physicochimie de macromolécules biochimie …...jeffries wyman max perutz pourquoi les...

Physicochimie de MacromoléculesBiochimie Structurale

James SturgisJean-Pierre Duneau

Sommaire

But du programme Organisation des

enseignements Organisation de l'examen Resources

Les molécules d'étude: hémoglobine et myoglobine

– Pourquoi ces protéines– Rôles physiologiques– Fonction biochimiques– Structures

But du programme

Donner une introduction

– A la physicochimiedes protéines

– A l'analyse de la fonction

– Aux relations structurefonction

Voir le role des molèles dans la compréhension

Voir comment sont présentés des résultats

Renforcer votre anglais scientifique.

Organisation des Enseignements

Les Cours (JS) Essentiellement un

modèle l'hémoglobine mais les idées sont générales....

Les TD (JPD) Analyse des données

– Pratiquer la conversion des mesures experimentales en valeurs utiles.

– Comment lire un article scientifique.

Sommaire des cours

Chapitre 1: Introduction Chapitre 2: Cooperativité et Allostérie Chapitre 3: Méchanique de l'hémoglobine Chapitre 4: MWC et Modulateurs Chapitre 5: Au dela de MWC, la cinétique. Chapitre 6: La dynamique d'une protéine.

Organisation de l'examen

Une Exercise

Une question de synthèse au choix.

Seront inclus dans l'examen:– Les cours– Les TD

Resources

Les transparents – Site web du département

ou du laboratoire

Les TD– Site web du département

ou du laboratoire.

Les articles (essentiellement en Anglais) pour approfondissement.

http://biologie.univmrs.fr/

Pourquoi les Hémoglobines?

Structure d'hémoglobine de Perutz et al. Nature 1960

Hommage à deux des géants de la Biochimie

● Jeffries Wyman

● Max Perutz

Pourquoi les Hémoglobines?

Structure d'hémoglobine de Perutz et al. Nature 1960

Structure de Myoglobine de Kendrew et al. Nature 1960

Pourqoui des Hémoglobines

Toujours d'actualité Plus de 200000 articles dans pubmed 4000 dans 2012 Une protéine de référence

– Facile a purifier– D'interêt médicale évident– Ouvert a plusieurs méthodes d'étude biophysiques– Tout à été faite avec!

Rôles des Hémoglobines

Fonctions Physiologiques Fonctions Cellulaires Fonctions Biochimiques

Fonctions Physiologiques– Transport d'oxygène– Stockage d'oxygène– Detoxification

Fonctions Biochimiques

Hémoglobines de mamifère

● Chargement d'oxygène dans les poumons

● Libération dans les tissus

Myoglobines de mamifère

● Stockage d'oxygène dans les muscles

● Libération en cas de besoin aigu.

Hémoglobines des légumes

● Maintien de régions dépourvues d'oxygène.

Fonctions Physiologiques

Fonctions Biochimiques– Liaison d'oxygène

Saturation [Oxygène]

Concentration d'oxygène

Les unités standard de concentration sont M (moles dm-3) mais pour des gaz comment faire?– PV = nRT ou n/V = P/RT– Proportionelle à

la pression, L'inverse de la temperature La fraction molaire

– 1 mole de gaz idéal (TPS) 24,4 l

Normalement utilise la pression partielle de l'oxygène.– 1 bar = 99,93 kPa

= 750mm Hg (Torr)= 14,5psi = 0,987 atm.

– A TPS l'air a une pression partielle de 0,21bar d'oxygène et la concentration dans l'eau est 0,269mM.

Hémoglobines

La couleur de l'hémoglobine est dû a l'absorption de lumière...

Hémoglobines

La couleur dépend de la liaison d'oxygène.– rose “oxyhémoglobine”– bleu

“desoxyhémoglobine”

Hémoglobines

La couleur est dû au cofacteur lié à la protéine.

l'héme elle est composé

– d'une partie organique la protoporphyrine IX

– une atome de fer.

Hémoglobines

L'héme est composé – d'une partie organique la

protoporphyrine IX– une atome de fer.

Le fer peut etre– Fe(II) ferreux comme

dans l'oxyhémoglobine– Fe(III) ferrique comme

dans la methémoglobine.

Hémoglobines – structure

● La protéine sert à tenir l'hème.

● Régule sa chimie:– Hémoglobine– Cytochromes

● Régule l'accès a l'hème

● Maintenir sa solubilité...

Une protéine est une structure complexe...

L'hémoglobine A est une tetramère– deux chaines et deux

chaines .

L'hémoglobine A est une tetramère

Les monomères ont des structures similaires.– 43% identité– 2,15 A rmsd. Structure des monomères d'hémoglobine

L'hémoglobine A est une tetramère

Les monomères ont des structures similaires.

Une structure tout .

Monomère d'hémoglobine

8 hélices – A à H

Organisé dans une sandwich:– AEF sur BGH

L'héme coincé entre les hélices E et F.

Des résidus importants– His F8

Liaison de l'hème

Des résidus importants– His F8 et His E6

Liaison de l'hème

Des résidus importants– His F8 et His E6– Lys E10 et His CD3

Liaison de l'hème

Des résidus importants Interieur hydrophobe

L'intérieur

Des résidus importants Interieur hydrophobe Surface hydrophile

La surface

Hémoglobine – structure

L'hémoglobine

Le tetramère Dans une tetramère... Contacts entre

sous-unités– .

– 1 et

– pas de contact .

Hémoglobine – structure

Dans une tetramère... Contacts entre

sous-unités– .

– 1 et

– pas de contact .

Interactions– Ponts salins– Liaisons hydrogène– Interactions hydrophobes

L'hémoglobine

Surface d'interactions

Hémoglobine – la suite...

Comment fonctionne cette protéine?

Pourquoi est elle une tetramère?

Comment comprendre la fonctionnement d'une protéine?

Cooperativité et Allostérie

Cooperativité

Qu'es la cooperativité? Comment peut-on mesurer

la cooperativité? Quelles sont les origines

moléculaire de la cooperativité?

Comment appliqué les idées de la cooperativité à l'hémoglobine?

Coopérativité

L'étude de l'affinité

Pour la Myoglobine (une protéine avec un seul site de liaison) on peut definir un equilibre:

Mb + O2 ⇔ MbO

avec une constante d'equilibre:

K=[MbO2]

[Mb ][O2]

Coopérativité

Ce modèle nous permet à prédire la saturation:

Y=[MbO2]

[Mb ][MbO2]

Y=K [O2]

1K [O2]

Y=[O2]

P50[O2 ]Ce modèle prédit bien le comportementde la Myoglobine à l'équilibre P

50=1Torr

Coopérativité

Le modèle équivalent pour l'hémoglobine:

Y=[HbmonoO2]

[Hbmono ][O2 ]

Y=K [O2]

1K [O2]

Ce modèle ne prédit pas bien le comportement de l'hémoglobine.

Coopérativité

La forme de la courbe pour:

– Myoglobine est hyperbolique– Hémoglobine est sigmoïde

Ca augmente sa capacité de transport.

C'est dû à la coopérativité.

Coopérativité

– Liaison d'un ligand augmente l'affinité.

Coopérativité

Pour la Myoglobine on a défini l'equilibre:

Mb + O2 ⇔ MbO

K=[MbO2]

[Mb ][O2]

Pour l'Hémoglobine on peut definir l'equilibre:

Hb + nO2 ⇔ HbnO

K=[HbnO2]

[Hb ][O2 ]n

Hill 1913tous les oxygènes se lient au même moment.

Coopérativité

Y=[HbnO2]

[Hb ][HbnO2]

Y=K×[O 2]

1K×[O2 ]n

Y=[O2]

P50n[O 2]

Hb + nO2 ⇔ HbnO

K=[HbnO2]

[Hb ][O2 ]n

Hill 1913tous les oxygènes se lient au même moment.

Coopérativité

Hb + nO2 ⇔ HbnO

Hill 1913tous les oxygènes se lient au même moment

Le modèle prédit bien la courbe pour l'hémoglobine avec n=2,8

Y=[O 2]

P50n[O2 ]

Coopérativité

Egalement sur le graphique de Hill (1910)

Hb + nO2 ⇔ HbnO

Hill 1913tous les oxygènes se lient au même moment

Le modèle prédit bien la courbe pour l'hémoglobine avec n=2,8

Y=[O 2]

P50n[O2 ]

Coopérativité

La valeur de n est une mesure de la coopérativitén > 1 coopérativité positive.n < 1 coopérativité négative.Si n = 1 on a la même chose que pour la myoglobine.

Plus n est grand plus la courbe de saturation est sigmoïde

Y=[O 2]

P50n[O2 ]

Plus n est grand plus la pente de la courbe de Hill est importante

Y=[O 2]

P50n[O2 ]

Coopérativité

Plus n est grand plus la pente de la courbe de titrage est importante

Y=[O 2]

P50n[O2 ]

Coopérativité

Pour l'Hémoglobine on trouve:

Hb + 2,8 O2 ⇔ Hb 2,8O

Y=[O2]

P502,8

[O 2]2,8

Ce modèle prédit bien la coube de liaison:

Mais:Comment peut on lier 2,8 oxygène?Pourquoi 2,8 si c'est un tetramère?

C'est difficile de reconcillier la structure avec ce modèle phénomènologique.

Coopérativité

Modèle simple de l'équilibre.

Permet de prédire la courbe de saturation.

Difficile à comprendre au niveau moléculaire la signification de 2,8.

Deux sites

Pr + 2L ⇔ PrL + L ⇔ PrL2K

K1=[PrL ]

[Pr ]×[L ]K2=

[PrL2]

[PrL ]×[L ]

Deux sites

Pr + 2L ⇔ PrL + L ⇔ PrL2K

K1=[PrL ]

[Pr ]×[L ]K2=

[PrL2]

[PrL ]×[L ]

PrL + L ⇔ Pr + 2L ⇔ PrL2

K1=[PrL ]

[Pr ]×[L ]K2=

[PrL2]

[Pr ]×[L]2

Deux sites

Ces modèles permettent de prédire la saturation

Y=[PrL ]2×[PrL2]

2×[Pr ][PrL][PrL2 ]

Y=0,5×K 1×[L ]K1×K 2×[L]

1K1×[L ]K 1×K2×[L ]2

Deux sites

Ces modèles permettent de prédire la saturation

Y=0,5×K 1×[L ]K1×K 2×[L]

1K1×[L ]K 1×K2×[L ]2

Pour la courbe de Hill...

Y1−Y

=0,5×K 1×[L ]K1×K 2×[L]

10,5×K1×[L ]

Grande [L]

Petite [L]

Demi saturation

Y1−Y

≈2×K2×[L ]

Y1−Y

≈0,5×K 1×[L ]

[L ]=1

K 1×K2

Deux sites

Graphique de Hill

Grande [L]

Petite [L]

Demi saturation

1−Y =log 2×K 2log [L ]

1−Y =log 0,5×K 1log [L ]

log [L] =−0,5×log K1×K 2

Symétrique autour de {0,5 x log(K1K

Deux sites – vue moléculaire

Au niveau moléculaire ilya deux formes possibles avec un ligand.

Site A

Site B

Pr PrLL

Si les deux sites n'interagissent pas:

Pr PrLL

Un ligand dans un site ne modifie pas l'affinité de l'autre site et:

Nota: si les deux sont équivalentsK

1 = 2 K

A et K

2 = 0,5 K

Si les deux sites interagissent entre eux:

Un ligand dans un site modifie l'affinité de l'autre site et:

Pr PrLL

K A≠K A 'et

K B≠K B '

maisK A×K B '=K B×K A '

K1=K AK B

K1×K 2=K A×K B 'C'est un système coopératif

Coopérativité

Si les deux sites interagissent entre eux:

Pr PrLL

C'est un système coopératif

SiK AK B

etKB 'K B

Cooperativité positive, liaison du premier ligand aide liaison du second.

Coopérativité

Une mesure de la coopérativité est la pente à un taux de saturation de 50% du courbe de Hill. Ce qui donne 2,8 pour l'hémoglobine.

>1 cooperativité +ve<1 cooperativité ve

Coopérativité

Au niveau moléculaire comment expliquer la coopérativité?

D'abord il faut plusieurs sites de fixation.

Il faut que les différentes sites interagissent:● Sites proches● Sites éloignés – changement de

structure de la protéine

Hémoglobine est un tétramère

Les sites sont loins l'un de l'autre

Hémoglobine

Un modèle coopératif de l'hémoglobine est compliqué

4 sites de liaison (ABCD),16 formes differentes et32 constants d'equilibre!!!

Hémoglobine

HbHbHb

Hémoglobine

C'est trop compliqué pour être un bon modèle!

HbHbHb

Comment faire plus simple?Et comprendre ce qui se passe?

Modèles Allostériques

Qu'es l'allostérie? Le modèle MWC. Comment parametriser le

modèle? Prédictions du modèle. Est le modèle raisonable?

Pauling (1935) Monod, Wyman et Changeux (1965) Koshland, Nemethy et Flimer (1966) Wyman (1972)

Minimum pour décrire l'hémoglobine:– 4 sites de liaison (c'est

un tetramère)– Cooperativité a longue

distance (plusieurs conformations)

Des sites identiques

Deux conformations distinctesTendue (T) et Relachée (R)

4 sites identiques et indépendants

Trois constants d'équilibre:– K

T l'affinité d'une site en

forme T

– KR l'affinité d'une site en

forme R

– L0 constant d'equilibre

entre les deux formes

KT=[TL ]

[T ]×[L]

forme T

forme R

entre les deux formes

KT=[TL ]

[T ]×[L]

KR=[RL ]

[R]×[L ]

forme T

forme R

entre les deux formes sans ligand.

L0=[R0]

4KT[L]

4KR[L]

4KT[L]

4KR[L]

4KT[L] 3K

T[L]/2 2K

T[L]/3 K

T[L]/4

4KR[L] 3K

R[L]/2 2K

R[L]/3 K

R[L]/4

4 3/2 2/3 /4

4c 3c/2 2c/3 .c/4

4 2 3 4

6L0c2 4L

L0(1+c)4

Fonction de partition

f T=1alpha

1alpha 4L0 1calpha

A partir de ces concentrations relatives il est possible de calculer la fraction en forme T...

4 62 43 4

6L0c2 4L

L0(1+c)4

Y=alpha 1alpha3

L0 c alpha1c alpha 3

1alpha4L0 1c alpha

A partir de ces concentrations relatives il est possible de calculer la fraction en forme Tou la saturation...

32 33 4

3L0c2 3L

L0(1+c)4

Modèles AllostériquesParamétrisation

Pour l'hémoglobine:

L0≈0,0001

K R≈1Torr−1

KT≈70Torr−1

c=0,014

Il faut trouver des paramètres pour le modèle qui le rapproche au maximum des observations

Modèles AllostériquesPrédictions

La courbe de saturation refléte la conversion entre la forme T et la forme R.

Le plupart des molécules d'hémoglobine ont 0 ou 4 ligandsil ny a presque jamais de la Hb.2O

f Hb2O2=

6 alpha21L0 c

1alpha 4L01c alpha4

4 62 43 4

6L0c2 4L

L0(1+c)4

Le plupart des molécules d'hémoglobine ont 0 ou 4 ligandsil ny a presque jamais de la Hb.2O

f Hb2O2=

6 alpha21L0 c

1alpha 4L01c alpha4

Un bon modèle est– Predictive– Raisonable– Utile.

Le plupart des observations fonctionelles sur l'hémoglobine à l'équilbre sont relativement bien prédites par le modèle de Monod, Wyman et Changeux.

Estque on peut mieux comprendre la structure dans le contexte du modèle?

Estque on peut incorporer dans le modèle les effets importants de modulateurs d'affinité?

4 sites identiques et équivalents

2 structures différentes T et R.

L'affinité de l'hémoglobine est modulée par son environnement, pH CO

2, BPG.

Estque cela est facile à incorporer dans le modèle et nous aide a comprendre son comportement et sa fonciton?

Le plupart des observations fonctionelles sur l'hémoglobine à l'équilbre sont relativement bien prédites par le modèle de Monod, Wyman et Changeux.

Estque on peut mieux comprendre la structure dans le contexte du modèle?

Estque on peut incorporer dans le modèle les effets importants de modulateurs d'affinité?

Méchanique de l'hémoglobine

MWC et Structure

4 sites équivalents.– Sous unités similaires

(2,1 Å rms deviation)– Sites de liaison

similaires Hème Histidines distale et

proximale

2 structures T et R.

MWC et Structure

4 sites équivalents.– Sous unités similaires

(2,1 Å rms deviation)– Sites de liaison

similaires Hème Histidines distale et

proximale

2 structures T et R.

MWC et Structure

4 sites équivalents– Pas si loin de la vérité.

2 structures T et R.– Les structures de

l'oxyhémoglobine et la desoxyhémoglobine sont différentes...

Desoxyhémoglobine

Oxyhémoglobine

MWC et Structure

4 sites équivalents– Pas si loin de la verité.

2 structures T et R.– Au moins mais ce n'est

pas déraisonnable.Desoxyhémoglobine

Oxyhémoglobine

Mécanique de l'Hémoglobine

Quelles sont les liens entre la structure de Perutz et l'allostérie de Monod Wyman et Changeux?

Quelles sont les rôles de la chimie dans le fonctionnement d'une protéine?

MWC et Structure

Une structure donne un vue statique...

mais souvent la fonction demande une dynamique...

Quelles sont les différences entre les deux stuctures?

Sontelles compatibles avec les deux états?

2 structures T et R.– Les structures de

l'oxyhémoglobine et la desoxyhémoglobine sont différentes...

MWC et Structure

La symétrie est conservéemais il y un déplacement des sousunitées d'environ 2Å.

2 structures T et R.– Les deux structures ont

des structures tertiaires et quaternaires différentes?.

Desoxyhémoglobine

Oxyhémoglobine

Comment une toute petite molécule O2 (Mr = 32)

d'une taille d'environ 2Å, peut-elle déplacer des enormes protéines (Mr = 67000) d'une taille de 50Å des longues distances?

Comment c'est déplacements changent-elles l'affinité pour l'oxygène?

Comment peut-on integrer les effets de modulateurs dans la mechanique et l'allostérie?

Quelles sont les limitations de ce modèle qui relie la structure et la fonction de l'hémoglobine?

Chimie du Fer

Pour comprendre comment l'hémoglobine fonctionne il faut regarder en détail....

L'oxygène se lie a une atome de Fe(II)...

Chimie du Fer

Les energies rélatives de ces orbitales dépendent des ligands:

Dans l'hème:Les ligands axiaux forts comme l'oxygène ou la cyanure favorisent les orbitaux Tg.

Les ligands axiaux faibles (eau ou rien) favorisent une dégénerescence des énergies.

OxyhèmoglobineDésoxyhèmoglobine

Chimie du Fer

Cela change les propriétes du fer et de l'hème:● Spin● Absorption● Forme

Haut spin 4/2 Bas spin (0)

Chimie du Fer

Pourpre Rose

Chimie du Fer

Sphérique Cubique

Chimie du Fer

FerSphérique

FerCubique

Et la position du fer dans l'hème

Hors plan possible Hors plan plus difficile

La liaison de l'oxygène sur le fer modifie les orbitaux.

Le fer devient bas spin Le fer entre dans le

plan de l'hème Cela entraine l'autre

ligand axiale, l'histidine proximale.

Fer hors plan

Fer dans le plan

Oxygène

HF8HF8

La liaison de l'oxygène demande également une glissement laterale de la porphyrine.

Qui entraine également l'histidine proximale.

Ces deux mouvements déplace l'hélice F

Comment ces petites movements (environ 0,5Å) declenchent ils une changement de la structure quaternaire importante?

HF8HE6

Des importants modifications de conformation des C-terminaux...

Une liaison hydrogène entre le tyrosine HC2 et la chaine peptidique (F8) est brisée.

Helice F

HF8HE6

Une liaison hydrogène entre le tyrosine HC2 et la chaine peptidique (F6) est brisée.

Cela libère le C terminal.

F Fe O2

pont salin avec D94

pont salinavec

Que font les C-terminaux des sous-unitées?– Sous unitée – Sous unitée

pont salin pont salin D126

Oxygenation d'une sous unité déstabilise une liaison .

Oxygenation d'une sous unité déstabilise deux liaisons

Oxygenation d'une sous unité déstabilise une liaison .

Oxygenation d'une sous unité déstabilise deux liaisons

6 ponts salins brisés par la transition TR

La transition est favorisé par liaison d'oxygène

Comment une toute petite molécule O2 (Mr = 32)

d'une taille d'environ 2Å, peut-elle déplacer des enormes protéines (Mr = 67000) d'une taille de 50Å des longues distances?

Comment c'est déplacements changent-elles l'affinité pour l'oxygène?

T R Les oxygènes

destabilisent les ponts salins et ainsi rendent la transition TR plus facile.

Les oxygènes destabilisent les ponts salins et ainsi rendent la transition TR plus facile.

c > 1: KR>K

T donc la

transition augment l'affinité.

Energ ie

On peut regarder également avec une diagramme energétique...– Sans Oxygène forme T– Avec Oxygène forme R

– KT plus petit que K

Liaison d'oxygène declenche une série de modifications structurales qui modifient les interactions entre sous-unités et ainsi favorise la forme R.

La forme R à une plus haute affinité parceque la structure est “préadapté” a la liaison, il n'y a pas des modifications de structure nécesaires.

Comment peut-on integrer les effets de modulateurs dans la mechanique et l'allostérie?

Quelles sont les limitations de ce modèle qui relie la structure et la fonction de l'hémoglobine?

Modulateurs

Qu'est un modulateur? Le modèle MWC. Mode d'action de certains

modulateurs? Les effets de pH.

Quels sont:– ses effets et– leurs origines moléculaires et– importances physiologiques?

Comment peut-on les intégrer dans le modèle MWC?

Modulateurs

Plusieurs molécules change l'affinité de l'hémoglobine:– CO

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

Sans CO2

Avec CO2

– H+

– BPG

– H2O

Le CO2 diminu l'affinité de

l'hémoglobine l'effet de Bohr

Modulateurs

Sans CO2

Avec CO2

– H+

– BPG

– H2O

Le CO2 diminu l'affinité de

l'hémoglobine l'effet de Bohr

Bohr, Hasselbalch, and Krogh dans Skan. Arch. Physiol. 1904 mais l'effet de pH maintenant appeller effet de Bohr decouvert en 1909.

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Le CO2 diminu l'affinité de l'hémoglobine.

Ca augment le transport d'oxygène

Modulateurs

L'hémoglobine lie le CO2

T RHaute AffinitéBas Affinité

La forme T lie le CO2

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

NH2 + CO

NHCOOH

Carbamylation des amines

Ca change une base (NH2) en acide (COOH).

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Plusieurs amines sont carbamylées

Certains de ces changements electrostatiques favorisent la forme T.

14% du CO2 dans le sang veineux est lié

a l'hémoglobine en forme des carbamylates.

Modulateurs

Une vue simpliste.... comment l'integrer dans le cadre du modele MWC?

Haute AffinitéBas Affinité

La forme T lie le CO

Deux formes T et RPlusieurs (n) sites dans chaque formeTous les sites identiques

Modulateurs

0 1 2 3 4 5 6

Modulateurs

Deux formes T et RPlusieurs (n) sites dans chaque formeTous les sites identiques K

T et K

0 1 2 3 4 5 6

.(n1)KT/2

.(n1)KR/2

Modulateurs

0 1 2 3 4 5 6

.n (n1)

.nc (n1)c

Modulateurs

0 1 2 3 4 5 6

.n (n1)n

L0(n1)nc2

L0 n!c2((n6)!6!)

Modulateurs

0 1 2 3 4 5 6

.n (n1)n

L0(n1)nc2

L0(1+c)n

Leff=f R

L0(1+c)n

(1+)n=

Modulateurs

Les ligands (autre que oxygène) qui se lient plus a une forme (T ou R) que a l'autre changent l'affinité pour l'oxygène parcequ'ils modifient l'équilibre T↔R et donc la valeur de L

0 il faut utiliser.

La valeur à utiliser Leff

depend du

valeur L0 dans l'absence de oxygène

et l'autre ligand (par exemple CO2),

la concentration du ligand L, le nombre de sites n, et les deux constants d'association.

Leff=f R

L0(1+c)n

(1+)n=

Un système à multiple équilibres liées

Modulateurs

D'une façon symmétrique l'oxygène va modifier l'affinité pour l'autre ligand en induisant la transition T→R. c=

Leff=f R

L0(1+c)n

(1+)n=

Un système à multiple équilibres liées

Modulateurs

Les protons diminus l'affinité de l'hémoglobine

.pH 7,4

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

Une partie de l'effet de CO2 (effet

de Bohr) est a cause des protons

CO2 + H

Anhydrase carbonique

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

L'effet dépend du pH et modifie L0...

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

Dans le context hémoglobine, ses ligands, et des equilibres multiples:

la forme T à une plus grande affinité pour les protons que la forme R.

Dans un context plus normal: la forme T à au moins un pK

A plus haut que la forme R.

Comment mesurer les pKA des acides

aminées dans une protéine et voir leurs déplacements?

– H+

– BPG

– H2O

Mesure de pKA dans une protéine

La méthode de choix est l'rmn, ceci est particulièrement efficace avec les histidine parceque la resonance du proton sur le C depend de la protonation.

Echange rapide...

Le pKA de H

146 est de 7,1

dans la forme R d'Hemoglobine et de 8,5 dans la forme T.

Déplacement des pKA et interactions

Les interactions modifient les pK

Les pKA sans

interactions:– Asp, Glu 4,4– His 6,5– Lys, Tyr, Arg 10,0

pK A=− log K A

−log [A−. ]×[H. ]

Les interactions modifient les pK

Les pKA sans

interactions:– Asp, Glu 4,4– His 6,5– Lys, Tyr, Arg 10,0

G°(X..AH)

G°(X..A)

G°(X..AH)

G°(X..A)

G°(AH..A )

= 2,303 R T pKA

G°(? )

= 2,303 R T pKA

G°(X..AH)

G°(X..A )

pKA' = pK

G°(X..A/AH)

2,303 R T

Différence des interactions introduit avec les deux formes.

G°(X..A/AH)

2,303 R T

Les interactions qui stabilisent le formes chargées

– Ponts salins– Liaisons hydrogènes

Ils...– Diminuent les pK

A's des

acides et– Augmentent celles des bases

Les interactions qui stabilisent les formes non-chargées

– Interactions hydrophobes– Enfouissement dans la

structure

Font le contraire.

Modulateurs

Stabilisation de la forme T en particulier par protonation du résidu C terminal His

146 et formation

d'un pont salin avec Asp94

– H+

– BPG

– H2O

Modulateurs

C'est important dans l'aclimatisation

Avec BPG

Sans BPG

– H+

– BPG

– H2O

Le 2,3bisphosphoglycerate diminu l'affinité de l'hémoglobine

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Il se lie entre les deux sousunités dans la forme T – il n'y a pas d'espace dans la

forme R

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Il interagit en particulier avec l'aminoterminus du sousunité , et K

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Le 2,3bisphosphoglycerate diminu l'affinité de l'hémoglobine en stabilisant la

forme T

Modulateurs

Une seule site et liaison possible seulement a la forme T...

La thermodynamique n'aime pas “seulement” et prefere “très preferentiellement”!!!

Modulateurs

– H+

– BPG

– H2O

Il y à plusieurs d'autres modulateurs qui modifient l'affinité d'hémoglobine en changeant l'équilibre entre les formes T et R. Certains sont plus important pour la physiologie que d'autres....

Pour un effet il faut que le molecule se lie plus a une forme que l'autre...

Au dela de MWC

Les limites du modèle MWC.

La cinétique.

Au dela de MWC

Le modèle de Monod Wyman et Changeux n'explique pas bien tous les effets observés avec l'hémoglobine...– Les sites et ne sont pas vraiment identiques.– Les différences entre les formes T et R sugèrent la

possibilité de structures intermédiaires.– Le modèle n'explique pas bien la cinétique de

l'hémoglobine.

Un modèle plus complexe

En principe, pour faire un modèle cinétique à partir d'un modèle à équilibre il suffit de remplacer chaque constante d'équilibre par deux constantes de vitesse:

eqK eq=

K eq=[B ]

Mais cette approche simple ne marche pas bien pour l'hémoglobine ou même pour la myoglobine. Pourquoi?

Mesures de la cinétique...

Melange rapide – stopped flow ou quenched flow

Saut de temperature ou de pression.

Photo-déclenchement.

Pourquoi MWC ne marche pas?

Pour q'un modèle “marche” les états importants doivent etre inclus.

A équilibre deux formes (T et R) et deux états (Hb et HbO

Dans le temps les formes intermédiaires. Hb

Trois extensions plus complexe

Plusieurs formes entre T et R.

Plusieurs états entre Hb et Hb.O

Les deux a la fois!!!

Un modèle TTS

Structures quaternaires et tertiaires liées

Changement de structure quaternaire

Liaison d'oxygène selon la structure quaternaire.

Changements de structure tertiaires

Changements de structure quaternaire

Liaison d'oxygène selon la structure tertiaire.

QTS = MWC TTS

Un modèle TTS

Les différentes structures dans les deux modèles:

QTS: 2 structuresTTS: 10 structures

(tttt)T

(tttt)R

(rrrr)T

(rrrr)R

Un modèle TTS

Les différentes constantes dans lesdeux modèles.TTS: 5 constantes...K

(tttt)T

(tttt)R

(rrrr)T

(rrrr)R

Un modèle TTS

Les différentes constantes dans les deux modèles.

Kt et K

r sont équivalents à

KT et K

R. L' est équivalent à

Si lT est petit et l

R est grand

ça approche le modèle MWC.

(tttt)T

(tttt)R

(rrrr)T

(rrrr)R

Un modèle TTS

On peut calculer une fonction de partage pour les 50 différents états:2 structures Quaternaires5 structures Tertiaires5 états d'oxygénation.

1+4lT+6l

T2+....

= {1+KtL+l

{1+KrL+l

rL)}4+ L'

(tttt)T

(tttt)R

(rrrr)T

(rrrr)R

Un modèle TTS

On peut estimer les valeurs de ces 5 constantes...

Kt = 0,005

Kr = 0,4

lT = 0,003

lR = 1,3

L' = 0,000002

Nota: lT est petit et l

R est grand

donc nous approchons au système MWC.

C'est quoi l'interêt?Un modèle plus complexe mais très similaire dans ses prédictions.

Modèles plus complexes

En générale des modeles plus complexes n'ont pas beaucoup d'interet SAUF dans le cas des modèles cinétiques.

Des états intermediaires

importants

Cinétique de la myoglobine

Les modèles cinétiques de l'hémoglobine ou myoglobine ont besoin (pour approcher de la réalité) de considérer les réactions d'association-dissociation en deux étapes (parfois plus).

MbCO Mb + CO.k

.kdiss

Mb...CO.k

Circinstance assez commun “liaison forte en deux etapes”.

Permet à augmenter la spécificité.

.kin(t)

.kout(t)

.kin(r)

.kout(r)

.kgem(t)

.kdiss(t)

.kgem(r)

.kdiss(r)

Un modèle plus complèxe

L'analyse des données cinétiques dans le cadre de ce modèle permet d'estimer les constantes de vitesse dans le contexte du modele TTS par saut de temperature...

kgem(r)

= 5,7 106 sec1

kgem(t)

= 7,6 103 sec1

kdiss(r)

= 0,02 sec1

kdiss(t)

= 0,07 sec1

kin = 2,4 104 sec1 (pseudo 1er ordre)

= 7,4 106 sec1

independent de la strucutre

Les modèles plus complexes

Les modèles cinétiques sont beaucoup plus complexes que des modèles à equilibre.

Il faut “fitter” tous ces parametres!!!

Nouveux “formes” présent de facon transitoire.

Constants de vitesse dans deux directions.

Moins de simplifications possibles (cycles)

Les modèles plus complexes

On peut augmenter la complexité des modèles à l'infini.

Ce n'est utile que si:– Il nous permet de

comprendre les évenements.

– Nous pouvons le paramétriser.

Parfois des couches de complexité ne sert a rien!! – Différences entre sous

unité et .

Parfois ils nous aident a la compréhension.– Site germinale

La cinétique de la myoglobine

Mb + CO

k obs=kassk diss

.kdiss

Pour un retour a équilibre:

kdiss≈0sauf avec lumièreouelle est très rapide

Myoglobine est un modèle idéal pour l'étude des interactions protéine ligand. [Grand changements d'absorption spécifiques de la protéine dans le spectre visible]

On étudie souvent la photodissociation et réassociation de CO. [Facile de déclencher la réaction très rapidement]

Il est possible d'utiliser les connaissances de la cinétique et l'effet des basses températures pour piéger des états intérmediaires.

On peut ensuite étudier la structure de ces états afin de visualiser un système dynamique.

La cinétique est plus compliquée que ce modèle simple.

Cinétique complexe et log(temps)

Quand on veut voir un cinétique complexe il est souvent utile de mettre l'échelle de temps en log...

Cela permet de voir plusieurs phases sur le meme graphique.

A des très basses températures, ou a temperature ambiente, une seule phase exponentielle.

A des températures plus « raisonnables » deux ou trois phases exponentielles.

Il est possible d'utiliser les connaissances de la cinétique et l'effet des basses températures pour piéger des états intérmediaires.

On peut ensuite étudier la structure de ces états afin de visualiser un système dynamique.

– Position du Fer– Localisation du CO

Forme CO

FormeGerminate

La dissociation du complexe « geminate » demande de la dynamique protéique.

Note: déplacement de l'hélice FG et C-terminal.

Grands déplacements de:– Histidine Distale et– Tryptophane 29.

Arrhenius

Eyring (etat de transition).k = A exp(EA/RT)

.k = kBT/h exp(S‡/R) exp(H‡/RT)

La dependence du constant de vitesse en temperature donne l'enthalpie d'activation

Multiples phases de taille variable impliquent diverses points de depart.

La dynamique des protéines

Les modes normaux.

Une ensemble pas une structure.

Liaison de O2 et CO par myoglobine

Comment les gazes entrent elles dans l'hémoglobine et myoglobine?

Comment trouver leur(s) route(s)?

Ca montre l'importance fonctionelle de la dynamique.

La structure d'hémoglobine et myoglobine contiens pas des routes pour l'entre des gases...

Sites de Xenon (14) (trous potentiel)

Simulation de dynamique moléculaire – routes...

Simulation de dynamique moléculaire – trous transitoires

Comment les gazes entrent elles dans l'hémoglobine et myoglobine?– Pas une route unique,

mais multiples routes.– Depend de la dynamique

locale de la protéine. Ca montre l'importance

fonctionelle de la dynamique.

Modes normaux et l'espaces des phases

Que sont des modes normaux?

La théorie des modes normaux supose que l'energie varie de facon harmonique autour du minimum. Comme ca les forces sont une fonction lineaire des coordonées atomiques. La diagonalisation de la matrice des forces donne 3N6 coordonées generalisées (modes normaux) et les frequences du système découplé.

O1 2 3

La dynamique peut etre décrits par des modes normaux.

Les changements de structure peuvent également etre decomposées en modes normaux.

Modelisation de la dynamique et l'espace des phases.

Les fluctuations complexes peuvent etre exprimées en composantes harmoniques.

r i t =1

3N−6

i C cos t

Position de l'atome i à temps t

masse de l'atome iEigen vecteurs du systemeAmplitude, Frequence (énergie) et phase du mode normal.

Experiences:Spectroscopie Raman,Infrarouge ou Diffusion desNeutrons donnent lesfréquences.

Calcul:Par diagonisation del'Hessian.Par tranformation d'unetrajectoire de dynamiquemoléculaire.

A quoi correspond ces modes ?

Les modes de plus basse energie et fréquence sont des mouvements collectives les plus molles...

Ils dependent de la structure globale de la protéine.

Souvent quelques modes de basse fréquence sont preponderant dans les changements importants pour la fonction.

Modelisation de la dynamique et l'espace des phases.1)Pas toujours le cas – notament

modifications locaux.2)Hors de la domaine harmonique.

Dans cette vision harmonique d'une protéine à chaque instant la position et vélocité des atomes sont decrits...(6 degrées de liberté).

C'est l'espace des phases avec 6 dimensions et chaque molecule évolue dans cette espace.

Pour l'instant accessible que par la modelisation.

Une ensemble de structures

Une protéine n'existe pas avec une structure mais dans une ensemble dynamique de structures. La diversité de l'ensemble, et sa dynamique sont importants pour la fonction.

Energy – 3D graph

Une ensemble de structures

Une protéine n'existe pas avec une structure mais dans une ensemble dynamique de structures. La diversité de l'ensemble, et sa dynamique sont importants pour la fonction.

Les formes “T” et “R” de l'hémoglobine preexistent et s'interconvertissent continuellement, meme en absence d'oxygène.

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