110 bp
Diagnosi: real time PCR
Flu A (M) Flu A Sw (NP)H1 Sw (HA)RnaseP
• Real time PCR–Tempi brevi (<6 ore)–Buona Sensibilità–Buona Specificità–Ridotte
contaminazioni–Semplificazione delle
tecniche quantitative
QUANTIFICAZIONE
• Quantificazione assoluta, confronto con curva standard
• Determinazione del viral load
• Standardizzazione delle metodiche di estrazione e di analisi
• Cut-off variabili in funzione di substrato e tipo dipaziente
Microarray per influenza H1N1 pandemica
Multiplex Sensibilità e specificità
Krunic et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222 (2011) 6–13
Variabili biologiche che condizionano i risultati di laboratorio
• Età del paziente: i bambini hanno un viral load più elevato degli adulti/anziani
• Timing del prelievo: generalmente più precoce è il prelievo più elevata è la sensibilità
• Sede del prelievo: – tampone/aspirato naso-faringeo, – t. faringeo, – aspirato tracheale, – escreato, – BAL
Valutazione economica
Oosterheert JJ, et al. Clin. Infect. Dis. 2005; 41:1438–44
Conclusioni 1
• Le polmoniti CAP sono sostenute dai stessi virus responsabili delle infezioni respiratorie acute
• Le polmoniti nel paziente critico e in quello immunodepresso sono spesso dovute ad infezione/riattivazione di virus herpetici (CMV, HSV, EBV?)
• Nell’anziano e nel bambino il RSV è un patogeno importante
• Nuovi virus sono emersi recentemente la cui importanza non è ancora ben definita: Metapneumovirus, Bocavirus, Coronavirus, Mimivirus
Conclusioni 2
• Il laboratorio può svolgere un ruolo importante nell’accertamento diagnostico delle polmoniti virali
• E’ importante la comunicazione clinico laboratorista per una diagnosi corretta ed appropriata
• Le notizie cliniche ed epidemiologiche sono essenziali per indirizzare la ricerca dell’agente
Grazie per l’attenzione
UCO Igiene e Medicina Preventiva Università degli Studi di Trieste
IRCCS “Burlo Garofolo”Laboratorio di Virologia
• Comar M.• Santon D.• Zanotta N.• Samar E.• Cortini E.